Summary
O objetivo deste protocolo é a realização de um ensaio comportamental, tais como o conjunto de atenção transferência de tarefas (AST) para avaliar a flexibilidade cognitiva prefrontal mediada pelo córtex em camundongos.
Introduction
O conjunto atencional transferência de tarefas (AST) foi desenvolvido como uma medida de atenção e flexibilidade cognitiva em ratos mais de uma década atrás, 1,2. AST é modelado a partir do componente intradimensional / extra-dimensional da Cambridge neuropsicológica Teste Automático de bateria (Cantab), que é usada para identificar a disfunção cognitiva em seres humanos e primatas não-humanos 3,4. Embora a capacidade de aprender regras simples permanece intacta, défices de aprendizagem para modificar uma resposta quando as regras mudaram são encontrados em pacientes que sofrem de uma variedade de distúrbios neuropsiquiátricos (por exemplo, esquizofrenia, distúrbio obsessivo compulsivo, depressão), desordens neurodegenerativas (por exemplo, A doença de Parkinson) e em pacientes com lesões no córtex pré-frontal 5. Mais geralmente, estes pacientes são descritos como tendo os défices cognitivos na flexibilidade. Défices análogos têm sido mostrados em ambos os primatas não-humanos e roedores quando as lesões to córtex pré-frontal foram induzidas 1,6-8. Estes déficits indicar um estado de inflexibilidade cognitiva ou uma capacidade prejudicada de mudar set atencional.
Um conjunto de atenção é formado quando um sujeito descobre que um conjunto de regras podem ser aplicadas a estímulos complexos, a fim de diferenciar relevante a partir de pistas irrelevantes. Por exemplo, na AST, os animais vão aprender a prestar atenção e responder à sugestão relevante (ou seja, cavando médio) e ignorar uma sugestão irrelevante (ou seja, odor), emparelhando uma recompensa alimentar com o meio. Esta associação é então reforçado em tarefas subsequentes, onde o tipo de escavação de médio e odor mudanças, mas a associação emparelhado entre médio e recompensa permanece. Esta regra reforçada forma um conjunto cognitivo. Dois estágios dentro dos aspectos medida protocolo AST de flexibilidade cognitiva: reversão ea mudança extra-dimensional. Na fase de inversão, os estímulos previamente negativos no prazo de um dimension (médio, neste exemplo) agora é positivo, o que desafia o animal a ignorar os estímulos positivos a partir da etapa anterior. Por exemplo, se sentiu meio de escavação foram os estímulos positivos na fase anterior e papel foram os estímulos negativos, agora o inverso é verdadeiro. Isso desafia a flexibilidade do animal em que a Europa deve manter o conjunto de atenção (ou seja, o meio é a dimensão relevante), alterando a regra aprendida para estímulo e recompensa par dentro de uma dimensão. A formação de um conjunto de atenção é contestada na fase de mudança extra-dimensional, quando a dimensão irrelevante (odor, neste exemplo) torna-se a dimensão relevante. Uma resposta perseverativo, como indicado por uma escolha contínuo usando a regra previamente aprendido, em qualquer fase reflecte um défice cognitivo em flexibilidade.
Estudos de lesões em ambos os primatas não-humanos e roedores mostraram regiões específicas do córtex pré-frontal pode ser atribuído à capacidade de perform estágios particulares do AST 1,9. Lesões no córtex orbitofrontal (OFC), uma sub-região do córtex pré-frontal (PFC), foram mostrados para induzir déficits de aprendizado reverso na AST 8. Além disso, lesões no córtex pré-frontal (MPFC) chumbo medial a dificuldades específicas na realização da mudança extra-dimensional.
Enquanto numerosos estudos utilizando a AST foram realizados em ratos e primatas não-humanos, relativamente poucos têm utilizado AST como uma medida da função cognitiva em ratos. Dada a facilidade de manipulação genética em ratos, e a necessidade crítica para medir a função do córtex pré-frontal em estudar uma variedade de doenças, adaptação e validar esta medida comportamental em ratos é um complemento importante para a investigação sobre doenças associadas à disfunção PFC. O protocolo detalhado aqui é uma modificação do procedimento por Birrell e Brown 1, que é optimizada para a aplicação nos ratinhos, e reflecte muitas das rato-específic adaptações que foram reportados anteriormente 2,6,10-13.
