Summary
Primär cellodling använder intakta vävnads organoids ger ett modellsystem som härmar flercelliga in vivo mikromiljö. Vi utvecklade ett serumfritt primära bröst epitel vävnadskultur modell som förevigar blandade cellodlingslinjer och utställningar differentierade morfologi, utan avbrott enzymatisk vävnad. Bröst organoids förbli livskraftig i> 6 månader.
Abstract
Bröst duktal cancer in situ (DCIS), per definition, är spridning av neoplastiska epitelceller inom ramarna för bröstkanalen, utan att bryta mot den kollagena basalmembranet. Medan DCIS är en icke-obligat gångare till invasiv bröstcancer är de molekylära mekanismer och cellpopulationer som tillåter progression till invasiv cancer inte helt kända. För att bestämma om stamceller som kan invasion fanns inom DCIS cellpopulationen har vi utvecklat en metod för insamling och odling steril human bröstvävnad vid tidpunkten för operation, utan enzymatisk upplösning av vävnad.
Steril bröstvävnad innehåller duktala segment skördas från kirurgiskt utskurna bröstvävnad efter rutin patologisk undersökning. Tissue innehållande DCIS placeras i näringsrikt, antibiotikum-innehållande, serumfritt medium, och transporteras till vävnadskulturlaboratorium. Bröstvävnaden är ytterligare dissected för att isolera de förkalkade områden. Multipla bröstvävnadsstycken (organoids) placeras i en minimal volym av serumfritt medium i en kolv med ett borttagbart lock och odlades i en befuktad CO2-inkubator. Epitelceller och fibroblast cellpopulationer sig ur organoida efter 10-14 dagar. Mammospheres spontant bildas på och runt den epiteliala cellmonoskiktet. Specifika cellpopulationer kan skördas direkt från kolven utan att störa angränsande celler. Vår icke-enzymatisk vävnadsodlingssystemet visar tillförlitligt cytogenetiskt onormala, invasiva progenitorceller från färska humana DCIS lesioner.
Introduction
Proliferation av epitelceller inom ramarna för mjölkgångarna och alveoler (duktal cancer in situ) redovisas som en obligat gångare till invasiv duktal och lobulär bröstcancer. Ändå är de molekylära mekanismer och cellpopulationsdynamik som tillåter progression till invasiv cancer dåligt kända. Belysa överlevnadsmekanismer som används av pre-invasiva bröstkarcinomceller, eller en på förhand invasiv tumör, kan avslöja terapeutiska strategier för att döda, eller till och med förhindra, pre-invasiva tumörer 1. Dock har enkla billiga metoder för funktionellt studerar mänskliga pre-invasiva skador saknats. Även om in vitro enskiktskultur av transformerade cellinjer är en etablerad laboratoriemetod, fenotypen och genotypen av dessa odödliga cellinjer inte rekapitulera den molekylära status av primära humana tumörceller 2. Även den icke-tumörframkallande MCF-10A cellinje som recApitulates 3-D bröstkörtel arkitektur, inte i tillräcklig utsträckning representerar den funktionella fenotyp och molekylära egenskaper hos en enskild patient pre-invasiv bröstcancer lesion 3,4.
För att bestämma om stamceller liknande neoplastiska celler med förmåga att invasionen fanns inom duktal cancer in situ (DCIS) cellpopulation, utvecklade vi en metod för insamling och odling steril human bröstvävnad vid tiden för operationen (Figur 1) 5. Vår ex vivo bröst organoid odlingssystem inte förlitar sig på vävnadsstörningar enzymatisk, basalmembran uttagningsmatris, eller fibroblast lagret, för att isolera och föröknings mammosphere bildande celler från färsk human bröst duktal cancer vävnad 6-8. Vårt nya system bygger på principen om cell streaming / migration 5. De urskiljbara bröstkanaler, och omgivande stroma är nedsänkta i en minimivolym av serumfritt näringsmedium (bara enough att täcka kanal fragment) för att maximera gasutbytet, med den skurna ytan av kanalen exponeras för odlingsmediet, men i ingen specifik orientering i kolven (Figur 1E-F). Denna kultur systemet tillåter celler att migrera ut ur kanalen och i / på den autologa stroma och odlingskolv. Det näringsmedium, kompletterat endast med epidermal tillväxtfaktor (EGF), insulin och antibiotika, stöder tillväxten av blandade cellpopulationer som härrör från organoida. Den vävnadsodlingskolv har en avtagbar, återförslutningsbar lock som gör att organoids och / eller celler som skall skördas utan att störa hela kolv eller angränsande organoids, samtidigt som en steril fuktig miljö.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Human bröstvävnad samlades in från patienter som ingick i en forskningsstudie, med skriftligt informerat samtycke, efter försvarsdepartementet, George Mason University, och Inova Health System Institutional Review styrelsen godkända protokoll.
