Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Effektiv Gene Transfer i Chick netthinne for primære cellekulturstudier: An Published: November 2, 2015 doi: 10.3791/52002
Automatic Translation
1, 1, 1
1Wilmer Eye Institute, The Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Embryoniske kylling retinal cellekulturer utgjør verdifulle verktøy for å studere fotoreseptoren biologi. Vi har utviklet en effektiv genoverføring teknikk basert på ex ovo plasmid elektroporering av netthinne før kultur. Denne teknikken øker betydelig i løpet av transfeksjonseffektivitet for tiden tilgjengelige protokoller, slik genetisk manipulasjon mulig for dette systemet.

Abstract

Kjeglen fotoreseptorlidelser-beriket kulturer avledet fra embryonale chick netthinne har blitt et uunnværlig verktøy for forskere rundt om i verden som studerer biologi netthinnens nerveceller, spesielt fotoreseptorer. Anvendelsen av dette system går utover grunnleggende forskning, da de lett kan tilpasses til høy gjennomstrømning teknologier for legemiddelutvikling. Imidlertid har genetisk manipulering av retinale fotoreseptorer på disse kulturene vist seg å være meget krevende, utgjør en viktig begrensning for nytten av systemet. Vi har nylig utviklet og validert en ex ovo plasmid elektroporering teknikk som øker frekvensen av transfeksjon av netthinneceller på disse kulturene ved fem ganger sammenlignet med andre for tiden tilgjengelige protokoller 1. I denne fremgangsmåten embryoniske kylling øyne er enucleated i trinn 27, RPE er fjernet, og retinal koppen plasseres i en plasmid-inneholdende oppløsning og elektroporert ved hjelp av lett konstrueres Custom-laget elektroder. Netthinne blir deretter dissosiert og dyrkes ved hjelp av standardprosedyrer. Denne teknikken kan brukes til overekspresjon studier samt til nedregulering av genekspresjon, for eksempel ved bruk av plasmid-drevet RNAi-teknologi, vanligvis oppnå transgene ekspresjon i 25% av populasjonen fotoreseptoren. Videoformatet av foreliggende publikasjonen vil gjøre denne teknologien lett tilgjengelig for forskere på feltet, slik at studiet av gen-funksjon i grunnskolen netthinnens kulturer. Vi har også tatt med detaljerte forklaringer av de kritiske trinnene i denne fremgangsmåten for et vellykket resultat og reproduserbarhet.

Introduction

Dissosierte cellekulturer fra embryonale chick netthinne har blitt mye brukt til å studere ulike aspekter av fotoreseptoren cellebiologi, inkludert deres overlevelse 2-9, differensiering 10-12, neurittutvekst 13, og mer. Fordelene med dette systemet, utviklet på 1980-tallet av Ruben Adler og medarbeidere og perfeksjonert av hans og andre grupper 14-20, bor i de iboende egenskapene til dama som en dyremodell 21. Den store størrelsen på chick øyet, selv på embryonale stadier, gir store mengder materiale for kulturer. Videre, når kulturene blir utført ved hjelp av embryonale dag (ED) 5 - 6 netthinne, 55 - 80% av deres forløperceller skille som fotoreseptorene 14,15,18,22,23, og siden ca 86% av fotoreseptorene i dette dyret er kjegler 24, disse kulturene er spesielt egnet for studier som fokuserer på denne celletype.

Vi har nylig utvikledeped og karakterisert en enkel teknikk som gjør det mulig for høyeffektiv plasmid transfeksjon av cellene i disse kulturene, og dermed utvider nytten av dette systemet ved å tilrettelegge for genetisk missexpression studie 1. Utviklingen av denne teknikken stammet fra et hulrom i den vitenskapelige litteratur metoder som ville gi et akseptabelt nivå av transfeksjon for å muliggjøre studier av genfunksjon i en celle autonom måte. Dette er delvis fordi primære nevrale kulturer er notorisk vanskelig å transfektere 25,26. Noen av de mest brukte teknikker som tidligere har vært tilgjengelig for dette formålet inkluderte kjemiske transfeksjonsmetoder så som lipofeksjon eller kalsiumfosfat-mediert transfeksjon, noe som resulterer i effektivitet i størrelsesorden 3-5%, og kan utøve betydelig toksisitet 27-32. Selv om bruken av plasmider med en enzymatisk rapportørsystem kan omgå problemet med dårlig transfeksjonseffektivitet ved å forsterke signalet, de ikkediskriminere celle-spesifikke effekter, og deres resultater er basert på en liten cellepopulasjon som kanskje ikke er representative for hele. En annen mye brukt metode i kylling, RCAS virusinfeksjon, gjelder bare for prolifererende celler, og dermed ikke er egnet for denne primær retinal kultursystem 33.

