Summary
Præsenteret er en fleksibel informatik workflow muliggør multiplex billede-analyse af fluorescens-mærkede celler. Arbejdsgangen kvantificerer nukleare og cytoplasmiske markører og beregner markør translokation mellem disse rum. Procedurer er tilvejebragt til forstyrrelse af celler under anvendelse af siRNA og pålidelig metode til markering detektion ved indirekte immunofluorescens i 96-brønds format.
Abstract
Fremskridt i forståelsen kontrolmekanismerne for opførsel af celler i vedhængende pattedyr vævskultur modeller bliver mere og mere afhængige af transportformer encellede analyse. Metoder, der leverer sammensatte data afspejler de gennemsnitlige værdier af biomarkører fra cellepopulationer risikerer at miste delpopulation dynamik, der afspejler heterogenitet for den undersøgte biologiske system. I tråd med dette, er de traditionelle metoder ved at blive erstattet af eller støttet med, mere sofistikerede former for cellulær assay udviklet til at tillade vurdering fra højt indhold mikroskopi. Disse analyser potentielt generere et stort antal billeder af fluorescerende biomarkører, som muliggøres af ledsagende proprietære software-pakker, giver mulighed for multi-parametriske målinger per celle. Imidlertid har de relativt høje kapitalomkostninger og overspecialisering af mange af disse enheder forhindret deres tilgængelighed til mange efterforskere.
Beskrevet her er engenerel anvendelse workflow til kvantificering af flere fluorescerende markør intensiteter fra specifikke subcellulære regioner af individuelle celler, der er egnede til brug sammen med billeder fra de fleste fluorescerende mikroskoper. Nøglen til denne arbejdsgang er gennemførelsen af den frit tilgængelige Cell Profiler software 1 til at skelne de enkelte celler i disse billeder, segment dem i definerede subcellulære regioner og levere fluorescens markør intensitetsværdier specifikke for disse regioner. Udvindingen af individuelle celle intensitetsværdier fra billeddata er det centrale formål med denne arbejdsproces, og vil blive illustreret med analysen af kontroldata fra et siRNA skærm til G1 checkpoint lovgiverne i vedhængende menneskeceller. Imidlertid kan arbejdsgangen præsenteres her anvendes til analyse af data fra andre midler celle forstyrrelse (f.eks sammensatte skærme) og andre former for fluorescens baseret cellulære markører og bør derfor være nyttige til en lang række laboratorier.
Introduction
Arbejdet præsenteres her beskriver brugen af frit tilgængelig software Cell Profiler til at udføre algoritme-styrede opdeling af fluorescerende mikroskopi billeder af adhærente celler at identificere individuelle celler og definerede subcellulære regioner. Denne fremgangsmåde, der betegnes som billede segmentering, tillader den efterfølgende multi-parametrisk analyse af de afbildede celler ved at kvantificere fluorescensmærkede markører lokaliseret til hver celle eller subcellulær region (benævnt segmenterede objekter). Denne arbejdsproces er et grundlag for, at high-indholdsanalyse og er beregnet til at fungere som et værktøj, der kan udvikles og tilpasses til multi-parametrisk yderligere, individuel celle analyser i laboratorier uden adgang til specialiserede højt indhold instrumenter eller proprietær software. Filerne, der følger med dette manuskript omfatter en test sæt relevante rå billeddata, algoritme indstillinger og understøtter scripts til at generere beskrevne analyse. Den algoritme indstillinger feller Cell Profiler er optimeret for eksemplet datasæt og diskussionen afsnit detaljer hvilke justeringer kan være nødvendige for at muliggøre brug af billeddata fra andre undersøgelser.
Når kvantitative data er udvundet ved hjælp af Cell Profiler kan forskellige laboratorier har forskellige krav til, hvordan man bruger de oplysninger, som den enkelte celle værdier i rådata; vist her, er en fremgangsmåde, hvor porte anvendes til de rå data for hver assay. Ved hjælp af disse porte er de data, omdannet til binære form af svar, så visualisering af tendenser forbinder forskellige behandlinger med subpopulationer af celler, der undergår reaktion defineres af portene. Portene er indstillet baseret på observationer af fordelingerne data opnået for passende negative og positive kontroller for hvert relevant måling. Brugen af porte er blot ét eksempel på, hvordan man kan styre de rå, cellebaserede målinger. Også vist her er brugen af kerne-DNA intensitet migasurements i deres rå form som en kontinuerlig række værdier i kombination med de kanaliserede data. Andre fremgangsmåder til at styre billede analysedata bør overvejes, afhængigt af arten af undersøgelsen; statistiske alternativer til at bruge porte til at tildele celler til subpopulationer er rapporteret 2 og systematiske sammenligninger af strategier til at opsummere høj indholdsdata tværs stort antal parametre er rapporteret 3.
High-indhold analyser af billeddata har fundet anvendelse i cellulære studier af narkotika-respons, omvendt genetik og miljømæssige stress signalering 4 - 6. Den fortjeneste af høj indholdsanalyse skyldes, at algoritmisk analyse af fluorescens mikroskopi data tillader kvantitative og rumlige parametre, der skal behandles samtidigt på tværs af individuelle celler 7. På denne måde kan cellulære resultater for flere analyser være krydsreferencer, differential adfærd assay-defined cellesubpopulationer kan spores inden for eksperimentelle betingelser og assays kan omfatte overvejelser af morfologiske variable. Strategierne og analyser workflow diskuteret her, som for andre high-indhold tilgange, er i stand til at levere multipleksede data, der krydshenvisning til de enkelte celler. High-indhold metoder passer undersøgelser, der genererer fluorescerende mikroskop billeder og gælder for analyse af data lige fra snesevis af billeder, der er produceret i lille produktion konventionel fluorescens-baserede mikroskopi igennem til de tusindvis af billeder, produceret ved hjælp af automatiserede højt indhold screening platforme.
Arbejdsgangen er illustreret her med eksempel data fra hvor separate analyser er målt i enten nukleare fluorescerende markør intensiteter eller nuklear / cytoplasmatisk translokation af en fluorescerende reporter protein. Arbejdsgangen er fleksibel, idet disse analyser kan betragtes hver for sig eller i kombination afhængig af each givet forskningsspørgsmål forskellige undersøgere. Eksemplet data produceres som en del af et RNA-interferens (RNAi) eksperiment (figur 1). Små interfererende RNA oligonukleotider (siRNA) anvendes til knockdown specifikke proteiner i HCT116 human colorektale carcinomaceller, der resulterer i ændringer for to fluorescerende reportere af cyclin-afhængig kinase (CDK) aktivitet. Den CDK6-afhængige phosphorylering af nukleare retinoblastoma protein ved serin 780 (P-S780 RB1) bedømmes ved antistoffarvning. I de samme celler, er et grønt fluorescerende protein-mærkede reporter af CDK2 aktivitet (GFP-CDK2 reporter) vurderede ved sin kerne og cytoplasma forhold, hvor der ikke foreligger CDK2 aktivitet reporteren bosat i kernen og efter CDK2 aktivering pendulfart i cytoplasmaet 8. Derudover er nukleare DNA af hver celle farves ved anvendelse af en DNA-interkalerende farvestof, bisbenzimid, der tjener som et middel til at identificere celler og definere kerner grænser i billederne samt ensa foranstaltning DNA overflod give oplysninger om cellecyklus position af cellen (figur 2).