1. Förbered näringsrik Medium med tillväxtfaktorer och antibiotika
- Bered stamlösningar av insulin, epidermal tillväxtfaktor (EGF), streptomycinsulfat och gentamicinsulfat.
- Rekonstituera insulin i sterilt filtrerat vatten till en slutlig koncentration av 10 mg / ml. Aspirera 10 ml typ 1 reagenskvalitet vatten i en steril 10 ml engångsspruta. Bifoga en 0,22 um polyetersulfon filter på sprutan. Fördela det sterila filtrerade vattnet in i en steril 15 ml koniska rör.
- Tillsätt 10 ml sterilt filtrerat vatten till en 100 mg flaska av insulin. Blanda innehållet kortfattat på en vortexblandare. Håll flaskan insulin på is. Fördela 450 pl av insulinaktielösningartion i märkta, sterila mikrocentrifugrör och förvara vid -20 ° C. Insulin stamlösning är stabil fram till det utgångsdatum som anges på flaskan.
- Bered stamlösning av epidermal tillväxtfaktor (EGF): Lägg 500 ul sterilt vatten till 500 ^ g EGF (lager 1 | ig / | il). Blanda innehållet kortfattat på en vortexblandare. Förvara EGF flaskan på is.
- Bered en arbetsstamlösning av EGF: Lägg 100 ul av lager EGF lösning till 900 | il näringsmedium (arbets lager kommer att vara 0,1 | ig / | il). Blanda innehållet kortfattat på en vortexblandare. Fördela 50 pl av EGF arbetsstamlösning i märkta, sterila mikrocentrifugrör och förvara vid -80 ° C.
OBS: EGF förrådslösning (1 | ig / | il) är stabil i ett år vid -80 ° C; arbetsstamlösning (0,1 | ig / | il) är stabil i 2 månader vid -80 ° C.
- Bered en arbetsstamlösning av EGF: Lägg 100 ul av lager EGF lösning till 900 | il näringsmedium (arbets lager kommer att vara 0,1 | ig / | il). Blanda innehållet kortfattat på en vortexblandare. Fördela 50 pl av EGF arbetsstamlösning i märkta, sterila mikrocentrifugrör och förvara vid -80 ° C.
- Väg 40 mg streptomycin sulfat på en analysvåg. Placera streptomycinsulfat intoa sterila 15 ml koniska rör. Tillsätt 4 ml av näringsmedium. Blanda innehållet kortfattat på en vortexblandare. Lösningen ska vara lätt rosa. Förvaras vid 4 ° C i skydd mot ljus. Streptomycinsulfat lösning är stabil i 7 dagar.
- Väg upp 20 mg gentamicinsulfat på en analysvåg. Placera gentamicinsulfat i en steril 15 ml koniska rör. Tillsätt 2 ml näringsmedium. Blanda innehållet kortfattat på en vortexblandare. Lösningen ska vara gul. Förvaras vid 4 ° C i skydd mot ljus. Gentamicinsulfat lösning är stabil i 7 dagar.
- Förbered två 200 ml satser av näringsmedium kompletterat med humant rekombinant EGF (10 ng / ml slutlig konc.), Insulin (10 | ig / ml slutlig konc.), Streptomycinsulfat (100 | ig / ml slutlig konc.) Och gentamicinsulfat (20 | ig / ml slutlig konc.).
- Lägg 200 ml näringsmedium till en vakuumfilterkolv försedd med en 0,2 fim polyetersulfon filterkolv och en 250 ml uppsamlingsflaskan. Lägg 20 &# 181; l arbets lager EGF, 200 ^ stock insulin, 2 ml stam streptomycin sulfat, och 400 pl lager gentamicinsulfat till 200 ml näringsmedium. Fäst filtret kolven till ett vakuum. Filtrera mediet. Kasta filtret och etikett kolven som "näringsrikt medium". Förvara vid 4 ° C i upp till 14 dagar.
2. Vävnads Förvärv och Grossing
- I operations sviten, underhålla steril teknik efter koppleri bröstvävnaden. Placera bröstvävnad i en steril bricka och täcka brickan med steril plastfolie.
- Transportera vävnad i täckta facket radiologi / patologi som krävs av din institution. Öppna inte facket. Transporttiderna varierar inom institutionerna. Vävnad kan förbli livskraftiga på denna täckt fack vid RT under upp till 45 min efter excision. Dock ger snabb bearbetning av vävnaden i näringsrikt medium optimala förutsättningar för efterföljande organoid kultur.
- Brutto vävnad dissektion att identifiera områden av DCIS i bröstvävnad: Använd sterila handskar, knivar, skalpeller, vävnads färgämnen märkning och vinäger under vävnads dissekering för att hålla vävnader sterilitet.
