Эмболические средней мозговой артерии Окклюзия (MCAO) для ишемического инсульта с гомологичными сгустки крови у крыс

Abstract

Клинически, тромболитическая терапия с использованием рекомбинантного тканевого активатора плазминогена (ТАП) остается наиболее эффективным средством для лечения острого ишемического инсульта. Тем не менее, использование ТАП ограничивается его узким терапевтическим окном и с повышенным риском геморрагической трансформации. Существует настоятельная необходимость в разработке подходящих моделей инсульта изучать новые тромболитических препаратов и стратегий для лечения ишемического инсульта. В настоящее время, два основных типа ишемических моделей инсульта были разработаны в крыс и мышей: внутрипросветной шовного MCAO и эмболии MCAO. Хотя модели MCAO через внутрипросветной техники шва широко используются в механизме управляемой исследований инсульта, эти модели шовные не имитировать клиническую ситуацию и не подходят для тромболитических исследований. Среди этих моделей, эмболии модель MCAO точно имитирует ишемический инсульт человека и подходит для доклинических исследования тромболитической терапии. Эта модель эмболии была впервые разработана в крыс О.В.ergaard др. ¹ в 1992 году и далее характеризовали Zhang и соавт. в 1997 году ^2. Несмотря на то, эмболии MCAO приобрела все большее внимание, есть технические проблемы, с которыми сталкиваются многие лаборатории. Для удовлетворения растущих потребностей в тромболитической исследований, мы представляем хорошо воспроизводимый модель эмболии MCAO на крысах, которые могут развиваться предсказуемый объем инфаркта в пределах территории MCA. Вкратце, модифицированный трубки ПЭ-50 слегка расширенный от наружной сонной артерии (ECA) в просвет внутренней сонной артерии (ВСА) до кончика катетера достигает происхождение MCA. Через катетер, один гомологичны тромб находится в начале координат МСА. Чтобы определить успех окклюзии СМА, региональный церебральный кровоток контролировали, неврологические расстройства и объемы инфаркта были измерены. Методы, представленные в этой статье, должны помочь следователям по преодолению технических проблем для создания этой модели для исследования инсульта. </ P>

Introduction

Инсульт является третьей ведущей причиной смерти в Соединенных Штатах, но варианты лечения острого инсульта оставаться ограниченным. В настоящее время внутривенное вливание рекомбинантного тканевого активатора плазминогена (ТАП), чтобы растворить тромбы является наиболее эффективным для лечения острого ишемического инсульта. Тем не менее, использование ТАП ограничивается его узким терапевтическим окном и с повышенным риском внутримозгового кровоизлияния. Поэтому модель инсульта подходящей для тромболитической исследования является насущной потребностью.

Средней мозговой артерии (МСА) является артерии окклюзии, чаще всего в инсульта у человека. Основное внимание на этой артерии, были созданы многие животные модели ишемического инсульта. В настоящее время, два основных типа грызунов фокусное моделей ишемии по окклюзии MCA были разработаны: шов MCAO модели и эмболии МСАО модель. Хотя модели MCAO через внутрипросветного техники шва были широко использованы в механизме приводом исследований инсульта, эти модели шовные неимитировать человеческое инсульт, а до 80% от ударов человека вызваны тромбоза или эмболии. Тем не менее, эмболии модель удара с использованием тромбов точно имитирует человеческую инсульт и считается подходящим для тромболитической исследования. Эта модель эмболии была впервые разработана в крыс Overgaard соавт. ¹ в 1992 году и далее характеризовали Чжан соавт. В 1997 году ² и ДиНаполи соавт. В 2006 году ^3. Несмотря на то, эмболии MCAO приобрела все большее внимание, есть технические проблемы, с которыми сталкиваются многими лабораториями.

В этой статье мы покажем, стандартный способ получения эмболической MCAO с гомологичными тромбов в взрослой крысы, которые могут развиваться предсказуемый миокарда в пределах территории MCA. Методы, представленные в этой статье, должны помочь исследователям преодолеть технические проблемы для установления эту модель для исследования инсульта.

