Summary
सीए 2 + संकेतन पौधों में विविध जैविक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करता है. यहाँ हम स्थानिक और लौकिक सीए प्रेरित अजैव तनाव की निगरानी के लिए दृष्टिकोण पेश Arabidopsis कोशिकाओं और आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सीए 2 + संकेतक Aequorin या Case12 का उपयोग ऊतकों में 2 + संकेतों.
Abstract
विकास और पर्यावरण संकेतों सीए संयंत्र कोशिकाओं में 2 + उतार चढ़ाव प्रेरित. प्रेरणा विशिष्ट स्थानिक लौकिक सीए 2 + पैटर्न सीए 2 + cascades संकेत आरंभ कि सेलुलर सीए 2 + बंधनकारी प्रोटीन द्वारा महसूस कर रहे हैं. हालांकि, हम अभी भी विशिष्ट सीए 2 + संकेतों उत्पन्न कर रहे प्रोत्साहन के बारे में कैसे कम जानते हैं. एक सीए 2 + संकेत की विशिष्टता किसी दिए गए प्रोत्साहन के जवाब में सीए 2 + चैनलों और / या ट्रांसपोर्टरों की गतिविधियों का परिष्कृत विनियमन के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है. इन सेलुलर घटकों की पहचान करने और उनके कार्यों को समझने के लिए, यह ऊतक और सेलुलर स्तर दोनों पर सीए 2 + संकेतों के एक संवेदनशील और मजबूत रिकॉर्डिंग की अनुमति प्रणालियों का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. विभिन्न सेलुलर डिब्बों को लक्षित कर रहे हैं कि आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सीए 2 + संकेतक सेलुलर सीए 2 + संकेतों का जीना सेल confocal इमेजिंग के लिए एक मंच प्रदान किया है. यहाँ हम अनुदेश का वर्णनदो सीए 2 + का पता लगाने प्रणालियों के इस्तेमाल के लिए है: एफएएस (फिल्म चिपकने वाला पौध) luminescence सीए 2 + इमेजिंग और case12 आधारित लाइव सेल confocal प्रतिदीप्ति सीए 2 + इमेजिंग आधारित aequorin. Case12 का उपयोग रहते सेल confocal इमेजिंग एक उच्च संकल्प पर साइटोसोलिक और परमाणु सीए 2 + संकेतों के एक साथ पता लगाने प्रदान करता है, जबकि एफएएस प्रणाली का उपयोग luminescence इमेजिंग, ऊतक स्तर पर स्थानिक और लौकिक सीए 2 + संकेतों के एक सरल, मजबूत और संवेदनशील पता लगाने प्रदान करता है.
Introduction
संयंत्र सेल सेल कार्यों का समन्वय करता है कि संकेत के माध्यम से पर्यावरण के लिए प्रतिक्रिया करता है. पर्यावरण उत्तेजनाओं के जवाब में घटना संकेत एक प्रारंभिक सेल एक क्षणिक सीए 2 + वृद्धि हुई है. नि: सीए 2 + एकाग्रता में पैटर्न, या एक क्षणिक वृद्धि के हस्ताक्षर अपने आयाम, आवृत्ति, और अवधि की विशेषता है. पृथक spatio- अस्थायी सीए 2 + हस्ताक्षर अलग सेलुलर गतिविधियों 1 विनियमित. ऐसी गर्मी, सर्दी, नमक, सूखा, प्रकाश, या संयंत्र हार्मोन के रूप में विशिष्ट उत्तेजनाओं, ठीक धुन सकता झिल्ली स्थानीयकृत सीए 2 + चैनलों और / या ट्रांसपोर्टरों की spatio- लौकिक गतिविधि, विशिष्ट सीए 2 + हस्ताक्षर में जिसके परिणामस्वरूप. सीए 2 + ट्रांसपोर्टरों अच्छी तरह से विशेषता किया गया है, छोटे पौधों 1 में सीए 2 + चैनलों की आणविक पहचान और कार्य के बारे में जाना जाता है. उत्तेजनाओं तनाव को बदल सीए 2 + प्रतिक्रिया के साथ म्यूटेंट के लिए आनुवंशिक स्क्रीन एक प्रभावी appr हो सकता हैसीए 2 + हस्ताक्षर रचना कि घटकों की पहचान करने के लिए oach. हाल ही में कई Aequorin आधारित सीए 2 + का पता लगाने प्रणालियों रोगज़नक़ हमले और अजैविक तनाव 2-4 के जवाब में घटकों संकेत 2 + कैरियर के लिए आनुवंशिक स्क्रीन की सुविधा है कि विकसित किया गया है.
