Summary
في هذه المقالة الفيديو، ونحن تصف التوليف في المختبر مرنا تعديل لتحريض التعبير البروتين في الخلايا.
Abstract
توصيل خارجي من الترميز رسول الاصطناعية RNA (مرنا) لتحريض تخليق البروتين في الخلايا المطلوبة لديه إمكانات هائلة في مجالات الطب التجديدي، بيولوجيا الخلية الأساسية، والعلاج من الأمراض، وإعادة برمجة الخلايا. هنا، نحن تصف خطوة بخطوة بروتوكول لجيل من تعديل مرنا التي تقل إمكانية تنشيط جهاز المناعة وزيادة الاستقرار، ومراقبة الجودة لإنتاج الرنا المرسال، ترنسفكأيشن من الخلايا مع مرنا والتحقق من التعبير البروتين الناجم عن التدفق الخلوي. تصل إلى 3 أيام بعد ترنسفكأيشن واحد مع EGFP مرنا، وتنتج خلايا HEK293 transfected EGFP. في هذه المقالة الفيديو، ووصف تركيب EGFP مرنا على سبيل المثال. ومع ذلك، يمكن تطبيق الإجراء لإنتاج الرنا المرسال المطلوبة الأخرى. باستخدام الاصطناعية تعديل مرنا، والخلايا يمكن أن يتسبب في التعبير عن عابر البروتينات المطلوبة، التي عادة لا تعبر.
Introduction
في الخلايا، ونسخ من الرنا المرسال (مرنا) وترجمة التالية مرنا في البروتينات المطلوبة ضمان الأداء السليم للخلايا. اضطرابات وراثية وراثية أو مكتسبة يمكن أن يؤدي إلى تخليق كافية ومختلة من البروتينات ويسبب أمراضا خطيرة. وبالتالي، فإن النهج العلاجي الجديد للحث على إنتاج البروتينات الناقصة أو المعيبة هو تسليم خارجي من تأليفي تعديل مرنا في الخلايا، والتي رموز للبروتين المطلوب. وبالتالي، يتم تشغيلها الخلايا لتخليق البروتينات الوظيفية، والتي عادة لا يمكن أن تنتج أو أن بطبيعة الحال لا تحتاج إليها. باستخدام هذا النهج، والاضطرابات الوراثية يمكن تصحيحها عن طريق إدخال مرنا أن رموز لمعيب أو مفقود البروتين 1. ويمكن أيضا العلاج مرنا استخدامها في التطعيم لsynthetize المستضدات البروتينية، والتي يتم التعبير عنها من قبل خلايا الورم أو مسببات الأمراض. وبالتالي، مضيفة نظام المناعة يمكن تنشيط فعال للقضاء على الخلايا السرطانية أو منع infections 2،3. وعلاوة على ذلك، في السنوات الأخيرة، وقد استخدم بنجاح مرنا لتوليد الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs). لهذا الغرض، و transfected الخلايا الليفية مع من mRNAs للحث على التعبير عن برمجة عوامل 4-6 وتحويلها في iPSCs مع إمكانات هائلة في مجال الطب التجديدي.
في السابق، كان مرتبطا استخدام مرنا التقليدي مع انخفاض واستقرار قوي المناعية. وبالتالي، والتطبيقات السريرية للمن mRNAs التقليدية كانت محدودة. ومع ذلك، فإن استبدال سيتيدين ويوريدين بنسبة 5-methylcytidine وسودويوريدين داخل جزيء الرنا المرسال بواسطة Kariko وزملاؤه جعل جزيئات مرنا مستقرة في السوائل البيولوجية وخفضت بشكل كبير تنشيط جهاز المناعة 7-10، والذي يسمح الآن انطباق السريري من mRNAs المعدلة.
استخدام من mRNAs تعديل المنتجة صناعيا، ونصوص الجين المطلوب يمكن تسليمها مؤقتا في الجسم الحي 11أو في المختبر للحث على البروتين التعبير. تتم ترجمة مرنا قدم تحت الظروف الفسيولوجية من قبل الأجهزة الخلوية الترجمة. نظرا لعدم الاندماج في جينوم الخلية المضيفة مقارنة الفيروسية ناقلات العلاج الجيني، يتم منع خطر تكون الورم 12،13. وبالتالي، فإن العلاج باستخدام مرنا الاصطناعية تعديل تتحسن قبول السريرية في المستقبل.
هنا، نحن تصف بروتوكول مفصلة لإنتاج المعدلة ومرنا (الشكل 1)، ترنسفكأيشن من الخلايا مع مرنا وتقييم تعبير البروتين في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تكبير البلازميدات المحتوية المطلوبة الترميز تسلسل الحمض النووي (CDS)
- قبل الدافئ المتوسطة SOC، والتي يتم تضمينها في عدة التحول، إلى درجة حرارة الغرفة و لوحات أجار LB تحتوي على 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين إلى 37 درجة مئوية. تتوازن حمام مائي إلى 42 درجة مئوية.
