Summary
이 기사는 효율적으로 선택적으로 참조 마커의 분석은 인구의 동질성과 정체성을 평가하기 위해 유동 세포 계측법 다음에 대한 Wnt 경로를 변조하여 심근에 인간 만능 줄기 세포를 구별하는 자세한 방법을 설명합니다.
Abstract
, 심장 손상을 복구하는 심장 독성이없는 새로운 치료제를 발견하고 정확하게 심장 질환을 모델링하기위한 전략을 향상시키기위한 방법을 개발하기위한 시급한 필요성이있다. 이러한 응용 프로그램은 "접시에"심장 근육을 생성하는 인간의 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC) 기술을 악용 가능성이 높은 열정을 생성하고 있습니다. 최근, 효율적으로 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs) 발 cardiomyogenic 세포를 생성하는 능력이 크게 다르게 접근 할 수없는 인간 심장의 초기 개발 단계를 모델링 우리에게 새로운 기회를 제공하는, 개선했다. 많은 이전의 방법과는 대조적으로, 심근 분화 프로토콜 세포 응집 또는 티빈 또는 BMP4의 추가를 요구하지 않는 여기서 설명하고 견고 심장 트로포 닌 고도로 양성 세포의 배양을 생성하여 I 및 T (TNNI3, TNNT2) iroquois- 클래스 homeodomain을 단백질IRX-4 (IRX4), 마이 오신 규제 경쇄 2, 심실 / 심장 근육의 이소 형 (MLC2v)과 미오신 규제 경쇄이 모든 인간 배아 줄기 세포 (hESC의)와 hiPSC 라인에서 일 10에 의해 심방 이소 형 (MLC2a는) 테스트 날짜입니다. 세포는 계대와 문화에 90 일 이상 유지 될 수있다. 전략은 기술적으로 구현하기에 간단하고 비용 효과적이다. 다 능성 세포로부터 유도 된 심근 세포의 특성은 종종의 mRNA 및 단백질 수준 모두에서, 기준 마커의 분석을 포함한다. 단백질 분석을 위해, 유동 세포 계측법에 배양 세포의 품질을 평가하고 모집단의 균질성을 결정하기위한 강력한 분석 도구이다. 그러나, 샘플 제조에서 기술 변화는 크게 유동 세포 계측법 데이터의 품질에 영향을 미칠 수있다. 따라서, 염색 프로토콜의 표준화는 다양한 차별화 전략 간의 비교를 용이하게한다. 따라서, IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3 및 TNN의 분석을 위해 염색 프로토콜을 최적화흐름에 의해 T2 세포 계측법에 설명되어 있습니다.
Introduction
hESC의와 hiPSC 포함 hPSCs,에서 심근의 발생은 기계 론적 연구, 그렇지 않으면 접근 할 수없는 단계에 대한 통찰력을 제공하고, 초기 인간의 심장 발달 과정의 체외 모델로 작동 할 수 있습니다. 이 모델 시스템은 심장 계통의 의지와 세포 운명 사양을 제어하는 분자 경로를 연구하는 독특한 기회를 제공합니다. 최근, 효율적 hPSCs에서 cardiomyogenic 세포를 생성하는 능력이 크게 향상되었다 1-15. 그러나, 프로토콜들 세포는 챔버 관련 마커 (예를 들어, 심실과 심방)를 발현하는 세포와 cardiomyogenic 타이밍을 생성하는 효율에 대해 세포주 편차가있다. 이상적으로,이 모델 시스템의 미래 응용 프로그램, 기능적으로 정의 된 세포의보다 균일 한 집단이 요구된다. 이전 방법과 대조적으로, 심근 분화 프로토콜 CE 필요없는 여기서 설명한LL 집계 또는 견고 티빈 또는 뼈 형태 형성 단백질 4 (BMP4)과의 추가는 일에 의해 TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v 및 MLC2a에 대한 문화가 매우 긍정적 인 일에 테스트 한 모든 hESC의와 hiPSC 라인에 걸쳐 10 세포를 생성합니다. 이 전략은 특히 입체 문화, 대중 문화, 또는 배아 체를 기반으로 전략 4-9에 비해 구현하기가 기술적으로 간단하고, 최근 hPSCs에 대한 선택적 독성을 가진 작은 분자를 설명하는 연구 (Boheler 등으로 정의 하였다. ) 65. 이 프로토콜의 특징은 작은 분자를 사용하여 완전하게 정의 미디어 (아무런 구별 1,2,7,13에서 유사) Wnt 신호를 변조 hESC의 자격을 갖춘 매트릭스 (마트 리겔)의 단일 층을 사용하여 단일 층 문화 hPSCs의 분화를 포함하고, 분화 효율 및 셀 아이덴티티 평가 염색 방법 최적화 유동 세포 계측법. 이전 보고서는 비용 effectiv을 포함에 요약하면,이 프로토콜의 장점을 비교eness, 재현성 및 hiPSC hESC의 라인을 포함하여 여러 hPSC 라인 중 심근를 생성하기위한 고효율.
