Summary
Hier beschrijven we een protocol dat paren twee proteomics technieken, namelijk de 2-dimensionale elektroforese (2DE) en massaspectrometrie (MS), te identificeren differentieel tot expressie / post-translationeel gemodificeerde eiwitten tussen twee of meer groepen van primaire monsters. Deze aanpak, in combinatie met functionele experimenten, maakt de identificatie en karakterisering van prognostische markers / therapeutische doelen.
Abstract
De identificatie van moleculen betrokken bij tumor initiatie en progressie is fundamenteel voor de biologie inzicht ziekte en, bijgevolg voor de klinische behandeling van patiënten. In dit werk zullen we een geoptimaliseerde proteomics aanpak voor de identificatie van moleculen die betrokken zijn bij de progressie van chronische lymfatische leukemie (CLL) te beschrijven. In detail zijn leukemische cellysaten gescheiden door 2-dimensionale elektroforese (2DE) en gevisualiseerd als "spots" op de 2DE gels. Vergelijkende analyse van proteomics kaarten maakt de identificatie van differentieel tot expressie gebrachte eiwitten (in termen van overvloed en post-translationele modificaties) die worden geplukt, geïsoleerd en geïdentificeerd door massaspectrometrie (MS). De biologische functie van de geïdentificeerde kandidaten worden getest door verschillende assays (bijvoorbeeld migratie, adhesie en F-actine polymerisatie), die we hebben geoptimaliseerd voor primaire leukemische cellen.
Introduction
Chronische Lymfatische Leukemie (CLL), de meest voorkomende leukemie bij volwassenen in de westerse landen, is afgeleid van de accumulatie van monoklonale neoplastische CD5 + B-lymfocyten en is klinisch zeer heterogeen. Het kan als een pre-leukemische vorm, gedefinieerd als monoklonale B-cel CLL (MBL) 1,2,3 zijn. In andere gevallen kan de ziekte voorkomen, ofwel met een indolent beloop, kan dat jarenlang stabiel blijven voordat behandeling nodig hebben, of als een progressieve chemorefractory ziekte met sombere prognose ondanks therapie. Ten slotte kan vooruitgang in een vaak dodelijke hooggradige lymfomen (Richter syndroom-RS) 2,3,4. Patiënten worden meestal ingedeeld in twee subgroepen: goede en slechte prognose, gebaseerd op een reeks van prognostische factoren die aanvullende informatie over voorspellers van de ziekte uitkomst en overleving biedt. Klinische heterogeniteit waarschijnlijk weerspiegelt biologische heterogeniteit. Een aantal genetische, micro-omgeving en cellular factoren is aangetoond dat eens aan pathogenese hoewel geen verenigende mechanismen gevonden 5. In detail hebben verscheidene studies aangetoond dat verschillen in het klinische verloop van de ziekte kan gedeeltelijk worden verklaard door de aanwezigheid (of afwezigheid) van bepaalde biologische markers die voorspellende waarde hebben 6,7,8. Deze gegevens toonden dat een beter begrip van de ziektebiologie extra aanwijzingen oplevert voor een klinische behandeling van de pathologie, de identificatie van zowel prognostische merkers en therapeutische doelwitten.
Het doel van dit papier aan hoe een combinatie van verschillende proteomische technieken kunnen worden gebruikt voor de identificatie van eiwitten betrokken bij CLL ontstaan en de progressie. Onze aanpak toont aan dat het mogelijk is om samen basic proteomische en klinische gegevens 5 sluiten.
In de huidige workflow, primaire leukemische cellen van geselecteerde patiënten(Good vs slechte prognose) geïsoleerd en cellysaten worden vervolgens gebruikt om proteoom kaarten verkrijgen. 2DE maakt de karakterisering van het proteomische profiel van een celpopulatie, waaronder post-translationele modificaties, waardoor indirect gegevens over de biologische activiteit van elk eiwit. Hele cellysaten worden opgelost door een eerste dimensie run gebaseerd op het isoelektrische punt, gevolgd door een tweede dimensie lopen op een polyacrylamidegel die eiwitten opgelost op basis van hun molecuulgewicht. Vergelijkende analyse van proteomics kaarten maakt de identificatie van differentieel tot expressie gebrachte eiwitten (zowel in overvloed en post-translationele modificaties) als vlekken op de gel af te snijden en door massaspectrometrie geanalyseerd. De rol van elke kandidaat kan vervolgens worden uitgebuit door verschillende assays.