- ذوبان الجليد قارورة واحدة من المكونات كيميائيا E. القولونية على الجليد.
- إضافة 1-5 ميكرولتر من البلازميد (10 خريج إلى 100 نانوغرام) التي تحتوي على CDS في قارورة من عنصر كيميائيا E. القولونية وتخلط بلطف. لا تخلط الخلايا بواسطة pipetting. بعد إضافة البلازميدات، خلط من خلال الاستفادة من أنبوب بلطف.
- احتضان الخليط على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- للحرارة صدمة للE. كولاي لمدة 30 ثانية في 42 درجة مئوية في حمام مائي دون أن تهتز.
- ضع قارورة على الجليد لمدة 2 دقيقة.
- إضافة 250 ميكرولتر من قبل تحسنت المتوسطة SOC إلى E. القولونية والبكتيريا يهز أفقيا في 300 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة جرثومية.
- نشر 100 ميكرولتر و 150 ميكرولتر من مزيج التحول على لوحات أجار LB استعد مسبقا، عكس لوحات واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- بعد أن أصبحت المستعمرات مرئية، تلقيح مستعمرة واحدة من كل لوحة إلى ثقافة أنبوب 15 مل تحتوي على 5 مل LB المتوسطة مع 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين. احتضان لهم بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 300 دورة في الدقيقة حتى الثقافة في أواخر السجل أو مرحلة ثابتة.
- عن التخزين الطويل الأمد للتحول E. القولونية، الماصة 75 ميكرولتر من الجلسرين بنسبة 100٪ في cryovial. إضافة 225 ميكرولتر من ثقافة البكتيرية (ستحتوي الأسهم المجمدة الجلسرين 25٪)، تخلط جيدا وتخزينها cryovial في -80 درجة مئوية.
- عزل البلازميدات تحتوي على CDS المطلوبة باستخدام طقم تنقية البلازميد وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- تحديد تركيز البلازميد باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
- إعداد aliquots من 20 ميكرولتر وتخزينها في -20 درجة مئوية لوقت طويل.
- ملاحظة: للحصول على قالب DNA لالنسخ في المختبر (IVT)، وCDS المصالح، هنا EGFP، يتم تضخيمه باستخدام PCR. في نفس الوقت، يتم إضافة بولي T-ذيل 120 thymidines (T) لإدراج باستخدام التمهيدي العكسي مع 120 التمديد تي. وبالتالي، فإن من mRNAs لدت حصول على بولي A-ذيل بطول محدد بعد IVT.
- تحضير خليط PCR كما هو مفصل في الجدول 1.
- خلط مزيج رد فعل تماما. ملاحظة: يمكن استخدام المنتج PCR في 4-5 ردود فعل IVT. لزيادة كمية الحمض النووي قالب لIVT، الحجم الكلي للخليط PCR يمكن زيادة. ويمكن استخدام كل منها يحتوي على 100 ميكرولتر PCR خليط عدة أنابيب PCR للحصول على عائد كاف من المنتجات PCR.
- وضع أنابيب PCR في thermocycler وتشغيل PCR باستخدام بروتوكول الدراجات PCR (الجدول 2).
- تنظيف Pرد فعل CR استخدام عدة تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وأزل الحمض النووي باستخدام 20 ميكرولتر nuclease خالية من المياه.
- قياس تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي. ملاحظة: تركيز الحمض النووي الكشف عن حوالي 300 ميكروغرام / مل. وبالتالي، يجب أن يكون المبلغ الإجمالي المتوقع ~ 6 ميكروغرام. كمية من الحمض النووي لبروتينات أخرى يمكن أن تختلف تبعا لطول CDS، وكمية من بلازميد تستخدم لPCR، ودرجة الحرارة الصلب من الاشعال، وعدد دورة.
- تجميد DNA في -20 درجة مئوية لمدة طويلة أو استخدامه بشكل مباشر عن IVT.
3. مراقبة الخطوة: جودة المنتج PCR
- تحقق من جودة المنتج PCR بواسطة هلام DNA الكهربائي.
- مزيج من المبلغ المطلوب من الاغاروز مع 1X TBE في قارورة. ل1٪ agarose هلام، إضافة 0.5 غرام من الاغاروز إلى 50 مل من 1X TBE.
- يذوب الميكروويف حتى الاغاروز. لا ندعه يغلي. تأكد من أن الاغاروز تماما في الحل.