유동 세포 계측법에 배양 세포의 품질을 평가하고 모집단의 균질성을 결정하기위한 강력한 분석 도구이며, 적절한 실험 설계로, 정량적 측정을 제공 할 수있다. 모든 항체 기반의 전략으로, 실험 결과의 정확한 해석은 하위 최적의 조건이 크게 항체의 효율성에 영향을 미치는로 항체 농도와 고정 및 permeabilization 조건 (세포 내 항원을 표적)을 포함하여 분석 디자인의 요소주의 깊게 각 항체 테스트해야 결과의 해석을 결합하고, 따라서. 정량 분석이 필요하다면 폴리 클로 날 항체가 여러 에피토프를 인식하고 뱃치 변화하는 경향이있다 중요한 것으로, 단일 클론 항체는 필수적이다. 현재 항체의 다양한 (포lyclonal 및 모노클로 날) 및 염색 프로토콜 어려운 프로토콜 1,2,9,11 중 cardiomyogenesis의 효율을 비교하기 위하여, 시험 관내 분화의 평가를 위해 설명되었다. 모든 유동 세포 계측법 분석을 위해 사용 가능한 경우 그 이유를 들어, 단일 클론 항체가 사용된다. 향후, 그것은 더 나은 차별화 전략 간의 비교를 허용해야, 특히 정량와 관련하여,이 염색 프로토콜의 표준화를 것으로 예상된다.
체외 cardiomyogenesis의 순도를 평가하기 위해 사용 된 마커의 선택 및 해당 항체는, 리포트 중에서 변한다. TNNT2는 cardiomyogenic 운명 커밋 세포의 지표로 간주되었으며 심장 일상적 분화 프로토콜의 효율을 평가하기 위해 사용된다. 그러나 TNNT2은 초기 병아리와 쥐 개발 (16, 17) 중 골격근에서 발현과 인간의 평활근 (18)에 존재한다 체외에서 인간의 cardiomyogenesis의 특정 마커 없습니다. MLC2v 및 MLC2a 일상적으로 각각 심실 및 심방 하위 유형의 대리 지표로 사용된다. 그러나, 체외 분화의 컨텍스트에서 심근 하위 유형을 판별 MLC2v 및 MLC2a에 의존하고있는 도전이 유전자 산물이 성인 통해 중심 튜브에서, 심장 개발 걸쳐 특정 챔버로 제한되지 않을 수 있다는 사실로부터 발생한다. 짐승의 마음을 루프에서 MLC2a의 mRNA는 심방 / 유입 관의 지역에서 우세하고 MLC2v의 mRNA는 심실 / 유출 요로 지역에서 지배적이다. 루프 중심부에 위치한 MLC2a 및 MLC2v의 mRNA의 공동 발현은 유입 경로, 방실 운하 및 유출 관 (19, 20)에서 관찰된다. 출생 후 삼일으로 MLC2v의 mRNA는 심실로 제한되고, 출생 후 십일에 의해, MLC2a는 신생아 쥐의 심장 (19)에 심방으로 제한됩니다. 따라서 해석cardiomyogenesis 효율성과 하위 정체성은 기준 마커 레벨의 존재와 양을 고려하지해야하지만, 분석 분화 timepoints이 해당하는 발달 단계 (들)을 고려해야한다에 관한 데이터. 이 hPSCs의 체외 분화에 의해 생성 cardiomyogenic 세포의 성숙 단계가 가장 밀접하게 배아 / 태아 발달 21-25들과 유사한 점을 고려 특히 중요합니다. 따라서, 출생 후 심장 마커의 공간 표현에 의존하는 것은 적어도 어떤 경우에는 hPSC 유래 세포의 평가를 위하여는 적절하지 않을 수 있습니다.
체외에서 심근 ID를 정의하는보다 구체적인 기준의 개발을 용이하게하기위한 노력으로, TNNI3는 그것이 병아리 및 지브라 피쉬 15,20에서 배아 걸쳐 심근로 제한으로서 체외에서 cardiomyogenesis을 평가하기위한 유용한 마커로 간주인간 태아의 골격 근육 (26)의 존재이다. TNNI1 인간 태아 심장에 존재하지만, TNNI3 정상 성인의 심장 (27, 28)의 유일한 TNNI 이소 존재입니다. 심근 하위 정체성과 관련하여, IRX4 29 ~ 31는 심실 운명 세포의 정보 마커입니다. 단백질 수준에서 IRX4 최근 마우스 (32)에 신생아 단계를 통해 선형 심장 관에서 심실로 제한하는 것으로 나타났다. 따라서, 유동 세포 계측법에 의해 TNNI3의 분석 및 최적화를위한 IRX4 염색 프로토콜을 설명한다. 우리가 알기로는,이 유동 세포 계측법에 의한 효율적인 항체 기반 염색 인간 심근에 IRX4 수준의 분석을위한 방법의 제 설명이다.
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Protocol
1 솔루션 및 미디어 준비
- hESC의 자격을 갖춘 매트릭스 코팅 원액
- 천천히 4 박 ºC에서 hESC의에게 얼음에 자격을 갖춘 매트릭스 (5 ㎖) 해동. 1.5 ㎖의 멸균, 사전 냉장 마이크로 원심 튜브에 분취 량을 분배하고 즉시 -20 ºC에 저장합니다.
참고 : 분취 량의 볼륨이 많은에 따라 일반적으로 270-350 μl를 범위 달라질 수 있습니다. 제조 단계 2.1에 설명 된대로 25 ML로 희석시 1 배 농도를 달성하는 데 필요한 나누어 볼륨에 대한 세부 정보를 제공합니다.
- 천천히 4 박 ºC에서 hESC의에게 얼음에 자격을 갖춘 매트릭스 (5 ㎖) 해동. 1.5 ㎖의 멸균, 사전 냉장 마이크로 원심 튜브에 분취 량을 분배하고 즉시 -20 ºC에 저장합니다.