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Protocol
NOTA: Os animais utilizados neste estudo são do sexo masculino camundongos C57BL / 6J entre 4 e 6 meses de idade, para os melhores resultados. Ratos são mantidos em um ciclo de luz inverso, a fim de testá-los convenientemente durante a fase ativa (escuro). Se o comportamento é realizado em uma sala separada da carcaça, os ratos são permitidos pelo menos 1 hora para se aclimatar seguinte transporte para a sala de ensaios. Teste comportamental é realizado sob condições de luz vermelha minimizar a perturbação da actividade normal dos ratos tão pouco quanto possível, enquanto ainda permitindo que o experimentador iluminação adequada para acompanhar visualmente a sessão de testes.
NOTA: Todos os aspectos do procedimento experimental aqui descritos foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, 8ª (NRC) e foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional na Universidade do Texas em Ciências da Saúde Center em San Antonio.
- Encha forminhas de cerâmica (não-poroso; 1.5 "profundidade x 2,5 cm de diâmetro), a borda interna com cavando meio (aproximadamente 1" a partir de baixo); rodadas de papel filtro de corte ao meio e colado dentro de trás do ramekin (Figura 1A)
- Quebre levemente adoçado cereal seco pequeno-almoço (recompensa alimentar) - Nut mel ou variedades de açúcar revestido, em cerca de 20 peças mg para as fases de aclimatação, treinamento e teste.
- Faça um conjunto de atenção transferência de tarefas (AST) câmara (Figura 1B): Aclimatar treinar e testar cada rato em câmaras individuais; recomendam produção de pelo menos 8 câmaras.
- Construa uma câmara AST 12 "x 8" x 7 "; muros e portão início feitas de acrílico branco opaco que é fácil de limpar com etanol 70%. O estilo guilhotina, removível portão de partida separa câmara em uma área de espera (5 "x 8") e área de testes (7 "x 8").
- Incluir um claro 5221; x7 "divisória amovível que separa os dois lados da área de testes de maneira uniforme; cortar três ¼ "buracos de diâmetro na parte inferior da divisória para permitir o acesso cheirar, espaçadas 1" distante e 1 "a partir da frente da partição (Figura 1C).
2. Visão geral do procedimento (Figura 2)
- Antes da AST, ratos de casa individualmente e permitir-lhes para se ajustar a um ciclo de luz reversa para, pelo menos, uma semana.
- Aclimatar, treinar e testar cada animal em câmaras de teste individuais. Atribuir cada câmara a um mouse e limpo com etanol a 70% depois de terminar o último dia de testes. Isso irá minimizar o estresse durante os testes, fazendo o cheiro câmara como "casa-gaiola" ou "self".
- Perfume os vasos de ensaio 2 dias antes do teste para permitir o perfume para dissipar; camundongos não vai cavar em vasos que têm um odor muito forte. Usando uma seringa com uma agulha de 25 G, adicionar cerca de 0,1 ml deóleo essencial para a parte superior do papel de filtro.
3. Manutenção (Dias 1-8)
- Lidar com ratos a partir de 8 dias antes do primeiro dia de restrição alimentar. Isso irá reduzir o estresse associado com a manipulação durante o teste.
- Pesar e pesos corporais registro a cada dia de manuseio. Lidar com cada rato 2-3 min por dia.
- Se vários experimentadores devem ser envolvidos em testar um conjunto de ratos, garantir que cada pesquisador participa do processo de manipulação para aumentar a familiaridade com os experimentadores e reduzir o estresse e ansiedade experientes no treinamento ou dias de testes.
- Continuar manuseamento e pesos de gravação ao longo da duração dos testes.
4. A restrição alimentar (Dias 12/09)
- Começando 4 dias antes do início da aclimatação, os ratos no lugar de uma dieta restrita para manter os ratos a 80-85% do seu peso corporal alimentar livre. Dê um grama de alimento por rato por dia. Se o peso do corpo cai abaixodo intervalo especificado dar 2 gramas por dia até que eles voltem para o intervalo apropriado.
- Coloque 2 ramequins na frente de cada gaiola, a fim de permitir que os ratos se aclimatar para os vasos de teste. Estes são os mesmos pontos usados para treinar o mouse para cavar para uma recompensa alimentar.
- Adicionar 2 gramas de comida e uma peça de recompensa alimentar (metade de um pedaço de cereal em cada) em ramekins cada dia durante 4 dias.
- Se o comportamento está a ser realizado numa sala separada do que aquela em que os ratos são alojados, começando no dia 1 de restrição alimentar, os ratinhos de transporte para a sala de teste durante pelo menos 1 hr por dia antes de voltar para a sala de alojamento para permitir eles se adapte à sala de ensaios.
- No último dia de restrição alimentar, antes do início da aclimatação, mudar a cama gaiola de origem. A roupa de cama gaiola não será alterado novamente até após a conclusão do teste para reduzir o estresse ou ansiedade experimentada durante o treinamento e teste (menos que seja absolutamente necessário).