Aequorin पहले 1990 के दशक में 5 सीए पौधों में 2 + संकेतों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था. तब से, Aequorin ऐसे सीए 2 विशेष सेल की निगरानी करने की जड़ में 8 tonoplast कोशिका द्रव्य 5, नाभिक 6, क्लोरोप्लास्ट 7, माइटोकॉन्ड्रिया 9, और स्ट्रोमा 10, साथ ही साथ करने के लिए विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के रूप में विभिन्न सेलुलर डिब्बों, के लिए लक्षित किया गया है + संकेतों 11. Aequorin आधारित सीए 2 + माप उत्तेजनाओं तनाव की कोशिकाओं की आबादी के स्थानिक और लौकिक सीए 2 + प्रतिक्रिया प्रकट करते हैं. हालांकि, ज्यादातर मामलों में, एकल कक्षों के सीए 2 + प्रतिक्रियाओं unsynchroni हैंप्रत्युत्तर देना ऊतक 4 में जेड. इसलिए, Aequorin सीए 2 + रिकॉर्डिंग जरूरी व्यक्ति की कोशिकाओं में सीए 2 + संकेत रिपोर्ट नहीं है. हाल के वर्षों में, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपी) उच्च subcellular संकल्प के साथ संकेत 2 + सीए अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है सीए ऐसे पीला Cameleon (YCS) 12 और CASEs12 13 के रूप में 2 + संकेतक, आधारित. YCS प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) पाकिस्तानी युक्त, सीए 2 + संकेतक आधारित और YFP प्रोटीन calmodulin और calmodulin बाध्यकारी पेप्टाइड M13 -binding 2 + सीए द्वारा जुड़ा हुआ वेरिएंट हैं. यह सीए 2 + करने के लिए बांध के रूप में Calmodulin जिससे वृद्धि हुई ऊर्जा हस्तांतरण (बढ़ाया झल्लाहट), जिसके परिणामस्वरूप करीब एक साथ पाकिस्तानी और YFP लाता है, एक गठनात्मक बदलाव आए. पाकिस्तानी संकेत तीव्रता को YFP के अनुपात के रूप में मोटे तौर पर गणना की समय पर झल्लाहट स्तर,, intracellular सीए 2 + गतिशीलता को दर्शाता है. कई YC संस्करणों संयंत्रों में इस्तेमाल किया गया है. YC3.6 टी थाcytosol 14,15, नाभिक 16, माइटोकॉन्ड्रिया 17, और प्लाज्मा झिल्ली 18, और YC4.6 और D4ER को argeted ईआर 15,19 को निशाना बनाया गया, और D3cpv peroxisomes 20 को निशाना बनाया गया. YCS व्यक्त ट्रांसजेनिक पौधों विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के विभिन्न सेलुलर डिब्बों के भीतर सीए 2 + गतिशीलता का जीना सेल इमेजिंग अनुमति देते हैं. मामले (शायद सीए lcium एसई nsor) एक calmodulin और calmodulin बाध्यकारी पेप्टाइड M13 शरण एकल चक्राकार permuted फ्लोरोसेंट प्रोटीन (cpFPs) कर रहे हैं. सीए 2 + के लिए बाध्य करने पर, मामलों प्रतिदीप्ति तीव्रता की वृद्धि करने के लिए अग्रणी, गठनात्मक परिवर्तन से गुजरना. मामला है प्रतिदीप्ति प्रतिक्रिया और सीए 2 + एकाग्रता के बीच संबंध intracellular सीए 2 + गतिशीलता मात्रात्मक मापा जा करने की अनुमति देता है. Case12 संस्करण 12 गुना सीए 2 + -saturated रूपों में प्रतिदीप्ति बढ़ गया है. एन benthiminana पौधों क्षणिक exprEssing Case12 या stably प्रकरण 12 व्यक्त Arabidopsis पौधों रक्षा और अजैव तनाव 4,21 में सीए 2 + संकेतन अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया. , या निर्जलीकरण तनाव को रोगज़नक़ हमले का जवाब देने की कोशिकाओं में अतुल्यकालिक स्थानिक और लौकिक सीए 2 + दोलनों Case12 आधारित सीए 2 + इमेजिंग के साथ खुलासा किया गया है.
यहाँ, हम Arabidopsis पौध में 2 + गतिशीलता सीए विशिष्ट, और साइटोसोलिक की confocal इमेजिंग और परमाणु कैरियर के लिए ऊतक और उत्तेजनाओं की Aequorin आधारित luminescence इमेजिंग के लिए विस्तृत निर्देश उपस्थित एफएएस के प्रकरण 12 Luminescence इमेजिंग व्यक्त कि Arabidopsis रूट कोशिकाओं में 2 + गतिशीलता बरकरार पौधों या यहाँ वर्णित नहीं ऊतकों में तनाव प्रेरित सीए 2 + गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए, या 2 + संकेतों सीए प्रेरित बदल तनाव के साथ म्यूटेंट के लिए mutagenized Arabidopsis संयंत्र आबादी स्क्रीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. लाइव सेल सीए 2 + इमेजिंग सेटअप सीए का विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता हैअन्य सीए 2 + संकेतक का उपयोग विभिन्न subcelluar डिब्बों के भीतर या विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में 2 + गतिशीलता.
