Summary
Beskrevet her er en metode for å detektere og kvantifisere mitokondrie ytre membran proteiner ved immunolabeling av mitokondrier isolert fra gnager vev og analyse av flowcytometri. Denne metoden kan utvides til å vurdere funksjonelle aspekter av mitokondrielle subpopulasjoner.
Abstract
Metoder for å oppdage og overvåke mitokondrie ytre membran proteiner komponenter i animalske vev er viktig å studere mitokondrie fysiologi og patofysiologi. Denne protokollen beskriver en teknikk hvor mitokondriene isolert fra gnager vev immunolabeled og analysert ved strømningscytometri. Mitokondriene er isolert fra gnager ryggmargen, og utsettes for en hurtig anrikning trinn slik som å fjerne myelin, en viktig forurensning av mitokondrielle fraksjoner preparert fra nervevev. Isolerte mitokondrier blir deretter merket med et antistoff for valg og et fluorescensmerket konjugert sekundært antistoff. Analyse ved strømningscytometri verifiserer den relative renhet av mitokondrielle preparater ved farging med en mitokondriell bestemt fargestoff, etterfulgt av deteksjon og kvantifisering av immunolabeled protein. Denne teknikken er rask, kvantifiserbare og høy gjennomstrømning, noe som åpner for analyse av hundretusener av mitokondrier per prøve. Det er aktuelt å vurdere romanen proteins på mitokondrie overflaten under normale fysiologiske forhold samt proteiner som kan bli mislocalized til dette organelle under patologi. Viktigere, kan denne metoden bli koplet til indikator fluorescerende fargestoffer for å rapportere om visse aktiviteter av mitokondriale subpopulasjoner, og er mulig for mitokondrier fra sentralnervesystemet (hjerne og ryggmarg), så vel som leveren.
Introduction
Mitokondrier er svært dynamiske organeller som gjennomgår flere runder med fisjon og fusjon, er fraktet til steder av høy etterspørsel etter energi og reagere raskt på fysiologiske stimuli en. Siden det er i økende grad anerkjent at mitokondriene innenfor ulike vev, selv ulike cellulære avdelinger, har forskjellige funksjonelle profiler, nye metoder for å identifisere disse forskjellige mitokondrielle undergrupper.
Mikros gir et middel hvorved de enkelte mitokondriene kan visualiseres og tilstedeværelsen av et protein ved eller i mitokondriene kan bli bestemt ved immunfluorescens 2. Imidlertid, kvantitativ analyse av denne metoden er arbeidskrevende og er mer egnet for forsøk med udødeliggjort eller primære cellelinjer. Studiet av individuelle mitokondrier stammer fra vev er betydelig vanskeligere og de fleste metodene ikke tillate for enkel identifisering av mitokondrie undergrupper samtidig med evaluasjon av mitokondriell funksjon 3.
For å løse dette hinderet, en ny metode for å immunolabel mitokondriene isolert fra gnagere vev og senere analysert ved flowcytometri har blitt utviklet. Dette gir mulighet for rask påvisning og kvantifisering av proteiner lokalisert til den mitokondrielle ytre membran, som i forhold til analyse ved mikroskopi, er mye mindre arbeidskrevende og tillater analyse av tusenvis av mitokondrier i en enkelt prøve. Denne analysen kan brukes til å overvåke skjebnen og relativ mengde av mitokondrie ytre membranproteiner som er tenkt å være tilstede konstitutivt i mitokondriene, rekruttering av proteiner til det mitokondrielle overflaten, eller påvisning av proteiner mislocalized til mitokondriene i patologiske tilstander. Videre inkorporering av konvensjonelle fluorescerende indikator fargestoffer muliggjør simultan evaluering av visse aspekter av mitokondriell funksjon i distinkte mitokondriesubpopulasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyr som brukes i denne studien ble behandlet i henhold til en protokoll (N08001CVsr) godkjent av Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM) Institutional komité for beskyttelse av dyr som følger nasjonale standarder som skissert av den kanadiske Rådet for dyrestell (CCAC).