- إضافة 5 ميكرولتر هلام حمض النووي وصمة عار إلى 50 مل هلام الاغاروز.
- صب جل في مربع agarose هلام، تعيين مشط، والانتظار حوالي 1 ساعة حتى طدت هلام.
- إزالة مشط ووضع هلام مربع في علبة الجل.
- خلط 2 ميكرولتر (200 نانوغرام) من 80-10،000 BP-DNA سلم و 200 نانوغرام من الناتج PCR مع كل 6X 2 ميكرولتر العازلة تحميل في إجمالي حجم 12 ميكرولتر.
- تحميل بعناية عينات من الحمض النووي في الآبار من هلام الاغاروز.
- باستخدام 1X TBE كما يعمل العازلة، تشغيل agarose هلام في 100 فولت لمدة 1 ساعة.
- تصور العصابات الحمض النووي على نظام التصوير (الشكل 2).
4. النسخ في المختبر (IVT)
- ملاحظة: بعد PCR، وتتضخم لإدراج بلازميد وأضاف بولي T-الذيل. خلال IVT، ونسخه من المعلومات الوراثية من الحمض النووي RNA ل. يتم استخدام النص مرنا ولدت لإنتاج البروتينات في الخلايا.
- تنظيف منطقة العمل والماصات مع ريبونوكلياز دحل econtamination. استخدام PCR نصائح نظيفة ومعقمة ماصة المزدوج مرشح وكثيرا ما تتغير قفازات للحد من التلوث من رد فعل ستختلط مع RNases.
- إعداد NTP / كاب خليط التناظرية كما هو موضح في الجدول رقم 3.
- خلط NTP / كاب مزيج دقيق من قبل vortexing التناظرية وتدور باستمرار لفترة وجيزة.
- تجميع خليط التفاعل IVT كما هو موضح في الجدول رقم 4.
- مزج خليط التفاعل IVT بشكل دقيق من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا. ثم الطرد المركزي أنبوب PCR لفترة وجيزة لجمع الخليط في الجزء السفلي من الأنبوب.
- احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات في thermomixer.
ملاحظة: فترة حضانة الأمثل يعتمد على طول إدراج والكفاءة النسخي من قالب معين. لإدراج قصيرة (<500 الإقليم الشمالي)، قد يكون وقتا أطول حضانة المفيد. ويمكن أن يتم تجربة الوقت بالطبع لتحديد فترة حضانة الأمثل لأقصى قدر من العائد. لذا، قم بإعداد ردود فعل IVT، على الامثلهه، ل 1، 2، 3، 4، 6 ساعة، والحضانة بين عشية وضحاها، وتحديد كمية مرنا. يظهر حركية النسخ في المختبر لتوليد EGFP مرنا في الشكل 3. - لإزالة قالب الحمض النووي، إضافة 1 ميكرولتر من الدناز (2 U / ميكرولتر) إلى IVT خليط التفاعل، تخلط جيدا واحتضان 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- تنقية خليط التفاعل باستخدام طقم تنقية RNA وفقا لتعليمات manufacturer's. أزل مرنا معدلة من الغشاء عمود الدوران مرتين مع 40 ميكرولتر nuclease خالية من المياه. ملاحظة: تركيز الحمض النووي الريبي الكشف عن حوالي 1500 ميكروغرام / مل. وبالتالي، يجب أن يكون المبلغ الإجمالي المتوقع ~ 120 ميكروغرام. كمية مرنا مركبة للبروتينات أخرى يمكن أن تختلف تبعا لطول CDS وكمية المنتج PCR تستخدم لIVT.
5. علاج تنقية مرنا مع القطب الجنوبي الفوسفاتيز
- ملاحظة: يتم التعامل مع مرنا ولدت مع الفوسفاتيز لإزالة 5 "ثلاثيالفوسفات، والتي يمكن التعرف عليه بواسطة RIG-I، وتؤدي إلى تنشيط جهاز المناعة. وعلاوة على ذلك، فإن العلاج الفوسفاتيز يمنع إعادة التعميم في رد فعل الربط الذاتي.
- إضافة 9 ميكرولتر من 10X القطب الجنوبي عازلة رد فعل الفوسفاتيز إلى 79 ميكرولتر من حل مرنا النقي. وفي وقت لاحق، إضافة 2 ميكرولتر من الفوسفاتيز القطب الجنوبي (5 U / ميكرولتر) وتخلط بلطف العينة. احتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- تنقية خليط التفاعل باستخدام طقم تنقية RNA وفقا لتعليمات manufacturer's. أزل مرنا معدلة من الغشاء عمود الدوران مرتين مع 50 ميكرولتر nuclease خالية من المياه.