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Protocol
एफएएस प्रणाली का प्रयोग 1 Aequorin आधारित सीए 2 + इमेजिंग
- Luminescence इमेजिंग के लिए पौध तैयार करें. 0.01% ट्राइटन-100 युक्त 10% ब्लीच समाधान के साथ Aequorin व्यक्त Arabidopsis पौधों के बीज जीवाणुरहित. पूरी ताकत एमएस (Murashige और Skoog बेसल नमक के मिश्रण), 1% sucrose, और 1.2% अगर युक्त एक वर्ग प्लेट (ग्रिड के साथ 10 x 10 सेमी वर्ग पेट्री डिश,) पर बाँझ बीज बोना. खड़ी 2 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 1 ए) में स्तरीकरण के बाद एक विकास कक्ष में जगह प्लेटें.
- एक फिल्म पर पौध स्थानांतरण. थाली पर बढ़ 7-10 दिन पुरानी पौध के शीर्ष पर एक चिपकने वाला फिल्म (चित्रा 1 बी) रखें. धीरे पौध फिल्म (चित्रा 1C) का पालन सुनिश्चित करना है कि हाथ से फिल्म धक्का. पौध फिल्म का पालन रहते हैं ताकि धीरे फिल्म पील (चित्रा -1 और 1E)
- Cofactor साथ पौध सेते हैं. एक जगहयुक्त वर्ग प्लेट (10 x 10 सेमी) पर dhered पौध 2 ग्राम की 15 मिलीग्राम / मिलीलीटर एच CTZ पानी में (coelenterazine). रातोंरात (चित्रा 1F) को 4 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर पौध सेते हैं.
- Luminescence इमेजिंग के लिए तैयार करें. दो टुकड़े के गठन, एच CTZ समाधान के बाहर फिल्म लो और मध्य यह कटौती. पौध दो अलग प्लेटों में चेहरे के साथ फिल्म का एक टुकड़ा रखें. 5 मिनट के लिए अंधेरे में प्लेटें छोड़ दें.
- Luminescence छवियों मोल. अंधेरे में, अगले luminescence इमेजिंग प्रणाली (चित्रा 1G) के मंच पर एक दूसरे से दो प्लेटें प्लेस. तुरंत एक साथ प्लेटों को उत्तेजनाओं समाधान के 20 मिलीलीटर जोड़ने पर छवियों मोल.
- Luminescence छवियों का विश्लेषण. सभी luminescence छवियों के लिए एक ही प्रदर्शन रेंज चुनें. ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र फसल और जेपीईजी फ़ाइलें (2A चित्रा) के रूप में छवियों को उत्पन्न करते हैं. वैकल्पिक रूप से, विशेष प्रारूप फ़ाइलों के रूप में छवियों को निर्यात और में उन्हें आयातImageJ छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर. रॉय के मतलब ग्रे मूल्य की गणना के लिए निर्धारित माप. आरओआई क्षेत्र के ही आकार का चयन करें और बार रेखांकन (चित्रा 2 बी) के रूप में मतलब ग्रे और वर्तमान डेटा को मापने.
2 लाइव सेल confocal सीए 2 + इमेजिंग
- Confocal इमेजिंग के लिए पौध तैयार करें. 0.01% ट्राइटन युक्त 10% ब्लीच समाधान के साथ case12 व्यक्त Arabidopsis पौधों के बीज जीवाणुरहित. पूर्ण शक्ति एमएस लवण, 1% sucrose, और 1.2% अगर युक्त एक थाली पर बाँझ बीज बोना. 2 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्तरीकरण के बाद एक विकास कक्ष में खड़ी प्लेस प्लेटें.
- सेटअप इमेजिंग चेम्बर्स
- एक स्लाइड और coverslip (चैंबर ए) का उपयोग कर एक इमेजिंग कक्ष इकट्ठे. स्लाइड के बीच पर पानी से लथपथ रूई का एक टुकड़ा रखें. फिर पानी से लथपथ रूई के शीर्ष पर थाली से एक या दो 5 दिन पुरानी पौध हस्तांतरण. एक coverslip, एक के प्रत्येक कोने में मिट्टी के छोटे टुकड़े चिपकाcoverslip और स्लाइड के बीच एक खाई (कक्ष) (चित्रा 3 ए, बाएं पैनल) बनाने के लिए पौध के शीर्ष पर घ जगह coverslip. एक 1 मिलीलीटर सिरिंज को पॉलीथीन ट्यूब (0.58 मिमी व्यास) के एक छोर से कनेक्ट और चैम्बर के लिए तुरंत आसन्न ट्यूब के दूसरे छोर जगह है. टेप (चित्रा 3 ए, सही पैनल) के साथ जगह में ट्यूबिंग पकड़ो.
- एक Plexiglass कक्ष (चैम्बर बी) का उपयोग कर एक इमेजिंग कक्ष इकट्ठे.
