Summary
Denne protokol viser en effektiv og pålidelig metode til at transficere humane THP-1-makrofager med siRNA eller plasmid-DNA ved elektroporering med høj transfektionseffektivitet samtidig opretholde en høj celle vitalitet og fuld makrofag kapacitet til at differentiere og polarisering.
Abstract
Makrofager, som centrale aktører i den medfødte immunreaktion, er i fokus for forskning beskæftiger sig med vævshomeostase eller forskellige patologier. Transfektion med siRNA og plasmid-DNA er et effektivt redskab til at studere deres funktion, men transfektion af makrofager er ikke en bagatel. Selv om mange forskellige tilgange til transfektion af eukaryote celler er til rådighed, kun få tillader pålidelig og effektiv transfektion af makrofager, men reduceret celle vitalitet og alvorligt ændret celle adfærd ligesom formindsket evne til differentiering eller polarisering er jævnligt observeret. Derfor er en transfektionsprotokol kræves, er i stand til at overføre siRNA og plasmid-DNA i makrofager uden at forårsage alvorlige bivirkninger, hvilket muliggør undersøgelser af virkningen af siRNA eller et plasmid i forbindelse med normal celle adfærd. Protokollen præsenteret her tilvejebringer en fremgangsmåde til sikkert og effektivt at transficere humane THP-1-makrofager og monocytes med høj celle vitalitet høj transfektionseffektivitet og minimale virkninger på celle adfærd. Denne tilgang er baseret på nucleofection og protokollen er optimeret til at opretholde maksimal kapacitet for celle aktivering efter transfektion. Protokollen er passende for adhærente celler efter løsrivelse samt celler i suspension, og kan bruges til små antal prøver. Fremgangsmåden præsenteres er nyttigt til undersøgelse genregulerende virkninger under makrofag differentiering og polarisering. Bortset fra at fremlægge resultater, der kendetegner makrofager transficeret ifølge denne protokol i forhold til et alternativt kemisk metode, er virkningen af celledyrkningsmediet udvælgelse efter transfektion celle adfærd også drøftet. De præsenterede data viser betydningen af at validere selektion for forskellige eksperimentelle indstillinger.
Introduction
Blandt de cellulære bestanddele af det menneskelige immunsystem, makrofager er af stor betydning for den medfødte immunreaktion. Deres opgaver er mangfoldige; de er involveret i fagocytose af patogener og nekrotisk materiale, de spiller en vigtig rolle i vævshomeostase og producerer og udskiller et stort antal cytokiner til at regulere og organisere immunresponset 1. Derfor makrofager integralt involveret i mange fysiologiske processer og patofysiologiske tilstande. På grund af mangfoldigheden af deres opgaver, makrofager er en meget heterogen og mangefacetteret celletype. Dette opnås ved forskellige polariseringer; afhængig af eksterne stimuli makrofager kan udvikle sig til forskellige fænotyper 2. Makrofager 'variation og indflydelse på immunresponset gøre dem til en meget interessant forskning emne. For at belyse deres komplekse metaboliske og regulerende funktioner, passende makrofag in vitro modeller er reqgendannes for som korrekt afspejler makrofag heterogenitet og variabilitet.
Transfektion af celler med plasmid-DNA-vektorer eller små interfererende RNA (siRNAs) for at ændre cellulær genekspression er blevet en udbredt og kraftfuldt værktøj i cellebiologi for at undersøge både genregulering og gen-funktion. I øjeblikket er der et stort udvalg af forskellige værktøjer til rådighed for transfektion af eukaryote celler. Disse værktøjer omfatter anvendelse af virale vektorer, mekaniske metoder (såsom genkanoner), kemiske fremgangsmåder (som er afhængige af polymerer eller lipider, som kan danne komplekser med nucleinsyrer), og elektroporation af celler 3. Alle disse fremgangsmåder har deres fordele og ulemper, og vælge den bedst egnede fra denne brede vifte til en specifik celletype og anvendelse kan være en vanskelig og tidskrævende proces.
Makrofager er notorisk vanskelige at transficere som næsten alle veletableret transfeKTIONSLINJE tilgange drastisk at reducere makrofager levedygtighed eller forstyrre deres adfærd, dvs differentiering og især polarisering. Derfor præsenterer vi her en effektiv, ikke-virale protokol til at transficere humane THP-1-makrofager ved hjælp af elektroporation baseret Nucleofector teknologi, som repræsenterer en optimeret elektroporation tilgang kræver reducerede mængder af DNA. Nucleofection er velegnet for følsomme celler, såsom monocytter og makrofager. Denne protokol er en tilpasning af tidligere offentliggjorte versioner 4,5.