- Rengör arbetsområdet med 70% etanol eller 1% blekmedel. Öppna sterila handskar och placera handsken omslaget på arbetsytan. Placera den sterila inre handsken omslagssidan uppåt. Ta på sterila handskar.
- Rengöra ytan på provbehållaren med 70% etanol. Ta bort plasthöljet från vävnadsprovet behållaren och placera provet på handsken omslaget.
- Doppa två bomulls tippade svabbar i vävnaden märkfärg. Applicera färgämnet på ytan av vävnaden genom att rulla kompresser över vävnadsytan.
OBS: Varje patologi avdelning har en standardiserad färg färg / vävnadsorientering protokollet. Mjukpapper är märkt med färgämnet för att orientera den vävnad i förhållande till dess läge i patienten. Färgämnet blottas ellermålades på vävnaden. Häll inte färgen över vävnaden. Hälla färgämnet kan orsaka att färgen att springa / dropp i vävnads sprickor därmed förvirrande orienteringen av kirurgiska marginaler. Tissue orientering ger kirurgen och patologen med anatomiska landmärken till a) beskriva vävnadsprovet, och b) bestämma placeringen av de kirurgiska marginaler i förhållande till tumören. - Häll destillerat vit vinäger (5% ättiksyra) på sterila gaskuddar. Blot färgade vävnaden med vinäger indränkt gasbinda. Kassera gasväv. Ättika används för att fixera vävnaden märkning färgämnen.
- Skär bröstvävnad i vertikala skivor ca 5 mm tjocka. Klipp inte hela vägen genom vävnaden (figur 2). Observera / palpera vävnaden för områden av förkalkning. Identifiera DCIS lesioner genom sin karakteristiska firma, blek utseende omgiven av rödaktig, gummi gränser som känns gryniga (pga kalcium spicules).
OBS: I vissa fall kan comedo (finne-liknande) områden varases som vita prickar, som representerar nekrotiska materialet från stor diameter DCIS lesioner. - Klipp ut områden av DCIS / förkalkade bröstvävnad, inklusive en liten mängd omgivande bröstvävnad. Placera bröstvävnaden i ett sterilt 50 ml rör innehållande 20 till 30 ml näringsrikt medium som framställts i steg 1.
- Blanda vävnaden och mediet genom att försiktigt vända röret flera gånger. Kassera mediet och tillsätt färskt medium. Placera röret innehållande vävnaden och mediet i en isolerad behållare och transportera den vävnad till vävnadsodlings labbet.
- Rengör arbetsområdet med 70% etanol eller 1% blekmedel. Öppna sterila handskar och placera handsken omslaget på arbetsytan. Placera den sterila inre handsken omslagssidan uppåt. Ta på sterila handskar.
3. Tissue Culture
- Att arbeta i ett biologiskt säkerhetsskåp, häll vävnaden och en liten mängd av näringsmediet i en steril petriskål. Med en steril skalpell skära bort och kassera den fibrösa vävnaden. Skär bröstvävnad i bitar (organoids) ca 3 mm 2 (Figur 1C-D). Försök att skära i vävnaden så att varje organoid innehåller minst en urskiljbar kanalsegment med omgivande stroma.
- Öppna locket på vävnadsodlingskolv. Använda steril pincett eller pincett, placera organoids i kolven. Stäng locket. Kassera petriskål.
- Lägg 11 ml serumfritt näringsrikt medium (framställd i steg 1) till vävnadsodlingskolv. Stäng flaskan och snurra kolven så organoids och medel är jämnt fördelade över hela kolvytan (Figur 1E-F).
- Inkubera kolven vid 37 ° C i en fuktad 5,0% CO2 atmosfär under 2 dagar. Flytta inte kolven under denna tid.
- På dag 2 efter inkubation, ta bort kolven från inkubatorn för att leta efter potentiella bakteriell / svampkontamination. Undvik plötsliga, kraftiga rörelser, eller virvlande av kolven. Placera kolven på ett inverterat mikroskop skede.
- Beakta det medium för bakterier, jäst, och / eller svampangrepp. Om ingen kontaminering noteras, tillbaka kolven till inkubatorn i ett tilläggnella dag. Om kontaminering noteras, kassera flaskan och innehållet i en lämplig behållare.
- På dag 3 efter inkubation ersätta det konditionerade mediet med färskt medium.
- Placera 11 ml av mediet i ett sterilt rör vid 37 ° C under 20-30 min. Avlägsna vävnadsodlingskolv från inkubatorn. Utan att störa organoids, ta bort och kasta mediet i kolven med en steril serologisk pipett.
- Med hjälp av en ny steril serologisk pipett, tillsätt 11 ml av den förvärmda färskt medium. Rotera mycket försiktigt kolven att distribuera mediet över kolven ytan.
