Introduction
L'absorption et la distribution des éléments nutritifs et les substances toxiques influencent fortement la croissance des plantes. En conséquence, l'étude des processus de transport sous-jacents constitue un domaine de recherche important en biologie végétale et en sciences agricoles de 1,2, en particulier dans les contextes d'optimisation nutritionnelle et les contraintes environnementales (par exemple, le stress salin, la toxicité de l'ammonium). Au premier rang des méthodes de mesure des flux dans les plantes est l'utilisation de traceurs radio-isotopiques, qui a été développé de manière significative dans les années 1950 (voir, par exemple, 3) et continue à être largement utilisé aujourd'hui. D'autres méthodes, telles que la mesure de l'épuisement des nutriments à partir du milieu de la racine et / ou l'accumulation dans les tissus, l'utilisation de micro-électrodes vibrants ions sélectifs tels que MIFE (microélectrode ion estimation du flux) et SIET (balayage de la technique de l'électrode sélective d'ions), et l'utilisation de colorants fluorescents ioniques spécifiques, sont également largement utilisés, mais ils sont limités dans leur capacité à détecter la grippe netxes (c'est à dire, la différence entre les flux et l'efflux). L'utilisation de radio-isotopes, d'autre part, permet au chercheur la capacité unique d'isoler et de quantifier les flux unidirectionnels, qui peut être utilisé pour régler les paramètres cinétiques (par exemple, K M et V max), et donner un aperçu de la capacité, énergétique, mécanismes et la régulation, des systèmes de transport. Mesures de flux unidirectionnels à base de radiotraceurs sont particulièrement utiles dans des conditions où le flux dans la direction opposée est élevé, et le chiffre d'affaires de piscines intracellulaires est rapide 4. En outre, les méthodes radiotraceurs permettent des mesures à effectuer en vertu des concentrations assez élevées de substrat, contrairement à beaucoup d'autres techniques (voir «Discussion», ci-dessous), parce que l'isotope tracé est observé sur un fond d'un autre isotope du même élément.
Ici, nous fournissons des instructions détaillées pour la mesure radio-isotopique de unidirectionnelle et nET flux de nutriments minéraux et des substances toxiques dans les plantes intactes. L'accent sera mis sur la mesure du flux de potassium (K +), un macro plante 5, et de l'ammoniac / ammonium (NH 3 / NH 4 +), un autre macronutriments qui est, cependant, toxique lorsqu'il est présent à des concentrations élevées (par exemple, 1 10 mM) 2. Nous allons utiliser les radio-isotopes 42 K + (t 1/2 = 12,36 h) et 13 NH 3/13 NH 4 + (t 1/2 = 9,98 min), respectivement, pour les plants intacts de l'orge du système de modèle (Hordeum vulgare L .), dans la description des deux principaux protocoles: afflux directe (DI) et analyse parcellaire par traceur efflux (CATE). Il faut noter d'emblée que cet article décrit simplement les étapes nécessaires pour effectuer chaque protocole. Le cas échéant, une brève explication des calculs et la théorie sont fournis, mais détaillées expositions de chaque techniqueLe contexte et la théorie de 'peuvent être trouvés dans plusieurs articles de fond sur le sujet 4,6-9. Fait important, ces protocoles sont largement transférables au flux analyse d'autres éléments nutritifs / substances toxiques (par exemple, 24 Na +, 22 Na +, 86 Rb +, 13 NO 3 -) et à d'autres espèces de plantes, mais avec quelques mises en garde (voir ci-dessous) . Nous soulignons également l'importance que tous les chercheurs travaillant avec des matières radioactives doivent travailler sous une licence arrangé par ionisants la réglementation de la sécurité de rayonnement de leur institution.
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Protocol
1. Plante Culture et préparation
- Pousser les semis d'orge hydroponique pendant 7 jours dans une chambre de croissance à température contrôlée (pour plus de détails, voir 10).