- قياس تركيز مرنا تعديلها باستخدام مقياس الطيف الضوئي. تحقق من أن نسبة الامتصاصية في 260 نانومتر / 280 نانومتر (A 260 / A 280) هي ≥ 1.8 ونسبة 260 / A 230 هو 2.0، مما يشير إلى النقاء.
ملاحظة: العائد الإجمالي المتوقع يجب أن يكون حوالي 90 ميكروغرام، والذي هو sufficieالإقليم الشمالي لحوالي 36 transfections مرنا. - ضبط تركيز مرنا إلى 100 نانوغرام / ميكرولتر بإضافة nuclease خالية من المياه.
- قسامة مرنا في تعديل مأخوذة تستخدم مرة واحدة اللازمة لtransfections وتخزينها في -80 درجة مئوية. تجنب متعددة تجميد والذوبان دورات. أعدت بشكل صحيح وتخزينها مرنا مستقرة لسنوات عديدة. أثناء العمل، والحفاظ دائما مرنا تعديل على الجليد.
6. مراقبة الخطوة: جودة تجميعي مرنا التعديل
- تحقق من جودة مرنا تعديلها من قبل جل RNA الكهربائي.
- مزيج من المبلغ المطلوب من الاغاروز مع 1X TBE في قارورة. ل1٪ agarose هلام، إضافة 0.5 غرام من الاغاروز إلى 50 مل من 1X TBE.
- يذوب الميكروويف حتى الاغاروز. لا ندعه يغلي. تأكد من أن الاغاروز تماما في الحل.
- إضافة 5 ميكرولتر هلام حمض النووي وصمة عار إلى 50 مل هلام الاغاروز.
- صب جل في صندوق agarose هلام، تعيين مشط، والانتظار حوالي 1 ساعة حتى هلام هو سوليdified.
- إزالة مشط ووضع هلام مربع في علبة الجل.
- مزيج 3 ميكرولتر (3 ميكروغرام) من 0.5-10 كيلوبايت RNA سلم و 200 نانوغرام من توليفها تعديل مرنا مع كل 7 ميكرولتر العازلة تحميل في الحجم الإجمالي من 10 ميكرولتر. يوصف تكوين العازلة تحميل في الجدول 5.
- تفسد السلم والعينات مرنا عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- تحميل بعناية سلم وعينات مرنا على agarose هلام 1٪.
- أداء الكهربائي على 100 فولت لمدة 1 ساعة باستخدام 1X TBE كما يعمل العازلة.
- تصور السلم وشرائح مرنا على نقل transilluminator الأشعة فوق البنفسجية وصورة باستخدام نظام التوثيق هلام (الشكل 4).
7. إعداد الخلايا لترنسفكأيشن
- لوحة 2 X10 5 الخلايا (خلايا HEK293) لكل بئر من لوحة 12-جيدا.
- احتضان خلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة الخلية. ملاحظة: في يوم من ترنسفكأيشن، يجب أن الخلايا لديها REAC[هد] 80-90٪ التقاء.
8. أداء مرنا ترنسفكأيشن من الخلايا
- ذوبان الجليد مرنا المعدلة.
- توليد lipoplexes لترنسفكأيشن.
- إضافة 25 ميكرولتر (2.5 ميكروغرام) من تعديل مرنا و2 ميكرولتر من الدهون الموجبة كاشف ترنسفكأيشن إلى 473 ميكرولتر غروب-MEM (الحد الأدنى الضروري المتوسطة) أنا خفضت المتوسطة المصل لتوليد الخليط ترنسفكأيشن لترنسفكأيشن من بئر واحدة من لوحة 12-جيدا. زيادة في حجم وفقا لعدد من الآبار لتكون transfected. كما سيطرة سلبية، وإعداد خليط ترنسفكأيشن دون مرنا.
- تخلط المكونات بلطف بواسطة pipetting. احتضان الخليط ترنسفكأيشن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة لتوليد lipoplexes لترنسفكأيشن.
ملاحظة: الخليط ترنسفكأيشن لا يحتوي على المضادات الحيوية. وبالتالي، الحرص على ضمان العقم أثناء التعامل مع الخلايا. - غسل الخلايا مع 500 DPBS ميكرولتر / جيد.
- إضافة 500 ميكرولتر ترنسفكأيشن الخليط جيدا إلى واحد من جيش التحرير الشعبى الصينى 12-جيداالشركة المصرية للاتصالات.
- احتضان الخلايا لمدة 4 ساعات في 37 درجة مئوية و CO 2 5٪.
- نضح الخليط ترنسفكأيشن وإضافة 1 مل كامل مستنبت الخلية إلى الخلايا.
- احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة في حاضنة الخلية.