Forbered alle reagenser som kreves for å utføre denne protokollen (tabell 1). Alle andre detaljer om utstyr, forsyninger og leverandører kan bli funnet i materialliste.
Tabell 1. Buffer komposisjoner.
1. Innsamling av Rat Spinal Cord
- Dypt anaesthetize rotte (Sprague Dawley) med 4% isoflorane. Kontroller for anestesi av en mangel på refleks ved klemming av the forepaw. Avlive rotta ved halshogging via giljotinen. Denne metoden for eutanasi er foretrukket fremfor andre, som kan forvrenge ryggmargen.
- Skjær skinnet på tilbake utsette ryggraden. Skjær ryggsøylen med bein saks like over bekkenbenet. Visual åpningen av virvelsøylen.
- Sett i en 10 ml sprøyte, med en 200 ul pipette (tilknyttet via smelter litt over flamme), fylt med fosfatbufret saltvann (PBS), inn i virvelsøylen.
- Spyl ryggmargen ved å anvende en middels mengde av trykk til stempelet.
- Hvis noe blod er til stede på ryggmargen, skyll med PBS før du går videre til neste trinn.
MERK: Denne metoden har også blitt validert for hjernen og leveren. Hvis inkludert disse vev, samle halve hjernen fra den avlives rotte og et stykke leveren lik i vekt til ryggmargen. Alle andre tiltak forblir identiske.
2. Isolering av ryggmargs Mitochondria (Tilpasset fra Vande Velde et al. 4)
- Samle hele intakt ryggmargen og plasser i 5 ml glass homogenisator med fem bind (~ 3,25 ml) homogeniseringsbufferen (HP). For optimal utvinning av isolerte mitokondrier, utføre alle trinnene på is eller i kalde rom. Homogenisere vevet for hånd til ingen store biter av vev gjenstår ca åtte slag. Plasser homogenat i to (2 ml) eller tre (1,7 ml) mikrosentrifugerør. Sentrifuger 1300 xg i 10 min ved 4 ° C i en bordmikrosentrifuge.
- Gjenopprette supernatant og plasser i en 5 ml ultrasentrifugerør. Legg 750 pl (~ 0,5 volumer) HB til pellets-inneholdende mikrosentrifugerør og forsiktig resuspendere pelleten. Gjenta sentrifugering og resuspensjon trinn to ganger til. Pool alle Supernatantene (S1a og S1b) inn i den samme 5 ml ultrasentrifugerør ovenfor. Dette trinnet tjener til å fjerne små rusk.
- Sentrifuger sammenslåtte S1 ved hjelp av en ultrasentrifuge utstyrt med en svingende spann råteeller og sentrifuger ved 17 000 xg i 15 min ved 4 ° C.
- Hold supernatant (S2) for videre behandling dersom de cytosoliske fraksjonen er av interesse (for eksempel for Western blot-analyse). Resuspender pelleten (P2), det urene mitokondrie fraksjonen, i 4 ml HB + 50 mM KCl. Sentrifuger 17.000 xg i 15 min ved 4 ° C i en svingende spannrotor. Kast supernatanten og resuspender pelleten forsiktig (P3) i 800 pl HB.
MERK: Mitokondrier er vasket med HB + 50 mM KCl å fjerne eventuelle uspesifikke mitochondrially-forbundet forurensninger. - I en ny 5 ml ultrasentrifugerør, tilsett nøyaktig 800 mikroliter av resuspenderte pellet (P3).
- Til dette rør legg, 200 pl Iodixanol (densitetsgradient medium), og dermed skape en sluttkonsentrasjon på 12% Iodixanol. Bland innholdet av røret forsiktig, men grundig via pipettering med en P1000. Tilsetning av Iodixanol først, og deretter resuspendert pellet (P3) kan være å foretrekke for å lette grundig blanding. Sentrifuger i en ultracentrifuge utstyrt med en svingende spannrotor ved 17.000 xg i 15 min ved 4 ° C.
- MERK: Lever inneholder ikke myelin og derfor dette trinnet er ikke nødvendig hvis bare leveren blir behandlet. Imidlertid, dersom leveren blir behandlet samtidig med CNS mitokondrier, anbefales det å behandle alle vev likt.