- hPSC 미디어 콘텐츠 솔루션
- 달리 언급하지 않는 희석제로서 초순수를 사용한다. 0.22 μm의 필터를 사용하여 모든 구성 요소를 소독. 4 ºC에서 대량의 솔루션으로 다음과 저장 : 탄산 수소 나트륨 (75 ㎎ / ㎖)를; 시트르산 (10 밀리미터의 pH = 3).
- 0.2 μm의 주사기 필터를 사용하여 모든 구성 요소를 소독 -20 ºC에 분주 각 저장 : Rho 키나아제 (ROCK) 억제제 Y-27632 (10DPBS에서 밀리미터, 100 ㎕의 분취); L-아스코르브 산 2 - 포스페이트 (64 ㎎ / ㎖, 500 ㎕의 분취 량); 아 셀렌 산 나트륨 (70 μg / ㎖, 100 ㎕의 분취 량); 트랜스페린 (50 ㎎ / ㎖, 107 ㎕의 분취); 섬유 아세포 성장 인자 2 (FGF2 200 NG / DPBS에 μL, 250 μL 나누어지는); 성장 인자 베타 1을 변화 (차가운 10 mM의 시트르산에서 TGFβ1, 100 NG / μL, 10 μL 나누어지는).
- hPSC 미디어 E8 솔루션 구성
- , L-아스 코르 빈산 2 - 인산 (500 μL, 최종 : (; 500 ㎖의 L-글루타민과 HEPES 포함), 탄산 수소 나트륨 (543 μg / ml의 3.62 ML 최종) DMEM / F12 단계 1.2에서 준비 분주을 사용하여 미디어를 준비 : 64 μg / ㎖), 아 셀렌 산 나트륨 (100 μL, 최종 140 NG / ㎖), 트랜스페린 (107 μL; 최종 : 10.7 μg / ㎖), 인슐린 (1ml를, 최종 : 20 μg / ㎖), FGF2 (250 μL, 최종 : 100 NG / ㎖), TGFβ1 (10 μL, 최종 : 2 ng / mL)로 측정 하였다.
- 최대 2 주 동안 4 ºC에서 모든 구성 요소, 필터 소독 및 저장을 결합합니다.
- ROCK 저해제 hPSC 미디어 E8
- 상기와 같이 제조 E8 미디어의 12 ml의 15 μL의 ROCK 저해제를 넣고 잘 섞는다. 최종 농도가 3.7 단계에서 / 미디어 세포의 첨가 후 10 μM이 있는지 확인합니다.
- Wnt에 변조기의 재고 솔루션
- -20 ºC에서 다음 분취 량을 저장합니다. 치르 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1 H -imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile; DMSO에서 10 밀리미터, 15 μL 나누어지는). IWR 1 - (4 - (1,3,3a, 4,7,7a 헥사 하이드로 1,3 - 디 옥소 4,7 - 메타 노-2H-이소 인돌 -2 - 일)-N-8-퀴 놀리 닐 - 벤즈 아미드; DMSO에서 10 밀리미터, 6 μL 나누어지는).
- 차별화 미디어
- 2 % B27 마이너스 인슐린 보충와 (L-글루타민) RPMI 1640으로 차별화 미디어 # 1을 준비합니다.
- 2 % B27 플러스 인슐린 보충 및 2 % FBS와 (L-글루타민) RPMI 1640으로 차별화 미디어 # 2를 준비합니다.
- 셀 워시 솔루션 F또는 세포 배양
- 칼슘 또는 마그네슘없이 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (DPBS)를 사용합니다.
- 유동 세포 계측법에 대한 셀 워시 솔루션
- 1 % FBS와 (칼슘 또는 마그네슘없이 PBS) 인산염 완충 생리 식염수를 사용합니다. 4 ºC에 저장합니다.
- 유동 세포 계측법에 대한 세포 유지 보수 솔루션
- 5 % FBS와 (칼슘 또는 마그네슘없이 HBSS) 행크의 균형 소금 솔루션을 사용합니다. 4 ºC에 저장합니다.
- 유동 세포 계측법에 대한 고정 솔루션
- TNNI3 및 IRX4 항체 고정 솔루션으로 Cytofix 버퍼를 사용합니다.
- TNNT2 및 MLC2a 항체 고정 솔루션으로 1X PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드를 (신선하게)를 사용합니다.
- MLC2v 항체에 대한 고정 솔루션으로 70 % 메탄올 / 30 % 아세톤을 사용합니다.
- 4 ºC 모든 솔루션을 저장합니다.
- 유동 세포 계측법에 대한 Permeabilization 솔루션
- permeabilization 솔루션 F로 Phosflow 파마 버퍼 III를 사용하여또는 TNNI3 및 IRX4 항체. 실내 온도 (25 ° C에서)에서 보관하십시오.
- TNNT2, MLC2v 및 MLC2a 항체에 대한 permeabilization 솔루션으로 1X PBS에 0.2 % 트리톤 X-100을 사용합니다. 4 ºC에 저장합니다.
- 차단 솔루션
- 1X PBS에서 10 % 염소 혈청을 사용합니다. 신선한 확인하고 사용까지 4 ºC에 저장합니다.
2 플레이트 코팅
- 천천히 30 분 동안 4 ºC에서 hESC의 자격을 갖춘 행렬의 한 나누어지는을 녹여 냉장 DMEM / F12의 25 ML에 추가하고 즉시 6 웰 플레이트를 코팅하기 전에 소독 조직 문화 후드에 잘 섞는다.