NOTE: Il est important de considérer l'examen des plantes à divers stades de développement, comme les besoins en nutriments vont changer avec l'âge. - Un jour avant l'expérimentation, regrouper plusieurs plants ensemble pour faire une seule répétition (3 plants par paquet de DI, 6 plantes par paquet pour CATE). Semis Bundle en enroulant un morceau de tube Tygon 2 cm autour de la partie basale des pousses, et la fixation du tube avec du ruban adhésif pour créer un «collier».
REMARQUE: Le nombre de plants par faisceau peut varier selon les conditions expérimentales 10,13,14. Le regroupement est fait pour améliorer les statistiques et la précision de mesure, en particulier lorsque la masse racinaire et / ou une activité spécifique sont faibles.
2 Préparation des solutions expérimentales / Matériaux
contenu "> REMARQUE: Ce qui suit est généralement effectuée un jour avant l'expérimentation.- Pour DI, rassemblez les informations suivantes: pré-étiquetage, l'étiquetage et des solutions de désorption (pour plus de détails, voir 11), tubes de centrifugation (pour l'essorage des échantillons de plantes), et flacons d'échantillon (du matériel végétal et l'activité spécifique [S o; voir ci-dessous]). Aérer et mélanger toutes les solutions.
- Pour CATE, recueillir les suivants: solutions, d'étiquetage et d'élution aéré bien mélangé (pour plus de détails, voir 10), entonnoirs efflux, tubes de centrifugation (pour l'essorage des échantillons de plantes), et flacons d'échantillon (pour éluats, des échantillons de plantes, et détermination de S o et le facteur de dilution [D f; voir ci-dessous]).
3 Préparer radiotraceurs
ATTENTION: Les étapes de sécurité suivantes doivent être prises avant de travailler avec la radioactivité.
- Veiller à ce que les exigences de la radioactive matériaux licence sont comprises et respectées. Porter un équipement de sécurité approprié (c.-à-lunettes, gants, blouse de laboratoire, le plomb gilet / collier) et dosimètres (par exemple, l'anneau de TLD et insigne). Mettre en place de protection (c.-à-plexiglas et briques de plomb) et effectuer des travaux radioactifs derrière elle. Assurez-vous que d'un compteur Geiger-Müller est présent afin de surveiller régulièrement la contamination.
- Préparation de 42 K +
- Placez un récipient propre et sec sur la balance. La balance à zéro.
- Retirer le flacon de traceur (20 mCi de 42 K 2 CO 3, sous forme de poudre) de l'emballage et versez traceur dans le bécher. Prenez note de la masse.
- Pipette 19,93 ml de dH 2 O, suivi par 0,07 ml de H 2 SO 4, dans le bécher. Cela conduira à la réaction chimique suivante:
42 K 2 CO 3 (S) + H 2 SO 4 (l) + H 2 O (l) → 42 2 SO 4 (L) + CO 2 (v) + 2H 2 O (l) - Calculer la concentration de la solution mère radioactive, compte tenu de la masse et le poids moléculaire de K 2 CO 3, et le volume (20 ml).
NOTE: Si vous travaillez avec 13 NH 3/13 NH 4 + Le traceur est produit dans un cyclotron par le bombardement de protons de l'atome d'oxygène de l'eau (qui entraîne généralement 100-200 activité mCi pour des détails de production, voir 12). Parce que la quantité de NH 14 3/14 NH 4 + est extrêmement faible dans ces solutions, la concentration en N de la solution mère est négligeable.
4 Afflux directe (DI) Mesure
- Pour 42 K +, pipette la quantité de solution mère radioactif nécessaire pour atteindre la concentration finale souhaitée de K + dans la solution d'étiquetage.
- Pour 13 NH 3/13 NH 4 +, pipette une petite quantité (<0,5 ml) dans la solution d'étiquetage. Laisser la solution d'étiquetage à mélanger soigneusement (par l'intermédiaire d'aération).
- Introduire à la pipette un sous-échantillon de 1 ml de solution d'étiquetage dans un flacon échantillon et répéter trois fois (4 échantillons au total).