Aktiviteter CDK6 og CDK2 kan påvises som celler transit fra G1 til S-fasen af cellens cyklus 5 og lykkes hinanden 9,10, og som sådan, forventes tæt overensstemmelse mellem de to reportere i individuelle celler. Demonstrationen datasæt anvendes her analyser som eksempel virkningen af siRNA rettet mod CDK6, retinoblastoma protein (RB1) og en ikke-målrettet negativ kontrol (tabel 1). Knockdown af CDK6 bør fremkalde både et fald i P-S780 RB1 epitop og en akkumulering af celler i G1-fasen af cellecyklussen. Den RB1 knockdown tjener som reagens kontrol for specificiteten af phospho-S780 antistof. Fluorescensmikroskop billeder fra formalinfikseret 11 fluorescerende farvede HCT116 vævskulturceller anvendes til algoritmisk billedanalyse. Den resulterende numeriske data anvendes derefter tilkrydshenvisning de journalister og måle virkningen af de forskellige knockdown stater.
Den potentielle størrelse af de data, der produceres af denne type analyse kan præsentere en udfordring til normale analyseværktøjer. For eksempel kan den enkelte celle data være større end nogle regneark vil rumme. Inkluderet er Perl-scripts, der udfører simple, højt gentagne, overvåget behandling af data til støtte analyse af store datasæt. Perl scripts er skrevet specielt til output-filer produceret af Cell Profiler, når de behandler billedfiler med en bestemt fil navngivning (figur 3), og giver mulighed for variable antal felter pr godt, der skal anvendes i analysen. Det er ofte vigtigt at gate individuel celle assay data til at spore tendenser i cellesubpopulationer 5 og vist her er anvendelsen af en Perl script til flag hver celle baseret på et sæt gate forudbestemt for hvert assay type. Også inkluderet er valgfri Perl-scriptsder sammenfatter oplysningerne resultatet for de enkelte brønde (eller betingelser), leverer: procentdelen af celler inden for den fastsatte gate og middelværdier for de rå assay scoringer. Sidstnævnte, mere homogen måde at betragte data, er gyldig, når svarene påvirker alle eller de fleste celler i en brønd. Som diskuteret ovenfor, sådan vurdering er mindre nyttigt end den, som den enkelte celle data gating hvor svar er begrænset til en delmængde af celler i en population.
Anvendeligheden af den beskrevne arbejdsgang er ikke begrænset til perturbation af siRNA eller markør beskrevne assays. Undersøgelser har brugt denne metode til at analysere svarene i vævskultur eksperimenter med kombinationer af siRNA, kemiske inhibitorer og strålebehandling samt ved ansættelse af andre end CDK6 markører og CDK2 aktivitet 5.
Begrebsmæssigt den eksperimentelle strategi tillader en række biologisk anvendelige subcellulære regioner automatisk blive registrereti individuelle celler til stede i fluorescensmikroskop billeder. Som sådan kan denne tilgang give kvantitative, multiplex data afslører biologisk information, der kan være forpasset gennem teknikker, der fokuserer på befolkningen snarere end enkelte celler. Med mindre ændringer, kan den tilgang og analyse workflow beskrevet giver kvantitative, individuelle celledata for eventuelle fluorescens-baseret assay udgange og celle-biologiske responser, hvor kvantitativ vurdering af DNA-indhold, kvantificering af nukleare eller cytoplasmatisk fluorescens eller shuttling af markører mellem disse to rum enten individuelt eller i en multiplex måde er af interesse. Som udgivelse krav stigende tendens hen imod forelæggelse af åbent tilgængelig rådata, adgang til og fortrolighed med gratis værktøjer til mikroskopi billedanalyse såsom dem der er beskrevet her, vil også være af direkte interesse for laboratorier, der ønsker at reanalyze offentliggjorte data.
Protocol
1. Eksperimentel Perturbation og cellemærkning for respons Markers (Reverse Transfection siRNA Screen)
- I en steril vævskultur hætte pipette 70 pi 200 nM siRNA i 1x siRNA buffer i brønde i en steril, almindelig 96 brønds plade. Fortynd transfektion lipid i 40 volumener af serum-frit DMEM medier og dispensere 105 pi til hver brønd indeholdende siRNA.
BEMÆRK: Fortynding 262,5 pi lipid i 10,5 ml serumfrit DMEM giver en master mix egnet for en hel 96-brønds plade af siRNA, der leverer 2.6 pi lipid per brønd. Anvendelse af 200 nM siRNA starter koncentration på dette trin vil levere en arbejdsgruppe koncentration på 20 nM i trin 1.3, men procedurer vil arbejde for at arbejde koncentrationer ned til 5 nm, med start koncentration justeres i overensstemmelse hermed (dvs. 50 Nm). Lower arbejder koncentration kan reducere off-target falske positive resultater, selv om de kan reducere størrelsen af on target reaktion, hvilket fører til stigning i på udsigt til rentenedsættelsert af falsk negative. - Bland pladen ved forsigtig vibration i ti minutter ved stuetemperatur. Opdele de resulterende 175 pi i tre 50 pi replikater pr mål på en uigennemsigtig, vævskulturbehandlet, plade med 96 brønde med en gennemsigtig base.
- Reverse transficere ved dispensering 8.000 celler per brønd i 150 pi DMEM indeholdende 10% serum direkte på 50 pi lipid-siRNA komplekser. Brug HCT116 humane colorektale celler, der stabilt udtrykker GFP-mærket markør rapportering CDK2 aktivitet 5,8. Ingen yderligere blanding er nødvendig. Forsegl plade med en steril adhæsiv åndbar membran for at styre fugt og forhindre plade 'kant-effekter "og placere pladen i en befugtet inkubator ved 37 ° C, 5% CO 2 i 48 timer.
- Aspireres medierne, således at en lille restmængde af medier forbliver i brøndene. Fikseres cellerne ved tilsætning af 100 pi 4% bufret formaldehyd til hver brønd og inkuberes i et stinkskab i 10 minutter ved stuetemperatur temperatur.
- Fjern fikseringsopløsning ved at aspirere pladen. På dette tidspunkt enten standse eksperimentet ved at vaske pladen tre gange med 100 ul phosphatpufret saltvand (PBS) og derefter gemme forsegles under 100 pi PBS i mørke ved 4 ° C i op til en uge, eller fortsætte med permeabilisering af cellerne.