Deze aanpak beperkt tot CLL in de huidige manuscript, kan gemakkelijk worden uitgebreid naar andere ziekten / samples, waardoor informatie verstrekken over het proteomic / biologische verschillen tussen de twee groepen (bijvoorbeeld pathologische versus normale gestimuleerde versus ongestimuleerde wildtype versus knockdown).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: alle weefselmonsters werden verkregen met toestemming van de Institutional Review Board van ziekenhuis San Raffaele (Milaan, Italië).
1 Human Tissue Monsters en Cell Purification (figuur 1)
OPMERKING: leukemie lymfocyten werden verkregen uit het perifere bloed (PB) van CLL patiënten gediagnosticeerd volgens de Mulligan c.s. 9.
1.1) Leukemic Cell Scheiding van PB
- Verzamel PB in vacutainer bloedafnamebuisjes met natriumheparine.
- Breng bloed in een 15 ml buis en voeg humane B-cel verrijkingscocktail 50 ul / ml volbloed. Meng goed en incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
- Verdun het monster met een gelijk volume PBS + 2% FBS, meng voorzichtig overlay bloed via Ficoll en zorg niet de interface breken. Gebruik minimaal 1 deel Ficoll 2 delen van het verdunde monster (bijvoorbeeld 4 ml Ficoll + 10 ml bloed in een 15 ml tube).
- Centrifugeer bij 400 xg bij kamertemperatuur (20 ° C) gedurende 20 min zonder remmen. Mononucleaire cellen zullen de interface.
- Zuig het interface naar de cellen herstellen en te plaatsen in een nieuwe buis voorzichtig. Was de cellen eenmaal met PBS en centrifugeer bij 300 xg, 4 ° C in het donker gedurende 5 minuten. De pellet wordt onderaan.
- Verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet in de resterende supernatant in door de buis heen en weer met vingertoppen. Verdun de pellet met 10 ml compleet RPMI-medium (RPMI 1640 aangevuld met 10% foetaal kalfsserum en 15 mg / ml gentamicine) en tel cellen met de Trypan Blue exclusiemethode.
1.2) Zuiverheid Evaluatie
OPMERKING: Zuiverheid van alle preparaten moet altijd boven 99% zijn.
- Incubate 100 ul van gezuiverd celsuspensie met de volgende antilichamen (in de handel verkrijgbaar, zie Tabel van Materialen): CD3 FITC (5 pl / test), CD14 PE (5 pl / test), CD19 ECD (6 pl / test), CD16-CD56 PC5 (2 pl / test), CD5 PC7 (4 pl / test), gedurende 20 min bij 4 ° C in een FACS buis.
- Was het monster met 4 ml PBS (centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 xg) en controleer de zuiverheid stroming cytometry.Check in de plot% van de CLL-cellen (> 99%) die CD19 en CD5-express samen op hun oppervlak getoond in Figuur 1 (6). Ervoor zorgen dat de voorbereidingen zijn vrijwel verstoken van NK, T-lymfocyten en monocyten door het controleren van het% van CD3, CD14 en CD16-56 in de plot, die moet worden in de buurt van nul.
1.3) De monsters Storage
- Voor proteomische studies uitvoeren, 25 x 10 6 cellen in een 1,5 ml buis, centrifuge cellen bij 300 g gedurende 10 min, gooi het supernatant en Lyophilize pellets 4 uur. Bewaren bij -80 ° C tot gebruik.
- Voor validatie assays, resuspendeer cellen in compleet RPMI (hoeveelheid afhankelijk van de verdere test die isgekozen) en ga verder met stap 4.
2 Tweedimensionale elektroforese (2-DE) (figuur 2)
2.1) Isoelectrofocusing (IEF)
- Oplosbaar CLL cellen pellets met een eindvolume van 380 pl 2-DE buffer (344 ui van een oplossing RBthio (9 M ureum, 10 mM Tris, 4% CHAPS), 30 gl 65 mM DTT, 6 pl 2% IPG buffer Ampholine pH 4-7).
- Toepassen eiwitmonsters (1 mg) tot 18 IPG strips (pH 4-7) en voer IEF volgende standaard protocol zoals beschreven door Conti et al. 10
- Equilibreer strips in 2 ml equilibratiebuffer (EB: 50 mM pH 8,8 Tris-HCl buffer die 6 M ureum, 30% glycerol, 2% SDS), aangevuld met 2% verse DTT, gedurende 15 minuten bij KT. Weggooien EB + DTT en voeg 2 ml van EB, aangevuld met 2,5% joodacetamide. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur op een schudplatform.
2.2) SDS-PAGE
- Droog de strips op een papier zonder het gel te verwijderende overmaat aan EB. Laad elke strook op een 9-16% gradiënt SDS-PAGE gel. Voeg een kleine hoeveelheid SDS-elektroforese buffer (Tris 25 mM, 192 mM glycine, SDS 0,1% w / v) op de gel het laden van de strip vergemakkelijkt.