I den nåværende protokoll embryoniske kylling øyne er enucleated ved trinn 27 (ED 5), retinal pigmentert epitel (RPE) er fjernet, og retinal koppen plasseres i en electroporation kammer fylt med et plasmid inneholdende oppløsning og elektroporert ved bruk av skreddersydde elektroder, etterfulgt av retinal dissosiasjon og kultur ved bruk av standard teknikker 21. Etter optimalisering av denne fremgangsmåten har vi vært i stand til konsekvent å oppnå transfeksjonseffektivitet i størrelsesorden 22% av det totale antall celler i kultur og 25% i løpet av fotoreseptoren populasjon alene, uten at overlevelsen og differensierings egenskaper avkulturer 1. Her har vi tilveiebringe en detaljert protokoll som beskriver alle de viktige trinnene i denne fremgangsmåten for å sikre suksess og reproduserbarheten av denne teknikk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer beskrevet i dette arbeidet ble utført i henhold til retningslinjene som er anbefalt av Animal Care og bruk komité ved Johns Hopkins University.

1. Ahead of Time: Utarbeidelse av instrumenter, reagenser og Dishes

  1. Fremstilling av egg: Inkuber befruktede hvite Leghorn kyllingegg ved 37,5 ° C og 60% relativ fuktighet i 5 dager i en inkubator egg.
    MERK: En inkubator med gynge kapasitet kan være nyttig for å standardisere og synkronisering av embryoutvikling, men gynge er strengt tatt ikke nødvendig for utfallet av denne protokollen.
  2. Plasmid Forberedelse:
    1. Design plasmidkonstruksjonen for genet overekspresjon eller nedregulering (for eksempel ved bruk av RNAi-teknologi 1,34) etter behov. Omfatte et reporter-gen (for eksempel EGFP, RFP eller LacZ) i konstruksjonen når det er mulig.
      MERK: Noen vanlige arrangører som CMV, kan bli brakt til taushet etter gang. Den CAG kaer (kylling beta-aktin promoter med CMV enhancer) er et veldig godt alternativ, og gir effektiv langsiktig uttrykk for det aktuelle genet 35-37.
    2. Tilbered en plasmid-oppløsning ved en konsentrasjon på 1,5 pg / pl i steril PBS. EKSTRA: Forbered plasmid løsning på forhånd og oppbevares frosset inntil klar til bruk.
      MERK: Høyere konsentrasjoner plasmid ikke resulterer i en betydelig økning i effektivitet, mens det ved bruk av lavere konsentrasjoner plasmid senke transfeksjonseffektiviteten 1.
  3. Elektroder:
    1. For anoden bruk tippet et tykt gullelektrode (se tabell over spesifikke materialer / utstyr). Tørk av med 70% etanol.
      MERK: Isolering av gull tippet lektroden, og etterlater ca. 0,5 mm eksponert, er det tilrådelig å redusere lekkasje av elektrisk strøm. Informasjon for isolasjonsmateriale kan finnes i tabell av spesifikke materialer.
    2. Lag en katode ut av en 2,5 mm square box filament, 4,5 mm bred (som normalt anvendes i mikropipette avtrekker). Ved hjelp av tang, angre den firkantede boksen og rette filament i en lang stripe. Deretter, i henhold til disseksjon mikroskop og ved hjelp av en linjal som en guide, bøye filamentet inn i en firkantet U-formet 3 mm lang i bunnen og 2 mm på den ene side, med den andre siden den gjenværende lengde av filament (Figur 1 , C - D). Bruk pinsett, dypp elektroden i 96% etanol og flamme for å sterilisere. Deretter legge en elektrisk ledning med en liten alligator klipp til lengre arm av elektroden.
  4. Electroporation Chamber Setup:
    1. Forbered elektroporering kammeret ved å kutte lokket av en steril 1,5 ml mikrosentrifugerør og feste den, flat side ned, til en 100 mm petriskål med tape (figur 1E).
      MERK: Annen container i form av et godt av tilsvarende størrelse ville fungere; imidlertid er et mikrosentrifugerør lokk lett tilgjengelig og autoklaveres. Brønnenmå være stor nok til å huse en kylling øye og katode-elektrode, men ikke så stor at det resulterer i en sløsing med plasmid-løsning.