BEMÆRK: Vi anbefaler, forarbejdning plader så hurtigt som muligt efter fiksering, og generelt foretrækker opbevaring af fuldt forarbejdede plader. Biocidholdige konserveringsmidler, såsom thimerosal, natriumazid, eller kommercielle alternativer kan tilsættes for at forhindre micoroganismal vækst. Tilsætning af phosphataseinhibitorer bidrager til at bevare phospho-epitoper og andre midler til at bevare protein modifikationstilstande kan være nyttige i relevante assay sammenhænge - Fjern PBS fra pladen og permeabilisere cellerne ved tilsætning af 100 pi permeabilisering opløsning. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur uden omrystning. Aspirer permeabilization opløsning under anvendelse af en MultiCHAnnel pipette. Gentag dette trin tre gange.
- Bloker cellerne ved tilsætning af 100 pi blok opløsning per brønd i 30 minutter ved stuetemperatur. Fjern blok opløsning ved at aspirere pladen derefter sonde med 50 pi anti P-S780 RB1 antistof fortyndet 500-fold i blokken opløsning i 2 timer i mørke ved stuetemperatur.
- Vask pladen tre gange med 100 pi plade vaskeopløsning, hvorefter opløsningen på pladen i 5 minutter hver gang. Probe pladen natten over i mørke ved 4 ° C med 50 pi fluorescens-mærket sekundært antistof fortyndet 1000 gange i blok opløsning suppleret med 2 pM af chromatin-specifik DNA farvestof bisbenzimid. Vask pladen tre gange som før og opbevares forseglet under 100 pi PBS i mørke ved 4 ° C. Billede pladen inden for to uger.
2. Imaging og Billede Segmentering
- Brug en konfokal eller spinding disk fluorescensmikroskop med et 20X objektiv at tage separate 16-bit, gråskala TIFF-billeder i tre kanaler, der svarer til DNA farvestof, GFP og immunfarvning fluoroforer. Capture mange ikke-overlappende billedsæt, der omtales her som rammer, at billedet ca. 1.000-2.000 celler pr.
- Navn billedfilerne systematisk, således at hvert filnavn er en unik kombination af 'eksperiment navn', 'godt adresse', 'frame nummer "og" kanal identifier «, i denne rækkefølge (figur 3). Det eksempel datasættet bruger "Blue" (kromatin DNA-farvning) eller "Grøn" (GFP) eller "Rød" (den immuno-farvede fluorophor), som kanalen identifikatorer. Brønden adresse, billednummer og kanal-id er videre benævnes billedet metadata. Brug understregninger at undgå forvirrende godt og ramme metadata.
- Navngiv filer med disse metadata elementer i den angivne rækkefølge. Dette er nødvendigt for at sikre, at de efterfølgende software trin Correctly gruppe sæt billeder til analyse.
- Download og installer freeware Cell Profiler, Active Perl Community Edition, R statistiske programmeringsmiljø og RStudio. Accepter alle standardindstillinger under installationen; PC-brugere installerer Active Perl skulle sætte alle muligheder vedrørende PATH, filtypenavn forening og script kortlægning hvor du bliver bedt om. Active Perl er valgfrit for Mac-brugere, men de ellers bliver nødt til at køre Perl script i trin 3.2 fra Terminal kommandolinjen stedet for at bruge ikonet klikke.
- Åbn Cell Profiler-softwaren, skal du klikke på 'Filer', 'Import Pipeline' og derefter 'Fra fil "og vælg den fil 3_channels_pipeline.cppipe (figur S1A & S1B). Filen indeholder instruktioner, der er nødvendige for den software til at fortolke billedfilen metadata fra filnavnet konvention beskrevet. Cell Profiler nu relaterer billederne, uddrag nuklear DNA og antistof intensiteter fra these og bruger GFP kanal til at beregne forholdet af nuklear versus cytoplasmaintensitet for hver celle detekteres (figur 4 og 5).
- Klik på knappen 'Vis output indstillinger "i nederste venstre hjørne af cellen Profiler vinduet. På toppen af den nye skærm er tekstbokse mærket »Standard Input Folder" og "Standard Output Folder". En ad gangen, klikke på mappen-ikonerne til højre for disse bokse og vælg placeringen af billedfiler til analyse og destinationen for de udtrukne data, (figur S1C).
- Begynd billedanalyse ved at trykke på knappen 'Analyze Images' i nederste venstre hjørne af Cell Profiler. I bunden af skærmen observere den resterende tid for dataudtræk, den 'Stop Analysis "og" Pause' knapperne. Hvis det er nødvendigt at holde pause i analysen ved at vælge knappen "Pause" til enhver tid, hvilket er nyttigtnår du ser de billeder, der analyseres (beskrevet i trin 2.8).
- Eventuelt åbne vinduerne for nogen af billedanalyse trin ved at klikke på øje-ikoner i panelet på det yderste venstre i programvinduet (Figur S1D). Overhold den "IdentifyPrimaryObjects 'vindue, og dem for» sekundær «og» tertiære objekter' for at se, at de aktuelle indstillinger i Cell Profiler til at udføre billedet segmentering er egnede (se figur 1 og Diskussion om råd om at ændre disse indstillinger).
- Klik på "OK" i meddelelsen, der vises, når analysen er færdig. Gå til den placering "Standard Output Folder", hvor alle de datafiler med resultaterne gemmes som kommasepareret værdi (.csv) filer (Figur S2A).
3. Dataudtræk
- Find den nye fil "Nuclei.csv«, som er inkluderet blandt deoutput fra Cell Profiler. Denne fil indeholder individuelle celle data for fluorescerende nuklear antistof intensitet, nuklear DNA intensitet og GFP-CDK2 reporter forholdstallene (figur 6A & S2a).
BEMÆRK: Forskellige laboratorier vil ønske at behandle denne type data, der passer til arten af deres egne analyser. Foreslået for den aktuelle data er gating af cellerne fra hver behandling betingelse i henhold til de antistof data og GFP-CDK2 reporter værdier ved hjælp af den medfølgende Perl script '2_gate_classifier.pl «. - Kopier forudsat Perl script filen '2_gate_classifier.pl' i den samme mappe som den "Nuclei.csv 'fil data (figur S2A). Dobbeltklik på ikonet for Perl script og, når du bliver bedt, skal du skrive det fulde navn på den datafil, efterfulgt af en ".csv" filnavn navn til filen, hvor cellerne skal gated og endelig gate værdier for antistoffetfluorescens og GFP-CDK2 reporter data.
BEMÆRK: Sådan hovedsagelig bestemme gate indstillinger og anvende disse til analyse af data diskuteres nedenfor i repræsentative data sektion og figur 6 (til at analysere de data, forudsat anvendelse «0,004" og "1.5", henholdsvis). Mac-brugere skal køre Perl script fra Terminal kommandolinje ved at skrive: »perl 2_gate_classifier.pl«. - Overhold den nyoprettede fil, som kombinerer de rå individuelle celle assay værdier fra den oprindelige celle Profiler data med sub-population etiketter, der viser, hvordan hver celle fra hver brønd udfører mod begge porte (figur 6C).