- Mesurer la radioactivité dans des flacons (en "coups par minute", cpm), à l'aide d'un compteur gamma. Assurez-vous que le compteur est programmé de telle sorte que les lectures cpm sont corrigées pour la décroissance isotopique (ceci est particulièrement important pour ces traceurs de courte durée).
- Calculer S o (exprimée en cpm mol -1) par la moyenne des comptages des quatre échantillons (cpm ml -1) et en divisant par la concentration du substrat dans la solution (mol ml -1).
- Plongez dans les racines pré-étiquetage (non radioactif) solution pendant 5 min, d'effectuer une pré-équilibrer les plantes dans des conditions d'essai (voirpar exemple, 10,13,14 des variations de temps de pré-étiquette).
- Plongez racines dans l'étiquetage (radioactifs) solution pendant 5 min.
NOTE: Les temps d'étiquetage peuvent varier en fonction expérience 3,4,7-10. - Transfert des racines de solution de désorption de 5 sec pour éliminer la plus grande partie de la radioactivité adhérant en surface. Transfert des racines dans un deuxième bécher de solution de désorption pendant 5 min à racines plus claires de traceur extracellulaire.
- Disséquer et pousses séparées, pousses basales, et les racines.
- Passer racines dans des tubes à centrifuger et des échantillons de rotation pendant 30 s à une faible vitesse, de qualité clinique centrifugeuse (~ 5 000 x g) pour éliminer l'eau interstitielle et superficielle.
- Peser racines (poids frais, FW).
- Compter la radioactivité dans des échantillons de plantes (tournage, tournage de base, et la racine; voir l'étape 4.2.1).
- Calculer le flux. Calculer afflux dans la plante en utilisant la formule
Φ = Q * / S o poids L
où Φ est le flux(Pmol g -1 h -1), Q * est la quantité de traceur accumulée dans les tissus (cpm, généralement dans la racine, tirer, et tirer de base, combiné), S o est l'activité spécifique de la solution de marquage (cpm pmol - 1), w est le poids frais des racines (g), et L t est le temps d'étiquetage (h).
REMARQUE: calcul plus sophistiqué peut être faite pour tenir compte simultanée traceur efflux de racines pendant l'étiquetage et la désorption, en fonction des paramètres obtenus à partir de CATE (voir ci-dessous pour des détails, voir 4).
5. parcellaire Analyse par Tracer efflux (CATE) Mesure
- Préparer une solution d'étiquetage et mesure S o (voir les étapes 04.01 à 04.02, ci-dessus).
- Mesurer le facteur de dilution (D f).
REMARQUE: Souvent, la position de l'échantillon par rapport au détecteur dans le compteur gamma peut influencer la quantitéde rayonnement mesuré. Voir discussion pour plus de détails.- Après la mesure de S o, ajouter 19 ml de H 2 O pour chaque échantillon (tel que le volume final = volume d'éluat = 20 ml). Nombre de radioactivité dans chaque échantillon de 20 ml (voir l'étape 4.2.1).
- Calculer D f en divisant les cpm moyenne des échantillons de 1 ml par le cpm moyenne des échantillons de 20 ml.
- Plongez racines dans une solution d'étiquetage pendant 1 heure.
- Retirez les plantes de solutions d'étiquetage et de transfert des plantes à efflux entonnoir, tout en s'assurant que le système racinaire est dans l'entonnoir. Doucement plantes sécurisés à côté de l'efflux entonnoir en appliquant une petite bande de ruban adhésif sur le collier en plastique.
- Verser doucement le premier éluat dans l'entonnoir. Lancement d'une temporisation (comptage).
- Ouvrez le robinet et recueillir l'éluat dans le flacon d'échantillon après 15 secondes (note: le temps d'élution varie; voir ci-dessous). Fermez le robinet. Verser délicatement la prochaine éluat dans l'entonnoir.