- Aspirer lag av myelin på toppen av røret og fjern forsiktig og kast supernatant. Pellet kan være løs. Resuspender pellet i 4 ml HB. Sentrifuger på nytt ved 17 000 xg i 10 min ved 4 ° C. Kast supernatanten og resuspender pelleten i 4 ml HB. Gjenta sentrifugeringen og fjerne supernatanten.
- Resuspender den endelige pellet (P7) i 100-200 pl HB og overføre til et 1,7 ml mikrosentrifugerør. Denne prøven inneholder isolerte mitokondrier.
- Fortsett til protein kvantifisering. Fortynn prøver og standardkurven i 2% natriumdodecylsulfat (SDS) for å sikre tilstrekkelig oppløsning av mitokondrier undeng protein kvantifisering.
3. immunolabeling av Isolert Mitokondrier flowcytometri
- For hver farging blanding som skal testes, pipette 25 ug av isolerte mitokondrier i et 1,7 ml mikrosentrifugerør. Inkluder en unstained prøve i hvert forsøk; og for hvert antistoff, sørg for å inkludere et eksempel for den aktuelle isotype kontroll.
- Sentrifuger ved 17000 x g i 2 min ved 4 ° C i en benk-topp mikrosentrifuge.
- Fjern supernatant og resuspender isolerte mitokondrier i 50 ul buffer Mitokondrier (M buffer) supplert med 10% fettsyrefritt BSA i 15 min ved 4 ° C (blokkeringstrinn).
MERK: Under merking, utføre inkubasjoner i kjøleskap ved 4 ° C. - Legg primært antistoff (kanin-anti-Mfn2, 20 pg per ml) til røret, og inkuber i 30 min ved 4 ° C.
MERK: Bestem optimal konsentrasjon av hvert antistoff empirisk ved titrering. På grunn av variasjoner i konsentrasjonen og / eller pm tv resikkerhet, kan forskjellige partier av samme antistoff fra samme produsent fører til forskjellige resultater; derfor titrering er nødvendig for hvert nytt parti av antistoff. - Vask vekk ubundet primære antistoff: Sentrifuger ved 17.000 xg i 2 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten og forsiktig resuspender pelleten i 200 pl M buffer. Sentrifuger ved 17000 x g i 2 min ved 4 ° C. Fjern supernatant og resuspender pelleten i 50 ul M buffer.
- Legg sekundært antistoff (esel-anti-kanin IgG fycoerytrin (PE), 0,5 mikrogram per ml) til røret og inkuber prøvene i 30 min ved 4 ° C, beskyttet mot lys.
- Vask vekk ubundet sekundært antistoff: Sentrifuger ved 17.000 xg i 2 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 200 pl M buffer. Sentrifuger ved 17000 x g i 2 min ved 4 ° C. Fjern supernatant og resuspender pelleten i 500 pl M buffer.
- For å sikre hendelser er faktisk mitokondriene, beis isolert mitokondrier med enmitokondrier spesifikke fluorescerende fargestoff i 15 min ved RT, beskyttet mot lys. Hvis farging av andre funksjonelle parametere (mitokondrie transmembrane potensielle eller superoksydproduksjon) er ønsket, fortsett til trinn 4. Hvis ikke, gå videre til trinn 5 for oppkjøpet.
MERK: Det er viktig å kontrollere at emisjonsspekteret til den sekundære antistoffet er kompatibel med at av de funksjonelle fargestoffer. For eksempel, dersom verifisering av mitokondriell renhet med et kommersielt fargestoff med spektrale egenskaper som ligner på FITC og transmembranpotensialet med tetra-metylester (TMRM), en levedyktig sekundært antistoff ville bli allophycocyanin (APC: Ex 650 nm / Em 660 nm). Legg kompensasjoner kontroller, dvs. en prøve immunolabeled eller beiset med et enkelt fluoroforen, når dette er aktuelt. - Overføring til et rør egnet for lasting flowcytometer. (For å forenkle den lille prøvestørrelse, en mikrotiter-røret er plassert inne i 3 ml flowcytometer røret.) Holde prøvene på is, og fortsette umiddelbart tilflowcytometer for oppkjøpet.