I korte træk er phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) anvendes til at skelne humane THP-1-monocytter i 48 timer i præmature makrofager før transfektion med siRNA eller plasmid-DNA. Til transfektion predifferentiated makrofager fritliggende enzymatisk af Accutase I-behandling. Transfektionen udføres ved hjælp af en Nucleofector 2b anordning til elektroporering af cellerne. Efter transfektion forskelligerentiering fortsættes i yderligere 24 til 48 timer efter behov. Endelig modne transficerede makrofager inkuberet med forskellige former for forbindelser til funktionelle studier.
Denne fremgangsmåde giver mulighed for transfektion af cellelinier, såsom humane THP-1-monocytter og makrofager og er blevet anvendt med succes tidligere 6-10. I modsætning til de fleste kemiske transfektion metoder, vores modificerede nucleofection under anvendelse af tidlige makrofager giver høje transfektionseffektiviteten i kombination med usvækket cellelevedygtighed, uden behovet for at anvende virale vektorer eller tilføje yderligere carrier forbindelser med ukendte bivirkninger. Desuden makrofager bevarer deres fulde potentiale for differentiering samt polarisering således at uhindret funktionelle undersøgelser efter transfektion 11.
Endvidere cellekulturmediet anvendes efter nucleofection kraftigt påvirker funktionelle undersøgelser efter transfection; i særdeleshed, kan makrofagerne evne til polarisering påvirkes afhængigt af den anvendte dyrkningsmedium. Her fire forskellige typer af cellekulturmedier (IMDM, X-VIVO 20, LGM3 og mus T Cell Nucleofector medium) blev afprøvet under deaktivering betingelser ved anvendelse af interleukin (IL) 10. Anvendelse af THP-1-makrofager, observerede vi, at celle respons til IL10 er stærkest, når Mouse T-celle Nucleofector medium anvendes i forhold til den anden kultur medier nævnt ovenfor. Disse resultater viser, at passende optimering af alle celledyrkningsbetingelser er afgørende for en vellykket transfektionsreagenser und efterfølgende funktionelle undersøgelser, da disse kan i høj grad forbedre eksperimentelle resultater.
Som makrofager er involveret i forskellige humane sygdomme, er meget forskning fokuseret på at belyse makrofag adfærd samt regulative mekanismer, der påvirker makrofager eller til gengæld kontrolleret af makrofager. Derfor er denne protokol er relevant imange forskellige forskningsområder.
Protocol
1. Predifferentiation af THP-1-makrofager
- Dyrk THP-1-celler i RPMI-1640-medium suppleret med 10% (v / v) føtalt kalveserum (FCS) og 1% (v / v) penicillin / streptomycin / L-glutamin (PSG) i en CO 2 (5% ) inkubator ved 37 ° C.
- Før transfektion, opdele celler og overføre dem til frisk RPMI medium som før. Dyrk celler i 24 timer.
- Frø 1,0-1,5 x 10 7 celler i en 75 cm² vævsdyrkningskolbe eller 2,5 x 10 7 celler i en 150 cm² vævskulturkolbe i RPMI-1640-medium, og der tilsættes 10% (v / v) FCS, 1% (v / v) PSG, 1% (v / v) natriumpyruvat, 1% (v / v) ikke-essentielle aminosyrer, 10 ng / ml PMA og 50 uM β-mercaptoethanol i 48 timer.
2. Fremstilling af nucleofection
- Placer Accutase I og alle medier i vandbad ved 37 ° C.
- Aspirer dyrkningsmedium fra kolben og erstatte med 6 ml (75 cm² kolbe) eller 12 ml (150 cm² kolbe) afAccutase I og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C til fuldstændig frigørelse af celler. Observer cellemorfologi efter Accutase I-behandling for at sikre, at cellerne har en rund udseende. Hvis nogle celler stadig synes at være knyttet omhyggeligt skylles kolben med en mikropipette eller bank forsigtigt på den for at fuldføre løsrivelse. Brug ikke celle skrabere, da dette vil have en negativ effekt på celle vitalitet. Overførsel cellesuspension til et 15 ml rør.