- REPEAt étape 5.6 pour le reste de la série d'élution, qui suit, de la première à l'éluat final: 15 sec (quatre fois), 20 s (trois fois), 30 sec (deux fois), 40 s (une fois), 50 sec (une fois), 1 min (25 fois), pour une période d'élution total de 29,5 min
REMARQUE: série de désorption peut varier en fonction des conditions expérimentales 7-10,13,14. - Une fois que le protocole d'élution est terminée, les plantes de la récolte (étapes 4.6 à 4.8 ci-dessus).
- Compter de la radioactivité dans les éluats et des échantillons de plantes dans le compteur gamma (multipliant la lecture pour chaque éluat par D f, voir 5.2).
- Terrain de presse de traceur (cpm g (FW racine) -1 min -1) en fonction du temps d'élution. Pour l'état d'équilibre, effectuer des régressions linéaires et des calculs de flux, la demi-vie de change, et les tailles de la piscine (pour plus de détails, voir 6-9).
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Representative Results
La figure 1 montre les isothermes trouvés en utilisant la technique de DI (à 13 N), pour l'arrivée de NH 3 dans les racines de plants d'orge intactes cultivées à élevée (10 mM), NH 4 +, et soit faible (0,02 mM) ou élevée (5 mM ) K +. Les isothermes montrent une cinétique de Michaelis-Menten NH 3 lorsque les flux sont tracés en fonction de la concentration externe NH 3 ([NH 3] de poste; ajustés par des changements de pH dans la solution 13). NH 3 flux étaient significativement plus élevés à faible K + que à haute K +. Analyse des paramètres cinétiques de Michaelis-Menten a montré que le K M est resté relativement stable entre K + niveaux (150 vs 90 μ M à basse et haute K +, respectivement), tandis que V max est fortement réduite à haute K + (205 contre 80 pmol g -1 h -1). Ainsi, les données indiquent que regulat de niveau K +es transports d'azote (effet max V), mais pas par la concurrence directe entre K + et NH 3 pour les sites des transporteurs de liaison (K M effet). Plutôt, K + peut réglementer NH 3 flux par d'autres moyens, tels que par la modulation de l'activité des aquaporines (pour plus de détails, voir 13).
DI est aussi utile pour la saisie des changements relativement rapides de flux due à des changements alimentaires, ou à la demande d'agents pharmacologiques. Par exemple, la figure 2 met en évidence la plasticité rapide du système K + -uptake dans les racines des jeunes plants d'orge cultivés intacts à modérée (0,1 mM) K + et haute (10 mm) NH 4 + conditions. Ici, nous avons observé une augmentation de ~ 350% de l'influx de K + dans les 5 min de NH 4 + retrait de la solution externe. A été trouvé Cet "effet d'ammonium de retrait" ("AWE") pour être sensible à la K + +), le baryum (Ba 2 +), et le césium (Cs +). Utilisation de DI et des mesures électrophysiologiques dans plusieurs génotypes d'Arabidopsis, nous avons pu attribuer avec certitude la grande majorité de l'AWE à l'évolution des activités de la chaîne d'Arabidopsis K +, AtAKT1, et de haute affinité K + transporteur, AtHAK5 14.
Figure 3 parcelles l'd'efflux l'état d'équilibre de 42 K +, au fil du temps, à partir de racines de plants pré-étiquetés orge cultivés à faible (0,1 mM) K + et modéré (1 mM) NO 3 -. Ces traces montrent comment la méthode de CATE peut révéler des changements rapides et importants dans l'efflux lors de l'application de divers agents pharmacologiques / nutritionnels. Substantielle, inhibition immédiate de la efflux de K + a été observée sur une demande soit de 10 mM Cs +, un bloqueur des canaux K +, ou une forte augmentationen K + fourniture (de 0,1 à 10 mM). Ces résultats sont cohérents avec des études moléculaires décrivant les propriétés uniques de déclenchement vers l'extérieur, les canaux K + de rectification 15. En revanche, l'application de 10 mM de NH 4 + rapidement et fortement stimulée efflux de K +. Cet effet peut être expliqué par l'activation de l'extérieur, les canaux K + de rectification par l'intermédiaire d'une dépolarisation du gradient de potentiel électrique à travers la membrane plasmique des cellules de la racine 16, qui est connu pour se produire lors de l'introduction de NH 4 + 17. Ainsi, en utilisant cette méthode, nous avons été en mesure de démontrer, dans la plante, que les canaux K + médiation efflux de K + dans les racines de l'orge 10.