4. assaying mitokondrie transmembrane Potensial og Mitochondrial superoksydproduksjon ved flowcytometri
- Kontroller at isolerte mitokondrier har en intakt transmembrane potensial ved farging med 100 nM TMRM (Ex 548 nm / Em 574 nm) 5, i trinn 3.8, i 15 min ved RT, beskyttet mot lys. For sammenligning av transmembranpotensialet mellom prøvene og populasjoner, bruk av lavere / ikke-slukke konsentrasjoner av TMRM (1 til 30 nM), kan være mer hensiktsmessig 6..
- Som en kontroll for TMRM farging, flekk isolerte mitokondrier med 100 nM TMRM i nærvær av 100 pM karbonyl cyanid m-klor fenyl-hydrazin (CCCP), en mitokondriell uncoupler som vil depolarize mitokondrier. Konsentrasjonen av CCCP kreves for å depolarize mitokondriene kan være mindre dersom lavere konsentrasjoner av fargestoff brukes.
- Kontroller at isolerte mitokondrier produsere mitokondrie superoksid etter staining med et passende mitokondriell superoksid indikatoren 7, også i trinn 3.8, i 15 min ved RT, beskyttet mot lys.
- Som en kontroll for mitokondriell superoksydproduksjon, flekk isolerte mitokondrier med fargestoff i nærvær av 10 uM antimycin, en inhibitor av kompleks III av respiratoriske kjeden som vil utfylle mitokondriell superoksydproduksjon.
5. innsamling og analyse av immunolabeled Isolert Mitokondrier med flowcytometri
- Instrument satt opp: Switch spenninger fra lineær å logge modus for å forenkle analysen av isolerte mitokondrier og satt spenninger (FSC: 450; SSC: 250). Påse at hendelsene er samlet i FSC-A (område) modus samt FSC-W (bredden) og FSC-H (høyde), å være i stand til å ekskludere dubletter (dvs. to arrangementer, som passerer gjennom detektoren samtidig ) i analyse post-datainnsamling. Angi antall hendelser skal samles til 100.000. Erverve kompensasjon kontroller, Hvis det er aktuelt.
- Datainnsamling: Før datainnsamling, unngå virvling prøver. I stedet bland ved å banke forsiktig tube. Utgangspunktet samle hendelser på et lavt trykk, under gating. Gate på totale befolkningen. Juster spenninger på tilsvarende histogrammer, vanligvis toppen av de ufargede prøven vil tilsvare det andre tiår (10 2). Når portene er etablert, og prøvene blir behandlet, kan trykket bli slått til høy.
- Analyse: Visual dubletter ved å plotte FSC-W versus FSC. Identifisere singleter og dubletter. Gate på singlets. Velg mitokondrie befolkningen ved gating på hendelser som er farget positivt med en mitokondrie-selektiv fargestoff.