- Plexiglass चैंबर के प्रत्येक पक्ष पर चैनलों में लेपित ट्यूबों दो पॉलीथीन ट्यूब (0.58 मिमी व्यास) के आसपास सिलिकॉन तेल की एक पतली परत फैल और प्रेस (चित्रा 3B पैनल छोड़ दिया). ट्यूब खांचे जिसमें चैम्बर की सतह पर सिलिकॉन तेल की एक पतली परत फैल और कक्ष खोलने (बाहर कटौती) के एक तरफ सील करने के लिए तेल में एक coverslip दबाएँ.
- चेंबर में थाली से एक पांच दिन पुरानी अंकुर स्थानांतरण और शीर्ष ओ पर पानी से लथपथ रूई का एक टुकड़ा जगहअंकुर च. चैंबर के अन्य सतह पर सिलिकॉन तेल बिखरा हुआ है, और सील करने के लिए शीर्ष पर एक और coverslip दबाएँ. एक 1 मिलीलीटर सिरिंज के लिए ट्यूब में से एक का अंत कनेक्ट करें. अन्य ट्यूब खुला (चित्रा 3B सही पैनल) के अंत छोड़ दें.
- एक संभाग कवर ग्लास (चैंबर सी) का उपयोग कर एक इमेजिंग कक्ष तैयार करें. 70% इथेनॉल के साथ संभाग कवर कांच जीवाणुरहित और शुष्क जब तक हुड पर छोड़ दें. 0.6 मिलीलीटर या क्रमशः, एक 2-अच्छी तरह से चैंबर के प्रत्येक अच्छी तरह से या एक 8 अच्छी तरह से चेंबर में (चित्रा -3 सी सही पैनल) 1% sucrose और 0.5% phytagel युक्त पूरी ताकत एमएस माध्यम की 0.2 मिलीलीटर जोड़ें. बीज जीवाणुरहित और स्पष्ट जेल की एक पतली परत से युक्त एक संभाग कवर गिलास में सीधे बीज बोना और उन्हें 5 दिन (चित्रा -3 सी) के लिए खड़ी हो जाना.
- एक confocal खुर्दबीन का उपयोग कर छवियों मोल. , बर्फ कर्नल धीरे से 150 मिमी NaCl के बारे में 200 μl इंजेक्षन, ऐसे नमक, ठंड या पेरोक्साइड के रूप में तनाव उत्तेजनाओं, लागू करने के लिएठीक पहले क्रमशः, छवियों को प्राप्त करने, या धीरे एक 2 या 8 अच्छी तरह से कक्ष की अच्छी तरह से करने के लिए प्रोत्साहन समाधान के 500 μl या 100 μl जोड़ने के लिए कक्ष (चैम्बर ए या बी) में डी पानी या 1 मिमी एच 2 ओ 2 समाधान . छवियों पर कब्जा तुरंत एक 20X पानी विसर्जन लेंस (संख्यात्मक एपर्चर 0.75) के साथ एक औंधा Nikon A1R confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग प्रोत्साहन समाधान को लागू करने के बाद. क्रमश: 550 एनएम, और 512 X 512 के पिक्सल रेजोल्यूशन पर - 488 एनएम और 500 की उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ 4 सेकंड के अंतराल पर छवियों का एक समय श्रृंखला लीजिए.
- छवि विश्लेषण
Nikon तत्वों का उपयोग, ROIs ब्याज की प्रत्येक कोशिका (या क्षेत्र) के चारों ओर खींचा गया. प्रत्येक रॉय के भीतर कुल तीव्रता समय मापन संवाद बॉक्स (ImageJ बजाय प्रयोग किया जा सकता है) का उपयोग कर समय पर मापा गया था. कुल तीव्रता माप निर्यात और DataGraph में प्रोसेस किया गया. सीए 2 + कील आयाम वें के रूप में शिखर तीव्रता शून्य से आराम तीव्रता, अवधि के रूप में परिभाषित किया गया थादो spikes के आसन्न स्पाइक चोटियों के बीच समय अंतराल के रूप में दीक्षा और एक कील के पूरा होने, और अवधि के बीच ई समय. -test साधन तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था टी.