Protocol

О себе Этика: Мужской взрослых Спрэг Доули (весом 330-380 г) были использованы в данном протоколе. Этот протокол был одобрен уходу и использованию комитета Институциональная животных (IACUC) в ЛГУ Health Science Center-Шривпорте по и в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных" (восьмое издание, Национальной академии наук, 2011 ).

1 Получение модифицированной трубки ПЭ-50

1. Держите 30 см длиной трубки ПЭ-50 выше газовой плитой руками, постепенно смягчить трубку. Осторожно потяните трубку.
2. Выберите точку на растянутой трубки с использованием цифрового суппорта (рисунок 1), пометьте его, и сократить измененный трубки ПЭ-50 в 25 см длиной сегмента в с длиной 1 см чаевых (внешний диаметр: 0.30-0.34 мм).

2 Получение гомологичных тромбов

1. Обезболить крысу с изофлураном (5% для индукции, 2-3% для технического обслуживания) в 70% N ₂ O и 30% O <суб> 2 на лицевой маски в донорстве. Подтвердите анестезией забой крайнем случае.
2. Выполнение бедренной артерии катетеризации донора крысы с опубликованным методом ⁴ и передавать бедренной артерии кровь непосредственно в 20 см длиной трубки ПЭ-50. Поместите пробирку в течение 2 ч при комнатной температуре для свертывания крови, а затем сохранить трубку в течение 22 ч при 4 ° С. Примечание: канюли осуществляется с помощью асептической техники, как описано на стадии 3.1. Донор крысы извлекают для дальнейшего отбора.
3. Отрежьте трубки ПЭ-50 в 50 сегментах мм и промойте сгусток из трубки в стерильную чашку Петри, содержащую физиологический раствор.
4. Трансфер 50 мм длинный сгусток в длинный 60 мм ПЭ-10 трубки и подключить каждый конец PE-10 трубки к длинной 20 см трубки ПЭ-50, подключенный к 1 мл шприц, содержащий физиологический раствор с 23 G иглы (Рисунок 2) .
5. Сдвиг тромб путем непрерывного переменного движения из одного шприца в другой в течение 5 мин, которые можно удалить из клеток кровисгусток и минимизировать хрупкий из внесосудистой свернувшейся сгустка, не нарушая при этом ядро ​​фибрина.
6. Обрежьте сгусток в 40 мм с длинной сегмента и передают сегмент сгустка в модифицированный ПЭ-50 катетера, как описано в шаге 1.2 в асептических условиях. Примечание: Все PE трубки стерилизуют с этиленоксидом.

3 Эмболические средней мозговой артерии окклюзии (3А, Б)