- Plot dataene for hver eksperimentel tilstand ved hjælp af de enkelte cellesubpopulation etiketter ved at åbne RStudio software. Klik på 'File "og" Åbn fil ", og vælg derefter den medfølgende" analysis.r' fil. Overhold de kommandoer til at plotte figur 6B,
BEMÆRK: Hvis RStudio anvendes for første gang på en given computer, vil R grafik pakke «ggplot2" skal installeres først. Det er en gang kun skridt for en ny installation af RStudio, hvorefter dette trin bliver overflødig. For at installere "ggplot2«, klikke på fanen kaldet »Kolli 'over vinduet i nederste højre hjørne af RStudio klikke på knappen" installere pakker', der vises under dette. Et nyt vindue vises. Skriv 'ggplot2 «(udelade citater) ind i" pakker "stempo i denne nye vindue og til sidst klikke på knappen "Installer" for at lukke vinduet, installere de nødvendige ggplot2 funktioner og vende tilbage til den vigtigste RStudio vinduet for at fortsætte fra trin 3.6. - Fremhæv linjer 1 til 17 i det øverste venstre vindue RStudio, og klik derefter på "Kør" knappen. Dette træder de eksperimentelle data, tærskelværdier og godt placering detaljer i R (figur S2C). R vil nu midlertidigt holde de relevante data for plotning.
- Fremhæv enkelte blokke af den resterende kode under linje 17 og skabe de tilsvarende parceller ved at klikke på "Kør" knappen som før. Overhold plots i vinduet i det nederste højre hjørne af RStudio og spar antal formater ved at klikke på 'Export' knappen (Figur S2D).
- Mens lukning RStudio Klik på 'Gem ikke ", når du bliver bedt om. Dette forhindrer forvirring på næste brug af RStudio, som ellers vil holde datafra det foregående møde.
Representative Results
Eksemplet sæt billeder dannet ved anvendelse af reverse-transfektion siRNA screening protokol er blevet udarbejdet og analyseret ved anvendelse af Cell Profiler software. Den resulterende numeriske rådata er sådan, at hver celle er individuelt repræsenteret, spores tilbage til sit image og godt for oprindelse og målt for flere fluorescens intensitet parametre (figur 6A). For hver celle identificeres middelværdien nukleare fluorescensintensitet for P-S780 RB1 antistof og det integrerede DNA til DNA dye defineret nukleare masker intensitet bestemmes. Mean GFP intensitetsværdier for nucleus og cytoplasma regioner i hver celle, registreres også tillader beregning af nukleare versus cytoplasmisk fluorescens af GFP-CDK2 reporter. Nedstrøms for disse algoritmisk fluorescensintensitet målinger gøres brug af disse individuelle celle data til at definere gates to assays, nuklear antistof farvning og GFP-CDK2 reporter. Efterfølgende annotation af cellerne på the basis assay resultat og anvendelse af disse etiketter for at aktivere specifikke subpopulationer skal yderligere kendetegnet ved en tredje måling (indhold nuklear DNA) er beskrevet.
Histogram plots af de rå fluorescensintensitet data indsamlet for hver analyse er en effektiv måde at vurdere, hvordan cellesubpopulationer opfører under forskellige forhold. Histogrammerne i figur 6B viser befolkningen fordelinger af individuelle celle data fra tredobbelte brønde for hver RNAi knockdown tilstand. Til venstre er dataene for nuklear antistof intensitet og til højre er de tilsvarende data for GFP-CDK2 reporter. P-S780 RB1 antistof data afslører, at cellerne i store træk findes i to populationer med hensyn til denne post-translationel modifikation, og at cellepopulationer med tab af RB1 phosphoryleres på S780 kan skelnes som en venstre top af nukleart intensitet som er beriget når CDK6 bliver slået ned af siRNA. Samme venstre topses når RB1 selv er RNAi mål, hvilket afspejler den direkte fjernelse af proteinet og dermed P-S780 RB1 farvning. I modsætning hertil de samme eksperimentelle betingelser for de samme celler, når de observeres via GFP-CDK2 reporter assay, viser en anden dynamik i den enkelte celle data. Der observeres en kontinuert fordeling, med kun en enkelt top, men siRNA som forstyrrer cellecyklussen (siCDK6) og forårsager ophobning i G1-fasen resulterer i en forlængelse af den højre skulder af denne fordeling (dvs. indikerer øget tilstedeværelse af celler, der viser en øges i den nukleare / cytoplasma GFP forholdet afbildet på X-aksen).
Også vist på histogrammer i figur 6B er porten værdier (lodrette søjler), der er valgt på baggrund af fordelingerne af begge sæt assay data. Reglen anvendes til P-S780 RB1 antistof data er at definere gate position som den halve højde: maksimal bredde position på venstre skulder af de vigtigste(Til højre) peak, når man overvejer de negative kontrol celle data (ikke-targeting siRNA). Data, fremhævede røde er celler med reduceret og fraværende P-S780 RB1, der er identificeret med denne port. En lignende gate placeret på den modsatte skulder forholdet værdi fordeling anvendes til GFP-CDK2 reporter. De resulterende høje forholdet delpopulation celler, som mangler eller nedsat funktion CDK2 aktivitet, er vist med grønt. For at illustrere multiplex analyse af de to analyser Figur 6C viser gennemførelsen af begge gate værdier ved hjælp af 2_gate_classifier.pl Perl-script til at konvertere de rå data (figur 6A) i den kommenterede fil nedenfor. Denne nye fil indeholder de originale data sammen en ny søjle af klasse etiketter til hver celle, og de to gate værdier, der anvendes til at skelne dem (i dette tilfælde porte 0,004 for antistof data og 1,5 for GFP-CDK2 reporter blev anvendt henholdsvis) .
Efter at have klassificeret de enkelte celler fFigur 7 viser scatter plots af den enkelte celle data for P-S780 RB1 og GFP- rom hver knockdown stand på grundlag af de to analyser er det nu muligt at anvende disse klasse etiketter for at bistå annotation af afbildninger af assay data. CDK2 analyser fra eksemplet datasæt for alle tre RNAi forhold. Numbers udfyldelse kvadranter på scatterplots viser de relative procentdele af hver låge subpopulation hele for at knockdown kontekst og genereres i R ved hjælp af klasse mærker, der er beskrevet ovenfor. Disse plots viser, at sammenlignet med celler transficeret med ikke-targeting siRNA (figur 7B), celler transficeret med siCDK6 afslører en netto datadistribution forskydes både nedad på Y-aksen (hvilket indikerer fravær af RB1 phosphorylering ved serin 780) og til højre på X-aksen (hvilket indikerer lav CDK2 aktivitet, figur 7C). Begge disse skift ventes til knockdown af målet. I modsætning til dette, data fra SirB1 transficerede celler (figur 7A) viser et tab af antistoffet farvning i overensstemmelse med tab af epitop, men ringe effekt i data fordelingen for CDK2 reporter sammenlignet med kontroller transficeret med ikke-targeting siRNA, hvilket tyder på nogen stor effekt på GFP -CDK2 reporter skyldes RB1 knockdown.