- 멸균 조직 문화 후드 아래에 6 잘 플레이트 잘 당 1 ML을 추가 (hESC의 자격을 갖춘 행렬의 한 나누어 코트 사 6 웰 플레이트에 충분하다).
- hESC의 정규화 된 행렬 후드를 실온에서 30 분 동안 설정할 수. 초과 hESC의 자격을 갖춘 행렬을 기음 잘 각각 ROCK 저해제 E8 미디어 2 ㎖를 추가합니다. 사용 플레이트 즉시, 또는 경우 데IRED, 4 °에서 상점은 즉시 최대 일주에 도금 및 사용하기 전에 30 분 동안 실온으로 평형 C.
3과 Passaging 및 단층 문화 미분화 hPSCs의 유지 보수
- 6 - 웰 플레이트에서 단일 층 문화 hPSCs을 유지하고 멸균 조직 문화 후드 아래의 모든 단계를 수행합니다.
- hPSC의 잘 설립 아르 라인 (> P20)를 사용하고, 신경, epithelial- 또는 섬유 아세포와 같은 형태로 세포의 존재없이 균일 한 형태를 나타낸다. 물론 당 0.75 × 10 6에서 시드 때 세포가 75 %의 합류에 3 일에 견고하게 증식하고, 평균 통행에 확인합니다.
- 단일 세포 수준으로 해리와 통로 hPSCs 적어도 5 배 전에 최대의 분화 효율을 보장하기 위해 차별화의 시작합니다. 통로 hPSCs으로, 흡인 E8 미디어 및 1X DPBS (실온에 미리 예열)의 4 ㎖로 두 번 세포를 씻으십시오. 세포 분리의 한 ML을 추가, 표준의 각 웰에 용액 (실온에 미리 예열) 및 셀 경계 라운드 업하기 시작 때까지 3-7 분 동안 잘 방해받지 둡니다.
- 셀을 제거하고 DMEM / F12 미디어 1 ㎖를 포함하는 15 ML 원뿔 튜브로 전송하는 전구 솜 연결 유리 피펫을 사용하십시오 (전지 분리 솔루션을 비활성화합니다).
- 세포 용액 10 ㎕를 분취를 제거하고 microcentrifuge 관에서 트리 판 블루의 10 μL와 혼합. 셀의 나머지는 실온에서 5 분 동안 130 XG에서 원심 분리에 의해 회수하는 동안 세포 (예 : 자동 또는 수동 혈구)를 카운트. 이 프로토콜을 사용 70-80% 생존 자동 혈구를 사용하여 총 세포 수에 대한 기본 모든 세포 수를 향후를 기대합니다.
- 대기음 매체 500 μL 당 0.75 × 106 세포의 최종 농도 DMEM / F12에서 세포 펠렛을 재현 탁하고.
- 6 - 웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 500 μl를 추가 여기서 각 웰 contaiROCK 억제제 NS 2ml의 E8 매체, 단계 2.3에서 제조. 조리대에 판을 떠나, 부드럽게 잘 걸쳐 전후 및 좌우 움직임 균일하게 분산하는 세포에서 이동합니다. 5 % CO 2, 37 ºC에서 인큐베이터 세포를 돌려줍니다.
- 계대 후 24 시간을 시작으로 매일 ROCK 저해제없이 2 ㎖ / 잘 E8을 사용하여 미디어를 교체합니다. 차별화의 시작 전에 100 % 합류를 달성하기 위해 파종 밀도를 최적화 할 수 있습니다. 825 × 106 세포를 시드 / 웰 사일 분화 시작하지만 필요에 따라 각각의 세포주에 대해 최적화 전.
대한 Wnt 통로의 선택적 변조에 의해 hPSCs의 4 심근 유도
- 일 0-7 중 매일 (2 ㎖ / 웰) 미디어를 새로 고친 일 8 후 매일.
- 0 일에, 분화 매체 # 1 E8 매체를 대체하여 분화 과정을 시작한다. 각 웰에 1.2 ㎕를 치르 (6 μM 최종)를 추가합니다. 일 하나에 반복합니다.
- 일 2-3에서 신선한 differen로 교체tiation 미디어 # 1.
- 일 사에서 신선한 차별화 미디어 1 번 교체하십시오. 각 웰에 1 μL IWR-1 (최종 5 μM)를 추가합니다. 일 5에 반복합니다.
- 일 6-7에서 신선한 차별화 미디어 # 1로 교체합니다.
- 일 8에서 신선한 차별화 미디어 # 2로 교체합니다.
- 차별화 미디어 # 2 문화의 원하는 시간에 대한 다른 모든 일을 대체하기 위해 계속합니다.
- 원하는 경우, 3.3-3.6에서 설명한 단계에 따라, 그러나 분화 매체 # 2 미디어 치환 세포 분리 용액을 사용하여 통로 심근. 계대시 ~ 3-10 세포의 작은 클러스터로 심근 세포를 떼어 놓다. 잘 사용 hESC의 자격을 갖춘 매트릭스 코팅 우물과 차별화 미디어 # 2 당 ~ 6 × 10 5 세포에서 씨.
유동 세포 계측법에 대한 세포의 5 컬렉션
- 실험실 벤치 (즉, 멸균되지 않음)에 5-9 단계의 나머지 부분을 수행합니다.