1. Стерилизацию всех хирургических инструментов в автоклаве (минимум 121 ° С, 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 15 мин). Sanitize таблицу хирургии и связанного хирургического оборудования, используя 70% этанола.
2. Обезболить крысу с изофлураном как описано в шаге 2.1. Проверьте глубину анестезии, выполняя ног щепотку на обоих задних ног, и любая наблюдается движение (снятия лапу) указывает, что животное не достаточно наркозом делать операцию. Нанесите небольшое количество ветеринарной мази на оба глаза, чтобы предотвратить сухость в то время как под наркозом. Бритье мех на брюшной шеи и головы реобласти как с электрическими ножницами, чтобы разоблачить участки кожи.
3. Поместите крысу в положении лежа на спине на грелку. Вставьте ректальный зонд, контроль и поддержание температуры тела между 36.5-37.5 ° С с использованием теплокровного блок управления одеяло.
4. Лечить бритая кожей и окружающей мех с 10% повидон-йода с последующим 70% этанола.
5. Сделайте 2-см длиной срединный разрез на шее под микроскопом рассекает. Используйте втягивающие выставить операционного поля и рассекают правая общая сонная артерия (CCA), наружной сонной артерии (ЭКА), внутренней сонной артерии (ВСА), и крыловидно артерии (PPA) бесплатно от окружающих нервов и фасции (рисунок 3А). Примечание: Перед операцией, изменить стерильные перчатки, если не помощник помогает подготовить животное.
6. Проанализируйте CCA бесплатно от окружающих нервов (без ущерба для блуждающего нерва) и поместите стерильный 5-0 шелковой нити под артерии. Свяжите узел промаха (# 1) и понять шов с помощью небольшого Hemosтат и тянуть учил к телу.
7. Проанализируйте ЭКА и свои две ветви, затылочная артерия (ОА) и верхняя щитовидная артерия (STA). Coagulate две ветви с помощью ветеринарного блока электрохирургической. Поместите две части стерильных 6-0 шелковыми швами под ЭКА.
8. Отдельные два шелка, помещенных под артерии, одна часть к голове (дистальный конец), а другой к телу. Свяжите плотный лигатуры (# 2) на стороне, самой близкой к голове, понять шелк с небольшими кровоостанавливающих и тянуть учил к голове. Подготовьте свободную узел (# 3) с другой шелка, чтобы использовать позже.
9. Рассеките ICA и PPA от окружающих нервов (без ущерба для блуждающего нерва). Свяжите PPA с 6-0 шва (# 4). Сделать скольжения узла с 6-0 шва вокруг ICA (# 5). Кроме того, клип ICA использованием микрососудистой клип.
10. Сокращение маленькое отверстие (1/2 через) в ЭКА между жесткой сыпучих (# 3) лигатур (# 2) и с Vannas стиле весенних ножницами. Вставьте модифицированный ПЭ-50-ваннаэ содержащий сгусток крови в разрез и заранее к бифуркации ОСА. Затянуть свободную лигатуры (# 3) вокруг просвета достаточно просто обеспечить сохранение мобильности трубки в-жилища.
11. Отрежьте ЭКА на месте небольшое отверстие, чтобы освободить пень и расположите пень ниже бифуркации ЭКА и ВСА; это позволит изменение трубка легко устанавливаться в ВСА. Открытие ICA и осторожно продвигать трубку из просвета ECA в ВСА, пока кончик катетера не достигнет происхождение MCA (~ 17 мм от бифуркации). Примечание: Перед вставить наконечник трубки в ECA, стерильной внешней поверхности трубки с 70% этанолом, а затем промывают стерильным физиологическим раствором.
12. Введите сгусток через модифицированного ПЭ-50 катетера вместе с 10 мкл физиологического раствора в течение 10 сек с помощью 100 мкл Hamilton шприц (фиг.3В).
13. Вывод катетера из ЭКА 5 мин позже. Свяжите ЭКА и открыть CCA. Шовный разрез на шее.

4 Мониторинг регионального мозгового кровотока (rCBF)

1. До окклюзии СМА, сделать длинный 1,2 см срединный разрез в коже головы, чтобы выставить кости черепа. Удалить тканей на кости черепа с зубной скребком и стерильным ватным свопов. Примечание: Перед операцией, поврежденная площадь кожи головы и окружающих мех дезинфицируют 10% повидон-йода с последующим 70% этанола.
2. Просверлите 1,5 мм Диаметр заусенцев отверстия расположены на 2 мм задней и 5 мм латеральнее брегмы используя сферическую заусенцев 0,7 мм из нержавеющей стали (рисунок 4).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите твердую мозговую оболочку в неприкосновенности.
3. Поместите зонд 0,5 мм над поверхностью твердой мозговой. Контролируйте rCBF в 0 (базового уровня), 5, 15, 30, 60, 90, и 120 мин после эмболизации и продолжить в 5, 15, 30, 45, и через 60 мин после внутривенного введения ТАП. После последнего измерения rCBF, волосистой части головы разрез закрывают швом. Примечание: Перед шеи разрез мы измеряем rCBF качестве базовых до MCA occlusионный. Сообщение MCA окклюзии мы измеряем rCBF после закрытия шва шеи разрез. Таким образом, шеи разрез сохраняется стерильным.

5 Послеоперационный уход

1. Введите 2,5 мл физиологического раствора подкожно, чтобы предотвратить обезвоживание и привнести Buprenex (0,05 мг / кг, подкожно) сразу после операции и через каждые 6-12 часов при необходимости для облегчения боли.
2. Стоп ИФ анестезии. Поместите крысу в 37 ° C ветеринарная восстановления камеры (держать животных в тепле) и держать наблюдение. Это обычно занимает 10 минут для крыс, чтобы оправиться от наркоза. Затем положить животное в стерилизованную клетке, место некоторые смоченной еду в чашке Петри в клетке, и вернуть клетку к животным стерилизации комнате.
3. 24 ч после инсульта, эвтаназии крысу с передозировкой пентобарбитала натрия (100 мг / кг массы тела, IP).

6 неврологического дефицита Оценка

1. Выполните счет Бедерсон до и в 2 ч после эмболизации. Используйте классификации SСетевой 0-3, как описано выше ^5: 0, поднимая крысу хвостом, животное продления обе передние конечности на пол и не выставляется никаких других дефицитов (нормальное движение); 1, в результате чего крыса хвостом, согните контралатеральный переднюю конечность; 2, снижение устойчивости к боковому нажиму (и передних конечностей сгибания) без кружили; 3, то же поведение, класса 2 с кружили.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Крысы не показывая Бедерсон балл = 0 (нет дефицита) в 2 часа после эмболизации исключены из дальнейшего исследования.

Representative Results

Лазерной допплеровской флоуметрии (LDF) был использован для контроля rCBF при индукции ишемии головного мозга ^6,7. Многие лаборатории в том числе нашу лабораторию уже используют rCBF для идентификации животных с успешной окклюзии МСА, но пороги базового варьировать между лабораториями, которые связаны с места измерения. Зонд из LDF расположен на 2 мм кзади и 5 мм латерально к темени, как описано выше ^6. rCBF контролируют при 0, 5, 15, 30, 60, 90, и 120 мин после инъекции сгустка. На основании этих данных, только животные, которые показывают снижение rCBF> 70% от исходного уровня считается успешным эмболии окклюзии МСА (фиг.5). В 2 ч после инъекции сгустка, стандартная доза крысы из ТАП (10 мг / кг) ^7,8 вводили внутривенно с 10% болюс и 90% непрерывной инфузии в течение 30 мин с помощью шприца ^7,8 инфузионного насоса. Мы заметили, что уровни rCBF постепенно увелиред в> 70% от исходного уровня в 30 мин ТАП терапии (Рисунок 5).

В 24 ч после эмболизации, животные были умерщвлены, и транскардиально перфузию 200 мл PBS, чтобы удалить кровь внутрисосудистое. Предыдущие исследования ^2,3,7,8 и наши данные (Рисунок 6) показали значительно большие тканевые инфаркты, произведенные в 24 часа после эмболизации. Мозги были собраны и снял. В обработанных солевым раствором группы, сгусток крови было легко визуализировать на происхождение СМА и ПМА, но сгусток был почти полностью растворяется в ТАП-обработанной группы (фиг.6А). После этого, мозг разрезали на семь 2 мм корональных секций с матрицей головного мозга крысы на льду. Инкубируйте срезов головного мозга в 2% 2,3,5-трифенилтетразолия хлорид (ТТС) при 37 ° С в течение 30 мин ^9,10. После окрашивания ТТС, корональные срезы помещали на пластине и фотографировали (фиг.6В). Площадь инф arction в каждом срезе определяли по компьютеризированной системы анализа изображений (Национальные Институты Здоровья изображения), а средний объем инфаркта рассчитывается путем умножения расстояние между секциями. Эта модель инсульта эмболии производится ткани миокарда в пределах территории MCA, как видно в неокортекса и стриатума регионах (Рисунок 6B). В начале реперфузии была создана путем внутривенного введения ТАП в 2 ч после эмболизации, объемы инфаркта были значительно снижены в ТАП-обработанной группе (229,1 ± 45,7 ^мм3, N = 12) по сравнению с физиологическим раствором группе, получавшей (394,2 ± 68,2 мм ^3, п = 9) (Р <0,01). Смертность 24 часа в сутки на 16% (4/25).

Рисунок 1 Измерение наружного диаметра модифицированной трубки ПЭ-50 с использованием цифрового суппорта.

нт "FO: Keep-together.within-странице =" всегда ">
Рисунок 2 Стиральная тромб в ПЭ-10 трубки. Тромб промывали альтернативы нажатием двух шприцев, подключенные к концу трубки ПЭ-50.

