Summary
כאן אנו מתארים פרוטוקול כי זוגות שתי טכניקות proteomic, כלומר 2 ממדים אלקטרופורזה (2DE) וספקטרומטריית מסה (MS), לזהות הביעו באופן דיפרנציאלי / חלבונים שונה שלאחר translational בין שתיים או יותר קבוצות של דגימות ראשוניות. גישה זו, יחד עם ניסויים פונקציונליים, מאפשרת זיהוי ואפיון של סמנים / מטרות טיפוליות פרוגנוסטיים.
Abstract
זיהוי של מולקולות מעורבות בהתחלה של גידול והתקדמות הוא יסוד לביולוגיה של המחלה הבנה ו, כתוצאה מכך, לניהול הקליני של מטופלים. בעבודה הנוכחית נתאר גישת proteomic מותאמת במיוחד לזיהוי של מולקולות מעורבות בהתקדמות של כרונית לימפוציטית לוקמיה (CLL). בפירוט, lysates תא leukemic נפתרים על ידי 2 ממדי אלקטרופורזה (2DE) ודמיין כ" כתמים "בג'לים 2DE. ניתוח השוואתי של מפות proteomic מאפשר זיהוי של חלבונים הביעו באופן דיפרנציאלי (במונחים של שפע ולאחר translational שינויים) שנקטפים, מבודדת וזוהה על ידי ספקטרומטריית מסה (MS). הפונקציה הביולוגית של המועמדים שאותרו, ניתן לבדוק על ידי מבחני שונים (כלומר הגירה, הדבקה ופילמור F-אקטין), שיש לנו מותאם במיוחד לתאי leukemic עיקריים.
Introduction
כרונית לימפוציטית לוקמיה (CLL), לוקמיה למבוגרים השכיחה ביותר במדינות המערביות, נובעת מהצטברות של לימפוציטים CD5 + B גידולים חד שבטי וקליני מאוד הטרוגנית. זה יכול להיות נוכח כצורה טרום leukemic, המוגדרת כlymphocytosis B-cell חד שבטי (MBL) 1,2,3. במקרים אחרים המחלה יכולה להופיע גם עם מהלך קליני עצל, שיכולים להישאר יציב למשך שנים לפני צורך טיפול, או כמחלה chemorefractory מתקדמת עם פרוגנוזה עגומה למרות טיפול. לבסוף, זה עלול להתקדם לימפומה לעתים קרובות קטלנית בדרגה גבוהה (תסמונת-RS של ריכטר) 2,3,4. חולים בדרך כלל מסווגים בשתי תת קבוצות עיקריות: פרוגנוזה טובה ורעה, המבוססים על סדרה של גורמים פרוגנוסטיים המספקת מידע משלים במנבאים של תוצאות מחלה והישרדות. ההטרוגניות קלינית סבירה משקפת הטרוגניות ביולוגית. מספר הגנטי, microenvironmental וceגורמי llular הוכחו מסכימים להיווצרות מחלה למרות שאין מנגנונים המאחדים נמצאו 5. בפירוט, מספר מחקרים הראו כי הבדלים במהלך הקליני של המחלה יכולים להיות מוסברים בחלקו על ידי הנוכחות (או העדרם) של כמה סמנים ביולוגיים שיש לי 6,7,8 ערך פרוגנוסטי. נתונים אלה הוכיחו כי הבנה טובה יותר של הביולוגיה המחלה יכולה לספק רמזים נוספים לניהול הקליני של פתולוגיה, על ידי זיהוי של שני סמנים פרוגנוסטיים ומטרות טיפוליות.
מטרתו של המאמר היא להראות כיצד שילוב של טכניקות proteomic שונות יכול לשמש לזיהוי של חלבונים מעורבים בתחילת CLL והתקדמות. הגישה שלנו מוכיחה כי זה אפשרי להצטרף proteomic יחד בסיסי ונתונים קליניים 5.
בעבודה הנוכחית, תאי leukemic עיקריים מחולים שנבחרו(טוב לעומת תחזית רעה) הם מבודדים וlysates התא משמש לאחר מכן כדי להשיג מפות proteomic. 2DE מאפשר אפיון של פרופיל proteomic של אוכלוסיית תאים, לרבות שינויים שלאחר translational, ובכך נותן מידע עקיף על הפעילות הביולוגית של כל חלבון. lysates תא השלם נפתרים על ידי ריצת ממד ראשונה המבוססת על הנקודה איזואלקטרית, ואחריו ממד שני לרוץ על ג'ל polyacrylamide שפותר חלבונים המבוססים על המשקל המולקולרי שלהם. ניתוח השוואתי של מפות proteomic מאפשר זיהוי של חלבונים הביעו באופן דיפרנציאלי (שניהם במונחים של שפע ולאחר translational שינויים) ככתמים על ג'ל שניתן לחתוך ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסה. התפקיד של כל מועמד ניתן לנצל לאחר מכן על ידי מבחני שונים.