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Representative Results
Mannitol, NaCl और एच 2 ओ 2 क्रमशः, निर्जलीकरण, नमक और oxidative तनाव उत्तेजनाओं के लिए परदे के पीछे के रूप में इस्तेमाल किया गया. भारी धातु आयन घन 2 + इन तीन तनाव उत्तेजनाओं से किसी के साथ synergizes अगर जाँच करने के लिए, हम घन 2 + की उपस्थिति या अनुपस्थिति में प्रत्येक उत्तेजनाओं को सीए 2 + प्रतिक्रिया की तुलना में. चित्रा 2 में दिखाया गया है, फैस luminescence इमेजिंग Arabidoposis पौध निर्जलीकरण, नमक और oxidative तनाव को अलग ढंग से जवाब दिया कि पता चला. 1 मिमी एच 2 ओ 2 प्रेरित करते हुए हम इस अध्ययन में जांच की उत्तेजनाओं की एकाग्रता के लिए, 75 मिमी NaCl, जोखिम (2A चित्रा मध्यम पैनल और चित्रा 2 बी) के पहले 40 सेकंड के दौरान पत्तियों और जड़ों में मजबूत सीए 2 + प्रतिक्रिया प्रेरित पहला और दूसरा 40 सेकंड (2A चित्रा सही पैनल) के दौरान पत्तियों और जड़ों में दोनों एक मजबूत सीए 2 + प्रतिक्रिया. 400 मिमी mannitol का समाधान केवल प्रेरितदूसरा 40 सेकंड के दौरान पत्ते में पहले 40 और बहुत कमजोर संकेतों के दौरान जड़ों में सीए 2 + प्रतिक्रिया. घन जोरदार आयाम और NaCl और mannitol (2A चित्रा बाएं पैनल) से चालू होने वाले सीए 2 + संकेतों की अवधि बढ़ाकर 2 +. यह घन 2 + एच सीए आयाम और अवधि (2A चित्रा सही पैनल और 2 बी) दोनों को कम 2 + संकेतों, प्रेरित 2 हे 2 पर निरोधात्मक प्रभाव था कि प्रतीत होता है.
Case12 व्यक्त Arabidopsis पौधों का उपयोग करना, हम एक साथ सीए 2 + cytosol में गतिशीलता और नाभिक मापा. Case12 की आणविक वजन Case12 व्यक्त इसलिए ट्रांसजेनिक पौधों GFP दोनों cytosol में संकेतों और पत्ती के नाभिक और जड़ कोशिकाओं (चित्रा -4 ए) है, 46 केडीए है. स्वनिर्धारित (चित्रा 3 ए और 3 बी) या वाणिज्यिक कक्षों (चित्रा -3 सी) एक confocal साथ लाइव सेल इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गयामाइक्रोस्कोप. कक्ष में अंकुर को 150 मिमी NaCl लागू है, हम cytosol और व्यक्ति की कोशिकाओं (; पूरक मूवी 1 चित्रा 4 बी और सी) के नाभिक दोनों में प्रतिदीप्ति तीव्रता के परिवर्तन मनाया. एनआईएस तत्वों (इमेजिंग सॉफ्टवेयर, Nikon उपकरण इंक) का उपयोग करना, हम समय के साथ ब्याज (आरओआई) के क्षेत्रों में प्रतिदीप्ति तीव्रता मापी. आयाम, अवधि और साइटोसोलिक और परमाणु सीए 2 + दोलन की आवृत्ति 4B चित्रा में रेखांकन भी प्रस्तुत कर रहे हैं. 2 + कोशिका द्रव्य में spikes और नाभिक एक ही रूट की कोशिकाओं के बीच और साथ ही विभिन्न जड़ों में कोशिकाओं भर में काफी भिन्नता है सीए के आयाम और अवधि. साइटोसोलिक सीए 2 + spikes के आयाम और अवधि क्रमश: 60.36 ± 45.22 ए.यू. (मनमाना इकाई) और 58.24 ± 15.70 सेकंड थे. परमाणु सीए 2 + spikes के आयाम और अवधि क्रमश: 316.26 ± 75.24 (एयू) और 61.71 ± 16.31 सेकंड थे. इसके विपरीत,साइटोसोलिक और परमाणु सीए 2 + spikes की अवधि में क्रमश: 17.43 ± 3.67 सेकंड और 17.33 ± 2 सेकंड थे, जो कोशिकाओं के बीच समान थे. फोकल हवाई जहाज़ और / या प्रतिक्रिया का एक नुकसान के परिवर्तन के कारण हो सकता है जो 2 + spikes के समय में कमी आई सीए के आयाम, क्योंकि इन विट्रो हालत में एक प्रतिकूल की उत्तेजनाओं तनाव की. इन परिणामों नमक तनाव कोशिका द्रव्य और नाभिक दोनों में सीए 2 + दोलन से चलाता है कि दिखा.
चित्रा 1 Aequorin उत्तेजनाओं तनाव के जवाब में स्थानिक लौकिक सीए 2 + गतिशीलता मापने के लिए एफएएस प्रणाली आधारित. ए) एमएस मीडिया. बी युक्त एक थाली पर खड़ी Arabidopsis बीज बोने, सी) पौध के शीर्ष (सी). डी, ई) पर एक चिपकने वाला फिल्म (बी) रखें एफ) जी) के बीच नीचे फिल्म में कटौती. 4 घंटे के लिए पानी में एच CTZ की 2 ग्राम / मिलीलीटर के साथ फिल्म का पालन पौध सेते हैं और एक अलग में प्रत्येक टुकड़ा जगह खाली थाली. 5 मिनट के लिए अंधेरे में प्लेटें छोड़ दें. एक साथ नियंत्रण और उत्तेजनाओं समाधान (पौध पूरी तरह से कवर कर रहे हैं सुनिश्चित करें), और तुरंत छवियों को प्राप्त लागू होते हैं. पैमाने पर पट्टी 5 सेमी है.