- Bestem bakgrunn merking fra isotype kontroll. Bruke isotype kontrollprøve, hvor mange prosent av den mitokondrielle befolkningen merking positivt for Mfn2 antistoff.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mitokondrier avledet fra rotte ryggmargen kan immunolabeled med et antistoff rettet mot Mitofusin2 (Mfn2), et protein innblandet i sammensmeltingen av den ytre membran av mitokondrier åtte. Etter isolering og merking med et Mfn2 spesifikt antistoff og et fluorescensmerket konjugert sekundært antistoff, er mitokondrier behandlet ved flowcytometri (figur 1). Etter datainnsamling, er prøvene analysert ved hjelp av flowcytometri analyse programvare, ved først å visualisere alle innsamlede hendelser på et prikkplott (figur 2A). Dubletter og singlets er differensiert når hendelsene er plottet i FSC, bredde (W) versus området (A) (figur 2B). Når singlets er valgt, gate mitokondrie befolkningen via FSC / SSC (figur 2C), og kontrollere antall hendelser flekker positivt for mitokondrier spesifikke fargestoff av co-plotting et histogram av unstained prøven med en prøve farget med mitokondriene-specific fargestoff. For å bestemme mitokondrie hendelser, plassere en gate i skjæringspunktet mellom de to toppene (figur 2D). For ryggmargs preparater, typisk> 90% av hendelsene er positive for mitokondriene spesifikke fargestoff. For andre vev som lever, ~ 98% av hendelsene vil etiketten med fargestoff (data ikke vist). Etter valg bare hendelser som Produsent positivt for mitokondrier spesifikke fargestoff, bestemme bakgrunnsmerking med isotype kontroll ved å velge en port (Mfn2 +) som inneholder 1% eller mindre isotype merking (figur 2E, til venstre). Påfør denne porten jevnt til alle prøver merket med antistoff Mfn2 for å bestemme prosentandelen av mitokondrier med Mfn2 tilstede på den ytre mitokondriemembranen (figur 2E, høyre). I dette eksperimentet, 30% av mitokondrier avledet fra ryggmargs etikett positive for Mfn2. Det er viktig å merke seg her, at selv om Mfn2 anses å være en ubiquitously uttrykt mitochondrial ytre membran protein, har det ikke vært tidligere kvantifisert. Videre har en immuncytokjemisk analyse av Mfn2 i dyrkede celler viser en ikke-homogen merking av individuelle mitokondrier 9. Det er også mulig at Mfn2 epitopen var utilgjengelig på grunn til å legge translasjonelle modifiseringer, eller på grunn av interaksjoner med seg selv eller andre bindingspartnere. Av notatet ble antistoffet i denne studien ble generert ved hjelp av et syntetisk peptid til N-terminus (aminosyrer 38-55). Det er en predikert spleisevariant av Mfn2 mangler de første 302 aminosyrer, selv om denne variant har ennå ikke bekreftet eksperimentelt (Uniprot database). Dermed er denne analysen ikke i stand til å detektere alternativt spleiset Mfn2 mangler den N-terminale sekvens, gitt antistoff som brukes.
Mitokondrie transmembrane potensial (ΔΨ m) og superoksydproduksjon kan vurderes i denne analysen. På tvers av den indre mitokondrie-membran, er det en separasjon av charge which driver ATP produksjon via oksidativ fosforylering. TMRM er et kationisk fargestoff som akkumuleres i løpet av mitokondriene i en membranpotensialet avhengig måte 5, og kan derfor brukes som en reporter for mitokondriell transmembrane potensial. Flertallet av mitochondria (95%) er TMRM positiv etter farging, sammenlignet med de ufargede kontroll (figur 3A). Imidlertid, når uncoupler CCCP tilsettes det er en betydelig reduksjon i antallet mitokondrier stand til å beholde TMRM (figur 3A). CCCP tillater fri passasje av ioner på tvers av den indre mitokondrie-membran, i det vesentlige å ødelegge separasjonen omkostninger og depolariserende membranen.
Mitokondrier frigjøring superoksid som en vanlig biprodukt av oksidativ fosforylering fra komplekset I og III i elektrontransportkjeden. Mitokondriell superoksid kan måles via en membran som er gjennomtrengelig fargestoff som er målrettet til mitokondriene og blir fluorescent Follofløyen en reaksjon med superoksid 7. Funksjonelle mitokondrier produsere en basal mengde superoksid forhold til ufargede prøver (Figur 3B). Tilsetning av kompleks III inhibitor antimycin A gir en økning i superoksyd, som sett av en høyrerettet endring i Florescence og et høyere antall av mitochondria (typisk ~ 10%) som er fluoriserende med denne mitokondrielle superoksid indikatorfargestoff (figur 3B).
Figur 1. Skjematisk av isolasjon, immunolabeling og analyse av mitokondrier. Trinn 1: samle vev og homogen Trinn 2:. Isolasjonsmetoden inneholder åtte sentrifugeringstrinn. Myelin, er en stor oppsamling av sentralnervesystemet vev fjernes ved å fortynne mitokondrier i Iodixanol (tettshetsgradient medium) og sentrifugefuging, noe som resulterer i myelin flyter til toppen av røret, mens mitokondriene er pelletisert. Trinn 3: Etter isolering og kvantifisering, blir blokkert mitokondrier, som er merket med primære antistoff og vasket. Et sekundært antistoff konjugert til et fluoroforen tilsettes deretter. Ubundet antistoff blir vasket ut. Trinn 4: På dette punktet fluorescerende fargestoffer som rapporterer om mitokondriell renhet, eller mitokondriefunksjon kan tilføyes. Trinn 5: Mitokondrier er nå klar til å bli analysert ved strømningscytometri.