Фигура 3 (А) Упрощенная схема крысы правого полушария изолированных артерий показывающие последовательные швов, чтобы подготовить введение модифицированной трубки ПЭ-50. (В) Схема артериальной архитектуры в головном мозге крыс, и катетер продвигаетс от ЕСА, чтобы МКА крысы. Один сгусток крови (черный) содержится в трубке.

Рисунок 4 бур-р отверстие (диаметром 1,5 мм), расположенный на 2 мм задней и 5 мм боковая к темени.

Рисунок 5 Региональный мозгового кровотока (rCBF) измеряли с помощью лазерного доплеровского расходомера (LDF). Инъекция сгусток привело к> 70% снижение rCBF исходного значения. ТАП (10 мг / кг) обрабатывали при 2 ч после инъекции сгусток восстановленного rCBF близко к базовой линии через 30 мин лечения тонн в год. Данные выражали как среднее ± SD.

Рисунок 6 (А) Типичные картины, показывающие тромбов (черные стрелки) в происхождении средней мозговой артерии (СМА) и передней мозговой артерии (ПМА) в 24 часов после инсульта. Левая, физиологический раствор крысы; Право, ТАП-обработанных крыс, бар = 5 мм.

Discussion

В этом исследовании мы показали стандартный метод для выполнения эмболической модель МСАО инсульта у крыс, в которой происхождение MCA окклюзии по фибрина богатых сгустка. Основным преимуществом данной модели является: окклюзия ствола СМА с фибрина богатых тромба похожа на тромбоэмболических инсульта у человека, модель эмболии инсульта подходит для выполнения доклинические исследования фибринолитической терапией, и что эта модель может развиваться воспроизводимым и предсказуемым объем инфаркта на территории, предоставленной MCA.

Для выполнения модели MCAO эмболии, сгусток введение, стабильность и помещения, здания трудно управлять, что приводит к изменению размера инфаркта головного мозга и пораженных регионов ^2,3. Предыдущие исследования показали, что воспроизводимые ишемические поражения на территории MCA может быть достигнуто только тогда, когда препятствующие сгустки подал в стволе СМА ^2,3. Чтобы точно подать тромб ипроизводить воспроизводимую эмболической модель хода, в этом исследовании, мы показали, как подготовить измененный трубки ПЭ-50 и как ввести кончик модифицированной трубки к происхождению MCA и как придать фибрина богатых сгусток в MCA. В соответствии с предыдущего отчета ^2, вводили сгусток крови были легко визуализировать в начале СМА во всех обработанных солевым раствором крыс (п ​​= 9), но в основном, растворенного во всех ТАП-обработанных крыс (N = 12) через 24 часа после эмболизация.

Чтобы оценить успех MCAO, rCBF, неврологические нарушения, а рисунок и распределение поражений головного мозга оценивались. После инъекции сгустка, rCBF была снижена до 30% от исходного уровня, и это снижение rCBF сохраняется в течение 2 часов после эмболизации, в соответствии с предыдущими докладами ^6,7. После обработки ТАП в 2 ч после эмболизации, уровни rCBF были восстановлены близко к базовой линии через 30 мин лечения тонн в год. Неврологические оценка была измерена 10 миндо лечения наркомании с помощью модифицированной шкале Бедерсон, чтобы помочь оценки успешности MCAO. Это неврологическое скоринг представляет собой простой и быстрый способ для обнаружения глобального неврологическую функцию в острой фазе инсульта. Животные, показывающие нормальные поведения (оценка = 0) были исключены из обращения наркотиков и дальнейшего анализа. Более того, мы показали, что повреждение ткани было произведено в основном на территории MCA, как показано на неокортекса и стриатума регионах, и лечения ТАП (на 2 ч) значительно уменьшил размер инфаркта в 24 часа после инсульта. Вместе, наши данные показали, что эмболии модель удара представлено в этой работе может развиваться предсказуемый объем инфаркта в пределах территории MCA.