- Dicht de gel door toevoeging ~ 5 ml agar-oplossing (0,8%) te voorkomen drijven van de strip, dan verzamelen de elektroforetische apparaat en vul met SDS-elektroforese buffer. Voer de run van 60 mA / gel gedurende 4 uur bij 4 ° C.
- Verwijder de gel uit de elektroforetische apparaat en plaats het in de juiste vlekken doos.
2.3) Silver Stain voor Preparatief Gel
| FIXER | 50% Methanol 12% Azijnzuur 0,05% Formaline | 2 uur (of overnacht) * |
| Wash Buffer | 35% Ehanol | 20 min (herhaal de stap drie keer) |
| Sensibiliserende | 0,02% Natriumthiosulfaat | 2 min |
| WASH | H2O | 5 min (herhaal de stap drie keer) |
| ZILVERNITRAAT | 0,2% Silver Nitrate 0,076% formaline | 20 min |
| WASH | H2O | 1 min (herhaal de stap tweemaal) |
| DEVELOPER | 6% natriumcarbonaat 0,0004% Natriumthiosulfaat 0,05% formaline | Totdat de kleuring voldoende |
| STOP | 50% Methanol | 30 min |
| * 2 uur is de minimale tijd die nodig is voor eiwitfixatie |
Tabel 1.
OPMERKING: Eiwit plekken kan worden gevisualiseerd door kleuring gels met MS compatibele zilveren vlek 11. Alle oplossingen nodigvoor zilver kleuring worden weergegeven in tabel 1.
- Bereid ongeveer 200 ml van elke oplossing / gel en verder als beschreven in tabel 1. Voeg voorzichtig elke oplossing van kleuring kast met de gel. Voer alle incubaties op een schommelende platform.
- Na de kleuring, verwijder de stop oplossing en laat de gel in een oplossing van 1% azijnzuur tot aankoop.
2.4) Gel Verwerving en Analyse
- Acquire beelden met een hoge resolutie met behulp van een densitometer binnen 3 dagen na de kleuring.
- Analyseer 2-D eiwitpatronen door het gebruik van software voor 2-DE-gels.
OPMERKING: De software maakt een snelle en betrouwbare image vergelijking.- Maak een project door te kiezen voor "maak een nieuw project" uit het contextmenu. Maak een map en de gels importeren door met .tif kiezen "import gel beelden", PNG. of .gel extensie.
- Zodra de gels worden geïmporteerd en toegevoegd aan de workspaas, voeren een geautomatiseerde spot detectie door het selecteren van de gels voor spot detectie en kiezen voor "bewerken> spot> detecteren" in het menu.
- Voer daarna een achtergrond aftrekken door het selecteren van het menu "aftrekken achtergrond". Opmerking: Na dat het mogelijk is om meerdere gels vergelijken en verschillen of overeenkomsten door kwantitatieve en / of kwalitatieve analyse detecteren.
3 Eiwit identificatie door MALDI-TOF MS analyse (Figuur 3)
3.1) eiwitvertering
- Spoel de gel met water en accijnzen plekken van interesse van gels of door handmatig (snijden met een schone scalpel) of door automatische excisie.
- Wassen gel deeltjes met water (100-150 ul), spin down (30 sec bij 400 xg) en verwijder de vloeistof.
- Voeg een gelijk volume (afhankelijk van de gel volume) CH3CN de gel stukken en wacht 10-15 minuten totdat de gelstukken krimpen. Droog de geldeeltjes ina vacuüm centrifuge.
- Voeg 75-100 ui 10 mM dithioerythritol verdund in 50 mM NH 4 HCO 3 en incubeer gedurende 30 minuten bij 56 ° C (reductiestap). Krimp opnieuw de gelstukken met CH3CN zoals beschreven in stap 3.1.3.
- Ga door alkylering door toevoeging 75-100 ul van een oplossing 55 mM joodaceetamide verdund in 50 mM NH 4 HCO 3 en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Krimp de gelstukken nogmaals met CH3CN met voldoende volume om de stukken gel, zoals beschreven in stap 3.1.3. Droog in een vacuüm centrifuge.
- Hydrateren de deeltjes in een buffer die 25 mM NH 4 HCO 3, 5 mM CaCl2 en 12,5 ng / ul trypsine bij 4 ° C gedurende 20 minuten. Gebruik voldoende volume van buffer om de gelstukken dekken. Verwijder de niet-geabsorbeerde supernatant uit de gel stukjes en voeg 25 mM NH 4 HCO 3, 5 mM CaCl2 zonder trypsine om covre van de gel.