Figur 2. Strategi for analyse av isolerte mitokondrier ved flowcytometri. FORWARD Scatter (FSC) og sidespredning (SSC) spenninger må justeres for små arrangementer, bruker begge parametere i logaritmisk modus. FSC bredde (FSC-W) data må væresamlet for å utelukke dubletter. Note, på de fleste flowcytometere, er standardinnstillingen for FSC og SSC lineær modus. (A) Visual alle innsamlede hendelser på et prikkplott. (B) dubletter, to mitokondriene går forbi laseren på samme tid, kan skilles fra singlets Ved å plotte FSC versus FSC-W (lineær modus). Hendelser blir ekskludert dersom FSC-W verdien er mer enn det dobbelte av gjennomsnittet FSC-W verdien av de fleste arrangementer, dvs. de som er del av den tette skyen. Aktivitet under denne terskelen er gated som singleter. (C) Igjen, visualisere hendelsene i et prikkplott, og gate på de resterende hendelser. (D) Plott et histogram av unstained prøven (solid, grå, fylt) og prøve farget med en mitokondrie bestemt fargestoff (MSD: solid, grønn). Gate hendelsene flekker positivt for MSD (MSD +). (E) Histogram av isotype kontroll, kanin IgG (stiplet, sort) og Mfn2 merket prøve (solid, rosa).Still inn gate, slik som å gi ≤ 1% Mfn2 + på isotype kontroll peak og bruke denne samme gate til eksperimentell prøve å bestemme prosentandelen av hendelser merking positivt for Mfn2 (Mfn2 +). Klikk her for å se en større versjon av dette figuren.
Figur 3. bestemmelse av mitokondrienes transmembrane potensial (ΔΨ m) og superoksydproduksjon i mitokondriene isolert ved strømningscytometri. (A) Under basale forhold alle aktive mitokondrier vil merke med TMRM (solid, svart), sammenlignet med unstained kontroll (solid, grå, fylt) fordi fargestoffet akkumuleres i mitokondriene med en transmembrane potensial. Addi sjon av protonophore CCCP (stiplede, blå) forsvinner den transmembrane potensialet forårsaker mitokondriene til depolarize og beholde mindre fargestoff i forhold til basale forhold. Dataene er rapportert som delta-betyr fluorescerende intensitet (ΔMFI), som er den gjennomsnittlige fluorescerende intensitet av de ufargede kontroll subtrahert fra den gjennomsnittlige fluorescerende intensitet av prøven (B). Under basale betingelser, produserer mitokondriene superoksid som et biprodukt av oksidativ fosforylering. Dette mitokondrie kilde superoksid kan analyseres med en mitokondrie superoksid indikator, (MitoO 2-: solid, svart) sammenlignet med unstained kontroll (solid, grå, fylt). Tilsetning av kompleks III-hemmer, antimycin A (stiplede, appelsin) resulterer i økt superoksydproduksjon, sammenlignet med basalnivåer. Dataene er rapportert som prosent av celle-farging positiv for MitoO 2-indikator.k "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er stadig tydeligere at mitokondriene er sentrale aktører i både normal fysiologi og sykdom. Mens immunoblotting kan bestemme hvilke proteiner blir funnet i mitokondrier eller i det mitokondrielle overflaten i en bestemt tilstand, denne metoden rapporter om gjennomsnittet av hele populasjonen. Denne metoden kan ikke gi informasjon om relative Forekomsten av mitokondrie subpopulasjoner eller undergrupper. Mens det har vært tidligere antatt at alle mitokondriene er skapt like, er feltet i økende grad erkjenner at mitokondrier i en celle har omfattende variasjon i form av morfologi og / eller funksjon 10.