2. Ex ovo Electroporation Prosedyre

  1. Utarbeidelse av instrumenter:
    1. Sterilisere mikro-disseksjon verktøy (2 par store buede Moloney tang for åpning eggeskall og øste ut embryoer, 2 par fine tips buede Dumont pinsett for å fjerne RPE, ett par Bonn tannet tang for å fjerne linsen og glasslegemet) ved å dyppe tips i 96% etanol og flaming. Clean disseksjon omfang bruker våtservietter dyppet i 70% etanol. Varm en flaske med steril kalsium-magnesium-fri Hanks balanserte saltløsning (CMF-HBSS) i en 37 ° C vannbad. Fyll 100 mm sterile petriskåler til 3/4 full med varmt CMF-HBSS.
    2. Plasser elektroporering kammer under en annen ren disseksjon mikroskop og fyll med 120 mL av plasmid løsning. Koble elektrodene til elektroporering apparat, noe som gjørat skreddersydd elektrode er forbundet med den negative pol og gull tippet elektroden til den positive pol.
  2. Embryo Collection:
    1. Rengjør eggene ved å tørke skjell med kluter fuktet i 70% etanol. Oppretthold steril prosedyre gjennom resten av protokollen for å unngå å bære forurensning inn i kulturer. Ved å bruke store buede Moloney tang åpne forsiktig i et hull i eggeskallet ved å banke på den avrundede spissen av en egg (over luftkammeret), og deretter å gripe og trekke ut skallstykker.
    2. Med en annen pinsett fjerne membraner og samle embryo ved øste det ut av egget (være forsiktig for ikke å skade fosteret). Plasser den i en skål med CMF-HBSS.
      MERK: samle så mange embryoer som er nødvendig for å oppnå den ønskede antallet netthinnens kopper for elektroporering som angitt i 2.4.4
    3. KRITISK STEP: Stage embryoene ifølge Hamburger og Hamilton 38.
      MERK: For å oppnå optimal effektivitet embryoermå være ved trinn 27 (figur 2A).
    4. Avlive de embryoer ved halshogging bruker Moloney tang.
  3. Innhenting Retinal Cups:
    1. Ved hjelp av gode Dumont pinsett, nøye enucleate øynene og overføre til en ny CMF-HBSS parabolen.
    2. Starter fra bakre del av hvert øye, i nærheten av synsnervehodet, og ved hjelp av to fine Dumont pinsett, presentere ett tips av hver pinsett mellom nevrale netthinnen og RPE og nøye dissekere ut RPE å være forsiktig å ikke skade nevrale retina (figur 2B).
      MERK: Mangelen på Ca 2+ og Mg 2+ i løsningen vil hjelpe RPE løsne fra nevrale netthinnen lettere.
  4. Electroporation:
    1. Sett opp electroporator parametere å levere 5 kvadrat pulser på 15 volt, 50 msek varighet, og 950 msek intervall. Plass 'U' formet negativ elektrode inne elektroporering skammer (mikrosentrifuge lokk fylled med 120 mL av plasmid-inneholdende oppløsning).
    2. Bruke buede Dumont pinsett overføre én retinal kopp til elektroporeringsmetoden kammeret (ved scooping, ikke trykke), og plassere den i "U" formet elektrode, med den bakre delen av netthinnen mot bunnen av elektroden og linsen vendt oppover ( Figur 2D).
    3. Plasser anoden slik at den berører fremre delen av øyet, ved siden av objektivet, og bruker electroporator fot pedal levere elektriske pulser.
    4. Overfør elektroporert retinal koppen til en ny petriskål med CMF-HBSS, og gjenta prosedyren elektroporasjon med hver av de gjenværende retinale kopper.
      MERK: Opptil 6 retinal kopper kan elektroporert med den samme plasmid løsning uten en betydelig reduksjon i transfeksjonseffektivitet.
    5. Fjern linsen og glasslegemet av hver elektroporert retinal cup ved å gripe dem med Bonn tann pinsett og dra forsiktig gjennom than elev åpning mens du holder øye på plass med baksiden av de buede Dumont pinsett.
    6. Fortsett til dissosiasjon og kultur av elektroporerte netthinnens celler etter standard prosedyrer.
      MERK: For en detaljert protokoll om dissosiasjon og kultur av chick netthinnens celler refererer til Vergara og Canto-Soler, 2012, Tilleggs fil 4 21 I denne protokollen cellene sådd ved lav tetthet på polyornitin-belagt seks-brønns plater eller 35. -MM retter (6 x 10 5 celler / 35 mm diameter tillegg eller parabol). Det anvendte medium er medium 199 med penicillin / glutamin, 10% føtalt kalveserum (FCS), og linolsyre-BSA ved 100 ug / ml. Kulturene blir opprettholdt i en fuktet 37 ° C inkubator med 5% CO2. Ved hjelp av denne fremgangsmåten, 5 - kan 6 x 10 6 celler typisk bli oppnådd pr hvert trinn 27 elektroporert øyet.
      MERK: Ideelt sett bør ikke mer enn tre timers passere mellom embryo innsamling og celle plating, for å sikre god celle overlevelseog redusere stress. En typisk timing for observasjon og ytterligere analyse er etter 4 dager i kultur, da på dette tidspunkt cellene har oppnådd gode morfologiske og molekylære differensiering og overlevelse er fremdeles høy.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her presenterer vi en enkel protokoll for plasmid transfeksjon inn erte utskrapte chick netthinnens kopper for påfølgende dissosiert cellekultur. Transfeksjon blir oppnådd ved elektroporering ved å bruke enkle å lage tilpassede elektroder (figurene 1 - 2). Parametrene som er beskrevet i denne protokoll har blitt optimalisert for å oppnå transfeksjonseffektiviteter som varierer mellom 20 og 27% (med et gjennomsnitt på 22%) (Figur 3D). Legg merke til at, av de grunner som er angitt ovenfor, er disse resultater kvantifisert etter 4 dager i kultur. I denne sammenheng refererer transfeksjonseffektiviteten til prosentandelen av celler som uttrykker transgenet i den totale cellepopulasjonen. Hvis bare den fotoreseptoren populasjonen er vurdert, transfeksjonseffektiviteter øke til et gjennomsnitt på 25% (figur 3D). Dette er et viktig trekk fordi disse typer kulturer blir primært brukt til å studere fotoreseptorene.