- Laat de monsters bij 37 ° C minstens 3 uur (de minimale tijd die vereist peptide digestie) overnacht.
3.2) massaspectrometrie Analyse (Gedroogde druppel techniek)
- Spot 1 pi aliquot van elk monster op een roestvrij stalen plaat MALDI en meng met 1 pl van α-cyano-4-hydroxykaneelzuur als matrix, bereid in 50% CH3CN en 0,1% TFA.
- Verkrijgen massaspectra een MALDI-TOF massaspectrometer. Accumuleren ongeveer 200 spectra per spot, het aanpassen van de laser intensiteit om verzadiging te voorkomen of om het signaal te verhogen. Proces spectra via Data Explorer software, zoals hieronder beschreven:
- Importeer het DAT-bestand en voer de basislijn correctie door te kiezen voor "proces> basislijn correctie". Kalibreren massa met behulp van de trypsine autolyse producten en matrix pieken door te kiezen voor "proces> massa kalibratie> handmatige kalibratie; Selecteer pieken dicht bij m / z 855,1 en 2163,1 by naar links te slepen en selecteer de bijbehorende referentie-massa's, en klik vervolgens op "plot" en "toepassen kalibratie" in de handmatige kalibratie venster.
- Pas de drempel voor piekdetectie ("piek> piekdetectie"), dupliceren de actieve trace ("scherm> dupliceren actieve trace"), selecteer het nieuwe trace en het uitvoeren van de deisotoping ("piek> deisotoping"). De macro "getpeaklist", genereren een lijst van massa's worden gebruikt voor de identificatie. Indien nodig, met de hand geluid signalen opgepikt als pieken naar de lijst schoon te maken en een betere identificatie te verwijderen.
- Identificeren eiwitten door te zoeken op een uitgebreide niet-redundante eiwit database met behulp van diepgaande en Mascot zoekmachines 12.
- Gebruik de volgende parameters in alle zoekopdrachten: een gemiste splitsing per peptide, methionine oxidatie als variabele modificatie, cysteïne carbamidomethylation als vaste modificatie en een initial massatolerantie van 50 ppm.
4 Cytoskelet Activiteit assays (figuur 4)
OPMERKING: Resuspendeer cellen gezuiverd in stap 1 in volledige RPMI (10 6 cellen / 200 pi).
4.1) Migratie Assay. Deze test maakt kwantificering van de trekkende capaciteit van de geanalyseerde cellen (lymfocyten). Gebruik een transwell kamer van 6,5 mm diameter en 5,0 micrometer poriegrootte en het uitvoeren van de test in drievoud. Optimaliseer poriegrootte en migratie tijd (stap 4.1.3) in het geval van verschillende celtypen.
- Bereid de onderste kamer door toevoeging van 600 ul compleet RPMI met of zonder specifieke stimuli (bijvoorbeeld SDF-1) de geïnduceerde en spontane migratie respectievelijk meten.
- Plaats de bovenste kamer op en laat het systeem equilibreren gedurende 30 minuten bij 37 ° C in de incubator.
- Seed 10 6 cellen / 200 ul in de bovenste kamer (totaal aantal cellen) en incubeerde plaat gedurende 4 uur bij 37 ° C in de incubator.
- Verwijder de bovenste kamer, het verzamelen van de media in de onderste kamer en was de onderste kamer een keer met 1 ml PBS. Verzamel de PBS in de buis.
- Centrifugeer 5 minuten bij 300 xg, gooi het supernatant en resuspendeer in 500 pi PBS.
- Door flowcytometrie, tel het aantal gemigreerde cellen na 1 min van de overname. Bij een geïsoleerde celpopulatie is het niet nodig om een oppervlak antilichaam toegevoegd. Controleer het aantal cellen in een bi-dimensionale puntdiagram gelet kant scatters van de cellen en het aantal gebeurtenissen zichtbaar in 1 min, hetgeen het aantal te gebruiken voor de berekening.
- Bereken de Migratie Index (MI) als:
4.2) Adhesie assay. Deze test maakt het meten van de hechting capaciteit van de cellen. Voer de test in drievoud.
- Pre-coat 96-wells plaat (vlakke bodem) met 50 ul / putje van hetzij 2% BSA-PBS (als achtergrond) of 1 ug ICAM-1 verdund in PBS, overnacht bij 4 ° C.
- Was de plaat tweemaal met PBS en blok aspecifieke plaatsen door toevoeging van 2% BSA-PBS (100 ul / putje) gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- Ondertussen resuspendeer cellen bij 5 x 10 6 / ml in volledig RPMI, labelen met 1 mM CMFDA-groene cel tracker en incubeer 30 minuten bij 37 ° C.