Fluorescerende mikros tilnærminger tar hensyn til heterogenitet av mitokondrier. Imidlertid er kvantifisering av denne type data arbeidskrevende. Videre er denne fremgangsmåten er bedre egnet for studier ved hjelp av dyrkede celler, som merking av mitochondria in vivo / in situ er vanskelig på grunn av de excesrende antall mitokondria stede, noe som gjør differensiering av individuelle organ iboende vanskelig. I de fleste immunocytokjemi protokoller, er det heller ikke mulig å samtidig merke ytre mitokondriemembranproteiner og vurdere mitokondriefunksjon på grunn av den cellulære permeabilization trinn som kreves for antistoff-merking. Den nåværende metode arbeider med isolerte mitokondrier, og således ikke krever en permeabilization trinn. I tillegg er visualiseringen av de enkelte mitokondrier bare mulig via elektronmikroskopi, som ikke er mottagelig for analyse av mitokondriell funksjon. Som blir sagt, vi erkjenner at isolering av mitokondrier fra vev fører til forstyrrelse av mitokondrie nettverket, og dette kan påvirke enkelte elementer av mitokondrienes funksjon. Men sammenligninger av funksjonelle aspekter av isolerte mitokondrier fra vev som er behandlet på samme måte fortsatt være gyldig.
Denne metoden for immunolabeling av vev-avledet isolasjoned mitokondrier og påfølgende analyse ved strømningscytometri muliggjør en hurtig og kvantifiserbare metode for å detektere og overvåke nærværet av et protein som ligger på den ytre membran. Påvisning av en svært rik mitokondrie protein (som Mfn2) er mulig med denne teknikken. På samme måte kan denne fremgangsmåte detektere lav overflod proteiner som bare er avsatt på mitokondriemembranen i sykdommer, slik som misfolded SOD1 i sammenheng med amyotrofisk lateralsklerose (ALS) 11. I tillegg kunne denne metode være nyttig for å overvåke de proteiner som forbigående forbinder med den mitokondrielle overflate som en del av deres normale funksjon. Eksempler er-makt-Related protein-1 (Drp1), en cytosolprotein som er rekruttert til mitokondriene for å fremme mitokondrie fisjon 12 og tumor nekrose faktor reseptor-assosiert faktor 6 (TRAF6), som translocates til mitokondriene for å øke mitokondrie reaktive oksygen arter som en del av en iboende immunrespons 13.
I dag er denne teknikken er mottagelig bare for proteiner lokalisert på mitokondrie overflate, som standard permeabilization protokoller for intracellulær merking kreve et vaskemiddel som forstyrrer den strukturelle integriteten til mitokondriene. Mens en rekke mulige reagenser har vært forsøkt (upublisert), er ytterligere optimalisering av immunolabeling protokollen fortsatt behov for å gjøre denne protokollen mottagelig for detektering intra-mitokondrie komponenter.
Denne teknikken har brede anvendelser og kan bli anvendt for å detektere tilstedeværelse eller rekruttering av en eller flere proteiner i mitokondriene under forskjellige eksperimentelle paradigmer. Videre mitokondriene kan være co-merket med to forskjellige antistoffer, så vel som med fluoriserende indikatorer 11. Andre fluorescerende prober kan også innarbeides for å karakterisere ytterligere aspekter av mitokondriell funksjon. For eksempel, med kommersielt tilgjengelige fargestoffer overvåke mitokondrie pH 14 15, og ATP-nivåer 16 er mulig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Laurie Destroismaisons og Sarah Peyrard for fremragende teknisk støtte og Dr.Alexandre Prat for tilgang til strømningscytometeret. Vi ønsker også å erkjenne Dr. Timothy Miller for hans bidrag vedrørende fjerning av myelin fra forberedelsene. Dette arbeidet ble støttet av den kanadiske Institutes of Health Research (CIHR) Nevromuskulær Forskning Partnership, Canadian Foundation for innovasjon, ALS Society of Canada, Frick Foundation for ALS Research, kompis Foundation og Fonds de la Recherche en Santé du Québec (CVV). Både CVV og NA er stipendiater i Fonds de la Recherche en Santé du Québec og CIHR nye undersøkere. SP er støttet av Tim Noël Student fra ALS Society of Canada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Charles River | Strain code 400 | Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used. |
