Summary
Bu makalede, sentezi ve nanopartiküllerin floresan etiketleme (UP) için yöntemler tarif etmektedir. NPler ökaryotik hücrelerin endo-lızozomal sistemi etiket darbe kovalayıcı deneyler uygulanmıştır. Hücre içi patojen Salmonella enterica faaliyetleri ile Endo-lizozomal sistemin Manipülasyon canlı hücre görüntüleme ve sayısal izledi.
Abstract
Arzu kimyasal, optik ve mekanik özelliklere sahip Floresan nanopartiküller (NPS) hücre içi organellere etiketlemek için umut verici araçlardır. Burada, biz ökaryotik hücrelerin Endo-lizozomal sistem etiket ve hücre içi patojen Salmonella enterica konak hücresel yolların manipülasyonları izlemek için altın BSA-rodamin NPs kullanarak bir yöntemi tanıtmak. NPS kolayca geç endozomlar / lizozomlarında HeLa hücreleri tarafından içselleştirilmiş ve lokalize edildi. Salmonella enfeksiyonu Salmonella kaynaklı zar yapılarında vezikül ve NP birikimi yeniden düzenlenmesini bağlı. Biz konfokal mikroskopi görüntüleri kantitatif analizleri için Imaris yazılım paketi dağıtmış. nesne sayısı ve enfekte olmayan hücreler içinde boyut dağılımı çok WT Salmonella endo-lızozomal sistemin yeniden modelleme gösteren Salmonella ile enfekte olan hücrelerde olanlardan çok farklıdırlar.
Introduction
Vb metal NPlerin, kuantum noktalar, polimer NPlerin, silika NP, karbon noktalar da dahil olmak üzere Floresan nanopartiküller (NPS), geçmiş yıllarda 1,2 sırasında büyük ilgi çekmiştir. Geleneksel organik boyalara kıyasla, floresan NPler gibi güçlü sinyal gücü, direnç photobleaching ve yüksek biyouyumluluk 3,4 olarak arzu kimyasal, optik ve mekanik özellikleri göstermektedir. Bu avantajlar, onları hücre içi algılama ve canlı hücre görüntüleme için tercih edilen yöntem yapmak. Ayrıca, elektron-yoğun NP çeşitli EM 5 ile ultrastrüktürel düzeyde ışık mikroskobu (LM) ve daha yüksek çözünürlükte izleme canlı hücrenin kombinasyonu tanır ilişkili mikroskopik analiz, onların kullanımını kolaylaştıran, elektron mikroskobu (EM) ile görebilir. Örneğin, altın NPler verimli bir şekilde hassas teşhisi için canlı hücreler hem de bağışıklık etiketleme 6 alanında biyosensörler olarak kullanılan uzun zaman olmuştur. Son studies farklı boyut ve şekle sahip, altın NPler hücre kuşaklarının büyük bir çeşitliliği tarafından alımı ve rutin olarak endozomal yolu ile taşıma, dolayısıyla büyük bir potansiyele olmak hücre içi vezikül taşıma takip ve endo-lızozomal sistem etiketleme uygulanmış kolaylıkla olabilir göstermektedir 7,8 .
Salmonella enterica, Shigella flexneri ve Listeria monocytogenes gibi Mikrobiyal patojenler, fagositik olmayan konak hücreleri 9 istila farklı mekanizmalar geliştirmişlerdir. Içselleştirilmiş sonra, patojenler, ya sitoplazmada lokalize veya zar-bağlı bölümlerinde tecrit, ev sahibi ortamları ile yoğun etkileşim ve kendi yaşam 10 lehine bu modüle. Örneğin, Salmonella enterica bulunduğu ve bir hücre içi phagosomal bölmesi enfeksiyonu 11 üzerine Salmonella ihtiva-eden çarpıtma (SCV) olarak adlandırılan içinde çoğaltır. olgunlaşan SCV, Golgi aygıtının doğru trafikleri endositik yolunun sürekli etkileşimleri geçiren ve Salmonella -kaynaklı filamentler olarak geniş tübüler yapılar, (SIF), neksin tübülleri sıralama, Salmonella indüklenen salgı taşıyıcı membran proteini 3 (SCAMP3) tübüller, vb oluşumunu uyarır . 12-14. Bu bakteriyel patojenler, konukçu hücre yolları değiştirme konusunda incelenmesi anlama bulaşıcı hastalık için gereklidir.