- Voeg 1 x 10 6 cellen / putje om de pre-beklede putjes na weggooien de blockingbuffer (stap 4.2.2) en incubeer 1 uur bij 37 ° C.
- Kwantificeren hechting met behulp van een ELISA-lezer (excitatiefilter: 485 nm, emissie filter: 535 nM). Voer een eerste meting van de totale input (INPUT).
- Was de plaat voorzichtig met 2% BSA-PBS (200 ul / putje) 4 keer (x). Voer een lezing van de plaat na elke wasstap (Hechting x).
- Na achtergrond aftrekken voor elke meting te berekenen specifieke kleefstoion (ADHESION):
4.3) Polymerisatie assay. Dit is een colorimetrische test die F-actine polymerisatie kwantificeert. Voer de test in drievoud.
- Resuspendeer 1x10 ^ 6 cellen in 100 ul voorverwarmde compleet RPMI en voeg de specifieke stimulus (bijvoorbeeld α-IgM 20 ug / ml) gedurende 10 minuten.
- Stop de reactie met 400 ui 4% paraformaldehyde en zet cellen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Was 3 maal met PBS (centrifuge bij 300 xg gedurende 5 min, 4 ° C).
- Verwijder het supernatant en permeabilize cellen met PBS-saponine 0,2% (200 pl) op ijs gedurende 2 minuten.
- Was 3 maal met PBS-0,1% saponine (centrifuge bij 100 xg gedurende 5 min, 4 ° C), het supernatant en resuspendeer in 100 ul PBS-0,1% saponine ontdoen.
- Vlek met Phalloidin-Alexafluor 488 (3 ug / ml) gedurende 30 min bij kamertemperatuur temperature in het donker.
- Was 3 maal met PBS-0,1% saponine. Verwijder het supernatant en resuspendeer in 300 pi PBS.
- Kwantificeren van de hoeveelheid F-actine door flowcytometrie, het berekenen van de gemiddelde Florescence intensiteit (MFI) van de Phalloidin. Analyseer de gegenereerde data in een enkele dimensie plot om een histogram gebaseerd op fluorescentie-intensiteit te produceren, wordt de MFI waarde in de grafiek verslag.
- Maatregel F-actine polymerisatie (Δ F-actine) als:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We geïsoleerd primaire leukemische B-cellen vormen PB van CLL-patiënten en analyseerden we proteomics kaarten. Monsters (n = 104) werden gegroepeerd in twee subsets op basis van de klinische kenmerken van elke patiënt (slechte prognose vs goede prognose) en vergelijkend onderzoek van 2DE-gel werd uitgevoerd.
De analyse maakte identificatie van differentieel tot expressie spots tussen de twee subgroepen (in termen van aanwezigheid / afwezigheid of verschuiving op de gel, hetgeen betekent veranderingen in post-translationele modificaties, n ≈ 16). We uitgesneden geselecteerde spots van de 2DE gels en na verminderd en gealkyleerd werden eiwitten gedigereerd met trypsine en peptiden in de verkregen supernatant werden gespot op een MALDI plaat. Spectra werden verworven in een MALDI-TOF Voyager DE. De resulterende piek lijst is MASCOT en ProFound ingediend. Massa's binnen een bepaalde massatolerantie toegewezen sequenties peptide in de database en samengevoegd tot een eiwit dat wordt beschouwdgeïdentificeerd als je langs een bepaalde waarschijnlijkheid score (figuur 3). Door deze analyse geïdentificeerd we eiwitten die vooral betrokken zijn bij het cytoskelet activiteit en metabole processen (ongepubliceerde gegevens).
Onder hen, hebben we ons gericht op hematopoietische stam-cel-specifieke proteïne-1 (HS1) waarvan de differentiële fosforylatie sterk geassocieerd met het klinische verloop van de ziekte (figuur 4). In het bijzonder hebben wij gevonden dat patiënten die een enkele vlek (n = 44, hyper-gefosforyleerd HS1) ervaren een slechte klinische uitkomst, terwijl patiënten met 2 spots (n = 60, hypo-gefosforyleerde HS1) goede prognose 13 (figuur 4 ). De aanwezigheid van de HS1 eiwit in de spots werd bevestigd door immunoblotting de 2DE gel met een monoklonaal antilichaam tegen HS1 13.
Omdat het bekend is dat HS1 is betrokken bij cytoskelet remodeling 14, voerden wij in vitro assays i testenf de HS1 fosforylatiestatus kon differentieel beïnvloeden cytoskelet activiteit in de twee subgroepen CLL (goede vs slechte prognose). We vonden dat CLL cellen die HS1 als een spot een verminderde cytoskelet activiteit in termen van migratie, adhesie en actine polymerisatie vergeleken met hypo-gefosforyleerde-HS1 monsters, aldus uitleggen van een ander klinisch gedrag 15 (figuur 5).