Cellekulturer som har blitt electroporat ed hjelp av denne teknikken er umulig å skille fra sine ikke-elektroporert kolleger i deres morfologi henhold DIC belysning, celleoverlevelses egenskaper, og uttrykk for molekylære markører som visinin (et mye brukt markør av fotoreseptorer) og Pax6 en.

Figur 1
Figur 1. Making of elektrodene. (A - D) Katoden er laget av en firkantet boks filament (A), som er rettet første (B) og deretter bøyd med pinsett i en firkantet U-formet (C - D). Anoden er en tykk gullutslagsgivende elektrode (D); Legg merke til isolasjonen rundt anoden elektroden, slik at bare 0,5 mm fra spissen utsettes for. (E) Electroporation oppsett. Inset viser høyere forstørrelse av eske området.pg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Utarbeidelse av Retinale Cuper for Electroporation. (A) Chick embryo ved Hamburger og Hamilton fosterstadiet 27. (B) Den RPE fjernes forsiktig fra utskrapte øynene ved hjelp av skarpe Dumont pinsett. (C) Den retinal cup til høyre er blottet for RPE og klar for elektroporering. (D ) Katoden elektroden er plassert inne i en elektroporering kammer laget av et 1,5 ml mikrosentrifugerør lokk fylt med plasmid-løsning. Retinal cup er nøye overført til katoden vendt oppover, og anoden elektroden er plassert på toppen, ved siden av linsen. Klikk her for å se en større versjonav dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Effektivitet av transgene uttrykk i dyrkede celler etter Electroporation (A - C). Retinal kopper ble elektroporert med en GFP ekspresjonsplasmid, dissosiert og dyrket i 4 dager. Fluorescens mikroskopi vise DAPI farget atomkjerner (A) og GFP uttrykke netthinnens celler (B). Anti-Visinin antistoffarging ble utført for å identifisere fotoreseptorcellene (C). (D) Diagram som illustrerer transfeksjonseffektivitet oppnås ved ex ovo elektroporering, representert som prosentandelen av GFP uttrykkende celler blant den totale cellepopulasjon (DAPI positiv), eller blant de fotoreseptoren populasjon spesielt (Visinin positive). Resultatene representerer gjennomsnitt ± SEM av 5 uavhengige eksperimenter. Scale bar i (A - C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den mest kritiske trinnet for å lykkes med denne protokollen er å velge riktig stadium av embryoene. I tidligere publikasjoner, er en rekke av embryonale stadier gitt for disse kulturene, typisk definert av dagers inkubasjon eller embryoniske dager (ED); dermed er det vanligvis antatt at bruk av ED 5 til ED 6 embryo vil gi tilsvarende resultater. Men vi har funnet ut at på scenen 27 (ED 5), vil transfeksjonseffektivitet være rundt 22% av den totale cellepopulasjonen, som nevnt ovenfor; men effektiviteten vil reduseres til 16% ved bruk av fasen 28 embryoer (ED), og 5,5 til 12% ved stadium 29 (ED 6) 1. Andre kritiske trinnene omfatter å opprettholde sterile betingelser gjennom hele prosessen; skaffe nødvendig fingerferdighet for å unngå skade på netthinnen under disseksjon og elektroporering; og unngå lange hull fra den tiden av embryo samlingen til den tiden av cellen plating.