स्थानिक लौकिक सीए की चित्रा 2 तुलना 2 + अलग तनाव उत्तेजनाओं को 10 दिन की पौध की प्रतिक्रिया. 400 मिमी mannitol और 400 मिमी mannitol प्लस 1 मिमी CuCl 2 (ए, बाएं पैनल), 75 मिमी NaCl और 75 मिमी NaCl प्लस 1 मिमी CuCl के अधीन पौध की luminescence छवियों का एक) एक समय श्रृंखला2 (ए, मध्यम पैनल), और 1 मिमी एच 2 ओ 2 या 1 मिमी एच 2 ओ 2 प्लस 1 मिमी CuCl 2 (ए, सही पैनल). एक के ऊपरी और निचले पैनल क्रमशः पहले 40 सेकंड और दूसरा 40 सेकंड, के दौरान अर्जित luminescence छवियाँ हैं. एक तीव्रता पैमाने बार उच्च (सफेद) को कम (काला) से luminescence संकेतों की वृद्धि हुई है. बी) ने संकेत तनाव उत्तेजनाओं के जवाब में पौध की औसत luminescence तीव्रता का बार चार्ट इंगित करता है.
एक जीवित सेल confocal इमेजिंग प्रयोग के 3 सेटअप चित्रा. ए) एक अनुकूलित कक्ष मिट्टी और रूई के चार टुकड़े के साथ एक स्लाइड, coverslip के साथ बनाया गया है. दो 5 दिन पुरानी पौध स्लाइड पर रखा जाता है. एक पॉलीथीन ट्यूब के एक छोर इकट्ठे चैम्बर के बगल में रखा और साथ तय हो गई हैदूसरे छोर Plexiglass के साथ किए गए एक 1 मिलीलीटर सिरिंज. बी) एक स्वनिर्धारित स्लाइड से जुड़ा है, जबकि टेप के एक टुकड़े मध्यम और चैनल के दो पहलू से जुड़े हैं कि दो चैनलों में एक खुले चैम्बर है. एक coverslip स्लाइड के शीर्ष पर रखा गया है और दो polyethlene ट्यूब चैनल में रखा जाता है. Coverslip और ट्यूब सिलिकॉन तेल के साथ स्थिति में तय कर रहे हैं. ट्यूबों में से एक का अंत एक 1 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ा है और एक और ट्यूब के अंत खुला रहता है. एक 5 दिन पुराने अंकुर कक्ष में रखा गया है और एक coveslip अंकुर के शीर्ष पर डाल दिया है और सिलिकॉन तेल के साथ बंद है. इकट्ठे कक्ष के साथ plexigalss स्लाइड खुर्दबीन के मंच पर रखा गया है. सी) Arabidopsis पौध एमएस में phytagel की 0.6% की एक पतली परत से युक्त संभाग कवर कांच के दाएं से बाएं दो कुओं () या 8 कुओं () में बड़े हो रहे हैं मीडिया.
चित्रा 4 साइटोसोलिक और परमाणु सीए 2 + नमक तनाव के जवाब में दोलन. ए) Confocal छवियों Case12 कोशिका द्रव्य और जड़ कोशिकाओं (बाएं पैनल) और Case12 व्यक्त ट्रांसजेनिक पौधों की पत्ती कोशिकाओं (सही पैनल) के नाभिक में व्यक्त किया है कि दिखा. सही पैनल पर छवि क्लोरोप्लास्ट की लाल autofluorescence और Case12. बी की हरी प्रतिदीप्ति) के नमक सीए 2 + cytosol में दोलन (ऊपरी पैनल प्रेरित तनाव (150 मिमी NaCl)) और नाभिक (कम पैनल) के विलय छवि है जड़ कोशिकाओं. मापा कोशिकाओं के स्थान पैनल पर संख्या के साथ तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं.