Enfin, le tableau 1 montre les paramètres de CATE extraites à partir des mesures de l'état d'équilibre de 42 efflux de K + ([K +] ext = 0,1 mM) dans les semences d'orgelings cultivées soit avec 1 mM NO 3 - ou 10 mM NH 4 +, ce dernier représentant un scénario toxique. La haute + condition NH 4 entraîne une suppression de tous les K + flux, et une baisse significative de K cytosolique concentration ([K +] cyt), qui est normalement homéostatique maintenue à ~ 100 mM dans des conditions de croissance saines 18 (comme on l'observe , par exemple, dans le tableau 1, en vertu de NO 3 - l'offre).
Figure 1: 13 NH 3 isothermes d'afflux révèlent comment K + offre réglemente le transport de l'azote. NH 3 afflux en fonction de différentes concentrations extérieures de NH
Figure 2 NH 4 + stimule retrait significativement médiation canal K + afflux. K + afflux à l'état d'équilibre, et au moment du retrait de NH 4 +, dans les racines de jeunes plants d'orge intactes cultivées à faible (0,1 mM) K + et haute (10 mM) NH 4 +. L'effet de canaux K + bloquants (10 mM TEA +, 5 mM Ba2 +, et 10 mM Cs +) sur l'afflux K + stimulée est prononcé. Les astérisques indiquent les différents niveaux de signification entre NH 4 + et de traitement paires (* 0,01 <P <0,05, *** p <0,001; ANOVA à une voie avec de multiples comparaison de Dunnett post-hoctest). Astérisques entre parenthèses indiquent un niveau de signification entre le contrôle et NH 4 + paire (t le de -test de Student). Les barres d'erreur représentent la SEM de> 4 répétitions. (Extrait de Coskun et al. Capacités et la plasticité des canaux potassiques et les transporteurs à haute affinité dans les racines de l'orge et Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013).)
Figure 3 efflux de K + est sous-K + La médiation conditions canal état d'équilibre 42 efflux de K + dans les racines des jeunes plants d'orge intactes cultivées à faible (0,1 mM) K + et modéré (1 mM) NO 3 -., Et les effets immédiats (à t = 15,5 min; voir flèche) de 10 mM CsCl, 5 mM de K 2 SO4, et 5 mM (NH 4) 2 SO 4 sur efflux. Chaque parcelle représente la moyenne de 3-13 répétitions (SEM <15% de la moyenne). (Extrait de Coskun et al règlement et mécanisme de libération de potassium à partir de racines d'orge:.. L'in planta 42 K + analyse New Phytol 188, 1028-1038 (2010).).
| Poste [K +] | La source de N | Afflux | Fuite | Flux net | E: Rapport I | Taille du pool | La demi-vie |
| (MM) | (Pmol g -1 h -1) | (MM) | (Min) | ||||
| 0,1 | 1 NO 3 - | 7,22 ± 0,23 | 1,86 ± 0,18 | 5,36 ± 0,18 | 0,25 ± 0,02 | 98,84 ± 14,08 | 28.18 ± 3.40 |
| 10 NH 4 + | 1,89 ± 0,13 | 0,57 ± 0,05 | 1,32 ± 0,10 | 0,30 ± 0,01 | 28.39 ± 3.40 | 32,50 ± 4,69 | |
Tableau 1 L'état d'équilibre K + flux et compartmentation vertu de diverses dispositions de N l'état d'équilibre de flux et l'analyse parcellaire de jeunes plants d'orge cultivé à 0,1 mM K +, et soit NO modérée 3 -. (1 mM, comme Ca de sel) ou haute NH 4 + (10 mM, comme SO 4 2-sel). Erreurs indiquent ± SEM> 8 répétitions. (Extrait de Coskun et al règlement et mécanisme de libération de potassium à partir de racines d'orge:.. L'in planta 42 K + analyse New Phytol 188, 1028-1038 (2010) et Coskun et al capacités et la plasticité des canaux potassiques et haute.. transporteurs affinité dans les racines de l'orge et Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013).)