For yderligere at undersøge brugen af enkelte celle data, delpopulation klassificering og assay multiplexing Figur 8 viser scatter plot for siCDK6 data fra figur 7C sammen med parrede histogram profiler til integrerede DNA intensitet. Parrene af histogrammer vedrører modsatrettede halvdele af hele befolkningen, fordelt på grundlag af enten antistof intensitet (til højre på Scatterplot) eller GFP-CDK2 reporter forholdstallene (over Scatterplot). Kvantificering af disse befolkningsgrupper nukleare DNA intensitet viser to toppe karakteristiske for 2N og 4N DNA-indhold som venstre og højre toppe, hhv. Den intentions af portene, der er vist i figur 6, 7 og 8 er sådan, at celler identificeres som lavt for P-S780 RB1 (mærket: P-S780-) eller med et højt forhold værdi fra GFP-CDK2 reporter (mærket: G1) vil være i G1-fasen af cellecyklussen. Faktisk er de dna-profil histogrammer for subpopulationer identificeret med en af disse analyser overvejende indeholder celler med 2N DNA-indhold. DNA-profiler af modsat gated befolkning (mærket: P-S780 + eller Non-G1) indeholder celler med distributioner spænder fra 2N til 4N, i overensstemmelse med sådanne celler vedtage en række cellecyklus positionerer post-G1 fasen.
Selvom fokus her har været produktion og analyse af de enkelte celle data fra fluorescens farvede billeder, er det også nyttigt at være i stand til at tage disse oplysninger og opsummere hver analyse på et godt-for-godt grundlag for at overvåge variabilitet mellem gentagelser og ydeevne af alle brøndene i en given assay i en hel plade af data.
Figur 1:. Oversigt over trinene i arbejdsgangen til kvantitativt analysere fluorescensmærkede mikroskop billeddata er Arbejdsgangen er repræsenteret her som fire trin (A) Først er det nødvendigt at eksperimentelt forberede celler til fluorescerende billeddannelse.. Den her beskrevne eksempel er enskærm, hvor siRNA-behandlede adhærente humane tumorceller dyrkes i 48 timer, fikseret og farvet på en 96-brønds vævskulturplade. Forskellige RNAi betingelser er til stede i tre eksemplarer i separate brønde i pladen. Celler farvet med en DNA-farvestof, et antistof specifikt for RB1 phosphoryleret på CDK4 og 6 selektiv målsted Serine-780 (P-S780 RB1), og de også stabilt udtrykker GFP-CDK2-reporter, rapportering G1 cellecyklus exit. Kollektivt disse fluorescerende prober udgør to assays særskilt vurderes i arbejdsgangen. (B) Parallelle mikroskop billeder for hver fluorescerende probe (kanal) genereres og navngivet som at indeholde oplysninger, som billedet analyse software kan organisere data. (C) Den billedfiler indlæses i Cell Profiler software, som algoritmisk identificerer individuelle celler og de tilknyttede par af kerner og cytoplasma før gav intensitetsmålinger for de tre fluorescerende prober opdageed i hver. (D) Endelig er en Perl-script bruges til at organisere de rå kvantitative producerede data. Dette trin gælder portene til fluorescensintensiteten data for hver celle, effektivt binning cellerne i subpopulationer, der kan plottes, spores og krydsforhøres. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2: Eksperimentelle data, der skal opnås ved billedanalyse De faste, siRNA-behandlede, fluorescens-mærkede celler fra eksemplet datasæt blev afbildet og tilsvarende intensitet målinger per celle.. Repræsentative billeddata er vist for hver parameter registreret under billedanalyse (A) Nuclear DNA intensitet:. Intensiteten af farvningen af nuklear DNA farvestof anvendes til opnåelse af en måling af DNA pr kernen (B) Nuclear intensitet phospho-RB1:. immunofarvning specifikt for P-S780 RB1 anvendelse af en primær (sort) antistof og fluorescens-mærkede sekundære antistof (rød) muliggøre en intensitet måling af RB1 phosphorylering ved . S780 per nucleus (C) GFP-CDK2 reporter: De anvendte celler stabilt udtrykker GFP-mærket reporter protein, der translokerer mellem kernen og cytoplasmaet i et sæt mønster med cellecyklussen. Dual måling af parrede nuklear og cytoplasmisk GFP for hver celle intensitet muliggør beregning af et forhold per celle, der kan anvendes til at skelne G1-fasen fra resten af cellecyklussen. Tre siRNA mål vil blive brugt til at illustrere analysen; en ikke-målrettet negativ kontrol siRNA; CDK6 siRNA som en positiv kontrol i forstyrrende RB1 phosphorylering og cellecyklus fremskridt; RB1 siRNA at etablere antistofspecificitet.k "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3: Organisation billedfiler før billedanalyse billeder taget fra vævskulturplade navngives systematisk for at give billedet analyse software at relatere de billeddata tilbage til den oprindelige eksperimentelle sammenhæng.. Denne information er placeret inden filnavnet for hvert billede. (A) Da hver brønd på eksperimentet pladen kan svare til forskellige RNAi mål eller behandlinger, brønden adresse er en del af filnavnet. (B) Rammen nummer er en del af filnavnet . som hver brønd afbildes at indsamle flere, ikke-overlappende rammer (C) fluorescerende prober fra hver ramme afbildes separat; følgelig filnavnene også nødt til at afspejle, hvilken kanal hvert billede vedrører.