En annen viktig faktor for å sikre god transfeksjon efficienCies er konsentrasjonen av plasmid-inneholdende løsning: anbefalte 1,5 pg / pl er den laveste konsentrasjon som vi testet som ikke resulterer i en reduksjon i effektivitet. Denne konsentrasjonen resulterer i en høy mengde av plasmid materiale tatt i betraktning at de retinale koppene er badet i den løsningen. Ved å bruke den minste størrelsen vel som vil imøtekomme øyet (for eksempel et mikrosentrifugerør lokk) kan minimere dette problemet. I tillegg kan flere øyne bli elektroporert ved anvendelse av samme løsning; vi har ikke sett en reduksjon i effektivitet når electroporating opptil 6 retinal kopper etter hverandre i samme plasmid løsningen, og mer kunne gjøres, men vi kan ikke attest til forskjellen i effektivitet etterpå.

Tidligere publiserte protokoller tilveiebringes typisk lave effektiviteten av genoverføring for denne type av kultur og således de ofte måtte stole på teknikker som måler produktet av enzymatiske reaksjoner i en celle lysate for å øke følsomheten. En slik tilnærming har den ulempe at den ikke tillater for celletype og diskriminering av å stole på et lavt antall celler å være ansvarlig for den observerte resultat, som kanskje ikke alltid være representative for virkemåten til større cellepopulasjon. En annen måte å omgå problemet med lav effektivitet er å utføre gen transfeksjon in vivo, forut for øye enucleation og kultur. Dette er en levedyktig tilnærming, men det kan vanligvis bare brukes til bestemte eksperimentelle paradigmer, siden både plasmid elektroporering og RCAS virusinfeksjon (et felles gen transduksjon vektor i dama) trenger vanligvis utføres på tidligere utviklingsstadier, og skaper en tidsforsinkelse mellom transfeksjon og kultur. Dette er en viktig faktor, fordi i løpet av den tidsforsinkelse cellene er utsatt for virkningene av både den ekstracellulære mikromiljøet, så vel som intracellulære faktorer, som har betydelig innvirkning på tolkningen av experimental resultater. I motsetning til dette, den betydelige økningen i genoverføring effektivitet oppnås med ex ovo electroporation tilnærming tillater studiet av genfunksjon i en celle-indre måte. Videre kan fordelen med denne høye transfeksjon hastigheten økes ytterligere når den brukes i forbindelse med automatisert high-throughput celle analyse 1.

På den innledende fasen av utviklingen av denne teknikken, opprettholdt vi elektroporert RPE-blottet øye kopper i kultur i 24 timer for å vurdere effektiviteten av elektroporering oppnås med ulike forhold 1. Selv om vi ikke forsøke å kultur dem for lengre tider, indikerer vår erfaring at den protokoll som er beskrevet heri kan også anvendes på Studier avhengige av retinal organotypiske eksplantater, forutsatt at passende lange eksplantat dyrkningsbetingelser anvendes.