- Inkubera kolven vid 37 ° C i en fuktad 5,0% CO 2 atmosfär.
4. Underhåll av etablerade organoid / epitelceller kolonier
- Bered färskt medium var 2 veckor och ersätta media i vävnadsodlingskolv 3 gånger per vecka.
- Placera 11 ml av mediet i en steril behållare vid 37° C i 20-30 min. Ta kolven ur inkubatorn. Använd en steril serologisk pipett, ta bort och kasta det konditionerade mediet från kolven, försiktigt så att inte störa organoids.
- Med hjälp av en ny steril serologisk pipett, tillsätt 11 ml av den förvärmda färskt medium. Rotera mycket försiktigt kolven att distribuera mediet över kolven ytan. Inkubera kolven vid 37 ° C i en fuktad 5,0% CO 2 atmosfär.
- Efter 10-14 dagar i kultur, ta bort alla bitar av vävnad i odlingsflaska som inte är vidhäftande.
- Periodvis skörda celler och / eller organoids från kolven för förökning i nya odlingsflaskor, för xenograft transplantation eller för fenotypisk och / eller molekylär analys.
- Avlägsna vävnadsodlingskolv från inkubatorn. Spraya kolven med 70% etanol. Torka bort överflödigt etanol på kolven med en ren pappershandduk som du har sprayat med 70% etanol.
- Organoid förökning: <ol>
- Öppna locket på flaskan och lägg locket sidan uppåt i den biologiska säkerhetsskåp. Under mikroskopisk visualisering, lokalisera organoida (er) som skall skördas. Använd sterila pincett eller pincett för att plocka upp en organoid.
- Att propagera organoida i en ny kultur kolv, placera organoida i ny kolv. Lägg 11 ml färskt, varmt medium. Inkubera vid 37 ° C i en fuktad 5% CO 2 atmosfär som beskrivs i steg 3,3 - 3.6.3. Ersätt cellodlingsmediet i vävnadsodlingskolv tre gånger per vecka.
- Skörd av celler:
- Under direkt mikroskopisk vixualization, försiktigt skrapa och aspirera celler och mammospheres använder en 1000 l pipett med sterila engångs pipettspetsar. Aspirera cellerna och omgivande medium. Dispensera celler / mediet i en steril mikrocentrifugrör.
- Snurra cellerna i korthet i en mini-centrifug vid 12.100 xg under 5 sek. Ta bort och kasta mediet. <ol>
- För DNA-analys, omedelbart frysa cellpelleten på torr is, i en liten volym medium (10 | il), med långtidslagring vid -80 ° C.
- För proteomik analys, lysera cellerna i 10 ^ il 8 M urea för masspektrometri eller 2x SDS Tris-glycin-buffert för western blotting / omvänd fas protein microarrays. Alternativt snurra celler i en cytocentrifug att göra cellutstryk för immunhistokemisk analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arbetsflöde för koppleri och odling steril bröst duktal cancer in situ vävnad
Bröstvävnad sterilitet bibehålls från operationssalen till cellodlingslabbet via mindre förändringar i typisk sjukhus patologi arbetsflöde (Figur 1). Tissue transporteras i en steril behållare med en plastfilm kåpa som möjliggör radiologisk bedömning samtidigt vävnads sterilitet bibehålls. Bruttovävnadsbehandling av en bröst lumpektomi eller mastektomi prov utförs med sterila handskar, knivar och vävnads märkning färgämnen. Brutto morfologiska utseende bröst duktal cancer in situ liknar bleka, lätt upphöjda områden med en grynig / fast struktur, omgiven av rödaktig / gul gummi vävnad. Områden av duktal hyperplasi och DCIS kan känna "grynig" och fast på grund av förkalkningar. Dessa områden av bröstvävnad visas ofta bruna eller en något annan färg än den omgivande bröstvävnad. Emellertid ADH cen enda urskiljas efter insamling vävnad och patologisk översyn av de färgade vävnadssnitt. Bröstvävnad förblir livsduglig genom att nedsänka vävnaden och / eller duktala organoids i serumfritt näringsmedium kompletterat med humant rekombinant EGF (10 ng / ml), insulin (10 | ig / ml), streptomycinsulfat (100 | ig / ml) och gentamicinsulfat (20 mikrogram / ml) 5. Cellodlingsflaskor med löstagbara / återförslutningsbar lock medger periodisk skörd av celler / organoids (Figur 1E-F). Denna modell framgångsrikt förökas humana bröst pre-invasiva skador från mer än 20 patienter med diagnosen atypisk duktal hyperplasi (n = 2) och duktal cancer in situ (n = 18).