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Discussion
Comme le montrent les exemples ci-dessus, la méthode de traceur radioactif est un puissant moyen de mesurer les flux unidirectionnels de nutriments et de substances toxiques in planta. Figure 1 montre que le NH 3 afflux peut atteindre plus de 225 pmol g -1 h -1, ce qui est peut-être le plus de bonne foi flux transmembranaire jamais enregistré dans un système de centrale 13, mais l'ampleur de ce flux ne serait pas visible si seulement les flux nets ont été mesurés. En effet, un grand écoulement de NH 3 se produit en même temps que l'afflux, dans un scénario futile vélo qui peut entraîner une sous-estimation de l'influx marqué qui augmente avec le temps d'étiquetage 13. En complétant la technique du traceur avec l'analyse électrophysiologique, nous avons pu démontrer que dans les conditions de la figure 1, à la fois afflux et l'efflux de 13 N est principalement du gaz neutre NH 3, et non de sa conjugmangé acide NH 4 + (pour plus de détails, voir 13). C'est la première démonstration in planta des rapides des flux de NH 3 de gaz dans les racines, et en tant que telle, fournit la preuve préliminaire importante vers élucider le mécanisme de transport qui se trouve au cœur de NH 3 / NH 4 + toxicité chez les plantes supérieures 2,13. Le travail moléculaire dans des systèmes d'expression hétérologues ont démontré que le NH 3 peut s'écouler via aquaporines dans les plantes, et les 19 données de la figure 1, avec la preuve pharmacologique récente, a commencé à corroborer ces résultats au niveau de l'organisme intact 13.
Les figures 2 et 3 fournissent également d'excellents exemples de l'utilité de la mesure des flux unidirectionnels radiotraceurs. Utilisation de DI avec 42 K +, nous avons pu démontrer que canaux ioniques sont pas responsables de l'état d'équilibre K + + et NH 4 + élevé, à la différence du système de modèle Arabidopsis 14. Ce n'est que lorsque NH 4 + a été retirée fait, nous voyons la preuve de l'engagement des canaux K + (Figure 2). Bien que le flux net de K + est également stimulée par NH 4 + retrait (comme indiqué par une augmentation du tissu teneur en K + 14), que par mesure afflux unidirectionnelle que nous avons pu révéler l'ampleur et l'apparition rapide de ce phénomène. En outre, en réalisant des mesures DI avec des mutants et des agents pharmacologiques, nous avons pu identifier les protéines de transport ont participé. De même, par application de produits nutritionnels et pharmacologiques tout en surveillant traceur efflux (Figure 3), nous avons pu caractériser et d'identifier les mécanismes de efflux de K + à partir de cellules orge profondes 10. Ainsi, les techniques telles que la DICATE et peut contribuer à la compréhension des caractéristiques de transport de macronutriments critique.
Comme indiqué dans le protocole, souvent la position de l'échantillon par rapport au détecteur dans le compteur gamma peut influencer la quantité de rayonnement mesuré. Ainsi, si un échantillon de 1 ml est "complété" avec 19 ml de H 2 O, les chiffres de mesure (cpm) dans l'échantillon de 20 ml peut être significativement inférieur à celui de l'échantillon de 1 ml, en dépit d'avoir la même quantité de traceur radioactif. Par conséquent, un D f peut être appliquée pour corriger cette «dilution» apparent de la radioactivité. Cette question est souvent pas explicitement indiquée par les fabricants de instruments de détection et doit être élaboré par le chercheur. De même, l'efficacité de la protection dans les détecteurs contre rayonnement ambiant (c.-à partir d'échantillons à proximité dans le compteur) peut être exagérée par les fabricants, et ces questions doivent être travaillépour des systèmes de mesure individuels.