Figuur 1:. Werkstroom van leukemische cellen zuivering uit PB Bloed van CLL patiënten overgebracht in een 15 ml buis (1), wordt Menselijke B-cel verrijkingscocktail toegevoegd aan het monster (2) en gedurende 20 minuten. Bloed wordt vervolgens verdund met PBS in een verhouding van 1: 1 en gelegd op de bovenkant van de dichtheidsgradiënt (3). Na centrifugatie monster (4) maakt de vorming van meerdere l Ayers: a) plasma, b) B-lymfocyten, c) Ficoll, d) rode cellen en ongewenste cellen. Gezuiverde B-lymfocyten (b layer) worden vervolgens verzameld (5), gewassen en de zuiverheid van celpreparaat wordt geanalyseerd door middel van flowcytometrie (6). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2:. Werkstroom van 2DE De pellet wordt opgelost in 2DE buffer (1) en geladen op de IPG strip voor de eerste dimensie run (2-isoelectrofocusing). Na equilibratie wordt de strook geladen op een gradiënt polyacrylamidegel voor de tweede dimensie run (3-SDS-PAGE). De gel wordt daarna gekleurd die vlekken zichtbaar / proteïnen (4). Na een hoge resolutie afbeelding acquisitie, worden proteomics kaarten geanalyseerd (5). les / ftp_upload / 51942 / 51942fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Workflow van MS-analyse (1) Vlekken van belang zijn uitgesneden uit de 2D-gel met een scalpel en overgebracht in een schone buis.. (2) Nadat gereduceerd en gealkyleerd, eiwitten gedigereerd met trypsine worden peptiden in het resulterende supernatant gespot op een MALDI plaat (3). Spectra worden verworven in een MALDI-TOF Voyager DE. (4) De resulterende piek lijst wordt aan MASCOT en ProFound zoekmachines ingediend en zocht tegen een uitgebreide niet-redundante eiwit database. (5) Masses binnen een bepaalde massatolerantie toegewezen aan peptidesequenties in de database, dan geassembleerd in een eiwit. target = "_blank"> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: HS1 fosforylatiestatus correleert met de prognose van CLL patiënten (1) De cirkel worden twee nauwe spots met dezelfde molecuulmassa (Mr) van 79 kDa en verschillende iso-elektrisch punt (pI) van 4,83 en 4,86 respectievelijk, die werd geïdentificeerd door. MS als HS1 eiwit (2). (2) Twee vertegenwoordiger gels van een slechte prognose (rood vierkantje) en een goede prognose van CLL-patiënten (groen vierkant). (3) Kaplan-Meier curves tonen cumulatieve overleving van CLL-patiënten gegroepeerd volgens HS1 fosforylering patroon (1 plek, n = 44, vs 2 spots, n = 60). Patiënten met 2 spot (groene stippen) hebben een significant langere overleving (mediane overleving niet bereikt) dan die met slechts een (rode stippen)./files/ftp_upload/51942/51942fig4highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: HS1 fosforylatiestatus invloeden cytoskelet functionaliteit CLL primaire monsters (1) Migratie van transwell primaire monsters in aanwezigheid of afwezigheid van SDF-1.. In de grafiek worden weergegeven middelen SEM van het aantal cellen verkregen in 1 minuut op de flowcytometer (n = 7 1 spot HS1 vs n = 12 2 spot HS1). (2) Spontane hechting werd gemeten na cel labeling en 1 uur incuberen in 96-well platen. Weergegeven zijn de middelen SEM voor primaire monsters (n = 7 van 1 spot HS1 vs n = 12 van 2 spot HS1). (3) F-actine polymerisatie vermogen van primaire monsters. Weergegeven zijn de middelen SEM van de relatieve F-actine content van CLL-cellen na stimulatie met SDF-1 en kleuring met FITC-gemerkte phalloidin (n = 5 1 spot HS1 vs n = 5 2 spot HS1). MFI: gemiddelde fluorescentie-intensiteit. Het histogram vertegenwoordigen als voorbeeld van afnemen van het monster. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het doel van dit manuscript is een geoptimaliseerd protocol beschreven voor de identificatie van moleculen die betrokken zijn bij de pathogenese van CLL, zelfs indien deze benadering kan worden uitgebreid naar andere ziekten en / of andere soorten monsters 16-18. Door het vergelijken van het proteomische profiel van 2 subgroepen van CLL patiënten goed versus slechte prognose 19 hebben we aangetoond dat ze verschillen in de fosforylering status van HS1 en dat de activatie beïnvloedt de migratie en adhesie aantal leukemiecellen.