Spontan mammosphere bildning in vitro och in vivo
Mammospheres och 3-D strukturer uppstod spontant från flera oberoende DCIS kanalvävnadsfragment humana från olika patienter med diagnosen atypisk duktal hyperplasia eller duktal cancer in situ (figur 3 och 4) 5,9. Enzymatisk avbrott i bröstvävnaden inte utföras före vävnadsodling, vilket resulterade i en blandad celltyp kultur. Varken serum, basalmembranextraktet, eller gelliknande matriser krävdes för spontan mammosphere bildning (Figur 4). De mammospheres genererade bröst xenotransplantattumörer i NOD / SCID musmodell med samma tillväxtmönster som för invasiv cancer (Figur 5) 5. Dessa resultat visar att stamceller med invasiv potential förut finns inom människobröst DCIS kanal men tydligen hålls i schack av duktal nisch och kan lirkade växa fram i organoid kultur. Dessa celler utgör en ny kategori av bröst stamceller-liknande celler som finns före det öppna manifestationen av den invasiva fenotypen 5,9,10.
Bekräftelse av epitelceller härledda mammospheres och xenografts
De mammospheres och xenotransplantat härrör från mammospheres bekräftades genom immunofluorescens ha epiteliala ursprung. Epitelceller adhesionsmolekyl (EpCAM) är ett membran glykoprotein uttryckt på epitelceller 11. Immunfluorescens med en monoklonal antikropp som reagerar med humant EpCAM (grön) och en nukleär färgning (DAPI, blå) visade EpCAM positiva celler i mammospheres i kultur (figur 6A) och centrum av en NOD / SCID xenograft (figur 6B).
Kontroll av intakt basalmembran gränser
Den mammosphere bildar, neoplastiska epitelceller i detta odlingssystem härleddes från pre-invasiva bröstförändringar som var saknade frank invasion eller microinvasion, vilket kan verifieras med oberoende patologisk analys enligt standardbehandling histopatologisk diagnos. Flera organoid strukturer från samma patient genererade mammosphere förming kolonier som visat sig vara tumörframkallande. Dessutom histopatologisk undersökning av vävnaden används för organoid kulturen avslöjade sammanflytande intraduktal lesioner med intakt basalmembran gränser (figur 7B) 5. Således kan man dra slutsatsen att de spontana mammospheres bildade i detta odlingssystem endast härrör från pre-invasiva neoplastiska områden och är inte en produkt av sällsynta områden microinvasion 5.
Figur 1. Arbetsflöde för att upprätthålla vävnads sterilitet under radiologisk avbildning och grov vävnad dissektion. (A) I operations sviten, är bröstvävnad (lumpectomy prov visad) placeras i en steril bricka och täckt med sterilt plastfolie. Vävnaden kan avbildas direkt i plastbricka. (B) Vävnad uppräkning för att identifiera områden av DCIS. Engångs endast vävnadsorienterings färgämnen är målade på vävnadsytan med steril bomull tippas kompresser. Hushålls destillerat vit vinäger hälls direkt på vävnad och blottades med steril gasväv. (C & D) Bröst vävnad transporteras till vävnadsodlings lab i näringsrikt medium kompletterat med antibiotika. Tissue dissektion, att isolera områdena DCIS, utförs med hjälp av sterila handskar och klingor / skalp / sax. Den DCIS vävnad skärs i flera organoids för kultur. (E & F) In vitro odling av bröst organoids. Humant DCIS vävnaden placeras direkt i vävnadsodlingskolvar med avtagbara lock, utan föregående enzymatisk digestion av vävnaden. En minimal mängd av serumfritt odlingsmedium kompletterat med epidermal tillväxtfaktor och insulin stödjer celltillväxt samtidigt som en luft-vätskegränssnittet runt organoida.6fig1highres.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Illustration av bruttovävnadsbehandling för bröst DCIS vävnad. Den lumpectomy eller mastektomi vävnad skärs i tunna snitt genom skärning av vävnaden vertikalt utan att skära hela vägen genom provet. Denna dissektion metoden ofta kallas "brödlimpa teknik", eftersom den skurna vävnaden liknar en limpa bröd. Området (er) som misstänks innehålla DCIS skärs ut och skivad i 2-3 mm skivor för diagnostisk patologi och organoid kultur.