Un avantage majeur de la technique du traceur est sa non-invasif, qui fournit un moyen de mesurer les flux, taille des pools intracellulaires, et des taux de change, à l'état d'équilibre. Par exemple, avec Cate, on peut quantifier de manière non invasive la concentration cytosolique de K + (tableau 1). Cela peut être préférable à d'autres méthodes telles que l'empalement de cellules avec des microélectrodes sélectives d'ions 18, qui confère des perturbations physiques et chimiques éventuellement à la cellule. En outre, la technique de traceur est unique en ce qu'il offre une vision globale des flux et la compartimentation des organes entiers et des plantes intactes. Ceci est important si l'on s'intéresse à la compréhension de la dynamique des nutriments végétaux entiers, de toxicité, et, finalement, la performance sur le terrain. Enfin, les méthodes radiotraceurs permet des mesures très sensibles à effectuer en vertu des concentrations assez élevées de substrat. Traditions des expériences d'épuisement et de techniques de microélectrodes peuvent rencontrer des problèmes de fond interférences et donc, peuvent exiger que la concentration externe du substrat d'intérêt est réduit bien inférieur à celui prévu lors de la croissance. Cela pourrait être problématique si l'on s'intéresse à l'étude des conditions «stable» de concentrations élevées de substrat (comme avec NH 3 / NH 4 + toxicité ou conditions "High-K +", voir ci-dessus).
Il est à noter que, comme toutes les techniques, mesure des flux de radiotraceurs n'est pas sans limites. Par exemple, la disponibilité de radiotraceurs peut être problématique, particulièrement pour les isotopes de très courte durée de vie comme le 13 N qui nécessitent une proximité d'une installation de production tel qu'un cyclotron. Une autre limitation importante est que, parfois, il peut être difficile de distinguer entre les flux qui se produisent à travers les membranes et les extracel survenantlularly. Ces distinctions appellent à la phase d'essai rigoureux 7,10,20. Dans le cas d'efflux de K +, qu'après un examen minutieux que nous avons pu confirmer que l'état d'équilibre de 42 K + libération de racines se produisait pas à travers les membranes cellulaires à haut poste [K +] (> 1 mM) 10, mais à partir extracellulaire des espaces (cf figure 3). Ces problèmes peuvent être résolus en examinant l'effet d'un large éventail d'agents pharmacologiques ou par des analyses thermodynamiques, qui ont montré, par exemple, que les flux très élevés Na + signalées dans des conditions salines seraient énergiquement irréalisable ont-ils été de procéder à travers les membranes cellulaires 21,22.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Model: Wallac 1480 Wizard 3" | |
| Geiger-Müller counter | Ludlum Measurements Inc. | Model 3 survey meter | |
| 400 ml glass beakers | VWR | 89000-206 | For pre-absorption, absorption, and desorption solutions |
| Glass funnel | VWR | 89000-466 | For efflux funnel |
| Large tubing | VWR | 529297 | For efflux funnel |
| Medium tubing | VWR | 684783 | For bundling |
| Small tubing | VWR | 63013-541 | For aeration |
| Aeration manifold | Penn Plax Air Tech | vat 5.5 | To control/distribute pressurized air into solutions |
| Glass scintillation vials | VWR | 66022-128 | For gamma counting |
| Glass centrifuge tubes | VWR | 47729-576 | For spin-drying root samples |
| Kimwipes | VWR | 470173-504 | For spin-drying root samples |
| Dissecting scissors | VWR | 470001-828 | |
| Forceps | VWR | 470005-496 | |
| Low-speed clinical centrifuge | International Equipment Co. | 76466M-4 | For spin-drying root samples |
| 1 ml pipette | Gilson | F144493 | |
| 10 ml pipette | Gilson | F144494 | |
| 1 ml pipette tips | VWR | 89079-470 | |
| 10 ml pipette tips | VWR | 89087-532 | |
| Analytical balance | Mettler toledo | PB403-S/FACT |
References
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