Burada, altın BSA-rodamin NPler konak hücresel endo-lizozomal sistemi etiketlemek için sıvı izleyiciler olarak kullanıldı, ve insan gastrointestinal patojen Salmonella enterica serovar Typhimurium (Salmonella) ile patojen etkileşimlerini incelemek için bir model bakteri olarak kullanıldı endositik yolu ev sahipliği. WT Salmonella ya da mutant suşları ile enfekte enfekte olmayan hücreler ve hücre içi altın BSA rodamin NPler konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ile görüntülendi.Daha sonra Imaris yazılım Salmonella enfeksiyonu endozomlar / lizozomların aşırı yeniden düzenlenmesine neden olduğunu gösteren, NP dağılımını ölçmek için kullanıldı. Bu yöntemin açıklaması ardından, benzer deneyler içselleştirilmiş NP uzun vadeli kaderini izlemek ve ökaryotik hücrelerin endositik yolu üzerinde çeşitli eksojen maddelerin veya endojen faktörlerin etkisini araştırmak için dizayn edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
10 nm Altın nanopartiküller (Altın NPS) 15 1. sentezi
- Çözelti A hazırlayın: 160 mi Milli-Q, ya da iki kez damıtılmış su içine 2 ml% 1 sulu bir altın klorür ekleyin.
- Çözelti B hazırlanması: 32 mL Milli-Q, ya da iki kez damıtılmış su içine 8 ml% 1 tri-sodyum sitrat x 2 H2O ve 160 ul% 1 tannik asit ekleyin.
- 60 ° C'ye kadar çözelti A ve B Isınma ve karıştırılırken karıştırın. Hemen bir koyu mavi renk gözlemleyin. 15 dakika sonra kırmızı bir renk dikkate alınmalıdır. Daha sonra, 95 ° C'ye kadar ısınması 5 dakika tutmak ve oda sıcaklığına kadar çözelti soğutulur.
- Bir karbon kaplı ızgara üzerine NP süspansiyon bir damla ekleyin ve havada kurumaya bırakın. Transmisyon elektron mikroskobu ile NP boyutunu ve morfolojisi kontrol edin.
Rodamin N-hidroksisüksinimidil Ester (NHS) ile BSA ve Etiketleme Altın NPlerin 2. Kaplama 16
- 30 dakika için 15,000 x g'de, 1.5 ml'lik Eppendorf tüpü içine 900 ul santrifüj altın NP ekleyin. Opduğunda, olabilir bir kerede birden fazla tüpler hazırlamak.
- 900 ul pelet steril Milli-Q su içinde yeniden askıya ve 100 ul, 2 mg / ml BSA / PBS ilave supernatant 30 dakika boyunca 800 rpm'de bir Vortex karıştırın.
- Aşırı BSA kaldırmak için, 60 dakika boyunca 15,000 x g'de santrifüj hazırlanması.
- Süpernatantı atın ve 125 ul PBS altın-BSA NPs yeniden askıya, 1 M bikarbonat 12.5 ul ekleyin.
- Kullanımdan hemen önce, rodamin NHS / DMSO içinde bir 10 mg / ml çözelti hazırlamak altın BSA NPler süspansiyon 1 ml'ye kadar rodamin NHS / DMSO çözeltisi ve 30 ul ekle. Işığa maruz kaçınarak, 800 rpm karıştırma sırasında, oda sıcaklığında 2 saat (ya da O / N) için reaksiyon inkübe edin.
- 48 saat - 36 dönemi boyunca 5 tampon değişiklikleri ile 4 ° C'de PBS karşı diyaliz yoluyla altın BSA-rodamin NPs arındırın.
- , NP stabilize her biri 1 mi altın-BSA-NP rodamin, 200 mg / ml BSA / PBS içinde 10 ul ekleyin. 15 yaşında, ücretsiz veya BSA-rodamin yayımlanan santrifüj kaldırmak için,60 dakika boyunca 000 x g. Işığa maruz kaçınarak, 4 ° C 'de OD 520 ve ölçüm haznesine, 2 mg / ml BSA / PBS içinde pelletini.
- Milli-Q veya iki kez damıtılmış su ile NP 10 kez seyreltilir, bir karbon ile kaplanmış ızgara üzerine bir damla ekleyin ve hava içinde kurumaya bırakın. Transmisyon elektron mikroskopisi (TEM) ile NP büyüklüğü ve morfoloji edin.
Not: NP hazırlanması için kullanılan bütün malzemeler sterilize edildi ve işlem, bir hücre kültürü kaputu veya alev yanında tezgah üzerinde gerçekleştirilmiştir.
HeLa Hücreleri 3. Kültür
- Sürekli LAMP1-GFP ifade eden HeLa hücreleri% 10 fetal dana serumu (FCS) ile, DMEM ve% 5 CO2 içeren bir atmosferde 37 ° C'de büyütülür.
- 8 oyuklu slaytı (Ibidi) içinde göz başına 50,000 yoğunlukta hücreler Tohum ve / N O inkübe edilir.