Figur 4:. Anvendelse af Cell Profiler til at måle nukleare DNA og antistoffarvning med indstillingerne i den medfølgende pipeline fil (3_channels_pipeline.cppipe) cellen Profiler Billedanalyse software foranstaltninger Fluorescensintensitet værdier for nuklear DNA og antistof-binding vedrørende individuelle celler . (A) Kerner er identificeret i den »blå« kanal billede af farvede DNA. (B) < / Strong> Placeringen af DNA farvede kerner midlertidigt holdes i en "Kerner maske". Kernerne maske derefter lagt oven på (C) de blå og røde kanal billeder (DNA og antistoffluorescens data, henholdsvis) og fluorescensen værdier fra billedet segmenter, der overlapper med masken registreres for hver identificeret celle. Vellykket identifikation af separate, tilstødende kerner kan vurderes visuelt i udseendet af Nuclei maske. Til illustration vist kredsede i denne maske billede, er eksempler, hvor de valgte indstillinger for algoritmen har mis-identificerede tilstødende kerner som en enkelt kerne. Justering algoritmen indstillinger for at minimere disse hændelser er indført i Discussion afsnit. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
/ftp_upload/51882/51882fig5highres.jpg "/>
Figur 5: Anvendelse af Cell Profiler at måle nukleare og cytoplasmiske GFP intensiteter GFP-mærkede CDK2 reporter translokerer mellem kernen og cytoplasmaet i forhold til cellecyklus position af cellerne.. På samme tid, Cell Profiler beregner DNA- og antistof nukleare intensiteter per celle (Figur 4), beregner også den nukleare til cytoplasma forholdet GFP intensiteter for hver celle. (A) DNA-farvestof data for hvert billede anvendes til at generere en Kerner maske. (B) Cell Profiler anvender Nuclei maske i forbindelse med GFP billede fra GFP-CDK2 reporter til frø positionen af hver celle, og derefter udvider til hver celle perimeter at estimere hele fodaftryk af hver celle. Dette bliver en ny, "Cell maske. (C) kerner maske subtraheres fra Cell maske til dannelse af en donut-lignende serie af cytoplasma skitserer, som bliverden "Cytoplasma maske". (D) kernerne maske og cytoplasma maske bruges af Cell Profiler til at måle par af nukleare og cytoplasmiske værdier GFP. Disse parrede værdier anvendes derefter ved Cell Profiler til at beregne nøgletal, der informerer om, hver celle position i cellecyklus. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 6:. Dataudtræk - Behandling individuelle celledata rå ved at pålægge porte på analyseværdier Biologiske tendenser fra den enkelte celle data for antistoffarvning og GFP-CDK2 reporter assays er udvundet ved hjælp af gated data. Histogrammer for de rå data gør det muligt at identificere egnede gate værdier. Disse bliver så pålagt med en Perl script. (A)slutprodukt med at analysere de billedfiler med de medfølgende Indstillinger for Cell Profiler er kommasepareret værdi (.csv) filer. Disse filer c ontain individuelle celle data vedrørende hver af de forskellige sub-cellulær segmenter. Filen 'Nuclei.csv "indeholder alle de valgte målinger i forbindelse med brug af Nuclei masken. Disse målinger omfatter nuklear antistof intensitet, nuklear DNA intensitet og GFP-forholdet (kerne / cytoplasma). (B) histogrammer af nuklear antistof intensitet (til venstre) og GFP-CDK2 reporter forhold (til højre) plottet fra individuelle celle data for hver siRNA knockdown tilstand . Søjlerne på det viste histogrammer viser de ønskede gate positioner for disse assays. Farvede oplysninger om histogrammer angiver gated subpopulationer. (C) Portene for de to analyser er illustreret i B anvendes på de rå data ved hjælp af Perl-script '2_gate_classifier.pl «. Scriptetopretter en modificeret kopi af filen oprindelige Cell Profiler output (Nuclei.csv) at bistå efterfølgende plotning. De to gate værdier registreres i den nye fil (fremhævet i farver her), og der tilføjes en ny kolonne "Label". Den etiketter bin hver celle i en af fire mulige undergrupper baseret på to gated analyseværdier for hver celle. Disse mærkater er anvendt i efterfølgende parceller som byder beregninger af bidragene fra hver delpopulation og sammenholdelse af yderligere parametre, der genereres i Cell Profiler. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 7:. Scatter plots for hver siRNA tilstand skildrer rå data for de enkelte celler og gate positioner Scatter plot af indobbelt celle data fra alle billeder for siRNA betingelser anført: (A) siRB1, (B) Sinon målretning negativ kontrol (C) siCDK6. Plottet mod Y-akser er værdier for nuklear fluorescens fra anti-P-S780 RB1 farvning. Afbildet mod X-akserne er det tilsvarende forhold, der er beregnet fra GFP-CDK2 reporter. De røde og grønne søjler indikerer positionerne af portene for P-S780 RB1 Tor og GFP-CDK2 reporter porte hhv. De to porte opdele cellerne i fire subpopulationer og numrene over resulterende kvadranter er procent antal celler fra hver af disse. Anmærkninger omkring akserne for A angiver de fire mulige label-elementer, der anvendes til hver celle af 2_gate_classifier.pl Perl script. Disse etiketter er vist i forhold til deres respektive assay gate og anvendes i R-script (analysis.r) til at generere plottene i figur 6, 7 og
Figur 8: cellesubpopulationer defineret af de to G1 transit analyser viser 2N og 4N DNA-profiler i overensstemmelse med assay resultat Scatter plot af data for siCDK6 celler gentages fra figur 7C.. Omkring punktdiagram er histogrammer for integreret nuklear DNA intensitet vedrørende undergrupper af befolkningen. De ovenfor Scatterplot vedrører GFP-CDK2 reporter assay. De til højre for Scatterplot vedrører nukleare phospho-RB1 antistof målinger alene. De farvede gate linjer er udvidet til at vise deres forhold til de histogrammer. Gate etiketter, hvorved celle data blev udvalgt til disse yderligere grunde er også vist. Celler med tab af RB1 phosphoryleret på serin 780 (P-S780-) eller dem med en høj GFP-CDK2 reporter kerne og cytoplasma ratio (indikerer lav CDK2 aktivitet) viser overvejende 2N-lignende DNA-profiler, mens deres modsatte kolleger for hver respektive assay viser en fordeling af 2N og 4N, karakteristisk for en blandet, post-G1 fasen population af celler. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 9: Oversigt plots af gated analyseværdier for hver siRNA tilstand summariske data plots af gated (A) P-S780 RB1 data og (B) GFP-CDK2 data fra tredobbelte brønde for hver siRNA knockdown stand.. Værdier blev beregnet ud fra den rå Cell Profiler output (Nuclei.csv) under anvendelse afPerl-scripts, "antibody_fluorescence_summary.pl« (A) eller »G1assay_summary.pl« (B). De plottede værdier er middelværdier af procent celler i porten anvendes til hvert assay. Søjler angiver standardafvigelser beregnet ud fra tredobbelte brønde. Uparrede, homoscedastic t-test P-værdier for hver knockdown tilstand sammenlignet med ikke-targeting siRNA er vist over de plottede data hvor P <0,001 (**) og P <0,05 (*). Klik her for at se en større udgave af dette figur.