- Under Accutase I behandlingen, forberede følgende medier:
- Forbered transfektion medium: tillæg cellekulturmedium med 1% (v / v) PSG, 1% (v / v) ikke-essentielle aminosyrer, 1% (v / v) natriumpyruvat og 5% (v / v) humant serum (for siRNA) eller 20% (v / v) human serum (plasmid-DNA); forberede et slutvolumen på enten 3 ml / prøve for en 6-brønds plade eller 4 ml / prøve i to 12-brønds plader.
- Forbered dyrkningsmediet: supplere dyrkningsmediet med 1% (v / v) PSG, 1% (v / v) ikke-essentielle aminosyrer, 1% (v / v) natriumpyruvat og 5% (v / v) humand-serum (til siRNA) eller 20% (v / v) human serum (plasmid), 2,5 ng / ml PMA og 50 uM β-mercaptoethanol; forberede et slutvolumen på enten 3 ml / prøve for en 6-brønds plade eller 4 ml / prøve i to 12-brønds plader.
- Centrifuger cellesuspension i 5 minutter ved 300 xg ved stuetemperatur.
- Aspirer Accutase I og resuspender cellerne i 1 ml RPMI-medium forvarmes til 37 ° C; tælle celler for at bestemme antallet af celler.
BEMÆRK: Når der anvendes hurtige automatiske celletælling procedurer, trin 2.4 og 2.5 kan udelades, og celler kan tælles umiddelbart efter løsrivelse, forudsat at langvarig udsættelse for Accutase jeg undgås. - For hver transfektion prøve forberede portioner i centrifugerør indeholdende 2,0-2,5 x 10 6 celler.
3. nucleofection af THP-1-makrofager
- Centrifugeres alle prøver i 10 minutter ved 250 xg ved stuetemperatur.
- Fortyndet plasmid-DNA eller siRNA i nukleasefritvand eller en passende puffer. Hold den nødvendige mængde af plasmid-DNA eller siRNA så lille som muligt.
- Forbered en Nucleofector kuvette med enten 1 ug siRNA eller 0,5 ug plasmid-DNA til hver transfektion.
- Udfør en transfektion ad gangen. Aspirer supernatanten fra celle portion.
- Resuspender pelleterede celler i Nucleofector opløsning til opnåelse af et totalvolumen på 100 pi af DNA / siRNA og Nucleofector opløsning. Hold eksponeringstiden til ren Nucleofector løsning til et minimum og sikre, at eksponeringen tid ikke overstiger 15 minutter.
- Bland resuspenderede celler og DNA / siRNA i Nucleofector kuvette ved en let banken.
- Transficerer celler ved at udføre programmet Y-001 i Nucleofector 2b enhed.
- Overfør transficerede celler ind i en reaktion hætteglas bruger engangsplastik Pasteur-pipetter.
- Tilføje Umiddelbart 500 pi af tilberedt transfektion medium.
- Gentag trin 3,4-3,9 for hver transfektion prøve.
- Forbered enten 6 brønde eller 12-brønds plader for transficerede celler. Pipetter 2,5 ml af transfektion medium til hver brønd i en 6-brønds plade (1 brønd / transfektion) eller 1,75 ml transfektion medium til hver brønd i en plade med 12 brønde (2 brønde / transfektion).
- Bland cellesuspensioner grundigt med en mikropipette.
- Overfør de transficerede celler ind i de fremstillede brønde (enten en brønd i en 6-brønds plade eller to i en 12 brønds plade).
- Pladerne inkuberes i 4 timer i en befugtet inkubator (5% CO2, 37 ° C).
- Kontroller refiksation af celler under mikroskop.
BEMÆRK: Et flertal af celler skal være klæbende igen. Lejlighedsvis, forlængelse af inkubationstiden med 1 time øger antallet af adhærente celler i tilfælde af utilstrækkelig refiksation. - Aspirere forsigtigt transfektion medium med en mikropipette og erstatte med samme mængde dyrkning medium. Aspirer kun én brønd ad gangen. <li> inkuberes celler til nødvendige tidsrum for maksimal effekt af plasmid eller siRNA (24-72 timer). Hvis inkubationsperioder overstige 48 timer, udskifte mediet efter 48 timer.
- For yderligere behandling med effektorer (f.eks. Cytokiner, agonister, antagonister og inhibitorer) bruger serumfrit medium uden PMA og β-mercaptoethanol. Tid slutningen af inkubationsperioden for effektor med tidspunktet for maksimal effekt af plasmid eller siRNA og planlægge ændring af mediet og tilsætning af effektor overensstemmelse hermed. Må ikke opretholde celler under serumfri betingelser i længere tid end 24 timer.