Bakterilerin 4. Kültür
- Kullanım Salmonella enterica serovar Typhimurium NCTC 12.023 wilD-tipi (WT) ve soyu. Karşılaştırma için, SIF için anahtar etkeni şifa eksik spi2-T3SS ve Δ şifa içinde Δ ssaV kusurlu mutant soylarda kullanır. Geliştirilmiş GFP yapısal ekspresyon için plazmid pFPV25.1 barındıran suşları kullanın.
Not: Bakteriyel suşlar 50 ug / ml karbenisilin ve / veya 50 ug / ml kanamisin (Δ ssaV, Δ şifa ilavesi ile 50 ug / ml karbenisilin (WT) ve LB ilavesi ile (LB) Luria-Bertani suyu rutin olarak kültürlenir ) plazmidleri muhafaza edilmesi için gerekli. - Sonra taze LB 01:31 sulandırmak ve 3.5 saat büyümesini devam uygun antibiyotiklerle 3 ml LB bakteri tek bir koloni aşılamak ve havalandırma için sallayarak koşullar altında 37 ºC / N O büyür. Bu zaman noktasında, kültürler geç log fazına ulaştıktan ve bakteri, yüksek oranda istilacı bulunmaktadır. Bir 'silindir davul' havalandırma test tüpü kültürleri inkübe uygundur.
HeLa hücrelerinin 5. enfeksiyon ileSalmonella ve Altın-BSA-Rodamin NPS Chase-etiketleme (şema için Şekil 1'e bakınız) Darbe
- Alt-kültürlenmiş bakteri OD 600 ölçün ve 1 ml PBS (~ 3 x 10 8 hücre / ml) içinde 600 = 0.2 OD, seyreltik bir çok sayıda elde etmek için 8-çukurlu oda slaytlar HeLa hücrelerinde bakterilerin uygun miktarlarda eklemek enfeksiyon 100 (İB).
- Olmayan içsel bakterileri çıkartmak için 3 kez PBS ile hücre kuluçka makinesi içinde, 30 dakika boyunca inkübe yıkama (bu zaman noktası, 0 saat sonra enfeksiyon ya da 0 saat pi olarak tespit edilmiştir). 100 ug / ml gentamisin içeren, taze kültür ortamının 300 ul ilave edin ve 1 saat boyunca muhafaza edilir. Daha sonra inkübasyon süresi sonuna kadar 10 ug / ml gentamisin ihtiva eden taze ortam ile orta yerine.
- 1 saat süre ile, 100 ug / ml gentamisin ihtiva eden kültür ortamı ile inkübe edildikten sonra, ortam ko (30 mM HEPES, pH 7.4 ile, FCS, L-glutamin, fenol kırmızı ve sodyum bikarbonat olmadan Eagles MEM) orta görüntüleme değiştirilir10 ug / ml gentamisin ntaining. Altın, BSA-rodamin NPler OD 520 = 0.1 nihai bir konsantrasyon elde etmek için, HeLa hücrelerine ilave edilir.
Not: Altın-BSA-rodamin NPler da enfeksiyondan önce veya farklı zaman noktaları pi hücrelere ilave edilebilir - 1 saat inkübe edildikten sonra, ortam maddesinin ayrılması 3 defa PBS ile yıkayın ve inkübasyon süresi içinde geri kalan% 10 FCS ve 10 | ig / ml gentamisin ihtiva eden taze bir görüntüleme ortamında 300 ul ilave edin.
Not: kuluçka süresi kullanılan NP ve hücre çizgileri konsantrasyonuna bağlı olarak değişebilir. RAW264.7 makrofaj için, yeterli içselleştirme izin OD 520 = 0.05 bir konsantrasyonda NP o 30 dakika inkübasyon görülmektedir.
6. Görüntüleme
- Gibi farklı zaman noktalarında yüksek çözünürlüklü görüntüleme için nemlendirilmiş bir ortam odası ile konfokal lazer tarama (CLSM) veya döner diskli (SD) mikroskop gibi bir konfokal görüntüleme sistemi kullanın.
- Sıcaklık c Anahtarıistikrarlı kadar ve sistem ontrol bekleyin. Böyle büyütme, tarama hızı, çözünürlük, Z-yığını vb GFP için uygun uyarma / emisyon ayarlarını kullanın ve altın-BSA-rodamin NP gibi görüntüleme ayarlarını optimize eder. Bu protokol için, 512 x 512 piksel 400 Hz tarama hızı, çözünürlük ve 0.25 mikron Z-adım boyutunu kullanın. GFP ve sırasıyla Ar, lazer (488 nm) ve HeNe lazer (543 nm) kullanılarak altın BSA rodamin harekete geçirir. Hücrelerin şeklini gözlemlemek için parlak alan (BF) kanalı ekleyin. Mikroskopi sistemleri ve enfeksiyon koşulları diğer için, ayar buna göre ayarlanması gerekir.