- 기음 성장 미디어 및 1X PBS로 두 번 세포를 씻으십시오.셀 경계 라운드 업하기 시작 때까지 (실온에 미리 예열) 각 세포 분리 용액 1 ㎖를 잘 추가하고 3-7 분 동안 방해받지 둡니다. 셀을 제거하고 얼음에 15 ML 원뿔 튜브로 전송하는 전구 솜 연결 붕규산 유리 일회용 9 "피펫을 사용합니다.
- 프로토콜의 나머지 부분 동안, 얼음 세포를 유지하고, 4 ºC에서 5 분 동안 200 XG에 centrifugations을 수행합니다.
- 원심 분리 및 흡인 솔루션에 의해 세포를 수집합니다. 세포 대단히 짧은 시간을 보장하기 위해 반복 분쇄와 10 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용하여 10 ㎖의 세포 세척 용액에 재현 탁 세포는 단일 세포로 분산된다. 나머지 세포를 원심 분리에 의해 회수하는 동안 단계 3.5에서와 같이 세포를 카운트.
- 세포 세척액 돌보는에 재현 탁 된 세포는 완전히 세포 펠렛 및 분취 둥근 바닥 튜브 당 1 × 106 세포를 해리하는한다. 원심 분리 및 흡인 솔루션에 의해 세포를 수집합니다.
(6) 고정 및세포 내 항원 염색에 대한 세포의 Permeabilization
- 세포 펠렛을 100 ㎕의 고정 솔루션을 추가합니다. 솔루션 드롭 현명한 연속 부드러운 소용돌이로 교반을 가진 후 15 분 동안 얼음에 설정을 추가합니다.
- 3 ㎖의 세포 세척 솔루션을 추가합니다. 원심 분리 및 흡인 솔루션에 의해 세포를 수집합니다.
- 세포 펠렛을 100 μL의 permeabilization 솔루션을 추가합니다. 솔루션 적가 한 후 30 분 동안 얼음에 설정 연속 부드러운 소용돌이로 교반과를 추가합니다. 표 1에 각 항체에 대한 설명으로 고정 및 permeabilization 조건을 사용합니다.
- 3 ㎖의 세포 세척 솔루션을 추가합니다. 원심 분리 및 흡인 솔루션에 의해 세포를 수집합니다. permeabilization 후 두 세척의 총 반복합니다.
| 차 항체 (클론) | 면역원 / 에피토프를 인식 | Istotype 제어 | 100 μL의 1 × 106 세포 당 차 항체의 양 | 고정 솔루션 | Permeabilization 솔루션 | 차 항체 | 100 μL의 차 항체의 양 / 일 × 10 6 세포 | |
| %의 양의 측정을 위해 | 항원 정량 | |||||||
| TNNI3 (284 (19C7) | ISASRKLQL (인간) | 마우스 IgG2b의 | 1.0 μg | 3.0 μg | BD Cytofix | BD Phosflow 파마 III | 염소 항 - 마우스 IgG2b의-Alexa488 | 600 NG |
| TNNT2 (1C11) | 전체 길이 정제 원시 인간의 트로포 닌 T 단백질. | 마우스의 IgG1 | 1.0 μg | 2.0 μg | 4 % PFA1 % PBS에서 | 1 % PBS에서 0.2 % 트리톤 X-100 | 염소 항 - 마우스의 IgG1 - 알렉사 488 | 600 NG |
| MLC2v (330G5) | FDPEGKG | 마우스의 IgG2a | 2.0 μg | 3.0 μg | 70 % 메탄올 / 30 % 아세톤 | 1 % PBS에서 0.2 % 트리톤 X-100 | 염소 항 - 마우스의 IgG2a - 알렉사 647 | 600 NG |
| MLC2a (4E7) | E.에서 생산 된 인간 MYL7의 전체 길이 인간의 재조합 단백질 대장균 | 마우스의 IgG1 | 0.5 μg | 3.0 μg | 1 % PBS에서 4 % PFA | 1 % PBS에서 0.2 % 트리톤 X-100 | 염소 항 - 마우스의 IgG1 - 알렉사 488 | 600 NG |
| IRX4 | LQEHRKNP YPTKGEKI MLAIITKM TLTQVST | 토끼의 IgG | 0.5 μg | 0.5 μg | BD Cytofix | BD Phosflow 파마 III | 염소 항-RA의 IgG-PE를 BBIT | 600 NG |
각각의 일차 및 이차 항체를위한 최적화 된 농도와 고정 및 유동 조건 permeabilization 사용 (모노클 경우)를 표 1 항체 농도. 이내가있는 일차 항체, 클론 세포 계측법 분석한다. 항체 스톡 농도가 동일한 클론의 공급 업체에 따라 다를 수 있듯이, 최종 고정 된 분석 볼륨에서 1 × 10 6 세포 당 각 항체의 농도보다는 희석가 제공됩니다. 면역원은 항체를 생성하는 데 사용하거나 제조사로부터 제공된 항원, 항체에 의해 인식 나열 되나 여기 실험적 검증되지 않았다.
7 항체 염색
- 모든 실험을 위해, 하나의 고정 / permeabilization 조건 당 흠 제어 및 사용 된 각각의 일차 항체에 대한 적절한 이소 타입 제어를 포함한다. (음성 대조군으로서 비 심근 세포 유형을 포함예를 들어, 다 능성 줄기 세포 또는 섬유 아세포). 일차 항체 대응과 동일한 농도로 아이소 타입 컨트롤을 사용하여 (표 1 참조).