Representative Results
Brug af denne protokol til transfektion af THP-1 makrofager med siRNA vi normalt opnår transfektions- satser på over 90% uden væsentlig reduktion af celle vitalitet. Figur 1 viser repræsentative data karakteriserer tilstanden af cellerne 24 timer efter transfektion med fluorescens-mærket siRNA versus en utransficerede kontrol, som ikke blev behandlet med nucleofection reagenser og puls eller siRNA men modtog alle ændringer kulturelle medier som transfekterede prøver. I figur 1A er vist cellemorfologi ifølge flowcytometrisk måling. Mikroskopiske billeder er vist i figur 1B Figur 1C og 1D repræsenterer de lave satser for apoptose (kontrol: 1,5%; nucleofection: 5,4%). Og nekrose (kontrol: 2,0%; nucleofection: 3,2%), der angiver upåvirket celle vitalitet. Nekrose og apoptose er lidt højere for den transficerede prøve som transfekterede THP-1-makrofager er merevanskeligt at afmontere end utransficerede celler, og dermed sandsynligheden for celleskader under udstationeringsprocedurer stiger. Endelig transfektionseffektivitet er vist i figur 1E. Da hele transficeret befolkning forskydes imod kontrolgruppen, indikerer dette, at alle celler transficeres hvilket bekræftes af fluorescens mikroskopiske billeder (figur 2B). Begge flow-cytometriske data samt fluorescens mikroskopiske billeder viser, at alle celler konsekvent transficeres med homogen fordeling af siRNA blandt celler såvel som i celler. Dette er i modsætning til mange kemiske transfektionsreagenser til sammenligning Figur 2A og 2B viser de respektive flowcytometriske data og fluorescens mikroskopiske billeder for en kemisk transfektion middel under anvendelse af et lipid tilgang. Disse tal viser, at to forskellige populationer af transficerede celler kan påvises. Den første population svarer til de transficerede celler følgenvinge nucleofection. De er karakteriseret ved lav samlet fluorescens og homogen fordeling af siRNA i cellerne. Den anden befolkning er præget af en mere intens fluorescens, som stammer fra meget lyse intracellulære agglomerater af siRNA. Den cellulære morfologi forbliver upåvirket både transfektionsreagenser tilgange, som vist ved differentiel kontrast indblanding i figur 2C. Transfektioner ved hjælp af plasmid-DNA udbytte effektivt lignende resultater for eksempler henvises til Robenek et al. (2009) 9 eller Xie et al. (2006) 7.
Valget af celledyrkningsmediet efter transfektion er af stor betydning; derfor forskellige celledyrkningsmedier blev testet i sammenligning. De valgte medier er alle egnet til dyrkning af THP-1-celler og blev udvalgt efter anbefalinger fra Lonza er relevant medie til post-nucleofection dyrkning. Figur 3 repræsenterer siRNA MEDIATudgave knockdown effektivitet ved hjælp af en siRNA rettet mod IL10RB (interleukin 10 receptor β kæde) mRNA. For alle testede medier ekspressionen af IL10RB blev signifikant reduceret til omkring 10 til 20% af kontrolniveauet (figur 3). De transficerede celler varierer dog afhængigt af dyrkningsmediet i deres potentiale for polarisering. THP-1-makrofager transficeret med enten uspecifik kontrol siRNA eller IL10RB specifikke siRNA blev dyrket i forskellige medier efter transfektion og behandlet med IL10. Efterfølgende ekspressionsniveauerne af IL10-induceret gen SOCS3 (undertrykker af cytokin signalering 3) mRNA-niveauet blev målt ved hjælp af RT-qPCR. Forskelle mellem kulturmedier forekomme med hensyn til omfanget af induktion af SOCS3 mRNA-ekspression (figur 4), de induktioner for hver af de testede medier Mouse T-celle Nucleofector Medium, LGM3 X-VIVO 20 og IMDM 19,5 [17,7-21,5 ] 11.5 [8,5-15,7], 8.0 [4,6-14,2] og 7,2 [5,6-9,5] gange. Dencering anvendelse af Mouse T-celle Nucleofector medie er afgørende. Desuden forskelle i virkningen af knockdown af IL10RB på SOCS3 ekspression efter IL10 behandling var observerbare blev ekspressionsniveauer af SOCS3 mRNA reduceret til 9,5 [8,8-10,3] fold i muse-T-celle Nucleofector medium, 2,1 [1,1-4,1] fold i LGM3, 4,8 [3,2-7,2] fold i X-VIVO 20 og 3,3 [2,7-3,9] fold i IMDM. Disse værdier svarer til nedsættelser af SOCS3 udtryk i de forskellige medier til 49%, 18%, 60% og 45% hhv. Reduktion af IL-10-induceret SOCS3 ekspression efter transfektion af IL10RB siRNA bekræfter vellykket nedregulering af IL10RB ved transfektion.