Voor andere werkwijzen is het belangrijkste voordeel van het proteomische technieken die in het manuscript 2DE gel en MS, is dat ze een volledige vingerafdruk van de cel proteoom en vooral informatie over de post-translationele modificaties van eiwitten ze geven. Eiwitten die differentieel geglycosyleerd of gefosforyleerd hun positie veranderen in de gel, en waarschijnlijk hun activiteiten veranderen in de cellen.
ove_content "> Voorts beschrijven we protocollen voor de evaluatie van migratie en adhesie cellen die werden gebruikt om de functionaliteit te testen cytoskelet; deze protocollen zijn nog slecht beschreven voor cellen die groeien in suspensie, omdat ze gewoonlijk worden toegepast hechtende cellen (bijvoorbeeld wondgenezing ). De belangrijkste beperking van de 2DE-en MS techniek is de hoeveelheid cellen / eiwitten (≈25 x 10 6 cellen per gel), terwijl functionele assays is de levensvatbaarheid van de cellen. De echte uitdaging is om te werken aan primaire cellen , maar voor veel ziekten is het niet mogelijk om een voldoende aantal cellen of levende cellen die experimenten bereikt, in dit geval, indien beschikbaar, het mogelijk is cellijnen.De meest kritische stap voor de MS-protocol is om te werken in een schone (keratine gratis) voorwaarden om verontreiniging te voorkomen en om een duidelijke identificatie van eiwit te verkrijgen. Cytoskelet assays zijn meestal moeilijk te reproduceren (met name op voorlopigry cellen), dus wordt voorgesteld om het experiment uit te voeren in drievoud.
We hebben aangetoond dat de combinatie van de benaderingen die in dit manuscript helpt bij de identificatie van nieuwe routes die betrokken zijn bij verschillende ziekten, en zo voor de ontdekking van nieuwe therapeutische doelwitten, zoals we hebben aangetoond voor HS1 eiwit 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken de lymfoïde maligniteiten Unit, Elisa ten Hacken, Lydia Scarfo, Massimo Alessio, Antonio Conti, Angela Bachi, en Angela Cattaneo.
Dit project werd ondersteund door: Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro AIRC (Investigator Grant en speciale programma Molecular Clinical Oncology - 5 promille # 9965)
CS en BA ontwierp de studie, voerde de experimenten, de data geanalyseerd en schreef het manuscript. MTSB, UR, FBPR geholpen bij het schrijven van het manuscript. PG en FCC ontworpen monsters van de studie verstrekt patiënten en klinische gegevens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitril | MERCK | 61830025001730 | |
| Ammonium Bicarbonate | SIGMA | A6141-500G | |
| 1,4-Dithioerythritol | SIGMA | D9680-5G | |
| Iodoacetamide | SIGMA | I6125-25G | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA | 223506-25G | |
| Trypsin, Sequencing Grade | ROCHE | 11418475001 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | SIGMA | C2020-10G | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6580 | |
| ZipTipµ-C18 | MILLIPORE | ZTC18M096 | |
| RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL | 15064 | |
| PBS | EUROCLONE | ECB4004L | |
| FBS | DOMINIQUE DUTSCHER | S1810 | |
| Lymphoprep | SENTINEL DIAGNOSTICS | 1114547 | |
| Trypan Blue | SIGMA | T8154 | |
| CD19 | BECKMAN COULTER | 082A07770 | ECD |
| CD5 | BECKMAN COULTER | 082A07754 | PC5 |
| CD3 | BECKMAN COULTER | 082A07746 | FITC |
| CD14 | BD | 345785 | PE |
| CD16 | BECKMAN COULTER | 082A07767 | PC5 |
| CD56 | BECKMAN COULTER | 082A07789 | PC5 |
| Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit | GE-Healthcare | 11-0033-64 | |
| Urea | SIGMA | U6504 | |
| Tris-Hcl Buffer | BIO-RAD | 161-0799 | |
| CHAPS | SIGMA | C2020-10G | |
| DTT | SIGMA | D9163-5G | |
| IPGstrips | GE-Healthcare | 17-1233-01 | Linear pH 4-7 18cm |
| IPGbuffer | GE-Healthcare | 17-6000-86 | pH 4-7 |
| Glycerol | SIGMA | G6279 | |
| PROTEAN II XL Cell | BIO-RAD | 165-3188 | |
| SDS | INVITROGEN | NP0001 | |
| Acrilamide | BIO-RAD | 161-0156 | |
| Agarosio | INVITROGEN | 16500 | |
| Methanol | SIGMA | 32213 | |
| Acetic Acid | VWR | 631000 | |
| Formalin | BIO-OPTICAL | 05-K01009 | |
| Ethanol | VWR | 9832500 | |
| Sodium Thiosulfate | FLUKA | 72049 | |