- 세포를 해리하는 데 P200 피펫을 사용하여 차단 솔루션 100 μL에 재현 탁 세포. 부드러운 락 25 분 동안 얼음에 설정 샘플입니다.
- 차단 솔루션을 제거하지 않고. 차 항체 또는 표 1의 지침에 따라 이소 타입 컨트롤을 추가 부드러운 락 얼음에 45 분을 품어.
- 3 ㎖의 세포 세척 솔루션을 추가합니다. 원심 분리 및 흡인 솔루션에 의해 세포를 수집합니다. 차 항체 라벨 후 두 세척의 총 반복합니다.
- 형광 - 복합 일차 항체를 사용하는 경우, 8.1로 이동합니다. 비 접합 차 항체 (예를 여기에 설명 된 모든 마커와 같은)를 사용하는 경우, 다음과 같은 형광 물질에 접합 된 이차 항체와 함께 라벨을 수행한다.
- DISA에 P200 피펫을 사용하여 차단 솔루션 100 μL에 재현 탁 세포ggregate 세포.
- . 표 1의 지침에 따라 이차 항체를 추가 부드러운 락 얼음에 30 분을 품어.
- 3 ㎖의 세포 세척 솔루션을 추가합니다. 원심 분리 및 흡인 솔루션에 의해 세포를 수집합니다. 차 항체 라벨 후 두 세척의 총 반복합니다.
유동 세포 계측법에 대한 세포의 8 준비
- 세포를 해리하는 데 P1000 피펫을 사용하여 400 ㎕의 세포 유지 보수 솔루션을 Resuspend 세포.
- 50 ㎕의 세포 유지 보수 솔루션을 사전 습윤에 의해 둥근 바닥 튜브 셀 스트레이너 캡을 준비합니다. 얼음에 튜브를 설정합니다. 흐름 cytometer 막히는 세포 집합체를 방지하기 위해 셀 스트레이너 모자를 사용한다.
- 스트레이너 캡을 세포 및 세포 현탁액은 중력에 의해 배출 할 수 있도록 셀 솔루션을 전송합니다. 세포가 튜브에 수집 가능한 빨리 다시 얼음에 설정 될 수 있도록 필요에 따라 벤치 위에 부드럽게 튜브의 바닥을 누릅니다. 250 ㎕의 세포 유지 보수 때문에 헹구고 체기술인 것은 세포의 최대한의 회복을 보장합니다.
- 얼음에 세포를 유지하고 유동 세포 계측법에 의해 분석 될 때까지 빛으로부터 보호합니다.
9 유동 세포 계측법 분석
자세한 인수 설정은 악기에 따라 달라집니다. 최적의 데이터 수집을 위해 고려해야 할 기본 파라미터는 아래에 설명되어 있습니다.
- 최적 스트림 안정성, 노즐 크기는 셀의 직경은 분석되고 5-6x 초과되도록.
참고 :이 상품에 따라 다를 수 있지만 분석기 및 세포 분류에 적합한 노즐 크기를 선택 모두 중요한 고려 사항이다 있습니다. 일 10 심근의 평균 직경은 (8-14 이르기까지) 11 μm의입니다; 따라서 분석기 표준 150 μm의 시료 주입 관은 잘 작동합니다. - 직전 데이터 분석, 각 튜브 잠시 소용돌이 세포 집합체를 분산한다.
- 앞으로 최적화하고 각 세포 유형 측면 산란 전압 설정에 기초관심 인구 규모에 있으며 (도 2a)을 중심으로되도록 실험에 사용 된 각 고정 / permeabilization 조건의 제어 흠.
- 중요한 변화는 사이토의 흐름 또는 샘플 준비 잠재적 인 문제를 나타낼 수 있으므로, 하나의 실험을 통해 이러한 설정을 유지하고 같은 악기 실험 실험에서 일관성.
- 각 형광 물질의 경우, 이소 제어를 분석하고 피크의 좌우 양쪽 가장자리를 표시 형광 히스토그램을 얻기 위해 요구되는 최소 강도를 결정하기 위해 적절한 레이저 전압을 조정한다. 항체 염색 샘플에 대응하는 데이터를 취득 할 때 각각의 아이소 타입 컨트롤 레이저 설정을 유지한다.
참고 : 신호는 종종 드리프트 같은 악기에 시간이 지남에 따라 발생합니다. 그것은 적절한 이소 제어에 기초하여 각각의 실험의 시작 부분에 레이저 설정을 조정하는 것이 중요하다. - 최소 모아서10000 이벤트. 50000 이벤트가 바람직하다.
- 통계 분석의 경우, 게이트 라이브 세포 인구 파편 (그림 2A)를 제외한다. 그림 2B, C에 나타낸 바와 같이, 아이소 타입 컨트롤에서 ≤2 %의 기여를 할 수 있습니다 마커 위치에 따라 게이트 인구 내에서 퍼센트 양성 세포를 확인합니다.