גישה זו, מוגבלת לCLL בכתב היד הנוכחית, ניתן להרחיב בקלות למחלות / דוגמאות אחרות, ובכך לספק מידע על proteomiג / הבדלים ביולוגיים בין שתי קבוצות (כלומר פתולוגיים לעומת נורמלי, מגורה vs wild-type unstimulated, לעומת מציאה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל דגימות הרקמה התקבלו עם אישור של המועצה לביקורת המוסדית של סן רפאלה בית החולים (מילאנו, איטליה).
1 דוגמאות רקמה אנושיות וטיהור נייד (איור 1)
הערה: לימפוציטים leukemic התקבלו מהדם היקפי (PB) של חולי CLL, אובחנו על פי et al מוליגן 9.
1.1) הפרדת תאי leukemic מPB
- לאסוף PB בצינורות איסוף דם Vacutainer עם נתרן הפרין.
- העבר את הדם לתוך צינור מ"ל 15 ולהוסיף קוקטייל העשרת B-תא אנושי ב50 μL / מ"ל של דם מלא. מערבבים היטב דגירה 20 דקות בטמפרטורת חדר.
- לדלל מדגם עם נפח שווה של PBS + 2% FBS, לערבב דם בעדינות ובכיסוי בזהירות מעל Ficoll, כדי לוודא שלא לשבור את הממשק. השתמש בחלק לפחות 1 של Ficoll ל2 חלקים של המדגם בדילול מלא (כלומר 4 מ"ל Ficoll + 10 מ"ל דם ב15 t מ"לUbe).
- צנטריפוגה ב XG 400, בטמפרטורת חדר (C ° 20) עבור 20 דקות עם בלם לא. תאי mononuclear יהיו בממשק.
- בזהירות לשאוב הממשק להתאושש התאים ומקום לתוך צינור חדש. שטוף תאים פעם עם PBS ו צנטריפוגות ב XG 300, 4 מעלות צלזיוס בחושך במשך 5 דקות. גלולה תהיה בתחתית.
- בטל supernatant. Resuspend גלולה בsupernatant שנותר על ידי מצליף את הצינור הלוך ושוב עם אצבעות. לדלל את הכדור עם 10 מ"ל בינוני RPMI מלא (RPMI 1640 תוספת 10% עגל בסרום עוברי ו15 מ"ג / מ"ל גנטמיצין) ולספור תאים באמצעות שיטת הדרת Trypan הכחולה.
1.2) הערכת טוהר
הערה: טוהר של כל ההכנות צריכה תמיד להיות מעל 99%.
- דגירה של השעיה תא מטוהרת 100 μl עם הנוגדנים הבאים (זמינים מסחרי; ראה טבלה של חומרים): CD3 FITC (5 μl / test), CD14 PE (5 μl / מבחן), CD19 ECD (6 μl / מבחן), CD16-CD56 PC5 (2 μl / מבחן), CD5 PC7 (4 μl / מבחן), עבור 20 דקות ב 4 ° C ב צינור FACS.
- לשטוף את המדגם עם 4 מ"ל של PBS (צנטריפוגות במשך 5 דקות ב XG 300) ולבדוק את טוהר על ידי זרימת cytometry.Check בעלילת% מתאי CLL (> 99%) אשר שיתוף מפורש CD19 וCD5 על פני השטח שלהם כ שמוצג באיור 1 (6). ודא שההכנות הן כמעט נטולות NK, לימפוציטים מסוג T ומונוציטים ידי בדיקת% מCD3, CD14 וCD16-56 בעלילה, שאמורה להיות קרובים לאפס.
1.3) אחסון דוגמאות
- ללימודי proteomic, לאסוף 25 x 10 6 תאים בצינור 1.5 מ"ל, תאי צנטריפוגות ב XG 300 10 דקות, להשליך כדורי supernatant וLyophilize ל4 שעות. שמור ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
- עבור מבחני אימות, תאים גלולים בRPMI המלא (כמות תלויה בassay נוסף שהואנבחר) ולהמשיך בשלב 4.
2 אלקטרופורזה דו ממדים (2-DE) (איור 2)
2.1) Isoelectrofocusing (IEF)
- Solubilize כדורי תאי CLL עם נפח סופי של 380 חיץ μl 2-DE (344 μl של פתרון RBthio (9 M אוריאה, 10 מ"מ טריס, בחורים 4%), 30 μl של 65mm DTT, 6 μl של 2% ampholine חיץ IPG pH 4-7).
- החל דגימות חלבון (1 מ"ג) ל18 רצועות IPG (pH 4-7) ולבצע IEF בעקבות פרוטוקול סטנדרטי כפי שתואר על ידי אל קונטי et. 10
- לאזן רצועות ב2 מ"ל של איזון חוצץ (EB: 50 חיץ מ"מ pH 8.8 טריס-HCl המכיל 6 מ אוריאה, גליצרול 30%, 2% SDS), בתוספת 2% מDTT הטרי, ל15 דקות ב RT. בטל EB + DTT ולהוסיף 2 מ"ל של EB בתוספת 2.5% Iodoacetamide. דגירה של 15 דקות ב RT על פלטפורמת נדנדה.