- Manterem ratinhos restrição alimentar até ao final do teste. Nos dias 13-17, dar comida camundongos após aclimatação, treinamento ou de teste com base em uma estimativa da quantidade de alimentos consumidos recompensa (geralmente <1g de pellet de alimentos).
5. Aclimatação (Dias 13-14)
- Começando 2 dias antes do início da formação, realizar aclimatação durante o ciclo escuro com luz vermelha.
- Espalhe uma pequena quantidade de roupas de cama suja da gaiola na câmara, isso vai reduzir o estresse de estar em um novo ambiente através da introdução de um familiar "home-gaiola" ou "self" cheiro para a câmara de teste (a mesma câmara será usado para um único rato para a duração do treinamento e teste).
- Coloque um ramekin limpo com água na sala de espera da câmara; camundongos tendem a não comer, se eles não têm acesso à água.
- Coloque os dois ramequins que têm sido utilizados para a restrição alimentar na área de testes com uma recompensa de alimentos (~ 20pedaço de cereais mg) em cada.
- Posicione o mouse na área de espera; remover a porta de início e permitir que o rato explorar a câmara durante 1 h.
- Continuamente adicionar recompensas alimentares (~ peça cereal 20 mg) para os ramequins vazias a fim de incentivar os ratos para explorar a área de testes e as panelas com freqüência.
- Certifique-se de que o rato pode ver o experimentador durante todo o período de aclimatação de modo que a presença do experimentador não é um estressor adicional durante o teste.
6. Treinamento (Dia 15)
- Posicione o mouse na área de espera.
- Coloque as forminhas vazias, cada uma contendo uma recompensa alimentar (~ peça cereal 20 mg), para a área de testes e levantar o portão de partida. Permitir mouse de 3 min para recuperar as recompensas alimentares. Repita este passo várias vezes.
- Aos poucos, adicione serragem / rato cama gaiola para as panelas em ensaios subseqüentes. Permitir que o mouse 3 min para recuperar a recompensa alimentar de cada pote antes de terminar o triai. Uma vez que o rato tenha recuperado a recompensa alimentar de cada pote, passe para a próxima prova. Se o mouse não faz tentativas de cavar uma vez que a recompensa alimentar é parcialmente coberto, pode ser fornecido dicas (ou seja, polvilhe pó cereal sobre a área da recompensa alimentar, fazer um recuo na serragem sobre a área de recompensa alimentar, descobrir parte do recompensa alimentar).
- Continue adicionando serragem / roupa de cama depois de cada julgamento até que a recompensa alimentar é totalmente coberto e o mouse demonstra de forma confiável a capacidade de escavar em um pote cheio de encontrar a recompensa alimentar.
- Se um rato não demonstrou de forma confiável a capacidade de encontrar uma recompensa comida em um pote cheio dentro de 2 horas do início da formação, continuam a um segundo dia de treinamento. Manter o mouse sobre a restrição alimentar e repita este procedimento no dia seguinte.
- Se o mouse não consegue cavar para uma recompensa alimentar depois de dois dias sucessivos, excluí-lo do restante do experimento, e anotar como um "não conseguiu cavar" no expregistro erimental.
7. Testes (Dias 16-17):
- Em um dia, testar discriminação simples (SD), a discriminação composto (CD), a reversão (R1), e mudança intra-dimensional (IDS).
- No segundo dia, testar a mudança intra-dimensional 2 (IDS2), shift intra-dimensional 3 (IDS3), a reversão 2 (R2; opcional), shift extra-dimensional (EDS).
- Meios par e aromas, como mostrado na Tabela 1.
- Na hora de lidar no dia de testes, camundongos dar uma recompensa alimentar para evitar a falta de foco durante os testes devido à fome. A partir deste ponto até ao final do dia de teste, não fornecem qualquer alimento excepto recompensas para escolhas correctas.
- No início do ensaio, usando uma pinça (limita a propagação de cheiros entre potes), colocar um pedaço do alimento de recompensa no pote que indica uma escolha correcta. A recompensa de alimentos deve ser totalmente coberto pela mídia (ver Figura 3). Para evitar uma sugestão perfume da recompensa alimentar, polvilhe o cereal poeiraVER todas as panelas no início do estágio.
- Posicione o mouse na área de espera com o portão fechado início. Colocar os vasos de ambos os lados da câmara de teste. O teste inicia-se quando a porta de início é removido e o temporizador é iniciado. Permitir que cada rato 3 min por tentativa de fazer uma escolha. Grave a escolha (correta ou incorreta) e tempo até o rato fez uma escolha para cada ensaio.