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Representative Results
0 일에, 세포는 콤팩트 형태 및 세포 파편 최소 100 % 융합 성이다. 1-2 일에, 그것은 중요한 세포 죽음 (40~50%)을 관찰하는 것이 일반적이지만, 부착 세포는 콤팩트 형태 (도 1a)을 유지한다. 이 시간 동안 미디어는 오렌지와 혼탁입니다. 핑크 미디어 과도한 세포 사멸을 나타내며,이 경우, 트리 판 블루로 확인하고 세포 사멸이 70 %를 초과하는 경우 중단. 세포는 3 ~ 4 일 동안 복구하고 밀도가 증가 할 것이다. 일 5-6시, 최소한의 세포 사멸이 발생하고 조밀 한 패치가 나타나기 시작합니다. 일 7-8으로 합류 단층은 조밀 한 패치 산재 컴팩트 한 형태로 얻을 수있다. 세포는 자발적으로 일 (8)에 의해 계약을 시작하고 첫번째 수축은 종종 밀도 패치에서 볼 수 있습니다. 일 10함으로써,보다 강력한 수축이 관찰되고 이후의 일에 문화에 퍼져 나갈 것입니다. α-티닌 및 TNNT2 쇼 근절 구조에 대한 면역 세포 화학 염색법(그림 1A). 양적 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (QRT-PCR)에 의해 측정으로, 중배엽 및 cardiomyogenic 약속의 표시 시간 프로파일을 참조 마커의 mRNA 수준은 심장 마커 호 메오 단백질 Nkx-2.5 (NKX2.5의 강력한 표정으로 (그림 1B) 예상대로 ), TNNI3, MLC2a, MLC2v 및 미오신-6 (MYH6). 평활근 (마이 오신 중쇄 11, MYH11) 및 골격 근육의 비 감지 수준으로 매우 낮은 (오게 닌, MYOG) 마커 일상입니다. 표현 TNNI1 및 TNNI2 견고하게 일 7 ~ 8시 감지 동종를 트로포 닌, 성인 20,27,28에서 골격 근육에 한정되기 전에 모두 심장과 골격 근육에서 관찰되는 초기 개발과 일치.
다른 보고서와 일관성이 체외 차별화 전략은 초기 심장 전구 세포의 특성을 가진 심근 (둥근 형태, MLC2a의 공동 발현, MLC2v) 19를 생성 (30, 32)로 커밋 될 듯하다. 유동 세포 계측법, 광 산란 프로파일은 세포 유형에 따라 달라집니다 및 고정 / permeabilization 조건 (그림 2A) 사이에서 상당히 변경합니다. 분석 이소 제어 및 항체 (그림 2B) 사이에 명확한 구분 단일 봉우리와 이소 타입 컨트롤을 보여 세포 계측법이 다양한 세포의 준비 조건에서 흐른다. 다 능성 세포 또는 다른 비 심근 세포는 여기에 사용 된 마커 부정적이다.
이 분화 및 염색 프로토콜을 사용하여 생성 된 세포 집단은 99 % TNNI3, 96 %의 IRX4 +, 91 % MLC2v + 전형적으로, 96 %가 MLC2a + 분화 10 일에 의해 유동 세포 계측법에 의해 측정. 99 % TNNT2 + 세포 (도 2C, 2D)이 관찰되지만, 전술 한 바와 같이, TNNT2는 유일하지 않다세포를 10 일에 의해 99 %가 심근 정통 TNNI3 단백질에 기초하는 것이 개발되어있어 어설 동안 심근한다. 그것은 QRT-PCR에 의해 모니터로 일 10 넘어 계속 배양하여, 구조 단백질의 단백질 농도는, 식 피크에 대하여 감소 된 단백질 안정성 및 3.2 및 3.5 일의 회전율과 일치 상대적인 유전자 발현 수준 비록 높은 남아 있는지 유의 각각 TNNI 및 TNNT 33. 이 관찰의 예 TNNT2 (11 일 (도 1b)에서의 피크 발현을 위해 도시되고, 하루 20 +에서 강력한 단백질 수준 (도 2E).
그림 1 hPSCs 대표 데이터에서 심근 분화의 전체 회로도. (A) 심근 differentiatio의 회로도 N 프로토콜은 혈통 및 / 또는 세포 운명의 약속의 해당 단계로 주석. 분화 과정의 주요 단계에서 세포의 대표적인 위상차 이미지. 스케일 바는 10 μm의 =. 오른쪽 = α-티닌 (녹색)의 면역 세포 이미지 중 TNNT2 (적색)과 핵 (파란색). (B) QRT-PCR 분석 (프로브 세트, 재료 표 참조) 18 참조 중배엽 및 심장 개발 마커와 겹쳐 분화의 제 십칠일. 모든 데이터는 각각 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타내는 세중, 분석 세 생물은 복제의 평균이며, 액틴 (ACTB)로 표준화한다. 코네티컷 값 (즉, 코네티컷 <35) 감지 할 수있는 곳의 모든 시점에 대한 메시지 수준이 차별화의 첫 번째 일을 기준으로합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
유동 세포 계측법 및 전기 생리학에 의한 심근의 그림 2 특성. (A) 다양한 고정 및 permeabilization 조건에서 일 10 hiPSC 유래 심근의 빛 산란 프로파일. 50000 이벤트를 수집하고, 통계 분석에 사용되는 게이트 된 인구 (즉 제외 파편)이 빨간색으로 표시된다. (B) 히스토그램 세 가지 고정 / permeabilization 조건을 사용하여 분화 일 10 IRX4의 방법 중 효율 염색의 차이를 도시. 세트는 각 조건을 사용하여 hiPSCs에 IRX4의 염색의 차이를 보여줍니다. differenti의 일 10 TNNI3, TNNT2, MLC2v, MLC2a의 이러한 데이터는 메탄올 / 아세톤 인해 hiPSCs 부족하지만, 탐지, 염색에 IRX4 피해야하는 이유를 설명한다. (C) 히스토그램 0.5 μg이 99 % TNNT2 + 세포를 측정하기 위해 필요한 최소 금액이라고하지만, 2 μg이 포화 점임을 나타내는 항체 적정 실험 TNNT2의 ation 표 1에 설명 된 최대 퍼센트 양성 세포를위한 최적의 염색 조건을 사용. (D) 히스토그램 정량이 필요합니다. 오직 하나의 이소 타입 제어가 도시되어 있지만, 적정 실험 이소 제어 해당 적정하여 각 항체를 비교에 기초하여 계산된다. TNNT2 단백질 (E) 정량 심근 세포에의 분화 0-24 일에, 중간 형광 세기의 차이로 표현 각 시점 패치 클램프 기술의 전체 - 셀 전류 클램프 구성을 사용하여 분화의 날 (46)에 하나의 자발적 수축 심실 형상 심근에서 기록. (F) 활동 전위에 대한 항체 및 아이소 타입 컨트롤 간의.ES / ftp_upload / 52,010 / 52010fig2highres.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| BD Matrigel, hESC-qualified matrix | BD Biosciences | 354277 | |
| Accutase cell detachment solution | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | 53817 | |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | |
| Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor | R&D Systems | 1254 | |
| L-Ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261-10G | |
| Transferrin (Optiferrin – Defined, Animal-free, Recombinant Human) | Invitria | 777TRF029 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | R&D Systems | 4144-TC-01M | |
| Transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) | Peprotech | 100-21 | |
| DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES | Life Technologies | 11330-032 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| CHIR-99021 HCl | Sellekchem | S2924 | |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Life Technologies | 11875-093 | |