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Discussion
हम Arabidopsis seedlings के स्थानिक अस्थायी सीए 2 + प्रतिक्रिया रिकॉर्डिंग के लिए एक एफएएस प्रणाली का प्रदर्शन किया है. इस एफएएस सीए 2 + रिकॉर्डिंग प्रणाली सीए यहां प्रस्तुत कर रहे हैं कि अजैव तनाव उत्तेजनाओं के अलावा विभिन्न उत्तेजनाओं से चालू होने वाले 2 + गतिशीलता मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि एक सरल, संवेदनशील और मजबूत दृष्टिकोण प्रदान करता है. इस प्रणाली का उपयोग करना, हम आसानी से पूरे संयंत्र स्तर पर ऊतक या उत्तेजनाओं विशिष्ट स्थानिक लौकिक सीए 2 + गतिशीलता तुलना कर सकते हैं. एफएएस की उच्च संवेदनशीलता उच्च तीव्रता तनाव प्रयोग किया जाता है जब कोशिकाओं को शारीरिक नुकसान की वजह से कलाकृतियों से बचने के लिए महत्वपूर्ण है जो सीए 2 + प्रतिक्रियाओं, जांच के लिए कम तीव्रता उत्तेजनाओं के उपयोग की अनुमति देता है. विभिन्न शारीरिक चरणों में पौध किसी दिए गए प्रोत्साहन के जवाब में अलग संवेदनशीलता और विशिष्टता हो सकता है, हालांकि 10 दिन पुराने Arabidopsis पौध को सात, ऊतक या उत्तेजनाओं विशिष्ट सीए 2 + प्रतिक्रिया देखी गई. इसलिए यह हैकरीब 100 पौध फिल्म के एक टुकड़े पर पालन किया जा सकता है जिसमें एफएएस माप के throughput बढ़ाने के लिए 7-10 दिन पुरानी पौध का उपयोग करने के लिए बेहतर. साथ में आसान और सरल प्रदर्शन, उच्च संवेदनशीलता और reproducibility के साथ, फैस प्रणाली भी बदल सीए 2 + प्रतिक्रियाओं के लिए ईएमएस mutagenized म्यूटेंट स्क्रीनिंग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. स्क्रीनिंग प्रयोजनों के लिए, यह अच्छी तरह से फिल्म पर प्लेट पर हो और पालन कर रहे हैं कि वर्दी पौध रखना जरूरी है. एच CTZ साथ फिल्म पालन पौध की चार से पांच घंटे ऊष्मायन aequorin के पुनर्गठन के लिए आमतौर पर पर्याप्त है. Apoaequorin और cofactor की प्रतिक्रिया ऑक्सीजन की आवश्यकता है, क्योंकि छेद के साथ चिपकने वाला फिल्म का उपयोग करना बेहतर है. एक ही फिल्म से मूल पौध के समूहों का उपयोग ऊतक या विशिष्ट उत्तेजनाओं-सीए 2 + प्रतिक्रियाओं की तुलना, के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि पौध और / या पुनर्गठन हालत कार्यात्मक aequorin की कुल राशि को प्रभावित कर सकता का राज्य. जब इन requiremeएनटीएस luminescence प्रतिक्रिया का अंतर ऊतक या उत्तेजना विशिष्ट सीए 2 + प्रतिक्रिया के लिए आनुपातिक है, से मुलाकात कर रहे हैं.
Aequorin सीए 2 + संकेतों के आधार पर माप कोशिकाओं की आबादी की प्रतिक्रिया दर्शाते हैं. हालांकि, सेल प्रकार और / या उत्तेजनाओं को ऊतकों में कोशिकाओं के विभिन्न पहुँच की विविधता पर विचार, Aequorin के परिणामों के आधार सीए 2 + माप किसी भी एक सेल के व्यवहार के लिए समानता नहीं है. सेलुलर स्तर पर सीए 2 + गतिशीलता को समझना subcellular संकल्प के साथ पता लगाया जा सकता है कि एक सीए 2 + सूचक की आवश्यकता है. प्रतिदीप्ति प्रोटीन का लाइव सेल confocal इमेजिंग (एफपी) सीए 2 + संकेतक एक वांछित ऊतक में सेलुलर संकल्प के साथ सेलुलर सीए 2 + गतिशीलता की रिकॉर्डिंग के लिए एक उन्नत सीए 2 + पहचान प्रणाली प्रदान करता है आधारित. इधर, लाइव सेल confocal इमेजिंग और एफपी आधारित सीए 2 + संकेतक का उपयोग कर, हम subcellular सीए दर्ज 2 + 2 + संकेतक के दो प्रकार के अलग अलग विशेषताओं के साथ पौधों में लागू किया गया है. YCS की तुलना में, एकल GFP आधारित सीए 2 + सूचक कुछ फायदे हैं: 1 Case12 YFP और पाकिस्तानी फिल्टर सेट या कई मान्यताओं और झल्लाहट 22 उपाय करने के लिए आवश्यक जटिल गणना की आवश्यकता नहीं है. Case12 एकल / उत्तेजना उत्सर्जन Maxima है और आसानी से मानक GFP फिल्टर सेट का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है. 2 Case12 शारीरिक पीएच के तहत स्थिर है, और एक अपेक्षाकृत एक छोटे प्रोटीन (46 केडीए) है. पौधों में व्यक्त जब Case12 ट्रांसजेनिक पौधों एक साथ साइटोसोलिक और परमाणु सीए 2 + गतिशीलता को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, ताकि गैर लक्षित Case12, कोशिका द्रव्य के साथ ही नाभिक में दिखाई देता है. इस संवाददाता की एक खामी यह एक गैर ratiometric सूचक है, तो प्रतिदीप्ति स्तर भी इस तरह की अभिव्यक्ति के स्तर के रूप में सीए के लिए 2 + एकाग्रता असंबंधित हैं कि कारकों से प्रभावित हो रहा हैCase12 और स्थानीय पीएच. फिर भी, Case12 एक ही प्रयोगात्मक शर्तों के तहत विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ सामग्री के बीच स्थानिक लौकिक सीए 2 + कोशिका द्रव्य में गतिशीलता और organelles की तुलना के लिए सेलुलर सीए 2 + एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए पर्याप्त है. भविष्य में, नए GFP सेलुलर रिकॉर्डिंग के लिए बेहतर संकेतक हो या में सीए 2 + गतिशीलता subcelluar सकता है, CA जानवरों में प्रदर्शन GCaMP3 24 और GCaMP5 25 की तरह उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात, तेज कैनेटीक्स और अधिक से अधिक प्रतिक्रिया, के साथ 2 + संकेतक आधारित पौधों.