Endelig vil det være mulig å utvide anvendeligheten av ther ex ovo electroporation tilnærming til andre dyremodeller. For eksempel i vår erfaring transfeksjon av mus øyne på postnatal dag 1 eller 4 under anvendelse av denne protokollen gitt kvalitativt gode resultater i eksplantering kulturer, men når dissosierte cellekulturer ble forsøkt transfeksjonseffektiviteten var i størrelsesorden 6%, sammenlignes med andre teknikker. Således kan dette være et enkelt alternativ til andre protokoller for denne dyremodell, men det må bli optimalisert for det spesielle system ved høye virkningsgrader er nødvendig. Av notatet, som nevnt ovenfor, fosterstadiet på tidspunktet for elektroporering var nøkkelen til høy effektivitet utfallet oppnådd i dama, så denne parameteren bør vurderes nøye ved anvendelse av teknikken til andre modeller.

Som konklusjon kan ex ovo elektroporering teknikk utvide anvendelsen av in vitro netthinnens systemer som kraftige verktøy for å komplettere in vivo studier, og tilbyr nEW muligheter retinal forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ECM 830 Electro Square Porator BTX/ Harvard Apparatus 45-0052
Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip BTX/ Harvard Apparatus 45-0115 model 512 Gold tipped electrode used as anode
Polyimide Tubing Vention Medical custom made Internal Diameter: 0.5 mm/wall thickness: 0.15 - 0.2 mm. Used for insulating gold tiped electrode
2.5 mm square box filament, 4.5 mm wide Sutter Instrument Company FB245B Used to make cathode electrode
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco - Life Technologies 14175-095
Moloney forceps Roboz RS-8254 Serrated; Slight Curve; 4.5" Length
Dumont tweezers 5/45 Roboz RS-5058 Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length
Bonn micro forceps, 1x2 teeth Roboz RS-5172 Tying Platform; 1x2 Teeth, 0.12 mm Teeth; 3.75" Length; 0.3 mm Tip Width