NOTA: A "escolha" é indicado por uma tentativa de cavar em qualquer pote. A escavação só é registrado como uma escolha se o rato tem deslocado a mídia e cutucou seu nariz longe o suficiente no espaço ele cria para encontrar a recompensa alimentar ou o suficiente deslocadas da mídia para descobrir a recompensa alimentar. Se um rato não fez uma escolha dentro de 3 min, esta é registrada como outra opção (incorreta). - Uma vez que uma escolha foi feita para qualquer vaso, remover o pote que não foi escolhido a partir da câmara de teste. Se a escolha correta foi feita, permitir que o mouse para terminar a recompensa alimentar, antes de colocar o mouse de volta emárea de espera. Se uma escolha incorreta é feito, deixe o mouse para explorar o pote para mostrar que não há recompensa alimentar para essa escolha antes de retornar o mouse para a área de espera.
- No final de cada ensaio, colocar o rato para trás na área de espera e substituir a porta de início.
- Certifique-se de que o mouse se encontra com o critério de 8 ensaios corretos consecutivamente para avançar para a próxima fase da AST. Se um rato não obtenha 8 escolhas corretas consecutivas no período de 50 ensaios, ele falha nessa fase e não pode seguir em frente para completar o teste. 6 consecutivos sem escolhas (3 minutos, sem uma escolha) é um fracasso para participar e proíbe o mouse se mova para a próxima fase.
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Representative Results
A medida dependente típico neste teste é o número de ensaios por cada fase para satisfazer o critério (ou oito escolhas correctas consecutivas). A Figura 4A mostra o número médio de ensaios para satisfazer critérios em cada fase não tratada C57BL / 6J usando a AST. Como ratinhos formar um conjunto de atenção sobre a dimensão relevante taco (odor ou meios), irá melhorar o desempenho, como indicado por uma redução em ensaios para satisfazer mudanças sucessivas no critério intradimensional, e as fases de reversão e a mudança extradimensional exigirá ensaios adicionais para satisfazer critério. É importante para contrabalançar o número de animais que começam em cada uma das duas dimensões relevantes (isto é, meios ou odor) como já observada alguma diferença na fase de discriminação simples reflectido num aumento do número de ensaios com o critério, se o odor é relevante cue (Figura 4B). Se os ensaios para chegar critério na fase SD são significativamente diferentes entre the duas dimensões de sinalização relevantes (ou seja, um melhor desempenho quando a mídia é relevante como na Figura 4B), os dados de desempenho para cada rato durante as fases subsequentes podem ser normalizados para o seu desempenho durante a fase de discriminação simples. Tal como ilustrado na Figura 4C, este passo de normalização reduz a variabilidade associada com o taco de aprendizagem inicialmente relevante e melhora a visualização de um melhor desempenho nos estágios subsequentes IDS. Embora o tamanho dos grupos de ~ 20 camundongos será suficiente para permitir a análise dos dados brutos sem normalização. Importante, um aumento significativo nos ensaios para atender critério durante o turno extradimentional em relação aos turnos intradimentional anteriores indica é uma medida de controle importante da validade do teste (Figura 4D e 4E). Antes da fase de mudança ED, os ratos aprendem a prestar atenção a uma única dimensão relevante cue (odor ou mídia), a fim de localizar a recompensa. A mudança para um new dimensão sugestão relevante, que anteriormente era irrelevante, deve exigir mais testes para chegar a critério, resultando em uma mudança de ID / ED. Curiosamente, a análise do deslocamento ID / ED dentro dos dados em bruto revelou um aumento significativo nos ensaios para alcançar critério entre IDS2 e ED (Figura 4D), e tendência para um aumento entre IDS3 e ED (dados não mostrados, p <0,1) e um aumento entre os ensaios médios para chegar critério de IDS2 e IDS3 comparação com ED (dados não mostrados). Curiosamente, uma mudança significativa ID / ED foi aparente entre ambos IDS2 e IDS3 ED quando comparado com os dados foram normalizados para o desempenho na fase SD (Figura 4E).
Espera-se que aproximadamente 70-80% dos ratos de controle irá completar toda a tarefa (20-30% índice de desistência). Medidas dependentes alternativos incluem latência média para fazer uma escolha, conforme medido em cada etapa da tarefa (embora tenhamos encontrado isso seja altamente variável entre os ratos),número total de erros e número de erros de "perda de set-" na reversão e estágios de mudança extra-dimensionais, conforme definido pela Lapiz-Bluhm et al. 14, como o número de vezes que uma escolha errada foi feita depois de três ou mais consecutivamente escolhas corretas. Um aumento do número de erros de "perda de set-" pode indicar um comportamento perseverative. Além disso, os ratinhos tipicamente completar cada fase de ensaio, em menos de 30 min (Figura 5), e a duração do tempo gasto em cada fase é uma função de ensaios para alcançar critério.