- أداء مضان المجهري تحليل باستخدام مجهر مضان (الشكل 5). ملاحظة: للنظر في التعبير عن بروتينات أخرى في خلايا، والتي يتم إنتاجها من قبل ترنسفكأيشن مع مرنا غير EGFP الترميز مرنا، ويمكن زراعة خلايا coverslips على. ثم ترنسفكأيشن لا يمكن أن يؤديها والخلايا يمكن ملطخة الأجسام المضادة المناسبة وتحليلها بواسطة المجهر مضان.
9. تحليل تدفق Cytometric من EGFP التعبير في خلايا
- إزالة خلية ثقافة المتوسط من الآبار، ويغسل جيدا مع كل 1 مل DPBS (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم). إضافة 500 ميكرولتر التربسين / EDTA لكل بئر لفصل الخلايا من سطح وحات ثقافة الخلية. وفي وقت لاحق، إضافة 500TNS ميكرولتر لكل بئر لإبطال نشاط التربسين.
- أجهزة الطرد المركزي لفصل الخلايا لمدة 5 دقائق في 300 x ج في درجة حرارة الغرفة. إزالة طاف ولم يتبق سوى بيليه. resuspend الكرية الخلية في 150 ميكرولتر الحل تثبيت الخلية ونقل تعليق خلية في أنبوب التدفق الخلوي.
- تحليل نسبة الخلايا معربا عن EGFP وكثافة مضان باستخدام جيو المتوسط (الوسط الهندسي من كثافة مضان) (الشكل 6).
10. قياس التعبير البروتين على مر الزمن
- أداء مرنا ترنسفكأيشن من الخلايا في 3 آبار من لوحة 12-جيدا كما هو موضح في الخطوة 8. بالإضافة إلى ذلك، احتضان 3 آبار للخلايا HEK293 مع خليط ترنسفكأيشن بدون إضافة مرنا.
- قياس التعبير عن EGFP 1، 2، وبعد 3 أيام ترنسفكأيشن لتقييم مدة البروتين التعبير (الشكل 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام pcDNA 3.3 بلازميد يحتوي على CDS من EGFP، تأسست توليف تعديل EGFP مرنا (الشكل 1). بعد إدراج التضخيم من قبل PCR وبولي T-المخلفات، تم الكشف عن الفرقة واضحة حيث يبلغ طوله حوالي 1100 سنة مضت (الشكل 2). زيادة الوقت IVT تضاف العائد من مرنا (الشكل 3). بعد IVT، تم الكشف عن عصابة مرنا واضحة ويبلغ طوله حوالي 1100 شركة بريتيش بتروليوم، والتي تتطابق مع طول EGFP مرنا ليتم إنتاجها (الشكل 4).
تم اختبار وظائف EGFP مرنا التي تولدها الخلايا ترنسفكأيشن HEK293. لهذا الغرض، تم إنشاء المجمعات ترنسفكأيشن (lipoplexes) باستخدام الدهون الموجبة كاشف ترنسفكأيشن. تم إجراء ترنسفكأيشن مع 2 × 10 5 خلايا لكل بئر من لوحة 12-جيدا. تم الكشف عن إنتاج EGFP في الخلايا بعد 24 ساعة ترنسفكأيشن باستخدام المجهر مضان (فيقوإعادة 5) والتدفق الخلوي (الشكل 6).
و transfected خلايا HEK293 مع EGFP مرنا. تم تحديد EGFP التعبير بعد 1، 2، و 3 أيام ترنسفكأيشن لتقييم مدة تعبير البروتين في الخلايا (الشكل 7). بعد 24 ساعة، وكان التعبير البروتين أعلى في الخلايا. تم تخفيض مبلغ 1.6 أضعاف كل يوم القادم. حتى بعد 3 أيام، وتضمنت الخلايا EGFP.
وتتضخم محة عامة عن عملية الإنتاج مرنا تعديل الترميز تسلسل الحمض النووي (CDS) مع تسلسل المرافقة معروفة من قبل PCR باستخدام بادئات محددة: الشكل 1. المنتج PCR هو النقى ويتم تحديد نوعية الحمض النووي التي تم إنشاؤها. يتم إنشاء مرنا من المنتج باستخدام الحمض النووي في المختبر عملية النسخ. والمنتج هو purifie د وتعامل مع الفوسفاتيز لإزالة 5'-triphosphates. بعد تنقية إضافية ومراقبة جودة ولدت مرنا، وtransfections مرنا يمكن أن يؤديها.
تم تشغيل تحليل الحمض النووي المنتج بعد PCR سلم DNA والمنتجات PCR على agarose هلام 1٪: الرقم 2. يجب الكشف عن الفرقة DNA واضحة بطول حوالي 1100 شركة بريتيش بتروليوم.
