כאן אנו מתארים פרוטוקול כי זוגות שתי טכניקות proteomic, כלומר 2 ממדים אלקטרופורזה (2DE) וספקטרומטריית מסה (MS), לזהות הביעו באופן דיפרנציאלי / חלבונים שונה שלאחר translational בין שתיים או יותר קבוצות של דגימות ראשוניות. גישה זו, יחד עם ניסויים פונקציונליים, מאפשרת זיהוי ואפיון של סמנים / מטרות טיפוליות פרוגנוסטיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מספוט 2DE-ג'ל לתפקוד חלבון: לקח מHS1 בכרוני לימפוציטית לוקמיה
במאמר זה
סיכום
תקציר
זיהוי של מולקולות מעורבות בהתחלה של גידול והתקדמות הוא יסוד לביולוגיה של המחלה הבנה ו, כתוצאה מכך, לניהול הקליני של מטופלים. בעבודה הנוכחית נתאר גישת proteomic מותאמת במיוחד לזיהוי של מולקולות מעורבות בהתקדמות של כרונית לימפוציטית לוקמיה (CLL). בפירוט, lysates תא leukemic נפתרים על ידי 2 ממדי אלקטרופורזה (2DE) ודמיין כ" כתמים "בג'לים 2DE. ניתוח השוואתי של מפות proteomic מאפשר זיהוי של חלבונים הביעו באופן דיפרנציאלי (במונחים של שפע ולאחר translational שינויים) שנקטפים, מבודדת וזוהה על ידי ספקטרומטריית מסה (MS). הפונקציה הביולוגית של המועמדים שאותרו, ניתן לבדוק על ידי מבחני שונים (כלומר הגירה, הדבקה ופילמור F-אקטין), שיש לנו מותאם במיוחד לתאי leukemic עיקריים.
מבוא
כרונית לימפוציטית לוקמיה (CLL), לוקמיה למבוגרים השכיחה ביותר במדינות המערביות, נובעת מהצטברות של לימפוציטים CD5 + B גידולים חד שבטי וקליני מאוד הטרוגנית. זה יכול להיות נוכח כצורה טרום leukemic, המוגדרת כlymphocytosis B-cell חד שבטי (MBL) 1,2,3. במקרים אחרים המחלה יכולה להופיע גם עם מהלך קליני עצל, שיכולים להישאר יציב למשך שנים לפני צורך טיפול, או כמחלה chemorefractory מתקדמת עם פרוגנוזה עגומה למרות טיפול. לבסוף, זה עלול להתקדם לימפומה לעתים קרובות קטלנית בדרגה גבוהה (תסמונת-RS של ריכטר) 2,3,4. חולים בדרך כלל מסווגים בשתי תת קבוצות עיקריות: פרוגנוזה טובה ורעה, המבוססים על סדרה של גורמים פרוגנוסטי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: כל דגימות הרקמה התקבלו עם אישור של המועצה לביקורת המוסדית של סן רפאלה בית החולים (מילאנו, איטליה).
1 דוגמאות רקמה אנושיות וטיהור נייד (איור 1)
הערה: לימפוציטים leukemic התקבלו מהדם היקפי (PB) של חולי CLL, אובחנו על פי et al מוליגן 9.
1.1) הפרדת תאי leukemic מPB
- לאסוף PB בצינורות איסוף דם Vacutainer עם נתרן הפרין.....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בודדנו תאי B leukemic עיקריים ליצור PB של חולי CLL ונתחנו מפות proteomic. דוגמאות (n = 104) קובצו בשתי תת קבוצות עיקריות המבוסס על המאפיינים הקליניים של כל חולה (פרוגנוזה רעה לעומת פרוגנוזה טובה) וניתוח השוואתי של ג'לי 2DE בוצע.
זיהוי הניתוח מותר של כתמים הביעו באופן דיפרנציאלי בין שתי תת קבוצות (בטווח של נוכחות / היעדרות או שינוי בג'ל, רומזים שינויים בשינויים שלאחר translational; n ≈ 16). אנחנו נכרת כתמ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
המטרה של כתב יד זה היא לתאר פרוטוקול מותאם לזיהוי של מולקולות מעורבות בפתוגנזה של CLL, גם אם גישה זו ניתן להרחיב למחלות אחרות ו / או סוגי מדגם אחרים 16-18. על ידי השוואת פרופילי proteomic של 2 תת קבוצות של חולי CLL, טובים לעומת תחזית רעה 19, הראינו כי הם נבדלים במעמד זירחון של HS1 וכי הפעלתה משפיעה על יכולת הנדידה והדבקה של תאי leukemic.
עם כל כבוד לשיטות אחרות, היתרון העיקרי .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
אנו מודים הלימפה ממאירות היחידה, אליסה עשר Hacken, לידיה סקרפו, מאסימו אלסיו, אנטוניו קונטי, אנג'לה בקי, ואנג'לה Cattaneo.