Em um estudo anterior, através de um paradigma semelhante, conforme detalhados aqui, lesões neurotóxicas à OFC ou o mPFC em camundongos foram mostradas a prejudicar o desempenho nas reversão e extra-dimensionais estágios turnos respectivamente, validando o uso desse teste para determinar déficits funcionais no mesmas regiões que ratos e estudos11 primata não-humano. Enquanto a sequência das tarefas no estudo acima mencionado varies ligeiramente à mostrada aqui, espera-se que as lesões ou défices da OFC e mPFC também vai resultar num desempenho deficiente em R1 e de EDS, tal como reflectido por um aumento no número de ensaios ao critério nas fases. .
| Etapa | Relevante | Exemplos | Relevante | Exemplos | ||
| Discriminação Simples (SD) | Médio | Camurça (+) | Papel (-) | Odor | Noz-moscada (+) | Rosemary (-) |
| Composto Discriminação (CD) | Médio | Camurça (+) / noz-moscada | Papel (-) / Rosemary | Odor | Noz-moscada (+) / Felt | Rosemary (-) / Papel |
| Camurça (+) / Rosemary | Papel (-) / noz-moscada | Noz-moscada (+) / Papel | Rosemary (-) / Felt | |||
| Reversão 1 (R1) | Médio | Papel (+) / Rosemary | Camurça (-) / noz-moscada | Odor | Rosemary (+) / Papel | Noz-moscada (-) / Felt |
| Papel (+) / noz-moscada | Camurça (-) / Rosemary | Rosemary (+) / Felt | Noz-moscada (-) / Papel | |||
| Turno Intradimensional (IDS) | Médio | Pompons | Lantejoulas (-) / Clove | Odor </ Td> | Canela (+) / pompons | Clove (-) / Sequins |
| (+) / Canela | ||||||
| Pompons (+) / Clove | Lantejoulas (-) / Cinnamon | Canela (+) / Sequins | Clove (-) / pompons | |||
| IDS2 | Médio | Pipecleaners | Olhos arregalados (-) / Ginger | Odor | Tomilho vermelho (+) / pipecleaners | Ginger (-) / olhos Googly |
| (+) / Tomilho vermelho | ||||||
| Pipecleaners (+) / gengibre | Olhos arregalados (-) / Red tomilho | Tomilho vermelho (+) / olhos Googly | Ginger (-) | |||
| IDS3 | Médio | Ribbon (+) / Vanilla | Tiras metálicos (-) / Lemon | Odor | Vanilla (+) / Ribbon | Limão (-) / tiras metálicas |
| Ribbon (+) / Lemon | Tiras metálicas (-) / baunilha | Vanilla (+) / tiras metálicas | Lemon (-) / Ribbon | |||
| R2 | Médio | Tiras metálicas (+) / baunilha | Ribbon (-) / Lemon | Odor | Lemon (+) / Ribbon | Vanilla (-) / Tiras metálicas |
| Tiras metálicas (+) / Limão | Ribbon (-) / Vanilla | Limão (+) / metal tiras lic | Vanilla (-) / Ribbon | |||
| Turno extradimensional (EDS) | Odor | Citronela (+) / Ráfia | Anis (-) / Foam | Médio | Ráfia (+) / citronela | Espuma (-) / Anise |
| Citronela (+) / Espuma | Anis (-) / Ráfia | Ráfia (+) / Anise | Espuma (-) / citronela | |||
Tabela 1. Exemplos de combinações de odor e médio cavando. Os aromas e media escavação nestas combinações foram validadas neste estudo. Os resultados representativos obtidos com estas combinações específicas são mostrados na Figura 2.
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Figura 1. AST câmara de teste. (A) e as dimensões da imagem e ramekin exemplo da colocação de papel de filtro. (B) Imagem da câmara de testes AST adaptado para ratinhos e (C) um diagrama da câmara de ensaio que ilustra a colocação de furos no interior da partição tridimensional.
Figura 2. Cavar médio. Exemplos de escavação pares médios utilizados neste protocolo como detalhado na lista de materiais (ii.-xi.). Panelas são preenchidos aproximadamente até a borda interna com cavando meio.
Figura 3. Timeline para testes.