الرقم 3: حركية النسخ في المختبر لتوليد EGFP مرنا 1) RNA سلم وIVT المنتجات بعد 2) 0 دقيقة، 3) 10 دقيقة، 4) 30 دقيقة، 5) 180 دقيقة، 6) 360 دقيقة، و7) قالب DNA تم تشغيل وحدها على هلام الاغاروز 1٪.
تم تشغيل تحليل المنتج مرنا بعد IVT المنتج سلم RNA وIVT على 1٪ هلام الاغاروز: الرقم 4. يجب الكشف عن الفرقة واضحة مرنا بطول حوالي 1100 شركة بريتيش بتروليوم.
الرقم 5: التحليل المجهري مضان من خلايا HEK293 24 ساعة بعد EGFP مرنا ترنسفكأيشن. (أ) المرحلة صورة النقيض من الخلايا في التكبير من 100X. (ب) وصور الإسفار من الخلايا في التكبير من 100X.
شخصية تحليل تدفق cytometric من EGFP التعبير في الخلايا HEK293 24 ساعة بعد EGFP مرنا ترنسفكأيشن خط وردي يمثل الخلايا دون مرنا ترنسفكأيشن والخط الازرق يمثل خلايا EGFP إيجابية بعد EGFP مرنا ترنسفكأيشن: 6. بعد EGFP مرنا ترنسفكأيشن، 93.91٪ من جميع الخلايا تقاس إيجابية وجيو المتوسط (الوسط الهندسي من كثافة مضان) هو 720.16.
الرقم 7: تحليل تدفق cytometric من EGFP التعبير في الخلايا HEK293 بعد 1، 2، و 3 أيام EGFP مرنا ترنسفكأيشن والتعبير البروتين هو أعلى 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن مرنا. بعد ذلك، يتم تقليل كمية 1.6 مرات كل يوم (ن = 3).
الجدول 1: تكوين خليط PCR.
| عنصر | التركيز النهائي | كمية (ميكرولتر) |
| إلى الأمام التمهيدي | 0.7 ميكرومتر | 7 |
| التمهيدي العكسي | 0.7 ميكرومتر | 7 |
| Q-5X الحل | 1X | 20 |
| 5X HotStar HiFidelity PCR العازلة | 1X | 20 |
| بلازميد الحمض النووي | 50 نانوغرام / 100μl | متغير |
| HotStar HiFidelity البلمرة DNA (2.5 U / ميكرولتر) | 2.5 U | 1 |
| nuclease خالية من المياه | متغير | |
| إجمالي حجم | 100 |
الجدول 1: تكوين خليط PCR.
| عدد دورة | مرة | درجة الحرارة (° C) | |
| الخطوة الأولي تمسخ | 1 | 5 دقيقة | 95 |
| 3-خطوة الدراجات | 2-25 | ||
| · تمسخ | 45 ثانية | 95 | |
| · التليين | 1 دقيقة | 55 | |
| · الإرشاد | 1 دقيقة | 72 | |
| خطوة التمديد النهائي | 26 | 10 دقيقة | 72 |
| نهاية PCR الدراجات | غير محدد | 4 |
الجدول 2: PCR الدراجات العلاقات العامة otocol.
| عنصر | تركيز الأسهم (مم) | التركيز النهائي (مم) | الحجم (ميكرولتر) |
| ATP (من MEGAscript T7 كيت) | 75 | 7.5 | 4 |
| GTP (من MEGAscript T7 كيت) | 75 | 1.875 | 1 |
| لي-CTP (من Trilink) | 100 | 7.5 | 3 |
| شبه UTP (من Trilink) | 100 | 7.5 | 3 |
| 3'-O-ME-م 7 G (5') PPP (5') G RNA هيكل سقف التناظرية | 10 | 2.5 | 10 |
| إجمالي حجم | 23 |
= "دائما"> الجدول رقم 3: تكوين NTP / كاب خليط التناظرية.
| عنصر | التركيز النهائي | كمية (ميكرولتر) |
| nuclease خالية من المياه | متغير | |
| ريبونوكلياز المانع | 40 U | 1 |
| NTP / كاب خليط التناظرية (من الخطوة 4.3) | 23 | |
| منتج PCR | 1 ميكروغرام | متغير |
| 10X العازلة رد فعل | 1X | 4 |
| 10X T7 RNA إنزيم البلمرة مزيج | 1X | 4 |
| إجمالي حجم | 40 |
الجدول 4: تكوين النسخ في المختبر (IVT) خليط التفاعل.