Figur 3. En blandad celltyp kulturhåller representativt in vivo cellpopulationer. (A) Faskontrast bild av blandad cellkultur som genereras från bröstet DCIS lesioner över 11 veckor (4X förstoring). (B & C) In vitro organoid odling framgångsrikt prop DCIS härledda epitelceller med förankringsoberoende tillväxt, som definieras som uppåt växande och expanderande mammospheres och lobulated, kanalliknande 3D-formationer, i serumfritt medium kompletterat med EGF, insulin, streptomycin och gentamicin (10x förstoring). (D) Exempel mammosphere bildades efter 11 veckor i odling (40X förstoring). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Spontantbildandet av mammospheres i serum fria organoid kultur. Ett exempel mammosphere formation efter 33 dagars odling (10x förstoring, 20X infälld). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. NOD / SCID-mus xenograftmodell. Xenografter genererades genom att injicera epitelceller härledda från en patient med diagnosen DCIS (mus höger bröstfettkudden) eller från en patient med diagnosen invasiv DCIS (musen vänster juverfett pad). Xenografter härrör från både ren DCIS och invasiv DCIS avslöjade en liknande tillväxtmönster och takt. Klicka här för att se en större version av thans gestalt.
Figur 6. Mammospheres bekräftas vara av epitelursprung. Immunfluorescens med anti-EpCAM konjugerad till FITC användes för att bekräfta epitelursprung av mammospheres och mus xenotransplantat genereras från mjölkgångarna innehåller DCIS. (A) EpCAM-FITC positiva celler (pseudo- färgat grönt, 488 nm) var bara sett i mammospheres av de blandade cellkulturer som härrör från bröst organoids (DAPI (pseudo-färgad blå, 408 nm) nukleära fläck). (B) I formalinfixerade paraffin inbäddade mus xenograft vävnadssnitt, EpCAM positiva Cellerna endast detekteras i mitten av xenograft tumörsektion. (20X förstoring) Klicka här för att se en större version av denna Figure.
Figur 7. Kollagen IV immunohistokemi avslöjar intakta basalmembran som omger kanaler. Normala mjölkgångarna (A) omges av intakta basalmembran anrikade på kollagen IV (diaminobenzidin = brun missfärgning). Efter organoid kultur, bröstvävnad innehåller också intakta basalmembran som bekräftar att mammospheres härrör från områden med DCIS och inte från invasiv cancer (kollagen IV immunohistokemi, panel A 4X förstoring, panel B 10X). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kulturen system som beskrivs här utgör en ny modell för att generera levande pre-invasiva neoplastiska bröstceller för grundläggande och translationell forskningsstudier. I det förflutna, har pre-maligna bröstcancer progression typiskt studerats med användning av tre olika metoder. Den första metoden är histopatologiska och genetisk analys av microdissected frysta eller fasta prover från människa 12-14. Den andra metoden använder musmodeller som innehåller hyperplastiska alveolära knutor (HAN lesioner) som tros likna humana pre-invasiva bröstförändringar 15. Den tredje modellen bygger på etablerad bröstkarcinom cellinjer såsom MCF7 sublinjer (MCF10A) som har en mycket differentierad DCIS som morfologi 3,4. Även om dessa tre modeller har gett molekylära ledtrådar till bröstcancer progression, ingen av dessa metoder är i stånd att bedöma malign potential eller molekylära fenotyp i en enskild patients lesion (er). Histopatiologic analys ger inte information om den funktionella fenotyp av cellerna i de pre-invasiva lesioner. Den musmodell för bröstcancer progression kanske inte alltid motsvarar den histomorphology och mångfald av mänsklig atypisk duktal hyperplasi, lobulär cancer in situ, och duktal cancer in situ 16-18. Dessutom stromal mikromiljö och avsättning av extracellulära matrix omgivande mus prekursor lesioner markant skiljer sig från den mänskliga motsvarigheten 16. Spontana murina prekursor lesioner kan uppvisa en mycket låg nivå av progression till invasion och metastasering. Den tredje metoden, odlade cellinjer, kan ge bara funktionell fenotypisk uppgifter om transplanteras till immunundertryckta värdar 3,4. Utöver de genetiska avvikelser i en lång passe cellinje får inte representera spontan bröstcancer progression hos människor 2. Slutligen är det väl etablerat att varje patients tumörhar en unik kombination av genetiska och epigenetiska avvikelser som driver tillväxten, differentierade tillstånd och utveckling till invasion och metastasering 13,14,17. Mänskliga pre-invasiva lesioner är multifokal och heterogen i cellsammansättning och histomorphology. Dessutom är den biologiska malign potential okänd för en enskild patients pre-invasiv lesion.