Figura 4. C57Bl / 6J desempenho na AST. (A) O número médio de tentativas para atender critério na AST para machos C57BL / 6J. Os dados representam a média ± SEM (n = 22 ratos / grupo), p = 0,013 para o efeito principal do palco. (B) O número médio de tentativas para chegar a critério na fase SD para dimensões de sinalização relevantes iniciais distintas. Os dados representam a média ± SEM (n = 22 ratos / grupo), * p = 0,01. (C) Dados normalizados representados como uma percentagem do desempenho individual de cada rato, na fase SD. Os dados representam a média ± SEM (n = 22 ratos / grupo), p = 0,06 para efeito principal do palco. (D) de deslocamento de ID / ED em ensaios para chegar a critério entre IDS2 e ED. Os dados representam a média ± SEM (n = 22 ratos / grupo), * p = 0,03. (E) mudança ID / ED em dados normalizados entre IDS3 e ED. Os dados representam a média ± SEM (n = 22 ratos / grupo), * p = 0,012.
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Discussion
Déficits na flexibilidade cognitiva mediadas pelo PFC representar uma deficiência significativa associada a uma variedade de doenças neurológicas e neuropsiquiátricas, e pode ter um grande impacto sobre os resultados e qualidade de vida dos indivíduos que sofrem desses transtornos. Otimização da AST para uso em camundongos é vital para investigar as bases genéticas de doenças acoplados a pré-frontais disfunção cognitiva mediada cortical. Verificou-se que o método descrito acima é uma medida de confiança de um défice cognitivo específico, flexibilidade cognitiva, e aproxima-se de perto os resultados obtidos usando esta tarefa em ratos e em primatas não humanos. O método descrito é o resultado de uma extensa pesquisa de protocolos previamente descritos em ratos e camundongos, bem como aconselhamento e orientação de especialistas da nossa instituição.
Relatórios anteriores usando tarefas semelhantes em camundongos demonstraram a capacidade de adaptação de uma medida de tal comportamento, embora comvárias advertências 2,6,11. Colacicco et al. Limitou o número de discriminações testadas por dia para 2, que se espalhou ensaio durante um período de quatro dias 11. Isto incluiu repetições de pares de estímulos anteriormente aprendidas em dias de teste consecutivos. Embora eficaz, o objectivo de desenvolver o protocolo aqui apresentado é o de minimizar a duração do período de teste e maximizar a eficiência. Aqui, nós limitamos o teste para um período de dois dias e eliminar repetições de pares de estímulos previamente aprendidos. Pesquisas anteriores observaram que os ratos exigem overtraining para formar um conjunto de atenção e exibem uma pequena "janela de testabilidade", em que eles vão manter responder effortful. Nosso protocolo envolve também overtraining modesto no turno intradimensional dentro da dimensão cue inicialmente relevante. Particularmente quando se avalia os dados normalizados na Figura 4C, parece que os ratos testados no nosso protocolo pode apresentar um défice duri mais pronunciadang a segunda inversão intradimensional (em relação à fase imediatamente anterior). Esta observação é consistente com a noção de exercício físico excessivo, a fim de assegurar a formação de um conjunto de atenção, como ratinhos também exibiu um deslocamento ID / ED. Uma possibilidade como de ratinhos por manter o desempenho de esforço no nosso protocolo (Figura 5), que envolve um comprimento médio sessão de 2 horas, pode ser devido à utilização de um ciclo de luz inverso. Testamos comportamento em uma sala de ensaio isolado dedicado e sob condições de iluminação de cor vermelha durante as primeiras quatro horas de ciclo (vigília) escuro. No entanto, o teste sistemático fora do âmbito do presente método manuscrito seria necessário para determinar quais os factores que contribuem para a duração em que os ratos irão continuar a executar a AST, e caso se suspeite de défices de discriminação olfactivo, prescreening pode ser garantido, antes do teste como alternativa metodologias, livre de odores têm sido relatados.
Além disso, duranteo método de desenvolvimento inicial, descobrimos que os ratos adultos jovens (8-12 semanas de idade) executada com uma maior variabilidade que ratos velhos ligeiramente mais velhas 4-6 meses. Especula-se que o protocolo de restrição alimentar afeta crescente ratos de forma diferente do que os ratos mais maduros, e ao mesmo tempo, em um sentido neurodesenvolvimento clássico, o cérebro do rato são consideradas inteiramente desenvolvido por seis semanas, é possível que a transição da adolescência para a maturidade adulta e início da idade adulta remodelação sináptica no córtex pré-frontal desempenho confundem AST nos ratos mais jovens. No entanto, essas questões fascinantes ainda precisam ser exploradas.