| عنصر | كمية (ميكرولتر) |
| الفورماميد | 3.3 |
| 37٪ الفورمالديهايد | 1 |
| MEN عازلة (10X) | 1 |
| 6X العازلة تحميل (مرفق مع peqGOLD المدى مزيج الحمض النووي سلم) | 1.7 |
| إجمالي حجم | 7 |
الجدول 5: إعداد العازلة تحميل لهلام RNA الكهربائي.
| الخلية الثقافة المتوسطة والواق | |
| HEK-293 خلية ثقافة المتوسط | إضافة 25 مل من السفح، 2.5 مل من البنسلين / الستربتومايسين، 2.5 مل من حمض الغلوتاميك L-tamine في 220 مل DMEM الجلوكوز المرتفع. تخزين المتوسطة في 4 درجات مئوية واستخدامها في غضون 2 أسابيع. |
| TBE عازلة (10X) | حل 0.9 M تريس القاعدة، 0.9 M حمض البوريك و 20 ملي EDTA في 1 لتر ماء (Ampuwa). الرقم الهيدروجيني للعازلة هو 8. |
| MEN عازلة (10X) | حل 200 ملي اجتماعات الأطراف، NaOAc 50 ملي و 10 ملي EDTA في 1 لتر ماء (Ampuwa). ضبط قيمة درجة الحموضة مع هيدروكسيد الصوديوم إلى 7. |
الجدول 6: خلية متوسطة الثقافة ومخازن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
العلاج مرنا لديها امكانات هائلة في مجال الطب التجديدي والعلاج من الأمراض والتلقيح. في هذا الفيديو، ونحن لشرح إنتاج، مرنا استقرت تعديل لتحريض التعبير البروتين في الخلايا. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن أن تتولد مرنا المطلوبة الأخرى. توليف في المختبر المعدلة مرنا يسمح ترنسفكأيشن من الخلايا مع من mRNAs المطلوب للحث على التعبير عن البروتينات المستهدفة. وبالتالي، يتم التعبير عن البروتين المطلوب عابر تحت الظروف الفسيولوجية حتى مرنا تسليمها خارجيا هو المتدهورة تماما.
في هذا الفيديو، وقد تجلى التعبير عن EGFP لمدة 3 أيام بعد ترنسفكأيشن واحد من الخلايا HEK293 مع EGFP مرنا. جزيئات مرنا ترميز البروتينات الأخرى يمكن أن تؤدي إلى فترة أقصر تعبير البروتين. التعبير عن هذا البروتين يقلل بسبب تدهور مرنا تسليمها خارجيا. وبالتالي فإن الحد من هذا الأسلوب لسومتطبيقات البريد قد يكون تحريض عابر للتعبير البروتين. وبالتالي، للحفاظ على التعبير البروتين في الخلايا لفترة أطول، مطلوب المتكررة تسليم مرنا. وعلى الرغم من مرنا ترنسفكأيشن لديه ميزة عدم الاندماج في جينوم المضيف، والذي يمنع الطفرات إقحامي وتطور السرطان وسرطان الدم مقارنة مع ناقلات فيروسية، يمكن للفي الجسم الحي كفاءة ترنسفكأيشن تكون أقل من استخدام النواقل الفيروسية.
يجب أن يكون الأمثل للتركيز مرنا المطلوبة وكمية ترنسفكأيشن الكاشف لكل نوع من الخلايا المختلفة 14، والتي هي الخلايا المستهدفة للتسليم خارجي مرنا لإنتاج البروتين المفقود.