Figur 1. Karakterisering af transficerede THP-1 makrofager. Den karakteristiske tilstand af cellerne er upåvirket som afsløret ved lysmikroskopisk og flow-cytometrisk analyse af transficerede control celler versus THP-1 makrofager transficeret ifølge den præsenterede protokol. THP-1-makrofager blev differentieret med 10 ng / ml PMA i 48 timer og transficeres med fluorescensmærket (Alexa 488) uspecifik kontrol siRNA. 24 timer efter transfektion enten billeder af levende celler blev taget (B), eller cellerne blev løsnet ved Accutase I-behandling og analyseret ved flowcytometri (A). Apoptose og nekrose farvning blev udført under anvendelse af Annexin V-phycoerythrin (PE) (C) og 7-aminoactinomycin (7-AAD) (D). Transfektionseffektivitet (E) blev bestemt ved flowcytometri under anvendelse af fluorescens etiket på siRNA. Fluorescenssignalet af de transficerede celler (sort) vises mod styresignal (grå). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Sammenligning af intracellulær fordeling af siRNA efter nucleofection versus lipofektion. THP-1-celler blev differentieret i 48 timer i henhold til denne protokol, og derefter transficeres enten ved nucleofection eller lipofektion. De præsenterede lipofektion resultater blev opnået ved anvendelse af Xtremegene siRNA kit ifølge producentens anbefalinger med et ladningsforhold på reagens siRNA 4: 1. 24 timer efter transfektion blev cellerne enten fritliggende med Accutase I for flowcytometrisk analyse eller evalueret mikroskopisk med levende celler. (A) Transfektionseffektivitet og distribution af siRNA per celle i befolkningen blev bestemt ved flowcytometri under anvendelse af fluorescens etiket på siRNA, der kontroller transficeret uden siRNA vises med gråt, er prøverne transficeret med siRNA vist i sort. (B) Fluorescens mikroskopibilleder, der viser intracellulær fordeling af fluorescensmærket siRNA (Alexa Fluor 488); skalalinjen repræsenterer 40 um. (C) Differential kontrast interferens billede svarende til fluorescensbillede; skalalinjen repræsenterer 40 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. siRNA-medieret knockdown af IL10RB i transficerede THP-1-makrofager. THP-1-makrofager blev transficeret ifølge den skitserede protokol. Efter transfektion blev cellerne dyrket i fire forskellige dyrkningsmedier, nemlig mus T Cell Nucleofector medium (A), IMDM (B) LGM3 (C), og X-VIVO 20 (D), suppleret som beskrevet i protokol afsnittet. Calen blev enten transficeret med uspecifik kontrol siRNA (Ctrl) eller IL10RB-specifik siRNA (IL10RB). Som yderligere kontroller følgende prøver blev inkluderet: Impulsstyring, dvs. celler, der undergik transfektion i fravær af siRNA (puls), og en mediekontrol, dvs. celler, der kun modtaget ændringerne i dyrkningsmedier, men forblev ellers ubehandlet. 24 timer efter transfektion blev cellerne inkuberet i serumfrit medium med eller uden 50 ng / ml IL10 for yderligere 24 timer. IL10RB ekspression blev målt ved RT-qPCR; diagrammer viser middelværdien af tre uafhængige forsøg, fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen af middelværdien; * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001 vs Ctrl. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. IL10-afhængig regulering af SOCS3 efter knockdown af IL10RB i transficerede THP-1-makrofager. THP-1-makrofager blev transficeret i overensstemmelse med den beskrevne protokol. Efter transfektion blev cellerne dyrket i fire forskellige dyrkningsmedier Mouse T-celle Nucleofector medium (A), IMDM (B) LGM3 (C) og X-VIVO 20 (D) suppleret som beskrevet i protokol afsnittet. Cellerne blev enten transficeret med uspecifik kontrol siRNA (Ctrl) eller IL10RB-specifik siRNA (IL10RB). Som yderligere kontroller følgende prøver blev inkluderet: Impulsstyring, dvs celler, der undergik transfektion i fravær af siNRA (puls), og en mediekontrol, dvs. celler, der kun modtaget ændringerne i dyrkningsmedier, men forblev ellers ubehandlet. 