Vårt primära vävnadsodlingsmetod övervinner bristerna hos tidigare modeller av human pre-invasiv bröstcancer och ger följande fördelar: 1) organoid kultur Systemet stöder tillväxten av neoplastiska cellpopulationer inom naturliga vävnaden mikromiljö som spontant växa och generera mammospheres som kommer att ge invasiva tumörer i mus xenograft-modeller. Cellerna representerar genotyp och fenotyp av en enskild patient och därigenom ge information om personlig terapi, eller individuell prognos. 2) organoid odlingssystem maintains de interna cellulära subpopulationer och ger en möjlighet att odla icke-maligna epitelceller, stromaceller och immunceller som ursprungligen fanns i den primära bröstvävnad, och transporteras in i kulturen inom organoida. Den låga volymen av media i odlingssystemet stödjer syreutbytet uppmuntra spontan mammosphere bildning och differentierad kanal och alveoler liknande strukturer utan behov av en artificiell tredimensionell byggnadsställningar. 3) Den primära cellkulturen är fri från ändringar och val som genereras av enzymatisk dissociation eller exogen genetisk modifiering. Dessutom är näringsmediet billig och enkel att tillaga. 4) Molekyl och genetisk analys kan utföras på specifika cellpopulationer och / eller organoids från kulturen vid olika tidpunkter utan att störa hela kulturen. 5) organoid odlingssystem tillåter tillväxt, differentierad morfologi och cell-cell interaktioner mellan de infödda cellpopulationer som kanskall studeras före och efter införande av terapeutiska medel in i odlingsmediet.
Även primära vävnadskultur har vissa fördelar, är det inte utan begränsningar. Den organoid kulturen stöder tillväxten av blandade cellkulturer, utan överväxt av någon typ en cell. Emellertid kan det särskilda förhållandet mellan celltyper inte styras och kan sålunda inte rekapitulera de exakta cellulära förhållanden hittats in vivo. Framgångsrik organoid Odling kräver steril insamling och bearbetning vävnad, som båda är inte rutinförfaranden i många samhällssjukhus patologi laboratorier. God kommunikation mellan kliniska forskare, kirurgisk personal och patologi personal är en förutsättning för att bibehålla prov sterilitet inom kontinuum av patientvården.
En ytterligare begränsning av organoid kulturen är effekten av underlaget fasthet på cellulär fenotyp och genuttryck 16,19. Differentiering av stamceller i odlingkan induceras genom tillsats av seruminnehållande medium eller kan bero på längre tid i kultur. En stam-liknande fenotyp bibehölls efter flera månader i denna icke-enzymatiska, serumfria organoid odlingssystem 5. Men vid någon tidpunkt kan cellerna differentierar som kan ses morfologiskt - cellerna blir mindre, tätare, och misslyckas med att bilda mammospheres. För att undvika eventuella problem med förändringar i cellfenotyp över tiden, molekylära experiment, såsom transfektioner eller riva analyser ska utföras med unga kulturer snarare än med gamla kulturer (mer än 6 månader).
Nycklarna till framgång organoid kulturen använder en lämplig volym av mediet i odlingsflaskan, och låta organoids tid att hålla sig till vävnadsodlingskolv. Överskott mediet i kolven gränser syrediffusion, hämma mammosphere bildning. De första 3 - 7 dagars vävnadsodling är kritiska för organoids att fästa på tisstämma odlingskolv. Generellt gäller att om en organoid inte har fäst vid dag 14, det sannolikt inte innehåller några livsdugliga DCIS duktala segment och kommer inte att bli anhängare. Organoids som inte vidhäftat vid dag 14 bör tas bort från kultur. Kan verifieras Bristen på livskraftiga bröst DCIS kanaler efter kultur genom att fastställa organoida i 10% formalin och bearbetning av vävnaden i paraffinblock för vävnadsfärgning och mikroskopisk utvärdering.
Vår icke-enzymatisk, serumfria odlingssystemet resultat stöder hypotesen att genetiskt onormala neoplastiska prekursorceller med invasiv potential finns inom pre-invasiva human bröstförändringar 5,9,20. Detta resultat är i linje med tidigare arbete Sgroi et al., Som genomförde genetisk analys av människans bröst pre-invasiva lesioner och Damonte et al. Som studerade bröst intraepitelial neoplasi utväxt (MINO) musmodell av bröstcancer progression 12,14 , 21. Taget together med slutsatserna från andra, vår kultur modell av patientens individuella pre-invasiva lesioner stöder uppfattningen att den aggressiva fenotypen av en patients invasiv bröstcancer kan vara i stort sett förutbestämd vid pre-invasiva stadiet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av (1) försvarsdepartementet Breast Cancer Research Program (US Army Medical Research Acquisition Aktivitet) utmärkelse # W81XVVH-10-1-0781 till LAL och VE, och (2) det Susan G. Komen Foundation IR122224446 Lal och VE. Patologi support och vävnads uppräkning hölls vänligen av Inova Fairfax patologi Institutionen, Dr Hassan Nayer, Dr. Geetha A. Menezes, och Dr Charles Bechert. Patient samtycke och prov upphandling var flytta vägledas av Inova Fairfax Hospital klinisk forskningssamordnare Holly Gallimore, Heather Huryk och Emil Kamar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Fisher | A405-P | prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water |