Outras variações de protocolos de AST em camundongos incluem ensaios "livres", ou seja, um determinado número de tentativas (tipicamente 4), no início de cada fase, não são marcados, e o animal é permitido explorar ambos os potes até que a recompensa é recuperado. O protocolo detalhado aqui não inclui quaisquer ensaios "livres". Além disso, vamos definir o requirements para atender critério mais rigoroso (8 ensaios consecutivamente corretos ao critério em vez do descrito anteriormente 10/08 ensaios para atender critério) e descobriram que este é um indicador eficaz de saber se o animal tem realmente aprendeu a regra. Garner et ai. mostrou que um período de overtraining na sequência de um IDS (ou seja, a apresentação dos estímulos anteriormente relevantes para outras 50 ensaios adicionais) aumentou significativamente os ensaios com o critério na EDS 2. Aqui, incluem vários turnos intra-dimensional, em um esforço para "overtraining" e assegurar a formação de um conjunto de atenção sobre a dimensão relevante, de acordo com Bissonette et al. 6. Além disso, Garner et ai. sessões de testes limitados a, aproximadamente, 1 h (ou quando o rato já não reagiu) 2, enquanto verificou-se que os ratinhos C57BL6 / J de forma adequada e segura progredir através de todas as quatro fases que lhes são apresentados a cada dia dentro de um período de aproximadamente 2 horas (para controleratinhos). Embora, os potenciais diferenças na capacidade motora entre os grupos experimentais devem ser consideradas na interpretação performance. O nosso procedimento restringe o tempo e trabalho de investimento para 17 dias para cada animal desde o início da manipulação através da realização de testes. Recomenda-se que um experimentador indivíduo limitar o número de ratinhos ensaiados num único dia para não mais do que 2 (isto pode ser modificado com base na capacidade individual experimentador e experiência), que permite que um único experimentador a capacidade de realizar o teste de pelo menos seis ratinhos por semana. Se a função motora é prejudicada mínimo, a duração de cada teste pode ser aumentado, como correta de responder, não a velocidade de resposta, é a variável dependente chave.
Discriminação visual paradigmas semelhantes aos que foram utilizados para avaliar o desempenho cognitivo em primatas não humanos têm sido recentemente adaptados para uso em roedores, e pode ser usado como uma alternativa para o meio de odor e discrimination tarefas descritas aqui. Esta abordagem pode ser necessário se diferenças significativas na discriminação olfactiva estão presentes entre os grupos experimentais de ratinhos. Brigman et al. Demonstraram que camundongos prontamente discernir estímulos visuais compostos em um ID e uma mudança de paradigma ED 15. Enquanto este método automatizado melhor representa o teste utilizado para o estudo da disfunção do córtex pré-frontal em seres humanos e primatas não-humanos, o custo das câmaras operativas e tácteis necessárias para executar este teste automatizado em ratinhos pode ser proibitivo.
Recomenda-se que o comportamento ser realizada de forma tão consistente quanto possível para cada rato, ou seja, a habituação, treinamento e testes devem ser realizados na mesma hora do dia para cada animal. Além disso, a sala de comportamento deve permanecer inalterada durante todo o experimento, tornando o uso do espaço compartilhado / comunidade problemática, devido ao fluxo de tráfego incontrolável, introdução odor, etc. Se os animais devem ser transportadosa partir de uma sala de alojamento para uma sala de comportamento remoto (como é o caso aqui), o mesmo percurso deve ser tomada de cada vez. A sala de comportamento deve ser em uma área onde o experimentador e os animais não será perturbado durante o procedimento de teste. Se vários experimentadores estão realizando a tarefa na mesma sala, a entrada e saída da sala deve ser tão limitada quanto possível para evitar ruídos altos ou perturbação que podem aumentar o estresse ou ansiedade do animal durante o teste. Além disso, os experimentadores deve ter cuidado na remoção e substituição do portão início, bem como os vasos para dentro e para fora da câmara de modo a criar o menos ruído e interrupções quanto possível. Experimentos realizados em ratos demonstraram que a realização AST pode ser interrompida por vários estressores.