24 timer efter transfektion blev cellerne inkuberet i serumfrit medium med eller uden 50 ng / ml IL10 for yderligere 24 timer. SOCS3 EXPREssion blev målt ved RT-qPCR; diagrammer viser middelværdien af tre uafhængige forsøg, fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen af middelværdien; *, # P <0,05; **, ## P <0,01; *** ### P <0,001 vs Ctrl vs Ctrl + IL-10. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Protokollen beskrevet her viser en pålidelig og effektiv måde til at transficere THP-1-makrofager, som normalt er temmelig vanskeligt at transficere. Transfektion kan opnås med transfektionseffektiviteten på over 90% for siRNA uden væsentlig reduktion af celle vitalitet. Effektivitetsgevinster for plasmider kan være mindre på grund af deres størrelse, men transfektionseffektiviteter på omkring 70% kan opnås som regel. Effektiviteten af siRNA-medieret knockdown kan nå op på 80 til 90% afhængigt af den anvendte siRNA. En stor fordel ved dette er, at den ikke interfererer med celledifferentiering. Efter transfektion af cellerne stadig reagerer normalt på differentiering middel PMA (figur 1A til 1B og figur 4) 12. Derudover cellulære polarisering af cytokin stimuli, såsom IL10 eller LPS / IFNy er upåvirket 12, men det afhænger også i høj grad af den valgte til dyrkning efter transfektion et mediumr vist i figur 4.
Der er flere muligheder inden den procedure, der kan ændres for at tilpasse protokollen til specifikke krav. Som vist i figur 4 cellerne reagerer forskelligt på samme IL10 stimulus afhængigt af dyrkningsmediet udvalgt efter transfektion. Dette indikerer, at mediet sammensætning har stærk indflydelse på cellulær adfærd. Da virkningen pålagt af mediet kan variere for forskellige eksperimentelle stimuli, er det muligt, at den optimale medium kan ændre og der er derfor et behov for at kontrollere egnetheden af medium til forskellige eksperimenter uafhængigt. Men RPMI-1640-medium, som er standard medium, der anvendes til dyrkning af THP-1-celler, har vist sig at være uegnede til dyrkning efter transfektion som et betydeligt tab i celle vitalitet blev observeret. Desuden protokol kan også anvendes til THP-1-monocytter uden forudgående PMA-induceret differentiering dettenaturligvis fjerner behovet for celle løsrivelse under proceduren, men alle resterende trin ikke behøver at blive justeret. The THP-1-monocytter kan differentieres derefter, hvis det kræves.
De mest kritiske elementer i protokollen er for det første udstationering og for det andet den tid, der kræves til transfektion. Løsgørelse skal udføres så skånsomt som muligt, med henblik på at opretholde en høj cellelevedygtighed. Vi anbefaler derfor forholdsvis milde enzymatiske udsendelsen Accutase jeg over ganske aggressive metoder såsom trypsinisering. Yderligere udstationeringsprocedurer metoder, såsom behandling med Lidocain eller skrabning blev anset for at være temmelig skadelig og bør ikke anvendes. I tilfælde af at 30 min Accutase I-behandling ikke bør være tilstrækkelig til at frigøre alle celler korrekt er det normalt et tegn på forkert opbevaret eller udløbet Accutase I-opløsning eller for mange fryse-tø cykler. Vi har opnået gode resultater ved at lagre små portioner af Accutase I ved -20 °C for at reducere antallet af frysning-optøningscykler. Men når der ikke er tilstrækkelig detachement enten erstatte Accutase jeg med frisk Accutase eller øge inkubationstid på op til 1 time. Derudover blid aflytning eller skylning af kolben eller pladen kan hjælpe løsrivelse. Med hensyn til den nødvendige tid til transfektion eksponeringstiden af cellerne til ren Nucleofector løsning har fået stor indflydelse på celle overlevelse og derfor bør være så kort som muligt. Den bedste måde at opnå dette på er at udføre hver transfektion på et tidspunkt (trin 2,10-2,15) og ikke flere transfektioner parallelt.