| 18 MΩ-cm water, sterile filtered | sterile filtered, Type 1 reagent grade water | ||
| 10 cc plastic disposable syringe, sterile | BD | 305482 | |
| 0.2 µm polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile | Thermo Scientific | 194-2520 | |
| 15 ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 14-959-49B | |
| 50 ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 05-539-6 | |
| 1.5 ml low retention microcentrifuge tubes, sterile | Fisher | 02-681-331 | |
| nutrient medium, DMEM-F12/HEPES | Invitrogen | 11330-032 | with L-glutamine |
| Insulin, human recombinant | Roche | 11376497001 | 10 mg/ml stock |
| Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant | Millipore | GF144 | 100 µg/ml stock |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S1567 | 10 mg/ml stock |
| Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G19114 | 10 mg/ml stock |
| Filtration flask and filter top, sterile | Millipore | SCGPU02RE | 0.22 µm PES membrane |
| 25 ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4489 | paper-plastic wrapped |
| 10 ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4488 | paper-plastic wrapped |
| Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange) | CDI | MD2000 | after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard |
| Cotton tipped applicators, sterile | Fisher | 23-400-115 | single use only |
| Gauze pads, 10 x 10 cm, sterile | Fisher | 2187 | |
| Plastic transfer pipettes, sterile, disposable | Samco | 202-20S | |
| Vinegar, white distilled | household use | 5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes | |
| #10 scalpels, sterile, disposable | Thermo Scientific | 31-200-32 | |
| Petri dish, sterile | Fisher | FB0875713A | |
| TPP 115 cm2 flask, with removable lid | MidSci | 90652 | screw cap with filter |
| CO2 incubator | Fisher | 13-998-074 | 5% CO2, 37 °C, humidified chamber |
| inverted light microscope | Olypmus | IX51 | |
| 8 M urea | Fisher | BP169-500 | optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells |
| 2X SDS tris-glycine buffer | Life Technologies | LC2676 | optional, for proteomic analysis of cultured cells |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | optional, for preparing cell smears |
References
- Shaughnessy, J. A., et al. Treatment and prevention of intraepithelial neoplasia: an important target for accelerated new agent development. Clin Cancer Res. 8 (2), 314-346 (2002).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Behbod, F., et al. An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ. Breast Cancer Res. 11 (5), (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Espina, V., et al. Malignant precursor cells pre-exist in human breast DCIS and require autophagy for survival. PLoS One. 5 (4), (2010).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Farnie, G., et al. Novel cell culture technique for primary ductal carcinoma in situ: role of Notch and epidermal growth factor receptor signaling pathways. J Natl Cancer Inst. 99 (8), 616-627 (2007).
- Wicha, M. S., Liotta, L. A., Garbisa, S., Kidwell, W. R. Basement membrane collagen requirements for attachment and growth of mammary epithelium. Exp Cell Res. 124 (1), 181-190 (1979).
- Espina, V., Liotta, L. A. What is the malignant nature of human ductal carcinoma in situ. Nat Rev Cancer. 11 (1), 68-75 (2011).
- Gong, C., et al. Beclin 1 and autophagy are required for the tumorigenicity of breast cancer stem-like/progenitor cells. Oncogene. 32 (18), 2261-2272 (2012).
- Simon, B., et al. Epithelial glycoprotein is a member of a family of epithelial cell surface antigens homologous to nidogen, a matrix adhesion protein. PNAS. 87 (7), 2755-2759 (1990).
- Ma, X. J., et al. Gene expression profiles of human breast cancer progression. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5974-5979 (2003).
- Schnitt, S. J., Harris, J. R., Smith, B. L. Developing a prognostic index for ductal carcinoma in situ of the breast. Are we there yet. Cancer. 77 (11), 2189-2192 (1996).
- Sgroi, D. C.
- Asch, H. L., Asch, B. B. Heterogeneity of keratin expression in mouse mammary hyperplastic alveolar nodules and adenocarcinomas. Cancer Res. 45 (6), 2760-2768 (1985).
- LaBarge, M. A., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Of microenvironments and mammary stem cells. Stem Cell Rev. 3 (2), 137-146 (2007).
- Smart, C. E., et al. In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Vaillant, F., Asselin-Labat, M. L., Shackleton, M., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. The emerging picture of the mouse mammary stem cell. Stem Cell Rev. 3 (2), 114-123 (2007).
- Kim, D. H., et al. Actin cap associated focal adhesions and their distinct role in cellular mechanosensing. Sci Rep. 2, 555 (2012).
- Espina, V., Wysolmerski, J., Edmiston, K., Liotta, L. A. Attacking breast cancer at the preinvasion stage by targeting autophagy. Women's Health. 9 (2), 1-14 (2013).
- D'amonte, P. Mammary carcinoma behavior is programmed in the precancer stem cell. Breast Cancer Res. 10 (3), (2008).