פרויקט זה נתמך על ידי: Associazione Italiana לla Ricerca sul Cancro AIRC (חוקר גרנט ואונקולוגיה קלינית מיוחד תוכנייה מולקולרית - 5 ל# mille 9965)
CS והתואר ראשון נועדו המחקר, שבוצעו הניסויים, ניתחו את הנתונים וכתבו את כתב היד. MTSB, UR, FBPR סייע בכתיבת כתב היד. PG וFCC נועדו דגימות של חולי המחקר סיפק ונתונים קליניים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אצטוניטריל | MERCK | 61830025001730 | |
| אמוניום ביקרבונט | SIGMA | A6141-500G | |
| 1,4-דיתיאוריתריטול | SIGMA | D9680-5G | |
| יודואאצטמיד | SIGMA | I6125-25G | |
| סידן כלוריד דיהידראט | SIGMA | 223506-25G | |
| טריפסין, דרגת ריצוף | ROCHE | 11418475001 | |
| &- חומצה ציאנו-4-הידרוקסיצינמית | SIGMA | C2020-10G | |
| חומצה טריפלואורואצטית | SIGMA | T6580 | |
| ZipTipµ-C18 | MILLIPORE | ZTC18M096 | |
| RosetteSep קוקטייל העשרת תאי B אנושיים | גזע | 15064 | |
| PBS | EUROCLONE | ECB4004L | |
| FBS | DOMINIQUE DUTSCHER | S1810 | |
| Lymphoprep | SENTINEL DIAGNOSTICS | 1114547 | |
| Trypan Blue | SIGMA | T8154 | |
| CD19 | בקמן קולטר | 082A07770 | ECD |
| CD5 | בקמן קולטר | 082A07754 | PC5 |
| CD3 | בקמן קולטר | 082A07746 | FITC |
| CD14 | BD | 345785 | PE |
| CD16 | בקמן קולטר | 082A07767 | PC5 |
| CD56 | בקמן קולטר | 082A07789 | PC5 |
| Ettan IPGphor 3 יחידת מיקוד איזואלקטרית | GE-Healthcare | 11-0033-64 | |
| אוריאה | SIGMA | U6504 | |
| Tris-HCL מאגר | BIO-RAD | 161-0799 | |
| CHAPS | SIGMA | C2020-10G | |
| DTT | SIGMA | D9163-5G | |
| IPGstrips | GE-Healthcare | 17-1233-01 | pH ליניארי 4-7 18 ס"מ |
| IPGbuffer | GE-Healthcare | 17-6000-86 | pH 4-7 |
| גליצרול | SIGMA | G6279 | |
| PROTEAN II XL Cell | BIO-RAD | 165-3188 | |
| SDS | INVITROGEN | NP0001 | |
| Acrilamide | BIO-RAD | 161-0156 | |
| Agarosio | INVITROGEN | 16500 | |
| מתנול | SIGMA | 32213 | |
| חומצה אצטית | VWR | 631000 | |
| פורמלין | BIO-OPTICAL | 05-K01009 | |
| אתנול | VWR | 9832500 | |
| נתרן תיוסולפט | FLUKA | 72049 | |
| כסף חנקתי | FLUKA | 85228 | |
| דינמיקה מולקולרית מד צפיפות לייזר SI אישי | אמרשם Biosciences | ||
| ImageMaster 2D Platinum 5.0 | Amersham Biosciences | ||
| נתרן קרבונט | MERCK | A0250292 | |
| MALDI-TOF Voyager-DE STR | תוכנת Applied Biosystems | ||
| Data Explorer (גרסה 3.2) | Applied Biosystems | ||
| transwell chambre קוטר 6.6 מ"מ | קורנינג | 3421 | |
| סל"ד | יורוקלון | ECB2000L | עם L-גלוטמין |
| ג'נטמיצין | SIGMA | G1397 | |
| SDF-1 | PREPROTECH | 300-28A | |
| תחתית שטוחה 96 בארות צלחת | בקטון דיקינסון | 353072 | |
| BSA | סנטה קרוז | 9048-46-8 | |
| ICAM-1 | מו"פ D Systems | 720-IC | |
| CMFDA | Life Thechnology | C7025 | Green |
| IgM | SOUTHERNBIOTECH | 2020-02 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
| Saponine | SIGMA | S-7900 | |
| Phalloidin | טכניית חיים | A12379 | אלכסה פלואור 488 |
מקורות
- Caligaris-Cappio, F., Ghia, P. Novel insights in chronic lymphocytic leukemia: are we getting closer to understanding the pathogenesis of the disease. J Clin Oncol. 26, 4497-4503 (2008).
- Rawstron, A. C., et al. Monoclonal B-....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