Figur S1. Opsætning Cell Profiler software til billedanalyse. (A) Screenshot af Cell Profiler før nogen indstillinger billedanalyse indtastes. (B) Screenshot af Cell Profiler efter algoritmen detaljer i '3_channels_pipeline.cppipe' er blevet indlæst. Den høje tændte fanen i øverste venstre hjørne angiver, at denne skærm viser de parametre for "LoadImages 'stadium af analysen. Ved at klikke på de øvrige dele af listen nedenfor dette vil afsløre detaljerne for de efterfølgende trin i analysen. (C) Screenshot af Cell Profiler med informationer til Input Folder og Output Folder indtastet. (D) Screenshot af Cell Profiler efter "Analyser knap billeder 'er blevet klikket for at begynde analysen. Indlagt er tre nye vinduer illustrerer algoritmisk producerede masker genereret af softwaren fra billederne under analyse. Disse vinduer er adgang til ved at klikke på "øje" ikoner til åben position ved siden af de relevante trin i analysen, i det øverste venstre hjørne af den vigtigste Cell Profiler vindue. Disse synspunkter hjælpe brugeren til at kontrollere, om de indstillinger, der resulterer i de konfetti-farvede masker enige med de ledsagende, original, gråtonedata.
ent "> Figur S2. Anvendelse af Perl og RStudio til gate individuel celle data og plot de resulterende cellesubpopulationer. (A) Højre panel viser den valgte at modtage output .csv filer (grønne ikoner) fra cellen Profiler analyse mappe. Perl scripts leveres med manuskriptet (blå ikoner) kopieres til denne mappe. fremhæves, er den "2_gate_classifier.pl" Perl-script, som har været dobbelt-klikket med musen for at fremstille dialogboks i panelet til venstre. Vist er det prompter og tilsvarende maskinskrevne svar er nødvendige for at gate den enkelte celle data fra "Nuclei.csv" fil. (B) Screenshot af RStudio umiddelbart efter indlæsning af "analysis.R" script. Fremhævet er de kommandoer til at uploade gated data fra A til softwaren før plotte (note detaljer i linje 5 og 6 skal justeres i forhold til, hvor gated data er placeret på Computer anvendes til analyse). (C) Screenshot af RStudio når data er blevet uploadet. (D) Screenshot af RStudio viser fremhævede blok af kode kræves for at producere plottet vist i det nederste højre vindue. Koder for hver parcel er adskilt af tomme linjer og grupperet efter type plot.| siRNA mål | Plate og adresser |
| Ikke-targeting (NT) | E5, F5, G5 |
| Retinoblastoma (RB) | E7, F7, G7 |
| Cyclinafhængig kinase 6 (CDK6) | B2, C2, D2 |
Tabel 1: Nå adresser og tilsvarende siRNA betingelser, der anvendes i eksemplet datasæt.
Discussion
Den beskrevne arbejdsgang udgør en procedure for brønde perturbance af celler under anvendelse af siRNA efterfølgende markør påvisning og endelig anvendelse af en serie af software-støttede foranstaltninger for at lette ekstraktion af kvantitative data fra de resulterende fluorescerende mikroskopi billeder. Fremgangsmåden er fokuseret på levering af nukleare og cytoplasmiske værdier intensitet for de enkelte celler, som har bred praktisk anvendelse i mange celle-baserede applikationer. Eksemplet data, der anvendes her blev genereret i en siRNA-skærm indstilling, hvor to fluorescerende assays for G1 fasen cellecyklus transit er testet og korreleret tilbage til en mere direkte biofysisk mål for indhold nukleare DNA.
Brugen af et fluorescerende DNA plet på billedet nukleare DNA er et nødvendigt skridt i billedet segmentering proces, da det giver mulighed for identifikation af de enkelte celler og den deraf »Kerner maske" tjener som udgangspunkt for identifikation af tilsvarende cytoplasmiC-regionerne. GFP-mærkede CDK2 reporter, som er stabilt udtrykt i cellerne, giver en variabel endnu konsekvent højere end baggrund signal i cytoplasmaet, som dette rum kan afgrænses. Samme analyse rørledning bør gælde for analysen af protein translokation begivenheder ved hjælp af andre egnede fluorescens-linked journalister og deres reaktion på perturbance. Også ville erstatte GFP-CDK2 reporter med cytoplasma-specifikke fluorescerende farvestoffer tillade alternativ anvendelse af denne algoritme til at måle dimensionerne af cytoplasmaet og de relative størrelser af cellerne i billederne.
Et andet design overvejelse i billedet segmentering strategi er beskrevet her er anvendelsen af Cell Profiler at levere integrerede intensitet værdier for DNA kvantificering. Integration af intensiteten værdier for kerne-DNA farvning data giver mulighed for mulige variationer i nucleus størrelse, og repræsenterer en tæt match til kvantificering profiler setfor propidiumiodid farvede FACS data. Dog kan integrerede intensitet ikke et passende middel til at vurdere protein funktion, hvor gennemsnitlig koncentration, eksemplificeret ved gennemsnitlig intensitet af antigen fluorescens, er mere biologisk relevant end den integrerede totale mængde protein (og tilhørende fluorescens) i en celle rum. Derfor betyder intensitetsværdier blev anvendt til P-S780 RB1 og GFP data. Muligheden for at ændre mellem de to tilstande (gennemsnit eller integreret) af data vurdering findes på "ExportToSpreadsheet 'panel af cellen Profiler-softwaren.
Indstillingerne Analysen i 3_channels_pipeline.cppipe filen er optimeret til billederne i sættet eksempel data. Analyse af nye billeder sæt med denne protokol vil kræve, at filnavnene vedtage navngivningskonventionen beskrevet ovenfor (Figur 3). Også følsomhed værdier lysstyrken passer nuklear DNA-farvning og tærskler for baggrundintensiteter i det nye billede sæt kan være nødvendigt at justere i cellen Profiler indstillinger. I betragtning af den centrale rolle, DNA-farvning holder til opbygning af de forskellige billede segmentering masker, anvendelse af korrekte følsomhedsindstillinger for denne kanal er nøglen til en vellykket analyse af nye billeddata med Cell Profiler-softwaren. Den angivne Cell Profiler indstillingsfil (3_channels_pipeline.cppipe) indeholder noter om de hyppigst nyttige parametre for at tilpasse analysen til nye data. Disse noter er i tekstfeltet øverst på skærmen i Cell Profiler hovedvinduet og indeholder vejledning om at ændre følsomhedsindstillinger og justere antallet af kanaler, der skal analyseres. Som tiltalt i protokol afsnit 2.8, for at teste indstillingerne for nye billeddata kan det være nødvendigt at observere segmentering billedet under billedanalyse ved at klikke Åbn "øje" ikoner for hver af de "Identificer ... objekter 'protokoltrin (figur S1D
Den rå produktion af individuel celle data fra Cell Profiler kan analyseres på forskellig vis, der passer til behovene i andre undersøgelser. Vist her er brugen af et Perl-script til at anvende porte til to af de parametre, der måles pr celle for at hjælpe udvinde biologiske tendenser fra data end tillader sammenholdelse af de identificerede undergrupper med yderligere målinger. Selv om det er lige så muligt at inkludere elementer af gating inden for rammerne af Cell Profiler, den alternative rute her anvendte giver større fleksibilitet og hastighed, især hvis store datasæt skal vurderes. Den langsomste stadium af post-billedoptagelse faser af den gældende protokol er driften af Cell Profiler-softwaren. Cell profiler her køres uden at pålægge porte til at frembringe et un-gated rå datasæt, som kan analyseres igen med efterfølgende Perl script hurtigere og, om nødvendigt, iterativt med forskellige gate værdier. Ikke alle undersøgelser vil vide på forhånd egnede gate værdier som kan variere med reagenser på en given datasæt, og potentielt over tid. Det anbefales derfor at generere histogrammer skildrer de rå data fordelingen opnået fra Cell Profiler for positive kontrol og mock-forstyrrede celler for at identificere egnede gate values for parametrene af interesse.