| Silver Nitrate | FLUKA | 85228 | |
| Molecular Dynamics Personal SI Laser Densitometer | Amersham Biosciences | ||
| ImageMaster 2D Platinum 5.0 | Amersham Biosciences | ||
| Sodium Carbonate | MERCK | A0250292 | |
| MALDI-TOF Voyager-DE STR | Applied Biosystems | ||
| Data Explorer software (version 3.2) | Applied Biosystems | ||
| transwell chambre 6.6 mm diameter | CORNING | 3421 | |
| RPMI | EUROCLONE | ECB2000L | WITH L-GLUTAMINE |
| Gentamicin | SIGMA | G1397 | |
| SDF-1 | PREPROTECH | 300-28A | |
| Flat-bottom 96-well plate | BECTON DICKINSON | 353072 | |
| BSA | SANTA CRUZ | 9048-46-8 | |
| ICAM-1 | R&D Systems | 720-IC | |
| CMFDA | Life Thechnology | C7025 | Green |
| IgM | SOUTHERNBIOTECH | 2020-02 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
| Saponine | SIGMA | S-7900 | |
| Phalloidin | Life Thechnology | A12379 | Alexa fluor 488 |
References
- Caligaris-Cappio, F., Ghia, P. Novel insights in chronic lymphocytic leukemia: are we getting closer to understanding the pathogenesis of the disease. J Clin Oncol. 26, 4497-4503 (2008).
- Rawstron, A. C., et al. Monoclonal B-cell lymphocytosis and chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 359, 575-583 (2008).
- Dagklis, A., Fazi, C., Scarfo, L., Apollonio, B., Ghia, P. Monoclonal B lymphocytosis in the general population. Leuk Lymphoma. 50, 490-492 (2009).
- Fazi, C., et al. General population low-count CLL-like MBL persists over time without clinical progression, although carrying the same cytogenetic abnormalities of CLL. Blood. 118, 6618-6625 (2011).
- Caligaris-Cappio, F., Bertilaccio, M. T., Scielzo, C. How the microenvironment wires the natural history of chronic lymphocytic leukemia. Seminars in cancer biology. , (2013).
- Damle, R. N., et al. Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 94, 1840-1847 (1999).
- Lanham, S., et al. Differential signaling via surface IgM is associated with VH gene mutational status and CD38 expression in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 101, 1087-1093 (2003).
- Wiestner, A., et al. ZAP-70 expression identifies a chronic lymphocytic leukemia subtype with unmutated immunoglobulin genes, inferior clinical outcome, and distinct gene expression profile. Blood. 101, 4944-4951 (2003).
- Mulligan, C. S., Thomas, M. E., Mulligan, S. P. Lymphocytes, B lymphocytes, and clonal CLL cells: observations on the impact of the new diagnostic criteria in the 2008 Guidelines for Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL). Blood. 113, 6496-6497 (2009).
- Conti, A., et al. Proteome study of human cerebrospinal fluid following traumatic brain injury indicates fibrin(ogen) degradation products as trauma-associated markers. J Neurotrauma. 21, 854-863 (2004).
- Mortz, E., Krogh, T. N., Vorum, H., Gorg, A. Improved silver staining protocols for high sensitivity protein identification using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight analysis. Proteomics. 1, 1359-1363 (2001).
- Zhang, W., Chait, B. T. ProFound: an expert system for protein identification using mass spectrometric peptide mapping information. Anal Chem. 72, 2482-2489 (2000).
- Scielzo, C., et al. HS1 protein is differentially expressed in chronic lymphocytic leukemia patient subsets with good or poor prognoses. J Clin Invest. 115, 1644-1650 (2005).
- Muzio, M., et al. HS1 complexes with cytoskeleton adapters in normal and malignant chronic lymphocytic leukemia B cells. Leukemia. 21 (9), 2067-2070 (2007).
- Scielzo, C., et al. HS1 has a central role in the trafficking and homing of leukemic B cells. Blood. 116, 3537-3546 (2010).
- Kashuba, E., et al. Proteomic analysis of B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukaemia reveals a possible role for kininogen. J Proteomics. 91, 478-485 (2013).
- Dhamoon, A. S., Kohn, E. C., Azad, N. S. The ongoing evolution of proteomics in malignancy. Drug Discov Today. 12, 700-708 (2007).
- Ummanni, R., et al. Identification of clinically relevant protein targets in prostate cancer with 2D-DIGE coupled mass spectrometry and systems biology network platform. PLoS One. 6, (2011).