यहाँ वर्णित Aequorin और Case12 पता लगाने प्रणालियों विवो में nondestructive क्रमशः पूरे अंकुर और subcellular स्तरों पर स्थानिक लौकिक सीए 2 + गतिशीलता की माप के लिए दृष्टिकोण प्रदान करते हैं. दोनों प्रणालियों में, शारीरिक स्थिति या विकास की स्थिति सीए पौध या कोशिकाओं के 2 + प्रतिक्रियाओं को प्रभावित कर सकता है. Physica हैंlly एक अच्छी हालत में हो गई क्षतिग्रस्त या नहीं, कोशिकाओं कमजोर या कोई भी सीए 2 + प्रतिक्रियाओं हो सकता था. इसके अलावा, स्थानिक और लौकिक सीए 2 + संकेतों की अवधि भी माप के दौरान अंकुर की स्थितियों से प्रभावित हैं. luminescence या प्रतिदीप्ति संकेत समय के साथ होने के कारण उत्तेजनाओं प्रेरित क्षति को कम, और / या confocal इमेजिंग के मामले में लेजर प्रेरित तस्वीर वाली क्षति हो सकती है. प्रेरणा प्रेरित नुकसान को टाला नहीं जा सकता है, phototoxicity लेजर जोखिम की तीव्रता और / या आवृत्ति को सीमित करके कम किया जा सकता है. इसके अलावा, Aequorin आधारित सीए 2 + रिकॉर्डिंग प्रणाली एक पुनर्गठन कदम की आवश्यकता है. सेल और / या CTZ साथ apoaequorin की प्रतिक्रिया के लिए CTZ के प्रसार में दखल कारक है कि सीए 2 + एकाग्रता के लिए सीधे जुड़े हुए हैं कि luminescence संकेतों को प्रभावित करेगा. इसलिए CTZ की एकाग्रता, साथ ही अवधि और CTZ ऊष्मायन की शर्तों को सर्वश्रेष्ठ संवेदनशीलता और reproducibil के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकताअल्पसंख्यक. आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सीए 2 + संकेतक गलत अनायास ही विशिष्ट subcellular डिब्बों, तापमान संवेदनशीलता, या सेलुलर सीए 2 मशीनरी 23 संकेत + के साथ रिपोर्टर के हस्तक्षेप करने को लक्षित सहित अन्य कारणों के लिए सेलुलर सीए 2 + सांद्रता रिपोर्ट कर सकते हैं. हम Aequorin या Case12 व्यक्त पौधों ऐसे बदल तनाव सहिष्णुता के रूप में कोई स्पष्ट रूपात्मक या सशर्त phenotypes है कि पाया. इसलिए यह इन आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सीए 2 + संकेतक पौधों में संकेत 2 + क्षमताओं के साथ प्रमुख हस्तक्षेप है कि संभावना नहीं है.
संक्षेप में, हम पूरे संयंत्र अंकुर और subcellular स्तर दोनों में स्थानिक और लौकिक सीए 2 + संकेतों को मापने के लिए यहां दो सीए 2 + का पता लगाने प्रणालियों के उपयोग के लिए विस्तृत निर्देश उपस्थित थे. इन दोनों प्रणालियों ऊतक (या सेल प्रकार) या उत्तेजनाओं विशिष्ट सीए 2 + उच्च संवेदनशीलता के साथ गतिशील पैटर्न निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है औरreproducibility. इसलिए वे विभिन्न पर्यावरण संकेतों के जवाब में सीए 2 + संकेतन आबाद कि जीन नेटवर्क elucidating के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm x 10 cm square Petri dish | VWR | 60872-310 | |
| Adhesive film | VWR | 60941-062 | |
| Polyethylene tubing | PerkinElmer | 9908265 | |
| 1 ml syringe | VWR | 53548-000 | |
| Silicone grease | Beckman | 335148 | |
| 2-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155379 | |
| 8-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155409 | |
| Luminescence imaging system | Princeton Instruments | N/A | |
| Inverted confocal laser-scanning microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon A1R |
| Imaging software | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Elements |
| DataGraph | Visual Data Tools Inc | N/A | DataGraph 3.1.1 is the newest version |
| Coelenterazine | NanoLight Technolgies | #301B NF-BCTZ-FB | |
| All purpose bleach | Any local store | N/A | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151500 | |
| MS salt | Phytotechnology Labs | M524-50L | |
| Sucrose | VWR | BDH8029-12KG | |
| Agar | Sigma | A1296-5KG | |
| Phytagel | Sigma | P8169-1KG |
References
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