Perl scripts er skrevet til at acceptere et stift defineret kolonne struktur af data fra Cell Profiler og kan holde op med at arbejde, hvis en bruger ændrer antallet af parametre output ved Cell Profiler med 'ExportToSpreadsheet' indstillinger. At hjælpe med at gennemføre en ændring af indstillingerne toner er inkluderet i Perl script-filer. For at se disse se scriptet i en teksteditor, helst en programmør tekst editor indstillet til farve kode Perl elementer (f.eks http://www.activestate.com/komodo-edit). Disse noter angiver, hvor at tilpasse scriptet til at tilpasse sig ændringer i dataformat. Svarende til Perl-scripts, R-kode fil forudsat (analysis.r), der indeholder instruktioner til at plotte tallene fra billedanalyse data, kan læses i en teksteditor eller RStudio software til at se yderligere Bemærkninger om brug og tilpasning. Disse notater kan suppleres med oplysninger om regulære udtryk og Perl <sup> 12 og ggplot2 13 pakke til R, som begge danner grundlag for, hvordan data læses, kommenteret og plottet hhv.
Nye undersøgelser under anvendelse af fluorescens mikroskopi samt rådata deponeret med open source publikationer er modtagelige for analysemetoder såsom dem beskrevet her. Selve karakteren af høj dataindhold egner sig til rekursive analyse med forskellige analytiske betoninger afhængigt forskning interesser en given observatør. Selvom de spørgsmål, der kan stilles til de data er begrænset af proberne oprindeligt anvendte, billeddata kan ofte meningsfuldt genanalyseret uden for rammerne af de undersøgelser, som har frembragt dem.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud CRUK 15.043 og CRUK 14.251.
Vi takker Daniel Wetterskog og Ka Kei Ho til faglig bistand og kritisk læsning af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AllStars negative control siRNA | Qiagen | 1027280 | Negative control siRNA. |
| CDK6 siRNA | Dharmacon/ Custom synthesis | NA | Antisense sequence: 5' CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU |
| RB1 siRNA | Dharmacon/ Custom synthesis | NA | Antisense sequence: 5' GGUUCAACUACGCGUGUAATT |
| 5x siRNA buffer | Thermo Scientific | B-002000-UB-100 | To be diluted with nuclease-free, non-DEPC treated water. |
| Nulcease-free water (non-DEPC) | Applied Biosystems | AM9937 | For dilution of siRNA buffer. |
| Hiperfect | Qiagen | 301705 | Transfection lipid. |
| DMEM | Life Technologies | 41966052 | Pyruvate and high-glucose supplemented tissue culture media. |
| 96 well tissue culture plate | Falcon | 3072 | Plain, 96 well tissue culture plate for the parallel, compartmentalized mixing of transfection complexes. |
| Packard Viewplate | Perkin Elmer LAS | 6005182 | 96 well TC plate with optical base on which cells are transfected, grown, fixed and eventually imaged. Supplied with opaque, adhesive plate seals, which are used during storage of used plates. |
| Breathable membrane | Alpha Labs | LW2783 | Sterile, gas-permeable, adhesive membrane. |
| Neutral buffered formalin, 10% | Sigma-Aldrich | HT5012-1CS | 10% Formalin (4% formaldehyde) fixative used neat in protocol. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100PC | Non-ionic detergent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | Trizma base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | For plate wash solution. |
| Anti-P-S780 RB1 antibody | Abcam | ab32513 | Rabbit monoclonal |
| AlexaFluor647 Anti-rabbit | Invitrogen | A21245 | Highly cross-adsorbed, fluorescently labelled secondary antibody. |
| Hoechst 33342 (Bisbenzimide) | Sigma-Aldrich | B2261 | Fluorescent, chromatin-intercalating, DNA dye. |
| Permeabilization solution | NA | NA | 0.1% Triton X-100 in 50 mM Tris-buffered saline, pH 8.0. |
| Plate wash solution | NA | NA | Tris-buffered saline containing 0.1% Tween-20. |
| Block solution | NA | NA | 5% powdered milk in Tris-buffered saline and 0.1% Tween-20. For blocking plate prior to immuno-staining and dilution of antibodies. |
| Cell Profiler 2.1 | Broad Institute | http://www.cellprofiler.org/download.shtml | |
| Active Perl Community Edition | ActiveState | http://www.activestate.com/activeperl/downloads | |
| R programming environment | The R Foundation | http://www.r-project.org | |
| Rstudio | Rstudio | http://www.rstudio.com/ |
References
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100 (2006).
- Khan, A., Eldaly, H., Rajpoot, N. A gamma-gaussian mixture model for detection of mitotic cells in breast cancer histopathology images. J Pathol Inform. 4, 11 (2013).
- Selzer, P., Beibel, M., Gubler, H., Parker, C. N., Gabriel, D. Comparison of multivariate data analysis strategies for high-content screening. J Biomol Screen. 16 (3), 338-347 (2011).
- Lyman, S. K., et al. High content, high-throughput analysis of cell cycle perturbations induced by the HSP90 inhibitor XL888. PLoS One. 6 (3), e17692 (2011).
- Richardson, E., Stockwell, S. R., Li, H., Aherne, W., Cuomo, M. E., Mittnacht, S. Mechanism-based screen establishes signalling framework for DNA damage-associated G1 checkpoint response. PLoS One. 7 (2), e17692 (2012).
- Heynen-Genel, S., Pache, L., Chanda, S. K., Rosen, J. Functional genomic and high-content screening for target discovery and deconvolution. Expert Opin Drug Discov. 7 (10), 955-968 (2012).
- Krausz, E.
- Gu, J., Xia, X., et al. Cell Cycle-dependent Regulation of a Human DNA Helicase That Localizes in. DNA Damage Foci. Mol Biol Cell. 15 (7), 3320-3332 (2004).
- Mittnacht, S.
- Mittnacht, S. The retinoblastoma protein--from bench to bedside. Eur J Cell Biol. 84 (2-3), 97-107 (2005).
- Nybo, K.
- Schwartz, R. L., Foy, B. D., Phoenix, T. Learning Perl - Making Easy Things Easy and Hard Things Possible. , 6th ed, O'Reilly Media. 1-363 (2011).
- Wickham, H. ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , Springer. New York. 978-970 (2009).