Наконец, отметим, что существует несколько технических проблем, которые могут повлиять на успех эмболического модели MCAO. Общей проблемой столкнулись при выполнении эмболической модель МСАО рано спонтанное реперфузии после эмболизации. Происшествие спонтанного реперфузии IS, вероятно, связано с хрупкой из внесосудистой свернувшейся сгустка и длины сгустка, используемого для закупоривать MCA ^2,3,10. Мы считаем, что метод мы описали (шаг 2) подготовить тромб бы минимизировать хрупкий из внесосудистой свернувшейся сгустка. Длина одного сгустка крови используется для закупоривания MCA варьировала от лаборатории до лаборатории в период с 25-мм к длине 50 мм ^2,3,6-8,10. Мы обнаружили, что использование 35-40 мм длинной сгустка в идеале окклюзии в СМА и получают высокую воспроизводимость объем инфаркта. Изменение трубки ПЭ-50 с диаметром кончика между 0.30-0.34 мм. Если диаметр наконечник> 0,34 мм, он не может достигнуть происхождение MCA. Если диаметр наконечник <0,30 мм, сгусток внутри модифицированной трубки ПЭ-50 трудно пройти через наконечник. Смертность тесно связана с тяжелой отек мозга и внутримозгового кровоизлияния. В этой работе, смертность 24 часа в сутки на 16% (4/25; см репрезентативные результаты), и все мертвые крысы показали сильную зыбь мозгачисле, хотя мы не видели внутримозгового кровоизлияния (возможно в связи с ограниченным размером выборки). Контролируемый фактор смертности температура тела во время операции. В не контролируя температуру тела между 36.5-37.5 ° С с начала операции до полного восстановления после анестезии. Температура тела существенно влияет на степень повреждения мозговой ткани. Гипотермия уменьшает и гипертермия увеличивает объем инфаркта ^11,12. Выполнение операции в течение короткого периода времени (около 20-25 мин) по протоколу с целью получения хорошо воспроизводимый размер инфаркта. Инфекционные осложнения являются ведущей причиной смерти у пациентов с острым инсультом ^13. Чтобы снизить заболеваемость инфекционными осложнениями и повысить выживаемость после инсульта, асептический метод следует использовать во время операции.

В заключение: методы, представленные в этой статье, должны помочь исследователям преодолеть технические проблемы для установления йявляется моделью для исследований инсульта.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
rh-tPA	Chemical	Genentech
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Chemical	Sigma	T8877
Anesthesia vaporizer	Equipment	Soma Technology	Drager Vapor 19.1
Rechargeable high speed micro drill	Equipment	Fine Science Tools	18000-17
Curved scissors	Equipment	Fine Science Tools	14117-14
Dumont forceps (Medical #7)	Equipment	Fine Science Tools	11270-20
Dumont forceps (Medical #5)	Equipment	Fine Science Tools	11251-35
Vannas-style spring scissors	Equipment	Fine Science Tools	15000-03
Veterinary recovery chamber	Equipment	Peco Services	V1200
Genie plus syringe pump	Equipment	Kent Scientific Corporation
Rat brain matrix	Equipment	Kent Scientific Corporation	RBMA-310C
Digital caliper	Equipment	World Precision Instruments	501601
Dissecting microscope	Equipment	World Precision Instruments	PZMTIII-BS-LWD
Hamilton syringe	Equipment	Hamilton	model 710
Homeothermic blanket control unit	Equipment	Harvard Apparatus
Electric clipper	Equipment	Braintree Scientific	CLP-9931
Veterinary electrosurgical unit	Equipment	MACAN Manufacturing Company	MV-9
Blood flowmeter	Equipment	Adinstruments
PowerLab 4/30	Equipment	Adinstruments
LabChart 7.2	software	Adinstruments
1 ml syringe	Consumable	Becton, Dickinson and Company	309659
23 G needle	Consumable	Becton, Dickinson and Company	305143
30 G needle	Consumable	Becton, Dickinson and Company	305106
PE-50 tubing	Consumable	Becton, Dickinson and Company	427517
PE-10 tubing	Consumable	Becton, Dickinson and Company	427400
6-0 Silk suture	Consumable	Harvard apparatus	723287
5-0 Silk suture	Consumable	Harvard Apparatus	517607