ينبغي تجنب تكرار التجميد والذوبان مرنا للحفاظ على استقرار مرنا المنتجة. وبالتالي، يمكن إعداد مأخوذة العمل. بعد PCR وIVT، يجب أن يتم الكشف سوى عصابة واحدة محددة. خلاف ذلك، فإن عدد دورات PCR، annea التمهيدييجب أن يكون الأمثل في درجة الحرارة لينغ، و / أو كمية من الحمض النووي بلازميد للحصول على منتج معين الحمض النووي لIVT. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون الأمثل في الوقت IVT ومقدار قالب الحمض النووي للIVT الحصول مرنا لمدة محددة بكميات كافية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تعلن المؤلفون أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل الصناديق الاجتماعية الأوروبية في بادن-فورتمبيرغ، ألمانيا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| DMEM, high glucose | PAA | E15-009 | |
| FBS | Life Technologies | 10500 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | 100x |
| L-glutamine | PAA | M11-004 | 200 mM |
| DPBS without calcium and magnesium | PAA | E15-002 | |
| 0.04% Trypsin / 0.03% EDTA | Promocell | C-41020 | |
| TNS | Promocell | C-41120 | Trypsin Neutralizing Solution, 0.05% trypsin inhibitor in 0.1% BSA |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Consumables | |||
| Tissue culture plates, 12-well | Corning | 3512 | |
| Cell culture flask (75 cm2) | Corning | 430641 | |
| DNase-and RNase-free 1.5 ml sterile microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 121.589 | Safe-Lock, Biopur |
| 15 ml conical tubes | greiner bio-one | 188271 | |
| PCR clean and sterile epT.I.P.S. dualfilter pipette tips | Eppendorf | 10 µl: 022491202; 100 µl: 022491237; 1,000 µl: 022491253 | |
| Cryovial | greiner bio-one | 122279-128 | Cryo.s |
| 14 ml polypropylene round bottom tube for bacterial culture | BD Falcon | 352059 | |
| Plasmid amplification and purification | |||
| pcDNA 3.3_eGFP Plasmid | Addgene | 26822 | |
| One Shot Top10 chemically component Escherichia coli | Invitrogen | C4040-10 | |
| Sterile water (Ampuwa) | Fresenius Kabi | 1636071 | |
| LB medium (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | Dissolve 25 g L-1 in sterile water. |
| LB agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | Dissolve 40 g L-1 in sterile water. |
| Ampicillin Ready Made Solution | Sigma Aldrich | A5354 | 100 mg/ml |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G2025 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| mRNA production | |||
| HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen | 202602 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| MEGAscript T7 Kit | Life Technologies | AM1334 | |
| 5-Methylcytidine-5´-triphosphate | Trilink | N1014 | 5-Methyl-CTP |
| Pseudouridine-5´-triphosphate | Trilink | N1019 | Pseudo-UTP |
| 3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5´)G RNA cap structure analog | New England Biolabs | S1411L | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 U/µl |
| TURBO DNase | Life Technologies | AM1334 | 2 U/µl (from MEGAscript T7 Kit) |
| Antarctic phosphatase | New England Biolabs | MO289S | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNaseZap solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Transfection | |||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | Cationic lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Invitrogen | 11058-021 | Improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows a reduction of Fetal Bovine Serum (FBS) supplementation |
| Gel electrophoresis | |||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Gelred Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | 10,000x in water |
| peqGOLD Range Mix DNA-Ladder | Peqlab | 25-2210 | |
| Flow cytometry analyses | |||
| CellFIX (1x) | BD Biosciences | 340181 | 10x concentrate |
| Primer for insert amplification and poly (T) tail PCR | |||
| Forward Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´-TTGGACCCTCGTAC AGAAGCTAATACG-3´ |
|
| Reverse Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´- T120-CTTCCTACT CAGGCTTTATTCAA AGACCA-3´ |
|
| Equipment | |||
| Cell incubator | Binder | CO2 (5%) and O2 (20%) | |
| CASY cell counter | Schärfe System | ||
| Sterile workbench | BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH | ||
| Bacterial incubator | Incutec | ||
| Water bath | |||
| ScanDrop spectrophotometer | Analytic Jena | ||
| PCR thermocycler | Eppendorf | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Vortex | peqlab | ||
| Thermomixer | Eppendorf | ||
| Gel apparatus for electrophoresis | Bio-Rad | ||
| Gel documentation system | Bio-Rad | ||
| FACScan System | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope | Nikon | ||
| Phase-contrast microscope | Zeiss | ||
References
- Bangel-Ruland, N., et al. CFTR-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis "gene therapy". The journal of gene medicine. , (2013).
- Benteyn, D., et al. Design of an Optimized Wilms" Tumor 1 (WT1) mRNA Construct for Enhanced WT1 Expression and Improved Immunogenicity In Vitro and In Vivo. Molecular therapy Nucleic acids. 2, 134 (2013).
- Petsch, B., et al. Protective efficacy of in vitro synthesized, specific mRNA vaccines against influenza A virus infection. Nature. 30, 1210-1216 (2012).
- Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature protocols. 8, 568-582 (2013).
- Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell stem cell. 7, 618-630 (2010).
- Yakubov, E., Rechavi, G., Rozenblatt, S., Givol, D. Reprogramming of human fibroblasts to pluripotent stem cells using mRNA of four transcription factors. Biochemical and biophysical research communications. 394, 189-193 (2010).
- Anderson, B. R., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic acids research. 38, 5884-5892 (2010).
- Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23, 165-175 (2005).
- Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1833-1840 (2008).
- Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current opinion in drug discovery & development. 10, 523-532 (2007).
- Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature biotechnology. 29, 154-157 (2011).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. The Journal of clinical investigation. 118, 3132-3142 (2008).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. The New England journal of medicine. 363, 355-364 (2010).
- Avci-Adali, M., et al. Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression. Journal of biological engineering. 8, 8 (2014).