| Dounce homogenizer | Kontes Glass Co. | 885450-0022 | Duall 22 |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend Micro 17 R | |
| Ultra-Clear Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344057 | Transparent, thin walled |
| Sorvall Ultracentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall WX UltraSeries | |
| AH-650 rotor and buckets | Thermo Scientific | ||
| Opti-prep | Axis-Shield | 1114542 | Iodixanol, density gradient medium |
| Fatty acid free Bovine Serum Albumin | Sigma | A8806 | Must be fatty acid free for mitochondria |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S9637 | |
| Rabbit anti-Mitofusin2 antibody | Sigma | M6319 | |
| Rabbit IgG | Jackson Immuno Research | 011-000-003 | |
| Anti-Rabbit IgG PE | eBioscience | 12-4739-81 | |
| Micro titer tube | Bio-Rad | 223-9391 | For sample acquisition by flow cytometry |
| MitoTrackerGreen (MTG) | Invitrogen | M7514 | 100 nM: Ex 490 nm/Em 516 nm |
| TMRM | Invitrogen | T668 | 100 nM: Ex 548 nm/Em 574 nm |
| CCCP | Sigma | C2759 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | 5 µM: Ex 540 nm/Em 600 nm |
| Antimycin A | Sigma | A8874 | |
| LSR II flow cytometer | BD | ||
| BD FACSDiva Software | BD | ||
| FlowJo | TreeStar Inc. | Software used for analysis | |
| BCA protein assay kit | Pierce/Thermo Scientific | 23225 | Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS |
References
- Itoh, K., Nakamura, K., Iijima, M., Sesaki, H.
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. J Cell Biol. 183, 795-803 (2008).
- Zorov, D. B., Kobrinsky, E., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Examining intracellular organelle function using fluorescent probes: from animalcules to quantum dots. Circ Res. 95, 239-252 (2004).
- Vande Velde, C., Miller, T., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4022-4027 (2008).
- Loew, L. M., Tuft, R. A., Carrington, W., Fay, F. S. Imaging in five dimensions: time-dependent membrane potentials in individual mitochondria. Biophys J. 65, 2396-2407 (1993).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50, 98-115 (2011).
- Xu, X., Arriaga, E. A. Qualitative determination of superoxide release at both sides of the mitochondrial inner membrane by capillary electrophoretic analysis of the oxidation products of triphenylphosphonium hydroethidine. Free Radic Biol Med. 46, 905-913 (2009).
- Otera, H., Ishihara, N., Mihara, K. New insights into the function and regulation of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta. 1833, 1256-1268 (2013).
- de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456, 605-610 (2008).
- Wikstrom, J. D., Twig, G., Shirihai, O. S. What can mitochondrial heterogeneity tell us about mitochondrial dynamics and autophagy. Int J Biochem Cell Biol. 41, 1914-1927 (2009).
- Pickles, S., Destroismaisons, L., Peyrard, S. L., Cadot, S., Rouleau, G. A., Brown, R. H. Jr, Julien, J. P., Arbour, N., Vande Velde, C. Mitochondrial damage revealed by immunoselection for ALS-linked misfolded SOD1. Hum Mol Genet. 22, 3947-3959 (2013).
- Frank, S., Gaume, B., Bergmann-Leitner, E. S., Leitner, W. W., Robert, E. G., Catez, F., Smith, C. L., Youle, R. J. The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis. Dev Cell. 1, 515-525 (2001).
- West, A. P., Brodsky, I. E., Rahner, C., Woo, D. K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Walsh, M. C., Choi, Y., Shadel, G. S., Ghosh, S. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472, 476-480 (2011).
- Abad, M. F., Di Benedetto, G., Magalhães, P. J., Filippin, L., Pozzan, T. Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant. J Biol Chem. 279, 11521-11529 (2004).
- Murphy, A. N., Bredesen, D., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9893-9898 (1996).
- Tantama, M., Martinez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nat Commun. 4, 2550 (2013).