Hvis knockdown effektivitet er lav, dette normalt ikke er forårsaget af lav transfektionseffektivitet, men dette kan let kontrolleres ved hjælp af flowcytometri eller fluorescensmikroskopi og fluorescensmærket siRNA eller en GFP-kodende plasmid. Overvejende årsagen er en ineffektiv siRNA eller plasmid-DNA. Under disse omstændigheder bør det anses for at øge mængden af siRNA (op til 2-3 ug) ellerplasmid-DNA (op til 1-2 ug) eller at bruge en anden siRNA eller ekspressionsvektor hvis tilgængelig. Alternativt kan tilfredsstillende resultater også opnås ved anvendelse af en pulje af flere forskellige siRNA'er rettet mod det samme mål. Desuden kan tidsforløbet eksperimenter være forpligtet til nøjagtigt at bestemme den periode af maksimal effekt, der normalt nås efter 24 til 72 timer efter transfektion.
Bortset fra transfektion ved elektroporation er der yderligere veletablerede teknikker til transfektion af pattedyrceller. Ofte anvendte systemer er kemiske transfektion midler, som kan danne komplekser med lasten nukleinsyre og derefter lette transport ind i cellerne. De mest almindeligt anvendte reagenser er enten baseret på forskellige lipidarter eller kan vælges fra en række af kationiske polymerer 3. For både nærmer sig en forskelligartet markering er kommercielt tilgængelige. Disse transfektionsreagenser tilbyder den fordel, at de er normaltlet at bruge, kræver ikke megen tid og arbejde med vedhængende celler så godt, og dermed fjerne behovet for løsrivelse. Desværre er temmelig vanskeligt at transficere ved disse fremgangsmåder, da de ikke prolifererer signifikant in vitro og besidder forsvarsmekanismer mod fremmed cytosoliske DNA 13-15 makrofager. Således kemisk transfektionsreagenser tilgange ofte resultere i en alvorlig reduktion af cellernes levedygtighed. Men som vist i figur 2, der er kemiske transfektion midler, der med succes kan overføre siRNA i makrofager, men som flowcytometrisk (figur 2A) og fluorescerende mikroskopi (figur 2B) analyser angiver, at de ikke opnår den samme homogen fordeling af siRNA i cellerne som opnået ved nucleofection. Faktisk flowcytometriske data viser, at to forskellige populationer af transficerede celler opstår dels en population med samme fluorescens som celler efter Nucleofectiopdages og for det andet er der en befolkning med mere intens fluorescens. Der er stadig behov Definite bekræftelse, men vi antager, at den første population er i fluorescensmikroskopi identisk med de celler, der udviser en homogen fordeling af fluorescerende siRNA i cytosolen, mens den anden population svarer sandsynligvis til cellerne med meget lyse agglomerater. De flowcytometriske data vist i figur 2A tyder på, at nucleofection resulterer i mindre siRNA per celle end den alternative lipofektion tilgang. Data i figur 3 viser imidlertid, at selv forholdsvis lille mængde siRNA inkorporeret ved nucleofection allerede er tilstrækkelig for 80 til 90% knockdown af målgenet. Derfor den ekstra mængde af siRNA inkorporeret ved den anden population efter kemisk transfektion er meget sandsynligt overskud og er derfor mere tilbøjelige til at forårsage uønskede bivirkninger end til yderligere stigning Knockdown effektivitet. Bortset fra atdannelse af intracellulære agglomerater allerede uønsket i sig selv, da disse siRNA molekyler er sandsynligvis ikke funktionel eller i det mindste mindre effektiv end gratis siRNA molekyler og kan forårsage forbi mål effekter. Desuden er endnu ikke klart, den sande natur af disse agglomerater. Det er muligt, at disse lyspunkter repræsenterer endosomer indikerer, at siRNA blev internaliseret af cellerne, men efterfølgende frigivelse fra endosomerne mislykkedes, og siRNA forbliver fanget og derfor ineffektiv. Alternativt pletter kan være agglomerater, der er dannet intracellulært. Funktionelle evalueringer af kemiske transfektion verserer derfor kan gøres endnu ingen endelige udsagn om knockdown effektivitet, eksistensen af to forskellige populationer er stadig allerede ugunstig, da dette betyder, at alle resultater beskriver gennemsnittet af begge populationer, dette svarer således ikke til enten af befolkningen. Derfor nucleofection er overlegen fremgangsmåde.
dvs programmer og composition af Nucleofector løsning, har ændret sig i overensstemmelse hermed, skal det bestemmes, hvis vores protokol kan overføres til disse systemer.
Men trods disse begrænsninger protokollen præsenteres her giver giver en pålidelig og effektiv transfektion af THP-1-celler, som er overlegen i forhold til alle andre ikke-virale metoder. Denne protokol gør det muligt at undersøge virkningen af ændret genekspression i THP-1-celler, som i alle andre aspekter differentierer og polariserer normalt og viser således som små bivirkninger af transfektion som muligt.
Disclosures
Offentliggørelse omkostninger for denne video-artikel er sponsoreret af Lonza Group Ltd
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Lonza Group Ltd for at sponsorere denne publikation ved at dække omkostningerne ved offentliggørelse. Vi takker Deutsche Infarktforschungshilfe Wilhelm-Vaillant-Stiftung, Ernest-Solvay-Stiftung, og Thüringer Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Kultur om tilskud til SL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase I | Sigma-Aldrich | A6964 | |
| Amino acids, nonessential | PAA | M11-003 | |
| Centrifuge tubes (15 ml) | TPP | TPP91015 | |
| Fetal calf serum (FCS gold) | PAA | A15-151 | |
| Human Monocyte Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1007 | Contains Nucleofector Solution, cuvettes, and Pasteur pipettes |
| Human serum off the clot | Lonza | C11-020 | |
| Isove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) with 25 mM HEPES and 25 mM L-glutamine | Lonza | 12-722F | |
| Lymphocyte Growth Medium 3 (LGM3) | Lonza | CC-3211 | |
| Mouse T Cell Nucleofector Medium | Lonza | VZB-1001 | |
| Nucleofector 2b | Lonza | AAD-1001 | |
| Penicillin / streptomycin / L-glutamine (100x) | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685 | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI 1640) | PAA | E15-840 | |
| siRNA / plasmid | |||
| Sodium pyruvate (100 mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| THP-1 human leukemia monocytes | CLS | 300356 | |
| Tissue culture flasks (75 cm²; 150 cm²) | TPP | TPP90076/TPP90151 | |
| Tissue culture plates (6-well; 12-well) | TPP | TPP92406/TPP92012 | |
| Tubes (1.5 ml) | StarLab | S 1615-5500 | |
| Water (nuclease-free) or appropriate siRNA/plasmid buffer | |||
| X-Vivo 20 with gentamycin | Lonza | BE04-448Q | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
References
- Ricardo, S. D., van Goor, H., Eddy, A. A. Macrophage diversity in renal injury and repair. J Clin Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
- Morille, M., Passirani, C., Vonarbourg, A., Clavreul, A., Benoit, J. P. Progress in developing cationic vectors for non-viral systemic gene therapy against cancer. Biomaterials. (24-25), 3477-3496 (2008).
- Schnoor, M., et al. Efficient non-viral transfection of THP-1 cells. J Immunol Methods. 344 (2), 109-115 (2009).
- Maeß, M. B., Buers, I., Robenek, H., Lorkowski, S. Improved protocol for efficient nonviral transfection of premature THP-1 macrophages. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (5), (2011).
- Ma, W., Liu, Y., Ellison, N., Shen, J. Induction of C-X-C chemokine receptor type 7 (CXCR7) switches stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling and phagocytic activity in macrophages linked to atherosclerosis. J Biol Chem. 288 (22), 15481-15494 (2013).
- Xie, Q., et al. Cell surface localization of ABCG1 does not require LXR activation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26 (11), 143-144 (2006).
- Buers, I., Robenek, H., Lorkowski, S., Nitschke, Y., Severs, N. J., Hofnagel, O. TIP47, a lipid cargo protein involved in macrophage triglyceride metabolism. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (5), 767-773 (2009).
- Robenek, H., Buers, I., Hofnagel, O., Lorkowski, S., Severs, N. J. GFP-tagged proteins visualized by freeze-fracture immuno-electron microscopy: A new tool in cellular and molecular medicine. J Cell Mol Med. 13 (7), 1381-1390 (2009).
- Guh, J. H., et al. Development of novel adenosine monophosphate-activated protein kinase activators. J Med Chem. 53 (6), 2552-2561 (2010).
- Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli. Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).
- Maeß, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli. J Immunol Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).
- Angosto, D., et al. Evolution of inflammasome functions in vertebrates: Inflammasome and caspase-1 trigger fish macrophage cell death but are dispensable for the processing of IL-1b. Innate Immun. 18 (6), 815-824 (2012).
- Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A.
- Muruve, D. A., et al. The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response. Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).