| B-27 Supplement Minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| B-27 Supplement (with Insulin) | Life Technologies | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10437 | |
| Flow Cytometry Reagents | |||
| Phosphate buffered saline (10x) | Quality Biological Inc. | 119-069-151 | |
| Hank's balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies | 14175-095 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Phosflow perm buffer III | BD Biosciences | 558050 | |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28906 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 179957-4L | |
| Acetone | Mallenckrodt Chemicals | 2440-16 | |
| Triton X-100 | Amresco | M236-10ML | |
| Goat serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Materials | |||
| 5 ml Round bottom polystyrene tube (without cap) | Corning | 352008 | For preparation of cells for flow cytometry |
| 5 ml Round bottom polystyrene tube (with 35 µM cell strainer snap cap) | Corning | 352235 | For preparation of cells for flow cytometry |
| 2 ml rubber bulbs | Fischer Scientific | 03-448-24 | |
| 9" borosilicate unplugged glass Pasteur pipets | BioExpress | P-2904-2 | |
| 0.65 ml Microcentrifuge tubes, graduated, green | GeneMate | C-3259-G | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes, graduated, red | GeneMate | C-3260-R | |
| TC20 automated cell counter | BioRad | 145-0102 | |
| Counting slides for TC20 | BioRad | 145-0011 | |
| 6-well Flat bottom tissue-culture treated plate | Corning | 353046 | |
| 20 ml Syringes | BD Plastipak | 300613 | For filter sterilization of aliquots |
| Sterile syringe filters, 0.2 µm polyethersulfone | VWR | 28145-501 | For filter sterilization of aliquots |
| 250 ml Filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding | Corning | 431096 | For filter sterilization of bulk media |
| 500 ml filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding | Corning | 431097 | For filter sterilization of bulk media |
| Antibodies and Isotype Controls | |||
| Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7)) | Abcam | ab19615 | Primary antibody |
| Anti-TNNT2 (clone: 1C11) | Thermo Scientific | MA1-16687 | Primary antibody |
| Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5) | Synaptic Systems | 310111 | Primary antibody |
| Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7) | Abcam | AB131661 | Primary antibody |
| Anti-IRX4 | Bioss | BS-9464R | Primary antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1 | Life Technologies | A21121 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a | Life Technologies | A21241 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b | Life Technologies | A21141 | Secondary antibody |
| Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG | R&D Systems | F0110 | Secondary antibody |
| Mouse IgG1 | BD Biosciences | 557273 | Isotype Control |
| Mouse IgG2a | eBiosciences | 16-4724-81 | Isotype Control |
| Rabbit IgG-PE | R&D Systems | IC105P | Isotype Control |
| TaqMan Probesets for qRT-PCR | |||
| ACTB | Life Technologies | Hs01060665 | |
| Brachyury T | Life Technologies | Hs00610080 | |
| CASQ2 | Life Technologies | Hs00154286 | |
| IRX4 | Life Technologies | Hs01100809 | |
| ISL1 | Life Technologies | Hs00158126 | |
| MESP1 | Life Technologies | Hs01001283 | |
| MYH11 (SMMHC) | Life Technologies | Hs00224610 | |
| MYH6 | Life Technologies | Hs01101425 | |
| MYL2 (MLC2v) | Life Technologies | Hs00166405 | |
| MYL7 (MLC2a) | Life Technologies | Hs01085598 | |
| MYOG | Life Technologies | Hs01072232 | |
| NKX2.5 | Life Technologies | Hs00231763 | |
| NPPA | Life Technologies | Hs01081097 | |
| POU5F1 | Life Technologies | Hs04260367 | |
| SOX17 | Life Technologies | HS00751752 | |
| TNNI1 | Life Technologies | Hs00913333 | |
| TNNI2 | Life Technologies | Hs00268536 | |
| TNNI3 | Life Technologies | HS00165957 | |
| TNNT2 | Life Technologies | Hs00165960 | |
References
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