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vergara, M. N., Gutierrez, C., O'Brien, D. R., Canto-Soler, M. V. Ex vivo electroporation of retinal cells: a novel, high efficiency method for functional studies in primary retinal cultures. Exp Eye Res. 109, 40-50 (2013).
  2. Chalmel, F., et al. Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential. BMC Mol Biol. 8, 74 (2007).
  3. Goureau, O., Regnier-Ricard, F., Desire, L., Courtois, Y. Role of nitric oxide in photoreceptor survival in embryonic chick retinal cell culture. J Neurosci Res. 55 (4), 423-431 (1999).
  4. Hewitt, A. T., Lindsey, J. D., Carbott, D., Adler, R. Photoreceptor survival-promoting activity in interphotoreceptor matrix preparations: characterization and partial purification. Exp Eye Res. 50 (1), 79-88 (1990).
  5. Leveillard, T., et al. Identification and characterization of rod-derived cone viability factor. Nat Genet. 36, 755-759 (2004).
  6. Lorentz, O., Sahel, J., Mohand-Said, S., Leveillard, T. Cone survival: identification of RdCVF. Adv Exp Med Biol. 572, 315-319 (2006).
  7. Nakamura, M., Singh, D. P., Kubo, E., Chylack Jr, L. T., Shinohara, T. LEDGF: survival of embryonic chick retinal photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (5), 1168-1175 (2000).
  8. Paes-de-Carvalho, R., Maia, G. A., Ferreira, J. M. Adenosine regulates the survival of avian retinal neurons and photoreceptors in culture. Neurochem Res. 28 (10), 1583-1590 (2003).
  9. Stenkamp, D. L., Gregory, J. K., Adler, R. Retinoid effects in purified cultures of chick embryo retina neurons and photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (8), 2425-2436 (1993).
  10. Fuhrmann, S., Kirsch, M., Hofmann, H. D. Ciliary neurotrophic factor promotes chick photoreceptor development in vitro. Development. 121 (8), 2695-2706 (1995).
  11. Toy, J., Norton, J. S., Jibodh, S. R., Adler, R. Effects of homeobox genes on the differentiation of photoreceptor and nonphotoreceptor neurons. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (11), 3522-3529 (2002).
  12. Yan, R. T., He, L., Wang, S. Z. Pro-photoreceptor activity of chick neurogenin1. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (12), 5567-5576 (2009).
  13. Adler, R. Regulation of neurite growth in purified retina neuronal cultures: Effects of PNPF, a substratum-bound, neurite-promoting factor. J Neurosci Res. 8 (2-3), 165-177 (1982).
  14. Adler, R. A model of retinal cell differentiation in the chick embryo. Prog Retin Eye Res. 19 (5), 529-557 (2000).
  15. Adler, R., Hatlee, M. Plasticity and differentiation of embryonic retinal cells after terminal mitosis. Science. 243 (4889), 391-393 (1989).
  16. Adler, R., Lindsey, J. D., Elsner, C. L. Expression of cone-like properties by chick embryo neural retina cells in glial-free monolayer cultures. J Cell Biol. 99 (3), 1173-1178 (1984).
  17. Adler, R., Magistretti, P. J., Hyndman, A. G., Shoemaker, W. J. Purification and cytochemical identification of neuronal and non-neuronal cells in chick embryo retina cultures. Dev Neurosci. 5 (1), 27-39 (1982).
  18. Belecky-Adams, T., Cook, B., Adler, R. Correlations between terminal mitosis and differentiated fate of retinal precursor cells in vivo and in vitro: analysis with the 'window-labeling' technique. Dev Biol. 178 (2), 304-315 (1996).
  19. Hyndman, A. G., Adler, R. Neural retina development in vitro. Effects of tissue extracts on cell survival and neuritic development in purified neuronal cultures. Dev Neurosci. 5 (1), 40-53 (1982).
  20. Politi, L. E., Adler, R. Generation of enriched populations of cultured photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 27 (5), 656-665 (1986).
  21. Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development. Neural Dev. 7, 22 (2012).
  22. Adler, R. Determination of cellular types in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1677-1682 (1993).
  23. Repka, A., Adler, R. Differentiation of retinal precursor cells born in vitro. Dev Biol. 153 (2), 242-249 (1992).
  24. Morris, V. B. Symmetry in a receptor mosaic demonstrated in the chick from the frequencies, spacing and arrangement of the types of retinal receptor. J Comp Neurol. 140 (3), 359-398 (1970).
  25. Li, H., Chan, S. T. H., Tang, F. Transfection of rat brain cells by electroporation. J Neurosci Methods. 75 (1), 29-32 (1997).
  26. Martinez, C. Y., Hollenbeck, P. J. Transfection of primary central and peripheral nervous system neurons by electroporation. Methods Cell Biol. 71, 339-351 (2003).
  27. Boatright, J. H., et al. The 5' flanking regions of IRBP and arrestin have promoter activity in primary embryonic chicken retina cell cultures. Exp Eye Res. 64 (2), 269-277 (1997).
  28. Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr Protoc Neurosci. Chapter 3, Unit 3.11 (2001).
  29. Kumar, R., et al. The bZIP transcription factor Nrl stimulates rhodopsin promoter activity in primary retinal cell cultures. J Biol Chem. 271 (47), 29612-29618 (1996).
  30. Toy, J., Bradford, R. L., Adler, R. Lipid-mediated gene transfection into chick embryo retinal cells in ovo and in vitro. J Neurosci Methods. 104 (1), 1-8 (2000).
  31. Werner, M., Madreperla, S., Lieberman, P., Adler, R. Expression of transfected genes by differentiated, postmitotic neurons and photoreceptors in primary cell cultures. J Neurosci Res. 25 (1), 50-57 (1990).
  32. Yuan, L., Kawada, M., Havlioglu, N., Tang, H., Wu, J. Y. Mutations in PRPF31 inhibit pre-mRNA splicing of rhodopsin gene and cause apoptosis of retinal cells. J Neurosci. 25 (3), 748-757 (2005).
  33. Hughes, S. H. The RCAS vector system. Folia Biol (Praha). 50 (3-4), 107-119 (2004).
  34. Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Dev Biol. 294 (2), 554-563 (2006).
  35. Nguyen, A. T., Dow, A. C., Kupiec-Weglinski, J., Busuttil, R. W., Lipshutz, G. S. Evaluation of gene promoters for liver expression by hydrodynamic gene transfer. J Surg Res. 148 (1), 60-66 (2008).
  36. Xu, L., et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice. Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).
  37. You, L. M., et al. A hybrid promoter-containing vector for direct cloning and enhanced expression of PCR-amplified ORFs in mammalian cells. Mol Biol Rep. 37 (6), 2757-2765 (2009).
  38. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).

Tags

Developmental Biology retina fotoreseptoren primærcellekultur elektroporering plasmid transfeksjon chick
Effektiv Gene Transfer i Chick netthinne for primære cellekulturstudier: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Electroporation Approach
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vergara, M. N., Gutierrez, C.,… More

Vergara, M. N., Gutierrez, C., Canto-Soler, M. V. Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach. J. Vis. Exp. (105), e52002, doi:10.3791/52002 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter