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Biology

मलेरिया मच्छरों के विकास, उपजाऊपन और उत्तरजीविता पर एक epigenetic ड्रग के परीक्षण प्रभावों के लिए विषाक्तता Assays

Published: January 16, 2015 doi: 10.3791/52041
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Entomology, Virginia Tech

Abstract

कीटनाशी प्रतिरोध मलेरिया नियंत्रण कार्यक्रम के लिए एक बड़ी समस्या बन गया है। मच्छरों मलेरिया उष्णकटिबंधीय देशों में एक सर्वव्यापी समस्या को नियंत्रित कर रही है, जल्दी से पर्यावरण में परिवर्तन की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुकूल है। कीटनाशक प्रतिरोधी आबादी के उद्भव वेक्टर मच्छर नियंत्रण के लिए उपन्यास दवा लक्ष्य रास्ते और यौगिकों के अन्वेषण वारंट। Epigenetic दवाओं अच्छी तरह से हालांकि बहुत कीड़ों पर उनके प्रभाव के बारे में जाना जाता है नहीं, कैंसर अनुसंधान के क्षेत्र में स्थापित कर रहे हैं। इस अध्ययन से मलेरिया वेक्टर, एनोफ़ेलीज़ gambiae पर, 3-Deazaneplanocin ए (DZNep), कैंसर के उपचार के लिए एक प्रयोगात्मक epigenetic दवा की विषाक्तता प्रभाव की जांच के लिए एक सरल प्रोटोकॉल प्रदान करता है। यौगिक उपचार को नियंत्रित करने के रिश्तेदार वयस्क मच्छरों के उपजाऊपन कम है, जबकि मृत्यु दर और आकार में कमी में एक एकाग्रता पर निर्भर वृद्धि हुई है, DZNep उजागर करने के लिए अपरिपक्व मच्छरों में मनाया गया। इसके अलावा, एस में एक दवा पर ​​निर्भर कमी थी -उपचार को नियंत्रित करने के DZNep रिश्तेदार को प्रदर्शन के बाद मच्छरों में adenosylhomocysteine ​​(एसएएच) hydrolase गतिविधि। इन प्रोटोकॉल बारी में, पानी में घुलनशील epigenetic दवाओं या के यौगिकों की विषाक्तता प्रभाव की खोज के लिए एक अद्वितीय बहु-शूल दृष्टिकोण का प्रदर्शन, एक प्रयोगात्मक दवा के लिए कई विषाक्तता समापन का आकलन करने के लिए एक सरल, कदम दर कदम प्रक्रिया के साथ शोधकर्ता प्रदान करते हैं और वेक्टर मच्छरों और अन्य कीड़ों के खिलाफ ब्याज।

Introduction

मलेरिया दुनिया में कीट से संबंधित मौतों की संख्या सबसे ज्यादा के लिए जिम्मेदार है। एक अनुमान के अनुसार 219 मिलियन मामलों में मुख्य रूप से अफ्रीका एक में लगभग 660,000 लोगों की मृत्यु, जिसके परिणामस्वरूप में दुनिया भर में प्रतिवर्ष होते हैं। ठोस प्रयासों के बावजूद, मलेरिया कार्यक्रमों कई चुनौतियों का सामना करना पड़ता है। कीटनाशी इलाज किया bednets और कार्यक्रम के इनडोर अवशिष्ट छिड़काव प्रपत्र प्रमुख घटक, स्थानीय आबादी में कीटनाशकों के लिए प्रतिरोध इन प्रयासों दो बाधित है। कीटनाशक प्रतिरोधी मच्छर आबादी में तेजी से वृद्धि काफी हद तक अपने वातावरण में परिवर्तन करने के लिए जल्दी से अनुकूलित और विभिन्न niches 3,4,5 शोषण करने के लिए मलेरिया मच्छरों की क्षमता के लिए जिम्मेदार ठहराया है। कीटनाशक प्रतिरोध के मौजूदा तंत्र पर काबू पाने के लिए, उपन्यास कीटनाशक लक्ष्य और अगली पीढ़ी के यौगिकों का अन्वेषण warranted है। मलेरिया मीटर की विभिन्न जीवन चरणों पर प्रयोगात्मक कीटनाशकों की प्रभावकारिता का निर्धारण करने के लिए एक सरल, कदम-दर-कदम प्रोटोकॉलosquitoes काफी इन प्रयासों में वृद्धि होगी।

सेल लाइनों और पशु मॉडल पर दवा प्रभाव के औषधीय अध्ययन कोशिकाओं और जीवों की आनुवंशिकी और शरीर विज्ञान नियमन के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में epigenetic दवाओं के प्रयोग की स्थापना की है। डीएनए मेथिलिकरण और हिस्टोन संशोधन अंतर्निहित डीएनए अनुक्रम 6 बदलने के बिना बहुकोशिकीय जीवों में जीन की अभिव्यक्ति को प्रभावित करने वाले दो epigenetic तंत्र हैं। ऐसे मिथाइलेशन के रूप में पोस्ट translational संशोधनों सेलुलर अखंडता और जीन की अभिव्यक्ति को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और कई मौलिक प्रक्रियाओं 7,8,9 प्रभावित कर सकता है। कुछ कीट प्रजातियों में रिसर्च oogenesis शामिल प्रक्रियाओं में epigenetics के महत्व पर प्रकाश डाला और सेल रखरखाव 10, साथ ही खुराक मुआवजा 11 स्टेम किया है। हालांकि, इस रोग वैक्टर में इस तरह के पहलुओं को अभी तक पता लगाया जाना है। मच्छरों में इस प्रणाली को व्यवस्थित करना एक यौगिक का प्रयोग करने में हमारे साथ उपलब्ध करा सकता हैउपन्यास कीटनाशक लक्ष्य रास्ते में जगहें। 3-Deazaneplanocin ए (DZNep) के कैंसर के विभिन्न प्रकारों पर प्रभाव 12,13,14,15,16 अध्ययन किया गया है जो एक ज्ञात हिस्टोन मिथाइलेशन अवरोध करनेवाला है। DZNep परोक्ष रूप से हिस्टोन लाइसिन एन -methyltransferase रोकता है कि एक स्थिर पानी में घुलनशील epigenetic दवा (EZH2), स्तनधारी कोशिकाओं में polycomb दमनकारी जटिल 2 (PRC2) का एक घटक है। PRC2 बहुकोशिकीय जीवों में स्टेम कोशिकाओं के विकास को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और हिस्टोन मिथाइलेशन PRC2 मध्यस्थता जीन मुंह बंद करने का एक महत्वपूर्ण पहलू है। Immunocompromised चूहों में, DZNep साथ पूर्व इलाज कोशिकाओं 17 कम tumorigenic होना दिखाया गया है। यह दवा ऐसे EZH2 18 फंसा है, जिसमें गैर शराबी फैटी लीवर रोग, के रूप में अन्य रोगों, अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है। DZNep एक स्थापित एस -adenosylhomocysteine ​​(एसएएच) hydrolase अवरोध करनेवाला 19, 20 है। एक में एसएएच hydrolase परिणामों के निषेधएसएएच के संचय और, बारी में, उपलब्ध मिथाइल दाता समूहों को सीमित करके मिथाइल गतिविधि के निषेध के लिए जाता है। एसएएच उनके चयापचय मार्ग में कीड़े, सहित कई जीवों द्वारा उपयोग एक एमिनो एसिड व्युत्पन्न है। एक ताजा अध्ययन में diapause प्रभावित और कीड़े 21 में विकास देरी हो सकती है कम मात्रा में है कि DZNep दिखाया गया है।

इधर, मच्छरों के विभिन्न जीवन चरणों पर एक पानी में घुलनशील यौगिक के प्रभाव की जांच करने के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल विकसित की है। इस प्रोटोकॉल के तीन भागों अपरिपक्व मच्छरों, वयस्क रक्त-खिला महिलाओं, और वयस्क नर और मादा मच्छरों के एंजाइम की गतिविधि पर एक पानी में घुलनशील यौगिक के प्रभाव की जांच के लिए निर्देश शामिल हैं। सबसे पहले, DZNep अपरिपक्व मच्छर विकास और अस्तित्व का अध्ययन करने के लिए पानी में भंग कर रहा है। यह दवा जोखिम में दस गुना वृद्धि से उत्पन्न होने वाली किसी भी मतभेदों की तुलना करने के लिए दो सांद्रता में किया जाता है। वयस्क मादा मच्छर, DZNep पर दवा के प्रभाव का पता लगाने के लिएdefibrillated भेड़ खून करने के लिए कहा और महिलाओं को कृत्रिम रूप से रक्त खिलाया जाता है। इसके बाद, उपजाऊपन पर दवा के परिणाम की जांच कर रहा है। अंत में, एक एंजाइम की गतिविधि परख वयस्क नर और मादा मच्छरों में एसएएच hydrolase निषेध पर DZNep के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए एक संकेत के रूप 5,5'-dithiobis- (2-nitrobenzoic एसिड) (DTNB) का उपयोग किया जाता है। इस प्रोटोकॉल एक मलेरिया मच्छर, एनोफ़ेलीज़ gambiae के साथ विकसित की है, यह आसानी से मच्छर या अन्य कीड़ों की किसी भी प्रजाति पर ब्याज की यौगिकों के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में विस्तृत तकनीक कुशलता से पानी या जलीय मीडिया में सीमित या कोई घुलनशीलता के साथ एक दवा के लिए लागू नहीं किया जा सकता है।

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Protocol

नोट: प्रोटोकॉल के तीन भागों लार्वा मच्छर, उपजाऊपन के अपने प्रभाव का अध्ययन करने के लिए वयस्क महिलाओं को DZNep की एक रक्त आधारित प्रदर्शन करने के लिए DZNep दवा के जलीय लोगों तक पहुंचाने का वर्णन है, और DZNep द्वारा एसएएच hydrolase निषेध एक साधारण वर्णमिति तकनीक का उपयोग करके मापा। इन assays का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्र 1 में दिखाया गया है।

1. अपरिपक्व मच्छर विकास और उत्तरजीविता Assays

नोट: इस खंड मच्छर लार्वा विकास और अस्तित्व को प्रभावित करता है कि एक पानी में घुलनशील दवा के उपयोग बताते हैं।

  1. हैच ए 28 डिग्री आसुत जल में सी (DH 2 ओ) और पीछे उन्हें 2 एन डी instar लार्वा पर ​​gambiae अंडे।
  2. एक छह अच्छी तरह से DNase, RNase मुक्त सेल संस्कृति की थाली ले लो और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 10 मिलीलीटर DH 2 हे डालना।
  3. 2 एन डी instar पर मच्छर लार्वा का चयन करें और अच्छी तरह से प्रति 15 लार्वा जोड़ें। थाली करने के लिए 2 एन डी instar लार्वा जोड़ने से पहले, पीअतिरिक्त पानी निकालने के लिए 2-3 सेकंड के लिए एक कागज तौलिया पर उन्हें ut।
  4. रंग कोडित टेप के साथ लेबल कुओं प्रयोग randomize करने के लिए। प्रत्येक प्लेट (चित्रा 2) पर परीक्षण एकाग्रता प्रति दो कुओं लेबल।
  5. DH 2 ओ के 1 मिलीलीटर में 0.3 मिलीग्राम DZNep भंग करके एक 1 मिमी DZNep हाइड्रोक्लोराइड (मेगावाट = 298.73) स्टॉक समाधान तैयार 0.5 माइक्रोन और 5.0 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने में लेबल वेल्स को DZNep.HCl का जायजा समाधान जोड़ें।
    नोट: शेयर समाधान 4 में संग्रहित किया जा सकता है अल्पावधि (एक महीने के लिए 1 दिन) या -20 के लिए सी ° लंबी अवधि (अब से एक महीने) के लिए डिग्री सेल्सियस।
    नोट: इस aforementioned सांद्रता के लिए स्टॉक समाधान के अलावा काफी कुओं में पानी की मात्रा में परिवर्तन नहीं होगा। हालांकि बहुत उच्च सांद्रता के मामले में, यह परिसर के किसी भी अनावश्यक कमजोर पड़ने से बचने के लिए लार्वा माध्यम में यौगिक भंग करने की सलाह दी जाती है।
  6. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए परत मछली भोजन के बराबर राशि जोड़ें। प्लेट कवरएस और 28 में उन्हें सेते एक मशीन में सी °।
  7. एक 24 घंटा जोखिम अवधि के बाद DZNep इलाज और इलाज लार्वा मच्छरों के लिए मृत्यु दर रिकॉर्ड है। निकालें और किसी भी मर लार्वा त्यागें। सभी लार्वा मरने तक हर दिन इस रिकॉर्डिंग दोहराने या कोषस्थ कीट धारण करना और वयस्कों के रूप में उभरेगा। वे कोषस्थ कीट धारण करना, जब तक लार्वा का आकार हर दूसरे दिन, यानी, दिन 0, 2, 4, 6, 8 रिकार्ड।
  8. एक पर्याप्त सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग लार्वा विकास और मृत्यु दर डेटा का विश्लेषण।
    ध्यान दें: एक बार ग्राफ माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल में मृत्यु दर डेटा का प्रतिनिधित्व करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। विचरण के बहुभिन्नरूपी विश्लेषण (MANOVA) दवा के विभिन्न खुराक मच्छर लार्वा की काफी अलग अस्तित्व में परिणाम अगर खोलेगा ऐसे जेएमपी या SPSS के रूप में एक सॉफ्टवेयर के साथ प्रदर्शन किया।

मादा मच्छर के कृत्रिम फीडर के माध्यम से दवा प्रशासन द्वारा 2. उपजाऊपन परख

नोट: इस खंड रक्त एक दवा के अलावा विवरणएन डी एक कृत्रिम फीडर सिस्टम का उपयोग कर वयस्क मादा मच्छर को खिला।

  1. नियंत्रण और परीक्षण पिंजरे के लिए पुरुष और महिला मच्छरों की समान संख्या के साथ वयस्क मच्छर पिंजरों सेट करें। महिलाओं तक पिंजरों दोनों को कपास गेंदों में भिगो 10% चीनी समाधान प्रदान करें (3-5 दिनों एनोफ़ेलीज़ gambiae के लिए इष्टतम है) को खिलाने के लिए तैयार हैं।
  2. 2 घंटा पूर्व रक्त खिलाने के लिए, महिलाओं के भूखे हैं सुनिश्चित करने के लिए कपास गेंदों को हटा दें।
  3. एक औंधा विस्तृत नीचे कांच कीप (व्यास = 50 मिमी, लंबाई = 70 मिमी) और औद्योगिक गोंद के साथ बंद एक आसपास के प्लास्टिक से मिलकर बनता है कि दो कृत्रिम रक्त भक्षण इकट्ठे। प्रवाह और पानी का बहिर्वाह के लिए कनेक्टर्स के माध्यम से दो फीडरों 'आउटलेट (व्यास = 10 मिमी) के लिए प्लास्टिक की ट्यूब (व्यास = 7 मिमी) संलग्न। "नियंत्रण" और के रूप में दो फीडरों लेबल "5 माइक्रोन DZNep।"
  4. खिलाने के लिए कार्यक्रम निर्धारित करते हैं, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हीटिंग तत्व का उपयोग करना। "मेनू" में "सेटिंग" जानाऔर "setpoints" का चयन करें; प्रीलोडेड कार्यक्रमों में दिखाई देगा। "SP1 के" का चयन करें और 37 के लिए तापमान सेट सी।
    नोट: हीटिंग तत्व प्रशासित रक्त एक निरंतर तापमान पर बनाए रखा है कि यह सुनिश्चित करता है। अतिरिक्त कार्यक्रम सेटिंग्स अलग मच्छर या कीट प्रजातियों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  5. पानी के साथ एक बाल्टी भरने और पानी में हीटिंग तत्व विसर्जित कर दिया।
  6. Parafilm का एक चौकोर टुकड़ा (50 मिमी x 50 मिमी) में कटौती और एक पतली झिल्ली फिल्म बनाने के लिए यह खिंचाव। Parafilm के साथ कृत्रिम भक्षण के नीचे कवर। Parafilm (50 मिमी x 10 मिमी) का एक टुकड़ा काट, यह खिंचाव और भक्षण के किनारों सील।
  7. ट्यूब द्वारा भक्षण और हीटिंग तत्व जोड़ने, प्रणाली को इकट्ठा। एक बार जब पूरा, प्रणाली पर स्विच और "SP1 के" का चयन करें। प्रेस प्रणाली शुरू करने के लिए "Enter"।
    नोट: पानी 37 पर गरम मिलेगा सी ° और उस तापमान पर बनाए रखा।
  8. वें मॉनिटरपानी की बाल्टी में एक थर्मामीटर का उपयोग पानी के ई तापमान।
    नोट: कनेक्टर्स और ट्यूबों रक्त का तापमान 37 पर रहता है तो यह है कि इस प्रणाली के माध्यम से पानी की एक निरंतर परिसंचरण बनाए रखने में मदद सी।
  9. किसी भी खून फैल शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा जो 10% ब्लीच समाधान के साथ एक फ्लैट नीचे ट्रे भरें।
  10. एक microcentrifuge ट्यूब defibrillated भेड़ के खून के 2 मिलीलीटर जोड़ें। "नियंत्रण" के रूप में इस लेबल। "5 माइक्रोन DZNep" "5 माइक्रोन DZNep" लेबल प्रयोगात्मक ट्यूब DZNep शेयर समाधान (1.5 कदम देखें) की .Add 6 μl के रूप में चिह्नित प्रयोगात्मक ट्यूब के लिए प्रक्रिया को दोहराएं धीरे इसे कई बार inverting द्वारा रक्त और नशीली दवाओं के मिश्रण। आरटी पर ट्यूब 10 मिनट सेते हैं।
  11. एक विंदुक का प्रयोग, तदनुसार लेबल वाले फीडरों के शीर्ष पर नियंत्रण और परीक्षण रक्त के 2 मिलीलीटर जोड़ें। ब्लीच समाधान में पिपेट त्यागें। एक काले बैग के साथ पिंजरे कवर और एफ प्रोत्साहित करने के लिए समय-समय पर पिंजरे पर हवा में सांस लेनेखिलाने के लिए emales।
  12. मच्छरों लगभग 30 मिनट के लिए फ़ीड करते हैं। खिला पूरा हो गया है एक बार, भक्षण बाहर ले, हीटिंग तत्व स्विच बंद और parafilm पट्टी। के बारे में 5 मिनट के लिए ब्लीच समाधान में फीडर लेना और विआयनीकृत पानी में अच्छी तरह कुल्ला।
  13. भक्षण निकालें और 48 घंटे के लिए पिंजरों पर चीनी पानी के साथ कपास गेंदों डाल दिया। अंडा बिछाने की सुविधा के लिए रात भर पिंजरों में पानी और फिल्टर पेपर से युक्त एक अंडा पकवान रखें। संबंधित परीक्षण या नियंत्रण एकाग्रता के साथ प्रत्येक अंडे पकवान लेबल।
  14. एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के नीचे अंडे की संख्या और संरचना अगले दिन अंडा पकवान निकालें और जांच करते हैं। क्यू colors5 सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों प्राप्त करते हैं। अंडे की संख्या की गणना। परीक्षण और नियंत्रण पिंजरों से प्राप्त अंडे की संख्या में अंतर का विश्लेषण करें।
    नोट: एक unpaired टी परीक्षण अंडे की संख्या (पी ≤0.05) काफी अलग हैं, तो यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

मच्छर एनजाइम निषेध की 3. बायोकेमिकल परखदवा से

नोट: इस खंड में वयस्क नर और मादा मच्छरों में एसएएच hydrolase निषेध पर DZNep के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए एक संकेत के रूप DTNB का उपयोग कर एक एंजाइम गतिविधि परख का वर्णन है।

  1. DH 2 ओ के 1 एल HPO 4 ना 2 के 14.19 छ जोड़कर एक 0.1 एम ना 2 HPO 4 (द्विक्षारकीय सोडियम फास्फेट) समाधान तैयार अगला, DH 2 ओ के 1 एल के लिए पीओ 4 नाह 2 के 13.79 छ जोड़कर एक 0.1 एम नाह 2 पीओ 4 (अकेले आधार सोडियम फास्फेट) समाधान तैयार
  2. पीएच 8.5 0.1 एम नाह 2 पीओ 4 समाधान के साथ 0.1 एम ना 2 HPO 4 समाधान टाइट्रेट।
    नोट: यह 0.1 एम ना 2 HPO 4 (पीएच 8.5) का काम कर शेयर समाधान हो जाएगा।
  3. 0.3% ट्राइटन X-100 जोड़कर 0.1 एम ना 2 HPO 4 (पीएच 8.5) के एक homogenization के समाधान तैयार है।
    नोट: homogenization के समाधान 4 ओ सी पर संग्रहित किया जा सकता है
  4. पीआरepare 0.1 एम ना 2 HPO 4 (पीएच 8.5) के 10 एमएल में एसएएच की 6.15 मिलीग्राम भंग करके एक 1.6 मिमी एसएएच (मेगावाट = 384.4) समाधान।
  5. 0.1 एम ना 2 HPO 4 (पीएच 8.5) के 10 एमएल में DTNB की 6.3 मिलीग्राम भंग करके एक 1.6 मिमी DTNB (मेगावाट = 396.4) समाधान तैयार है। उपयोग करें जब तक बर्फ पर ताजा DTNB समाधान रखें।
  6. 1ml DH 2 ओ में DZNep के 0.3 मिलीग्राम भंग करके एक 1 मिमी DZNep.HCl (मेगावाट = 298.73) समाधान तैयार अगला, DH 2 ओ में 0.002 माइक्रोन के लिए 1000 माइक्रोन से सांद्रता की एक श्रृंखला में 1 मिमी DZNep समाधान पतला
  7. DZNep द्वारा एसएएच hydrolase निषेध मापने के लिए, मच्छरों के एक कच्चे एंजाइम निकालने को तैयार: ठंडा 0.1 एम नाह 2 पीओ 4 (पीएच 8.5), जिसमें 0.3% ट्राइटन एक्स के 1 मिलीलीटर में 10 गैर खून से सिंचित वयस्क मच्छरों homogenize 100, एक गिलास ऊतक homogenizer का उपयोग कर। एक 1.5ml microcentrifuge ट्यूब homogenate स्थानांतरण।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10,000 XG पर 5 मिनट के लिए homogenate अपकेंद्रित्र। एक साफ करने के लिए सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब। एसएएच जैव रासायनिक परख के लिए एंजाइम स्रोत के रूप में सतह पर तैरनेवाला का प्रयोग करें।
  9. रिक्त उपचार के लिए (यानी, कोई DZNep, कोई एंजाइम), 50 μl 1.6 मिमी साह, 50 μl 1.6 मिमी DTNB, और 100 से जोड़ने μl 0.1 एम ना 2 HPO एक 96 अच्छी तरह से व्यक्तिगत कुओं के लिए 4 (पीएच 8.5), फ्लैट नीचे microplate।
  10. नियंत्रण (यानी, कोई DZNep) के लिए, 50 μl 1.6 मिमी साह, 50 μl 1.6 मिमी DTNB जोड़ने के लिए, 50 μl 0.1 एम ना 2 HPO 4 (पीएच 8.5) और 50 μl एंजाइम अलग-अलग करने के लिए (एसएएच hydrolase कच्चे तेल निकालने से प्राप्त) कुओं।
  11. DZNep उपचार के लिए, 50 μl 1.6 मिमी साह, 50 μl 1.6 मिमी DTNB, व्यक्तिगत कुओं के लिए 50 μl एंजाइम और 50 μl चयनित DZNep एकाग्रता जोड़ें। उपचार और नियंत्रण के प्रति 4 प्रतिकृति तैयार करें।
  12. एक 96 अच्छी तरह से microplate रीडर का उपयोग कर 20 सेकंड के अंतराल पर 5 मिनट के लिए 405 एनएम पर एसएएच एंजाइम नमूने के ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) पढ़ें।
  13. नियंत्रण एक से रिक्त आयुध डिपो घटाएँएन डी उपचार आयुध डिपो में अच्छी तरह से प्रत्येक से प्राप्त की। निम्न समीकरण का उपयोग एसएएच hydrolase गतिविधि शेष प्रतिशत की गणना:% अवशिष्ट गतिविधि = (उपचार आयुध डिपो / नियंत्रण आयुध डिपो) 100 x।

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Representative Results

चित्रा 1 assays के एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व है; यह इस आलेख में सूचीबद्ध प्रक्रिया के विभिन्न चरणों का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल मच्छरों के विभिन्न जीवन चरणों पर आधारित है, यहाँ विस्तृत प्रयोगों के लिए पीछा किया जा करने के लिए कोई विशेष क्रम है। उपयोगकर्ता नमूना उपलब्धता पर निर्भर करता है, एक ही समय में एक या एक से अधिक assays के संचालन करने के लिए चुन सकते हैं।

चित्रा 2 अपरिपक्व मच्छर विकास और उत्तरजीविता assays के लिए स्थापित की थाली को दर्शाता है। परीक्षण सांद्रता और प्रतिकृति की संख्या उपयोगकर्ता की आवश्यकताओं और नशीली दवाओं की उपलब्धता के आधार पर बदला जा सकता है। अपरिपक्व मच्छर परख के लिए, DZNep की 1 मिमी शेयर समाधान 0.5 माइक्रोन और एक दवा मुक्त आबादी युक्त कुओं के साथ एक नियंत्रण पैन के साथ साथ 5 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए मच्छरों से युक्त पानी के लिए जोड़ा गया है। प्रयोग का प्रदर्शन किया है कि अधिक लार्वा और pupae survDZNep इलाज कुओं में से नियंत्रण कुओं में ived।

चित्रा 3 प्रयोग के दौरान मलेरिया मच्छरों के समग्र उत्तरजीविता पर DZNep के प्रभाव को दर्शाया गया है। परिणाम epigenetic दवा DZNep वृद्धि और विकास को दबा और अपरिपक्व मच्छरों की मृत्यु दर को प्रेरित करता है कि प्रदर्शित करता है। 5 माइक्रोन से अवगत कराया व्यक्तियों की एक बड़ी संख्या में इसके विपरीत दिन 8 से मृत्यु हो गई, जबकि 0.5 माइक्रोन से अवगत कराया मच्छर का बहुमत है, प्रयोग के दिन 10 से मृत्यु हो गई, नियंत्रण उपचार (कोई दवा) में मच्छरों की मृत्यु दर बने अप्रभावित और कई प्रयोग के दिन 8 पर वयस्कों के रूप में उभरा। एक उलटा संबंध दवा एकाग्रता और मच्छर शरीर के आकार (चित्रा 4) के बीच मनाया गया।

चित्रा 5 मच्छर उपजाऊपन पर DZNep के प्रभाव दिखाता है। रक्त DZNep युक्त से तंग आ चुके वयस्क मादा मच्छर एक महत्वपूर्ण रिडक्शियो का प्रदर्शनएन व्यवहार्य अंडे की संख्या में। चित्रा 5A नियंत्रण पिंजरे (कोई दवा) से प्राप्त अंडे से पता चलता है। चित्रा 5 ब परीक्षण पिंजरे से प्राप्त अंडे से पता चलता है। परीक्षण पिंजरे से प्राप्त अंडे की एक बड़ी संख्या में गहरे रंग में थे और सामान्य रक्त से सिंचित मादा मच्छर (चित्रा 6) से प्राप्त अंडे की तुलना में तैरता (exochorion की हवा से भरे विस्तार) का अभाव है। गहरे रंग अंडे के साथ तैरता के अभाव exochorion गठन में epigenetics की संभावित भूमिका को इंगित करता है।

चित्रा 7 वयस्क पुरुष और महिला मलेरिया मच्छरों में एसएएच hydrolase गतिविधि पर DZNep के प्रभाव को दर्शाता है। आयुध डिपो में एक DZNep-निर्भर कमी DZNep एसएएच hydrolase गतिविधि को रोकता है जो बताता है कि नियंत्रण उपचार (कोई दवा) की तुलना में प्रत्येक दवा के इलाज के लिए मनाया जाता है।

चित्रा 1 चित्रा 1:। मलेरिया मच्छरों पर एक epigenetic दवा का उपयोग assays के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व योजना के बाएं हिस्से अपरिपक्व मच्छरों का उपयोग कर विकास और उत्तरजीविता assays के पता चलता है। मध्य भाग वयस्क महिलाओं को दवा रक्त-खिलाने के माध्यम से उपजाऊपन परख को दर्शाता है। सही हिस्सा दवा से एंजाइम अवरोध के जैव रासायनिक परख दर्शाया गया है।

चित्रा 2
चित्रा 2: प्लेट अपरिपक्व मच्छर विकास और उत्तरजीविता परख चित्रण "सी" के निशान नियंत्रण कुओं लेबल।। लेबल "0.5" 0.5 माइक्रोन DZNep साथ कुओं से पता चलता है। लेबल "5" 5 माइक्रोन DZNep साथ कुओं को इंगित करता है।

चित्रा 3
चित्रा 3: मलेरिया मच्छरों की उत्तरजीविता पर DZNep का प्रभाव। एकाग्रता पर निर्भर मृत्यु दर अपरिपक्व मच्छरों के साथ मनाया जाता है।

चित्रा 4
। चित्रा 4:।। 0.5 माइक्रोन DZNep (आकार = 4 मिमी) (सी) के लार्वा के साथ इलाज किया अपरिपक्व मच्छरों के विकास पर DZNep का प्रभाव (ए) के नियंत्रण उपचार (आकार = 5 मिमी) से लार्वा (बी) के लार्वा 5 के साथ इलाज माइक्रोन DZNep (आकार = 3 मिमी)। सभी लार्वा प्रयोग के एक ही दिन पर मापा गया।

चित्रा 5
चित्रा 5:। नियंत्रण उपचार से मच्छर उपजाऊपन अंडा व्यंजन पर DZNep का प्रभाव (कोई दवा) मच्छरों अंडे की बहुत अधिक से अधिक संख्या में शामिल (ए) कंपनियों5 माइक्रोन DZNep (बी) के साथ इलाज महिलाओं का अंडा व्यंजन के साथ लाल।

चित्रा 6
चित्रा 6: एक खुर्दबीन के नीचे देखा मलेरिया मच्छरों में अंडा संरचना पर DZNep का प्रभाव। नियंत्रण उपचार से (ए) अंडे (कोई दवा) मच्छरों मंगाई और थाली की तरह विधानसभाओं। (बी) के अंडे तैरता है और थाली की तरह विधानसभाओं की कमी DZNep 5 माइक्रोन के साथ इलाज मच्छरों से प्रदर्शित करते हैं।

चित्रा 7
चित्रा 7:। मलेरिया मच्छरों में DZNep द्वारा एसएएच hydrolase निषेध DZNep नियंत्रण उपचार (कोई दवा) के साथ तुलना में आयुध डिपो में कमी का कारण बनता है।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल के सफल आवेदन के लिए महत्वपूर्ण कई कदम उठाए हैं। लार्वा परख के लिए, देखभाल सही ढंग से लेबल और प्रत्येक परीक्षा एकाग्रता को दोहराने के लिए लिया जाना चाहिए। परीक्षण के नमूने randomizing और संबंधित परीक्षण वेल्स को दवा के नामित राशि जोड़ने के लिए स्थापित इस प्रयोगात्मक का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है। एक 96 अच्छी तरह से microplate के लिए 2 एन डी instar मच्छर लार्वा जोड़ने से पहले, प्रत्येक लार्वा अतिरिक्त पानी निकालने के लिए 2-3 सेकंड के लिए एक कागज तौलिया पर रखा जा सकता है। सुखाना रोकने के लिए, लार्वा तुरंत संदंश की एक कुंद जोड़ी का उपयोग microplate वेल्स को स्थानांतरित किया जाना चाहिए। यह अच्छी तरह से प्रत्येक microplate में पानी की मात्रा सुनिश्चित करता है और उद्देश्य के रूप में दवा की एकाग्रता बनी हुई है। उनके शरीर की लंबाई मापने के लिए लार्वा के हस्तांतरण है, यह स्थिर रखने के लिए उन्हें क्रम में कुछ मिनट के लिए बर्फ पर लार्वा डाल करने के लिए सिफारिश की है। एक अलग यौगिक के लिए इस प्रोटोकॉल आदत डाल करते हैं, देखभाल प्रत्येक में जोड़ा शेयर समाधान की राशि का निर्धारण करने के लिए लिया जाना चाहिएवेल। ऐसे मामलों में, यह सीधे से पहले अच्छी तरह से प्रत्येक microplate में लार्वा को जोड़ने के लिए पानी में यौगिक की गणना की राशि भंग करने के लिए बेहतर हो सकता है।

रक्त खिला assays के लिए, यह मच्छरों के प्रयोग के पहले चीनी पानी में कम से कम दो घंटा हटाने के द्वारा उचित रूप से भूखे हैं कि महत्वपूर्ण है। ऐसा करने में विफलता अधूरा खिलाने और वयस्क मादा अंडा उत्पादन पर थोड़ा प्रभाव में हो सकता है। DZNep भंग करने के कुछ ही मिनट लगते रूप में पूरी तरह से मिश्रण है और रक्त में दवा के समान वितरण, साथ ही एक महत्वपूर्ण कदम है। दवा इलाज किया रक्त तुरंत खिलाया जाता है, तो DZNep समान रूप से मच्छर सिस्टम में वितरित नहीं मिलता है। यह जोरदार defibrillated रक्त बेहतर परिणाम के लिए (निष्कर्षण तारीख के बाद से एक सप्ताह से भी कम यानी) ताजा है कि सिफारिश की है।

ब्याज की एक परिसर के साथ एक जैव रासायनिक परख की सफलता के लिए महत्वपूर्ण कई कदम उठाए हैं। इस आद्य में इस्तेमाल प्रत्येक शेयर के समाधान की सांद्रता कर्नल DZNep के लिए अनुकूलित किया गया है। एक अलग यौगिक के लिए प्रोटोकॉल के लिए अनुकूलित करने के लिए, हम विभिन्न पीएच की एक श्रृंखला के परीक्षण का सुझाव देते हैं, साह, DTNB सांद्रता और कीट नमूना आकार सबसे विश्वसनीय परिणाम निर्धारित करने के लिए। कच्चे तेल एंजाइम निकालने की तैयारी इस प्रक्रिया में सबसे अधिक समय लेने कदम है। Homogenate तैयारी के दौरान यह absorbance के पढ़ने में बाधा हो सकती सतह पर तैरनेवाला में मौजूद लिपिड के रूप में, नहीं 10 से अधिक वयस्क मच्छरों का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है। इस समस्या से बचने के लिए, (एक चैनल micropipette का उपयोग) पर तैरनेवाला में लिपिड के ऊपर परत कदम 3.8 के बाद हटाया जा सकता है। सतह पर तैरनेवाला एक स्वच्छ microfuge ट्यूब को हस्तांतरित किया जाना चाहिए। चरण 3.8 किसी भी शेष चिपचिपा लिपिड त्यागने के लिए दोहराया जाना चाहिए। शेष स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला सभी ट्यूबों से जमा और धीरे से मिलाया जाना चाहिए। एक मल्टी चैनल पिपेट कुओं में एसएएच जोड़ने के लिए वृद्धि की दक्षता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। DTNB परख में एक संकेतक के रूप में प्रयोग किया जाता है, और पिछले तैयार है और बर्फ पर रखा जाना चाहिए।

NT "> इस प्रोटोकॉल मच्छरों के विभिन्न जीवन चरणों पर एक यौगिक के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए सरल कदम के साथ उपयोगकर्ता प्रदान करता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए कुछ सीमाएं हैं। यह तकनीक DZNep का पानी घुलनशीलता पर मुख्य रूप से निर्भर करता है, वहाँ रहे हैं। अपरिपक्व लार्वा उनके आसपास के मीडिया में भंग दवा के संपर्क में हैं। यौगिक परीक्षण किया जा रहा है तो जलीय मीडिया में अघुलनशील है, यह इस प्रोटोकॉल कम कुशल प्रस्तुत करना हो सकता है। उपजाऊपन परीक्षण के लिए, हम defibrillated भेड़ रक्त में भंग दवा के लिए वयस्क महिलाओं अधीन है। यह एक प्रयोगशाला (यानी, मच्छरों को खिलाने के लिए चूहों या गिनी सूअरों का उपयोग करता है) सीधे स्तनधारी रक्त पर मच्छर कालोनियों rears अगर संभव नहीं होगा।

इस लेख में विस्तृत अलग assays के संयोजन कीड़ों पर एक पानी में घुलनशील यौगिक के प्रभाव के परीक्षण के एक उपन्यास के तरीके के साथ उपयोगकर्ता प्रदान करता है। DZNep ज्यादातर कैंसर अनुसंधान के लिए इन विट्रो में सेल लाइनों से जोड़ा जाता है; हालांकि, इस प्रोटोकॉल यू के लिए सक्षम बनाता हैसेवा विवो में एक कीट के विभिन्न जीवन चरणों पर कोई प्रभाव की जांच करने के लिए। इसके अलावा, यह भी विषाक्तता assays के लिए कदम-दर-कदम दिशा निर्देशों के साथ शोधकर्ता प्रदान करता है। वर्तमान साहित्य में, ज्ञान कीड़ों पर epigenetic दवाओं के प्रभाव के संबंध में सीमित है। एक उदाहरण के रूप DZNep का उपयोग करना, हम संभावित कीट नियंत्रण एजेंट के रूप में अन्य epigenetic दवाओं या उपन्यास यौगिकों की खोज की दिशा में एक पूर्व अपेक्षित कदम के रूप में उपयोग किया जा सकता है कि एक प्रक्रिया प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल मलेरिया मच्छर के लिए विकसित की है, यद्यपि यह DZNep के प्रभाव, या अन्य मच्छर या कीट प्रजातियों में ब्याज की किसी भी पानी में घुलनशील यौगिक, परीक्षण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well microplate Fisher Scientific 12565561
Cell culture plate CytoOne CC7682-7506
Centrifuge Sorvall Fresco 76003758 A different centrifuge can be used
Colored tape rolls Fisher S68134
Dissection microscope Olympus SZ
DTNB Sigma Aldrich D8130
DZNep.HCl Sigma Aldrich SMLO305
Egg dish cups
Filter papers Fisher 09-795E
Glass feeders Virginia Tech
Glass tissue homogenizer
Heating element Fisher Scientific NC0520091
Incubator Percival scientific I36VLC8 A different incubator can be used
Microcentrifuge tube, 2 ml Axygen 22-283
Microcentrifuge tube, 1.5 ml Axygen MCT-150-C
Micropipette Eppendorf 4910 000.069
Na2HPO4 Fisher Scientific M-3154
NaH2PO4 Fisher Scientific M-8643
pH meter  Mettler Toledo 7easy S20
Plate reader Spectramax M2
SAH Sigma Aldrich A9384 store at -20 °C
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787

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References

  1. CDC Report. , Available from: http://www.cdc.gov/malaria (2010).
  2. Gatton, M. L., et al. The importance of mosquito behavioural adaptations to malaria control in Africa. Evolution; International Journal of Organic Evolution. 67, 1218-1230 (2013).
  3. Sternberg, E. D., Thomas, M. B. Local adaptation to temperature and the implications for vector-borne diseases. Trends in Parasitology. , (2014).
  4. Rocca, K. A., Gray, E. M., Costantini, C., Besansky, N. J. 2La chromosomal inversion enhances thermal tolerance of Anopheles gambiae larvae. Malaria Journal. 8, 147 (2009).
  5. Coluzzi, M., Sabatini, A., Petrarca, V., Di Deco, M. A. Chromosomal differentiation and adaptation to human environments in the Anopheles gambiae complex. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73, 483-497 (1979).
  6. Donepudi, S., Mattison, R. J., Kihslinger, J. E., Godley, L. A. Update on Cancer Therapeutics. Science Direct. 2 (4), 157-206 (2007).
  7. Greer, E. L., Shi, Y. Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance. Nature Reviews. Genetics. 13, 343-357 (2012).
  8. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  9. Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
  10. Clough, E., Tedeschi, T., Hazelrigg, T. Epigenetic regulation of oogenesis and germ stem cell maintenance by the Drosophila histone methyltransferase Eggless/dSetDB1. Developmental Biology. 388, 181-191 (2014).
  11. Conrad, T., Akhtar, A. Dosage compensation in Drosophila melanogaster: epigenetic fine-tuning of chromosome-wide transcription. Nature Reviews. Genetics. 13, 123-134 (2011).
  12. Miranda, T. B., et al. DZNep is a global histone methylation inhibitor that reactivates developmental genes not silenced by DNA methylation. Molecular Cancer Therapeutics. 8, 1579-1588 (2009).
  13. Cui, B., et al. PRIMA-1, a Mutant p53 Reactivator, Restores the Sensitivity of TP53 Mutant-type Thyroid Cancer Cells to the Histone Methylation Inhibitor 3-Deazaneplanocin A (DZNep). J. Clin. Endocrinol. Metab. 99 (11), E962 (2014).
  14. Fujiwara, T., et al. 3-Deazaneplanocin A (DZNep), an inhibitor of S-adenosyl-methionine-dependent methyltransferase, promotes erythroid differentiation. The Journal of Biological Chemistry. , (2014).
  15. Li, Z., et al. The polycomb group protein EZH2 is a novel therapeutic target in tongue cancer. Oncotarget. 4, 2532-2549 (2013).
  16. Nakagawa, S., et al. Epigenetic therapy with the histone methyltransferase EZH2 inhibitor 3-deazaneplanocin A inhibits the growth of cholangiocarcinoma cells. Oncology Reports. 31, 983-988 (2014).
  17. Crea, F., et al. Pharmacologic disruption of Polycomb Repressive Complex 2 inhibits tumorigenicity and tumor progression in prostate cancer. Molecular Cancer. 10, 40 (2011).
  18. Vella, S., et al. EZH2 down-regulation exacerbates lipid accumulation and inflammation in in vitro and in vivo NAFLD. International Journal of Molecular Sciences. 14, 24154-24168 (2013).
  19. Tan, J., et al. Pharmacologic disruption of Polycomb-repressive complex 2-mediated gene repression selectively induces apoptosis in cancer cells. Genes & Development. 21, 1050-1063 (2007).
  20. Chiang, P. K., Cantoni, G. L. Perturbation of biochemical transmethylations by 3-deazaadenosine in vivo. Biochemical Pharmacology. 28, 1897-1902 (1979).
  21. Lu, Y. X., Denlinger, D. L., Xu, W. H. Polycomb repressive complex 2 (PRC2) protein ESC regulates insect developmental timing by mediating H3K27me3 and activating prothoracicotropic hormone gene expression. The Journal of Biological Chemistry. 288, 23554-23564 (2013).

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संक्रामक रोग अंक 95, मलेरिया मच्छर DZNep साह विषाक्तता परख epigenetics वेक्टर नियंत्रण
मलेरिया मच्छरों के विकास, उपजाऊपन और उत्तरजीविता पर एक epigenetic ड्रग के परीक्षण प्रभावों के लिए विषाक्तता Assays
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Sharma, A., Anderson, T. D.,… More

Sharma, A., Anderson, T. D., Sharakhov, I. V. Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes. J. Vis. Exp. (95), e52041, doi:10.3791/52041 (2015).

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