2.2) SDS-PAGE
- ייבש את הרצועות על נייר בלי לגעת בג'ל להסרתהעודף של EB. לטעון כל רצועה על גבי 9-16% ג'ל SDS-PAGE שיפוע. הוספת נפח קטן של SDS-אלקטרופורזה חוצץ (טריס 25 מ"מ, גליצין 192 מ"מ, SDS 0,1% w / v) על גבי ג'ל כדי להקל על עומס של הרצועה.
- לאטום את הג'ל על ידי הוספה ~ 5 מ"ל של תמיסה אגר (0.8%) כדי למנוע צף של הרצועה, אז להרכיב את יחידת electrophoretic ולמלא עם SDS-אלקטרופורזה חיץ. לבצע את הריצה ב60 mA / ג'ל ל4 שעות על 4 מעלות צלזיוס.
- להסיר את הג'ל מיחידת electrophoretic ולמקם אותו בתיבת הצביעה הנכונה.
2.3) כתם כסף עבור ההכנה של ג'ל
| Fixer | 50% מתנול 12% חומצה אצטית 0,05% פורמלין | 2 שעות (או לילה) * |
| הצפה לשטוף | 35% Ehanol | 20 דקות (לחזור על השלב שלוש פעמים) |
| רגישות | 0,02% נתרן תיוסולפט | 2 דקות |
| WASH | H 2 O | 5 דקות (לחזור על השלב שלוש פעמים) |
| כסף חנק | 0,2% חנקה כסף 0076% פורמלין | 20 דקות |
| WASH | H 2 O | 1 דקות (לחזור על השלב פעמיים) |
| DEVELOPER | 6% נתרן קרבונט 0,0004% נתרן תיוסולפט פורמלין 0,05% | עד מכתים מספיק |
| STOP | מתנול 50% | 30 דקות |
| * שעה 2 היא הזמן המינימאלי הנדרש לקיבוע חלבון |
טבלת 1.
יכולים להיות דמיינו כתמי חלבון על ידי צביעת ג'לי עם כתם כסף תואם MS 11: הערה. כל הפתרונות דרושיםלצביעת כספם מופיעים בטבלה 1.
- הכן על 200 מ"ל של כל פתרון / ג'ל ופעל כמפורט בטבלה 1. להוסיף כל פתרון לתיבת ההכתמה המכילה את הג'ל בזהירות. לבצע את כל incubations על פלטפורמת נדנדה.
- לאחר הצביעה, להסיר את להפסיק הפתרון ולהשאיר את הג'ל בתמיסה של 1% חומצה אצטית עד לרכישה.
2.4) ג'ל רכישה וניתוח
- לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהה באמצעות מדידת צפיפות תוך 3 ימים מההכתמה.
- לנתח את דפוסי חלבון 2-D באמצעות תוכנה לג'לי 2-DE.
הערה: התוכנה מאפשרת השוואת תמונה מהירה ואמינה.- ליצור פרויקט על ידי בחירה באפשרות "ליצור פרויקט חדש" מתפריט ההקשרים. צור תיקייה ולייבא את ג'לי על ידי בחירה באפשרות "תמונות ג'ל יבוא" עם .tif, .png. או .gel הארכה.
- ברגע שג'לים מיובא והוסיף לworkspאס, לבצע זיהוי מקום אוטומטי על ידי בחירה בג'לים לגילוי מקום ובחירה באפשרות "עריכה> נקודה> לזהות" בתפריט.
- בשלב בא, לבצע חיסור רקע על ידי בחירה מהתפריט "רקע לחסר". הערה: לאחר שזה אפשרי להשוות ג'לי מרובה וכדי לזהות הבדלים או דמיון על ידי ניתוח כמותי ו / או איכותי.
.3 זיהוי חלבון על ידי MALDI-TOF MS ניתוח (איור 3)
3.1) עיכול חלבון
- יש לשטוף את הג'ל עם כתמי מים ובלו של ריבית מג'לי או על ידי מדריך ל( חיתוך עם סכין מנתחים נקיים) או על ידי כריתה אוטומטית.
- לשטוף חלקיקי ג'ל עם מים (100-150 μl), ספין למטה (30 שניות ב XG 400) ולהסיר את הנוזל.
- הוסף נפח שווה (תלוי בג'ל הנפח) של CH 3 CN לחתיכות ג'ל ולחכות ל10-15 דקות, עד שחתיכות ג'ל להתכווץ. ייבש את חלקיקי ג'ל iצנטריפוגה ואקום na.
- הוספת 75-100 μl של 10 מ"מ Dithioerythritol מדולל ב50 מ"מ NH 4 HCO 3 ודגירה של 30 דקות ב 56 ° C (שלב הפחתה). כווץ שוב חתיכות ג'ל עם CH 3 CN כמתואר בשלב 3.1.3.
- להמשיך עם אלקילציה ידי הוספת 75-100 μl של פתרון 55 מ"מ Iodoacetamide מדולל ב50 מ"מ NH 4 HCO 3 ודגירה של 20 דקות בטמפרטורת חדר בחושך.
- לכווץ את חתיכות ג'ל פעם נוספת עם CH 3 CN באמצעות נפח מספיק כדי לכסות את חתיכות ג'ל כפי שמתואר בשלב 3.1.3. יבש בצנטריפוגה ואקום.
- רעננותם החלקיקים במאגר המכיל 25 מ"מ NH 4 HCO 3, 5 מ"מ CaCl 2, ו12,5 ng / μl של טריפסין על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. השתמש בנפח מספיק של חיץ כדי לכסות את חתיכות ג'ל. הסר את supernatant שקוע בלתי מחתיכות ג'ל ולהוסיף 25 מ"מ NH 4 HCO 3, 5 מ"מ CaCl 2 ללא טריפסין לcovאה ג'ל.
- השאר דגימות על 37 מעלות צלזיוס שעה לפחות 3 (הזמן המינימאלי הנדרש לעיכול פפטיד) ללילה.
3.2) המוני ספקטרומטריית ניתוח (טכניקת טיפה יבשה)
- aliquot μl ספוט 1 של כל דגימה על צלחת MALDI נירוסטה ומערבבים עם 1 μl של α-Cyano-4-hydroxycinnamic חומצה כמטריצה, שהוכן ב50% CH 3 CN ו0.1% TFA.
- לקבל ספקטרום המוני בספקטרומטר מסת MALDI-TOF. לצבור על 200 ספקטרום למקום, התאמת עוצמת לייזר על מנת למנוע רוויון אות או להגדיל את האות. ספקטרום תהליך באמצעות תוכנת נתונים Explorer כמפורט להלן:
- ייבא את הקובץ הזאתי המחתה ולבצע תיקון הבסיסי על ידי בחירה באפשרות "תהליך> תיקון בסיס". לכייל המונים באמצעות מוצרי autolysis טריפסין ופסגות מטריצה על ידי בחירה "> כיול מסה> כיול ידני תהליך; לבחור פסגות קרובות למ '/ z 855.1 ו2,163.1 בy שמאל גרירה ובחר את המוני התייחסות המתאימים, לאחר מכן לחץ על "עלילה" ו "להחיל כיול" בחלון הכיול הידני.
- התאם את הסף לגילוי שיא ("פסגה> איתור שיא"), לשכפל את העקבות הפעילה ("תצוגה> לשכפל עקבות פעילים"), בחר את העקבות החדשות ולבצע deisotoping ("שיא> deisotoping"). שימוש במאקרו "getpeaklist", ליצור רשימה של המונים שתשמש לזיהוי. במידת הצורך, להסיר באופן ידני אותות רעש הרימו כמו פסגות לנקות את הרשימה ולקבל זיהוי טוב יותר.
- זיהוי חלבונים על ידי חיפוש במסד נתוני חלבון לא יתיר מקיף באמצעות עמוק וקמע כמו מנועי חיפוש 12.
- השתמש בפרמטרים הבאים בכל החיפושים: אחד מהם פספס מחשוף לפפטיד, חמצון מתיונין כשינוי משתנה, carbamidomethylation ציסטאין כשינוי קבוע וinitiסובלנות המונית אל 50 עמודים לדקה.
.4 Cytoskeletal פעילות מבחני (איור 4)
הערה: תאי Resuspend מטוהרים בשלב 1 בRPMI המלא (10 6 תאים / 200 μl).
4.1) ההגירה Assay. בדיקה זו מאפשרת כימות של קיבולת הנדידה של התאים ניתחו (לימפוציטים). השתמש בתא transwell של 6.5 קוטר מ"מ וגודל נקבובית 5.0 מיקרומטר ולבצע את assay בשלושה עותקים. לייעל את גודל נקבובית וזמן נדידה (שלב 4.1.3) במקרה של סוגי תאים שונים.
- הכן את התא התחתון על ידי הוספת 600 μl של RPMI המלא עם או בלי הגירויים הספציפיים (כלומר SDF-1) כדי למדוד וההגירה הספונטנית המושרית בהתאמה.
- שים את החדר העליון עליו ולאפשר למערכת לאזן במשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס בחממה.
- תאי זרע 10 6/200 μl בחדר העליון (סה"כ מספר תא) ו דגירההצלחת ל4 שעות על 37 מעלות צלזיוס בחממה.
- הסר את החדר העליון, לאסוף את המדיה בתא התחתון ולשטוף את התא התחתון פעם אחת עם 1 מ"ל PBS. לאסוף את PBS בצינור.
- צנטריפוגה 5 דקות ב XG 300, לבטל את supernatant וגלול ב500 μl PBS.
- על ידי cytometry זרימה, לספור את מספר התאים הגרו לאחר 1 דקות של רכישה. במקרה של אוכלוסיית תא מבודדת זה לא הכרחי להוסיף כל נוגדן משטח. בדוק את מספר התאים בעלילה נקודה דו ממדית שוקלת מחליקי הצד של התאים ואת מספר האירועים דמיינו בדקות 1, המהווה את המספר לשימוש עבור חישוב.
- לחשב את מדד ההגירה (MI) כ:
4.2) assay הידבקות. assay זה מאפשר מדידת קיבולת ההידבקות של התאים. לבצע את assay בשלושה עותקים.
- טרום מעיל 96-welצלחת ls (שטוח למטה) עם 50 μl / היטב או 2% BSA-PBS (כרקע) או 1 מיקרוגרם ICAM-1 מדולל PBS, הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
- לשטוף את הצלחת פעמיים עם PBS ולחסום אתרים שאינם ספציפיים על ידי הוספת 2% BSA-PBS (100 μl / טוב) לשעה 1 ב37 מעלות צלזיוס.
- בתאי resuspend בינתיים ב5 x 10 6 / מ"ל בRPMI המלא, לתייג אותם עם גשש תא 1 מ"מ CMFDA ירוק ודגירת 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
- הוסף 1 x 10 6 תאים / היטב לבארות מצופים מראש לאחר השלכת פתרון החסימה (שלב 4.2.2) ודגירת השעה 1 ב37 מעלות צלזיוס.
- לכמת הידבקות באמצעות קורא ELISA (עירור מסנן: 485 ננומטר, פליטה לסנן: 535 ננומטר). לבצע מדידה ראשונה בקלט הכולל (קלט).
- לשטוף את הצלחת בעדינות עם 2% BSA-PBS (200 μl / טוב) 4 פעמים (x). לבצע קריאה של הצלחת לאחר כל שלב כביסה (x הידבקות).
- לאחר חיסור רקע לכל מדידה, לחשב adhes הספציפייון (הידבקות):
4.3) assay פלמור. זה assay colorimetric שמכמת פילמור F-אקטין. לבצע את assay בשלושה עותקים.
- Resuspend 1x10 ^ 6 תאים בשל RPMI המלא מראש חימם 100 μl ולהוסיף הגירוי הספציפי (כלומר 20 מיקרוגרם / מ"ל α-IgM) עבור 10 דקות.
- לעצור את התגובה עם 400 μl של paraformaldehyde 4% ולתקן תאים ל10 דקות ב RT.
- לשטוף 3 פעמים עם PBS (צנטריפוגות ב XG 300 5 דקות, 4 ° C).
- מחק את תאי supernatant וPermeabilize עם 0.2% PBS-saponine (200 μl) על קרח למשך 2 דקות.
- לשטוף 3 פעמים עם 0.1% PBS-saponine (צנטריפוגות ב XG 100 ל5 דקות, 4 ° C), לבטל את supernatant וגלול ב0.1% 100 μl PBS-saponine.
- כתם עם Phalloidin-AlexaFluor 488 (3 מיקרוגרם / מ"ל) ל30 דקות ב t החדרemperature בחושך.
- לשטוף 3 פעמים עם PBS-0.1 saponine%. בטל supernatant וגלול ב300 μl PBS.
- לכמת את כמות F-אקטין על ידי cytometry זרימה, חישוב העוצמה הממוצעת בתפרחת (MFI) של Phalloidin. לנתח את הנתונים שנוצרו בעלילה ממד אחד כדי לייצר היסטוגרמה המבוססת על עוצמת הניאון, ערך MFI מוצג בדו"ח הגרף.
- למדוד פילמור F-אקטין (Δ F-אקטין) כ:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בודדנו תאי B leukemic עיקריים ליצור PB של חולי CLL ונתחנו מפות proteomic. דוגמאות (n = 104) קובצו בשתי תת קבוצות עיקריות המבוסס על המאפיינים הקליניים של כל חולה (פרוגנוזה רעה לעומת פרוגנוזה טובה) וניתוח השוואתי של ג'לי 2DE בוצע.
זיהוי הניתוח מותר של כתמים הביעו באופן דיפרנציאלי בין שתי תת קבוצות (בטווח של נוכחות / היעדרות או שינוי בג'ל, רומזים שינויים בשינויים שלאחר translational; n ≈ 16). אנחנו נכרת כתמים נבחרים מג'לי 2DE ולאחר שהופחת וalkylated, חלבונים היו מתעכלים עם טריפסין ופפטידים בsupernatant וכתוצאה מכך הבחינו על צלחת MALDI. ספקטרה נרכשה בMALDI-TOF וויאג'ר DE. רשימת השיא וכתוצאה מכך הוגשה לקמע ועמוק. המונים בתוך סובלנות המונית מסוימת הצטרף לפפטיד רצפים בבסיס הנתונים, ולאחר מכן התאספו לתוך חלבון, שנחשבזיהה אם הוא עובר ציון מסוים הסתברות (איור 3). על ידי ניתוח זה זיהינו חלבונים מעורבים בעיקר בפעילות cytoskeletal ותהליכים מטבוליים (נתונים שלא פורסמו).
ביניהם, אנו מתמקדים בהיווצרות דם שושלת תאים ספציפי חלבון-1 (HS1), שההפרש זירחון קשור מאוד עם המהלך הקליני של המחלה (איור 4). בפרט, מצאנו כי מטופלים שנשאו נקודה אחת (n = 44, Hyper-פוספורילציה HS1) לחוות תוצאות קליניות רעות, בזמן שיש לי (היפו פוספורילציה HS1 n = 60,) בחולים עם 2 נקודות פרוגנוזה טובה 13 (איור 4 ). הנוכחות של חלבון HS1 בכתמים אז אומתה על ידי immunoblotting ג'ל 2DE עם נוגדנים חד שבטיים כנגד 13 HS1.
מאחר שידוע שHS1 מעורב בשיפוץ cytoskeletal 14, ביצענו במבחני חוץ גופית כדי לבחון if מעמד זירחון HS1 דיפרנציאלי עלול להשפיע על פעילות cytoskeletal בשתי תת קבוצות CLL (טובות לעומת תחזית רעה). מצאנו כי תאי CLL ביצוע HS1 כמו שיש לי נקודה אחת פעילות cytoskeletal לקויה במונחים של הגירה, הדבקה ופילמור אקטין, בהשוואה לדגימות-HS1 תת פוספורילציה, דבר המסביר את ההתנהגות קלינית שונה 15 (איור 5).
איור 1:. זרימת עבודה של טיהור תא leukemic מPB דם מחולי CLL מועבר לתוך צינור 15 מ"ל (1), קוקטייל העשרת B-cell אדם נוסף למדגם (2) וטופחו במשך 20 דקות. דם ואז מדולל עם PBS בשיעור של 1: 1 והניח על החלק העליון של שיפוע הצפיפות (3). צנטריפוגה מדגם שלאחר מכן (4) מאפשרת היווצרות של l מרובה איירס: פלזמה), ב) לימפוציטים מסוג B, C) Ficoll, ד) תאים אדומים ותאים לא רצויים. לימפוציטים מסוג B מטוהרים (שכבה ב) נאספים אז (5), שטפו וטוהר של הכנת תא נותח על ידי cytometry זרימה (6). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. זרימת עבודה של 2DE גלולה היא solubilized במאגר (1) 2DE והעמיסה על רצועת IPG לריצה הראשונה הממד (2-isoelectrofocusing). לאחר איזון, הרצועה נטענת על גבי ג'ל polyacrylamide שיפוע לריצה השנייה הממד (3-SDS-PAGE). ג'ל אז מוכתם לדמיין כתמים / חלבונים (4). לאחר רכישת תמונה ברזולוציה גבוהה, מפות proteomic מנותחות (5). les / ftp_upload / 51,942 51942fig2highres.jpg "target =" / _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: זרימת עבודה של ניתוח MS (1) כתמים של עניין הם נכרת מ2D-ג'ל עם אזמל והועברו לתוך צינור נקי.. (2) לאחר שהופחת וalkylated, חלבונים מתעכלים עם טריפסין, פפטידים בsupernatant וכתוצאה מכך הם הבחינו על צלחת MALDI (3). ספקטרום נרכש בMALDI-TOF וויאג'ר DE. (4) רשימת השיא וכתוצאה מכך הוגשה למנועי קמע וחיפוש עמוק וחיפשה מול מסד נתונים של חלבון לא יתיר מקיף. (5) המונים בתוך סובלנות המונית מסוימת הצטרף לרצפי פפטיד באתר, ולאחר מכן התאסף לתוך חלבון. target = "_blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: מצב זירחון HS1 בקורלציה עם סיכויי ההחלמה של חולי CLL (1) המעגל מזהה שני כתמים קרובים עם אותה המסה מולקולרית (מר) של 79 kDa ונקודה איזואלקטרית שונה (PI) של 4.83 ו4.86 בהתאמה, אשר זוהה על ידי. MS כמו חלבון HS1 (2). (2) שני ג'לים נציג של פרוגנוזה גרועה (ריבוע אדום) וחולים אחד פרוגנוזה טובה CLL (ריבוע ירוק). (3) עקומות Kaplan-Meier להראות הישרדות מצטברת של חולי CLL קובצו לפי דפוס זירחון HS1 (מקום 1, n = 44, לעומת 2 נקודות, n = 60). לחולים עם 2 נקודה (נקודות ירוקות) הישרדות ארוכה יותר באופן משמעותי (חציון הישרדות לא הגיעה) מאשר אלה עם רק אחד (נקודות אדומות)."Target =" /files/ftp_upload/51942/51942fig4highres.jpg _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: פונקציונלי cytoskeletal השפעות מצב זירחון HS1 בדגימות ראשוניות CLL (1) הגירה על transwell של דגימות ראשוניות בנוכחותו או היעדריו של SDF-1.. בגרף מוצגים באמצעות SEM של מספר התאים שנרכשו בדקה 1 בcytometer הזרימה (n = הנקודה HS1 7 של 1 vs n = 12 של 2 נקודה HS1). (2) הידבקות ספונטנית נמדדה לאחר תיוג תא ודגירת שעה 1 ב96-גם צלחות. המוצג כאן הם אמצעי SEM עבור דגימות ראשוניות (n = הנקודה HS1 vs n = 7 של 1 12 של 2 הנקודה HS1). (3) יכולת פילמור F-אקטין של דגימות ראשוניות. המוצג כאן הם אמצעי SEM של המשך F-אקטין היחסיאף אוזן גרון של תאי CLL לאחר גירוי עם SDF-1 וצביעה עם phalloidin FITC שכותרתו (n = הנקודה HS1 5 של 1 vs n = 5 של 2 הנקודה HS1). MFI: ממוצע הקרינה עוצמה. ההיסטוגרמה מייצגת כדוגמה לרכישת מדגם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המטרה של כתב יד זה היא לתאר פרוטוקול מותאם לזיהוי של מולקולות מעורבות בפתוגנזה של CLL, גם אם גישה זו ניתן להרחיב למחלות אחרות ו / או סוגי מדגם אחרים 16-18. על ידי השוואת פרופילי proteomic של 2 תת קבוצות של חולי CLL, טובים לעומת תחזית רעה 19, הראינו כי הם נבדלים במעמד זירחון של HS1 וכי הפעלתה משפיעה על יכולת הנדידה והדבקה של תאי leukemic.
עם כל כבוד לשיטות אחרות, היתרון העיקרי של טכניקות proteomic מוצגות בכתב היד, ג'ל 2DE וMS, הוא שהם מספקים טביעת אצבע של proteome התא שלמה והכי חשוב שהם נותנים מידע על השינויים שלאחר translational של חלבונים. חלבונים שנמצאים באופן דיפרנציאלי פוספורילציה או מסוכר לשנות את עמדתם בג'ל, ועלולים לשנות את פעילותם בתאים.
ove_content "> יתר על כן, תארנו פרוטוקולים להערכה של ההגירה וההדבקה של תאים ששמשו לבדיקה פונקציונלי cytoskeletal; הפרוטוקולים הללו עדיין מתוארים בצורה גרועה לתאים גדלים בהשעיה, שכן הם מיושמים בדרך כלל לתאים חסיד (למשל ריפוי פצע ). המגבלה העיקרית של טכניקת 2DE וMS היא כמות תאים / חלבונים (≈25 x 10 6 תאים לג'ל), ואילו עבור מבחני פונקציונליים היא יכולת הקיום של התאים. האתגר האמיתי הוא לעבוד על תאים ראשוניים , אבל למחלות רבות שלא ניתן להגיע למספר מספק של תאים או תאי חיים לבצע ניסויים אלו, במקרה זה, אם הוא זמין, ניתן להשתמש בשורות תאים.השלב הקריטי ביותר עבור פרוטוקול הטרשת הנפוצה הוא לעבוד בתנאים נקיים (קרטין חינם) על מנת למנוע זיהום וכדי להשיג זיהוי חלבונים ברור. מבחני Cytoskeletal בדרך כלל קשים לשחזר (במיוחד על פרימהתאי ר"י), ולכן הוא הציע לבצע את הניסוי בשלושה עותקים.
כפי שהראנו, השילוב של הגישות שהוצג בכתב יד שזה עוזר בזיהוי של מסלולים חדשים המעורבים במחלות שונות, ובכך לספק לגילוי מטרות טיפוליות חדשות, כפי שהראנו לחלבון HS1 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מודים הלימפה ממאירות היחידה, אליסה עשר Hacken, לידיה סקרפו, מאסימו אלסיו, אנטוניו קונטי, אנג'לה בקי, ואנג'לה Cattaneo.
פרויקט זה נתמך על ידי: Associazione Italiana לla Ricerca sul Cancro AIRC (חוקר גרנט ואונקולוגיה קלינית מיוחד תוכנייה מולקולרית - 5 ל# mille 9965)
CS והתואר ראשון נועדו המחקר, שבוצעו הניסויים, ניתחו את הנתונים וכתבו את כתב היד. MTSB, UR, FBPR סייע בכתיבת כתב היד. PG וFCC נועדו דגימות של חולי המחקר סיפק ונתונים קליניים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitril | MERCK | 61830025001730 | |
| Ammonium Bicarbonate | SIGMA | A6141-500G | |
| 1,4-Dithioerythritol | SIGMA | D9680-5G | |
| Iodoacetamide | SIGMA | I6125-25G | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA | 223506-25G | |
| Trypsin, Sequencing Grade | ROCHE | 11418475001 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | SIGMA | C2020-10G | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6580 | |
| ZipTipµ-C18 | MILLIPORE | ZTC18M096 | |
| RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL | 15064 | |
| PBS | EUROCLONE | ECB4004L | |
| FBS | DOMINIQUE DUTSCHER | S1810 | |
| Lymphoprep | SENTINEL DIAGNOSTICS | 1114547 | |
| Trypan Blue | SIGMA | T8154 | |
| CD19 | BECKMAN COULTER | 082A07770 | ECD |
| CD5 | BECKMAN COULTER | 082A07754 | PC5 |
| CD3 | BECKMAN COULTER | 082A07746 | FITC |
| CD14 | BD | 345785 | PE |
| CD16 | BECKMAN COULTER | 082A07767 | PC5 |
| CD56 | BECKMAN COULTER | 082A07789 | PC5 |
| Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit | GE-Healthcare | 11-0033-64 | |
| Urea | SIGMA | U6504 | |
| Tris-Hcl Buffer | BIO-RAD | 161-0799 | |
| CHAPS | SIGMA | C2020-10G | |
| DTT | SIGMA | D9163-5G | |
| IPGstrips | GE-Healthcare | 17-1233-01 | Linear pH 4-7 18cm |
| IPGbuffer | GE-Healthcare | 17-6000-86 | pH 4-7 |
| Glycerol | SIGMA | G6279 | |
| PROTEAN II XL Cell | BIO-RAD | 165-3188 | |
| SDS | INVITROGEN | NP0001 | |
| Acrilamide | BIO-RAD | 161-0156 | |
| Agarosio | INVITROGEN | 16500 | |
| Methanol | SIGMA | 32213 | |
| Acetic Acid | VWR | 631000 | |
| Formalin | BIO-OPTICAL | 05-K01009 | |
| Ethanol | VWR | 9832500 | |
| Sodium Thiosulfate | FLUKA | 72049 | |
| Silver Nitrate | FLUKA | 85228 | |
| Molecular Dynamics Personal SI Laser Densitometer | Amersham Biosciences | ||
| ImageMaster 2D Platinum 5.0 | Amersham Biosciences | ||
| Sodium Carbonate | MERCK | A0250292 | |
| MALDI-TOF Voyager-DE STR | Applied Biosystems | ||
| Data Explorer software (version 3.2) | Applied Biosystems | ||
| transwell chambre 6.6 mm diameter | CORNING | 3421 | |
| RPMI | EUROCLONE | ECB2000L | WITH L-GLUTAMINE |
| Gentamicin | SIGMA | G1397 | |
| SDF-1 | PREPROTECH | 300-28A | |
| Flat-bottom 96-well plate | BECTON DICKINSON | 353072 | |
| BSA | SANTA CRUZ | 9048-46-8 | |
| ICAM-1 | R&D Systems | 720-IC | |
| CMFDA | Life Thechnology | C7025 | Green |
| IgM | SOUTHERNBIOTECH | 2020-02 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
| Saponine | SIGMA | S-7900 | |
| Phalloidin | Life Thechnology | A12379 | Alexa fluor 488 |
References
- Caligaris-Cappio, F., Ghia, P. Novel insights in chronic lymphocytic leukemia: are we getting closer to understanding the pathogenesis of the disease. J Clin Oncol. 26, 4497-4503 (2008).
- Rawstron, A. C., et al. Monoclonal B-cell lymphocytosis and chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 359, 575-583 (2008).
- Dagklis, A., Fazi, C., Scarfo, L., Apollonio, B., Ghia, P. Monoclonal B lymphocytosis in the general population. Leuk Lymphoma. 50, 490-492 (2009).
- Fazi, C., et al. General population low-count CLL-like MBL persists over time without clinical progression, although carrying the same cytogenetic abnormalities of CLL. Blood. 118, 6618-6625 (2011).
- Caligaris-Cappio, F., Bertilaccio, M. T., Scielzo, C. How the microenvironment wires the natural history of chronic lymphocytic leukemia. Seminars in cancer biology. , (2013).
- Damle, R. N., et al. Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 94, 1840-1847 (1999).
- Lanham, S., et al. Differential signaling via surface IgM is associated with VH gene mutational status and CD38 expression in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 101, 1087-1093 (2003).
- Wiestner, A., et al. ZAP-70 expression identifies a chronic lymphocytic leukemia subtype with unmutated immunoglobulin genes, inferior clinical outcome, and distinct gene expression profile. Blood. 101, 4944-4951 (2003).
- Mulligan, C. S., Thomas, M. E., Mulligan, S. P. Lymphocytes, B lymphocytes, and clonal CLL cells: observations on the impact of the new diagnostic criteria in the 2008 Guidelines for Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL). Blood. 113, 6496-6497 (2009).
- Conti, A., et al. Proteome study of human cerebrospinal fluid following traumatic brain injury indicates fibrin(ogen) degradation products as trauma-associated markers. J Neurotrauma. 21, 854-863 (2004).
- Mortz, E., Krogh, T. N., Vorum, H., Gorg, A. Improved silver staining protocols for high sensitivity protein identification using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight analysis. Proteomics. 1, 1359-1363 (2001).
- Zhang, W., Chait, B. T. ProFound: an expert system for protein identification using mass spectrometric peptide mapping information. Anal Chem. 72, 2482-2489 (2000).
- Scielzo, C., et al. HS1 protein is differentially expressed in chronic lymphocytic leukemia patient subsets with good or poor prognoses. J Clin Invest. 115, 1644-1650 (2005).
- Muzio, M., et al. HS1 complexes with cytoskeleton adapters in normal and malignant chronic lymphocytic leukemia B cells. Leukemia. 21 (9), 2067-2070 (2007).
- Scielzo, C., et al. HS1 has a central role in the trafficking and homing of leukemic B cells. Blood. 116, 3537-3546 (2010).
- Kashuba, E., et al. Proteomic analysis of B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukaemia reveals a possible role for kininogen. J Proteomics. 91, 478-485 (2013).
- Dhamoon, A. S., Kohn, E. C., Azad, N. S. The ongoing evolution of proteomics in malignancy. Drug Discov Today. 12, 700-708 (2007).
- Ummanni, R., et al. Identification of clinically relevant protein targets in prostate cancer with 2D-DIGE coupled mass spectrometry and systems biology network platform. PLoS One. 6, (2011).