Aromatização dos vasos devem ser realizados a cada semana e no mesmo dia de cada semana, pelo menos, 2 dias antes do primeiro dia de teste. Recomenda-se que as panelas são perfumadas em uma bem-ventárea ilated fora da área em que o teste deve ser realizado (por exemplo, laboratório independente, hall, exaustor). Isso vai ajudar a evitar a contaminação cruzada dos perfumes e evitar confundir os ratos com aromas que não fazem parte do teste. Além disso, antes e durante o ensaio, odores fortes que podem distrair o animal da discriminação (isto é, o consumo de café ou goma imediatamente antes do teste, forte perfume / desodorizante, etc.) devem ser evitadas para a razão acima mencionada. Caso experimentadores desejo de usar o meio de escavação alternativo do que o que está descrito no presente protocolo, recomenda-se que o meio de ter uma densidade semelhante e peso ao descrito aqui (excesso de peso / densidade torna difícil para o mouse para cavar adequadamente). Por exemplo, verificou-se que os pequenos grânulos de plástico não eram adequados, pois eram difíceis para os ratos para afastar. Além disso, qualquer mídia com um cheiro muito forte (por exemplo., Tiras de borracha e alguns plastMaterial ic) não é adequado uma vez que podem interferir com a capacidade para detectar os aromas a ser testado.
Formação e testes de um ratinho individual deve ser realizada por um único experimentador, no entanto aclimatação pode ser feito por qualquer experimentador contanto que participaram no manuseio. Todos os vasos para ser utilizado nas quatro fases realizadas a cada dia deve estar dentro do alcance, de modo a limitar a quantidade de tempo que o animal está na área de espera entre as etapas. Isso ajudará a manter a atenção do mouse sobre cada tarefa. Além disso, uma vez que o teste começou, é importante não parar até a conclusão das tarefas para que dia de testes (ou seja, todas as 4 etapas para cada dia de testes deve ser concluída em sucessão).
Em conclusão, o protocolo descrito aqui fornece instruções metodológicas detalhadas para a utilização eficaz da AST para medir a função cognitiva cortical dependente pré-frontal em camundongos, incluindo a descriçãode análise de dados e potenciais ressalvas. Uma variedade de métodos de AST do rato são relatados na literatura primária, cada um com o seu próprio detalhe processual distinta. O acoplamento única de ambos informações baseadas em texto e visual será particularmente útil para os investigadores a tentar incorporar este poderoso ensaio comportamental em seu repertório científico.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada por doações R01-MH090127, P30-MH089868 do Instituto Nacional de Saúde Mental e número prêmio UL1TR001120 do Centro Nacional para a Promoção da Ciência Translacional. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do NIMH ou NCATS. Além disso, gostaríamos de reconhecer com gratidão Dr. David Morilak por sua valiosa experiência para orientar o desenvolvimento do método cedo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Testing Chamber | Fabricated in-house, specifications can be found in protocol | ||
| 3 oz. Ramekins | BIA Cordon Bleu | 900002S12 | Purchased on amazon.com |
| Essential Oils: | Fronteir Natural Products Co-Op | Purchased on http://www.frontiercoop.com/prodlist.php?ct=anpceoeo | |
| Clove Bud | 191114 | ||
| Red Thyme | 191140 | ||
| Lemon | 190810 | ||
| Cinnamon Leaf | 191111 | ||
| Rosemary | 191133 | ||
| Citronella Java | 191112 | ||
| Vanilla in jojoba oil | 191231 | ||
| Anise Seed | 191102 | ||
| Ginger | 191121 | ||
| Nutmeg | 191161 | ||
| Filter Paper, 9.0 cm diameter | VWR International | 28310-048 | Purchased on https://us.vwr.com/ |
| Digging Media | |||
| Raffia | Ashland 8 oz Raffia | Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips |
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| Green Felt | Creatology Basic Felt Forest/Dark Green 36 in x 36 in | Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1 cm x 1 cm squares |
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| Brown foam | Creatology Fun Foam 18 x 12 in sheets (light brown/tan) | Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1/2 cm x 2 cm rectangles |
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| Crepe paper (yellow) | Celebrate It Paper Crinkle 4 oz yellow jumbo | Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips |
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| Ribbon (turqoise) | Celebrate It Wide Ribbon 4 in x 10 yd 100% polyester | Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1 cm x 1 cm squares |
|
| Metallic | Celebrate It Metallic Crinkle Gold 2 oz | Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips |
|
| Googly Eyes, 4 mm | ME4144 | Purchased on http://factorydirectcraft.com/index.php | |
| Black Sequins, 3 mm | 8780BK | ||
| Pink Pom Poms, 1/4 inch | 1018221 | ||
| Pipe Cleaners, red | 108430 | ||
| Bedding material/sawdust | Obtained from in-house animal resources | ||
| Timer | Control Company | 5000 | Purchased on http://www.control3.com/5000p.htm |
| Lightly sweetened dry breakfast cereal loops | HEB | Honey nut toasted oats used in the protocol described, any lightly sweet coated breakfast cereal is recommended |
References
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