NOT: Bir fotoğraf çarpanı (PMT) detektörü ile tespit edildi BF kanalı ve sinyal ışık kaynağı aynı Ar lazer kullanın. - Belirtilen zaman noktaları pi anda, mikroskop sahne ve kayıt görüntülerinde enfekte hücreleri içeren 8-iyi odasının slaytlar monte edin.
Görüntüler 7. Analizi
- Mikroskopi görüntü analizi yazılımı kullanın (bkz
NOT: Alternatif olarak, ImageJ veya FIJI gibi açık kaynak yazılım paketleri kantitatif görüntü kullanılabilir analizleri. - Simgesine görünümü Aşan tıklama nesneleri araç çubuğunda
Yeni bir yüzey öğesi eklemek. Tıklayın 
(Sonraki). - İlgi (ROI) bir bölge seçin segmenti bir ROI analiz etmek. Bir görüntüleme alanında, resmi üzerine bindirilmiş bir dikdörtgen çerçeveli bölüm yatırım getirisi temsil ediyor. Y, ilgili x- değerleri girin, ve z alanlar, ya da doğrudan boyutu ve ROI konumunu değiştirmek için önizleme dikdörtgenin içinde okları tıklatın. Ardından tıklayın
= "/ Files / ftp_upload / 52.058 / 52058icon2.jpg" /> (Sonraki).
- Bir kaynak kanalı olarak seçin Kanal 3 (Altın-BSA-Rodamin NPlerin için sinyali). Elde edilen alanın düzgünlüğü kurmak için yumuşak seçeneği işaretleyin. Elle bir değer tanımlayın veya otomatik olarak oluşturulan değeri kabul. Eşiği için, Mutlak Yoğunluk seçeneğini seçin.
- Eşik ayarı için, manuel seçeneği seçin ve bir değer ayarlayın. Görüntüleme alanında, bir yüzey eşik önizleme gri görüntülenir.
- Sekmesinde sınıflandırır Yüzeyler üzerinde ortaya çıkan yüzeyi çeşitli kriterlere göre filtre edilebilir. Bir varsayılan filtre ve diğer filtreler 'voksellerin> 10 sayısı' da 'eklemek' tıklayarak dahil edilebilir. Bir filtreleme gerekli değilse, o zaman silme butonuna tıklayarak tüm filtreleri silin. Tıklayın (Sonraki).
- Yüzey oluşturma işlemini tamamlamak için, tıklayın/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg "/> (Finish). Nesne listesinde, şimdi kontrol un öğe Hacmi ve yeni oluşturulan yüzeyin için kutuyu görüş alanı görüntülenir.
- Istatistik verin. Şimdi, Aşan görünümünde konuların renk alanlarına göre mor kırmızıya değişir. Ve 'Plot Numaraları Alan' tablo istatistik bilgilerini (örneğin, kimlik numarası ve nesnelerin alan) gösterir. Tıklama ile bir Excel dosyasına yüzeyin 1 tüm istatistikleri İhracat
(Kaydet).
Yeni bir yüzey öğesi eklemek. Tıklayın 
(Sonraki). 
(Kaydet). Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Altın NPler sitrat ve tanik asit chloroauric asidin indirgenmesi ile iyi bilinen bir yöntem ile üretilmiştir. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, sentezlenmiş altın NPler yaklaşık 10 nm arasında bir boyuta sahip şeklinde yarı-küresel edildi. BSA-kaplama ve rodamin-etiketleme kendi morfoloji veya boyutunu (Şekil 2B) etkilememiştir.
Bu altın NPler hali hazırda çeşitli memeli hücreler tarafından alınır ve endositik sistemleri 7 bitti edilebilir bildirilmiştir. Daha önce yapılan çalışmalarda uygun olarak, parlak kırmızı ışık sinyalleri hücrelerin NP etkin içselleşmesini gösteren, altın, BSA-NP rodamin (Şekil 3, ila 5 saat pi) ile 1 saat inkübe edildikten sonra, HeLa hücrelerinde gözlenmiştir. Kırmızı sinyallerin çoğu NPler geç endozomlarda veya lizozomlarında sınırlı olduğunu gösteren, yeşil sinyalleri ile kolokalize bulundu edildi. Ancak, geç endozomlar / lizozomlarında NPlerin tekdüze dağılım aksineenfekte edilmemiş hücreleri (Şekil 3, sahte) 'de, kendi yerleri büyük ölçüde WT Salmonella ile enfekte olan hücrelerde yeniden düzenlenmiştir. (Şekil 3, WT 5 saat pi) enfeksiyonun erken evresinde, Salmonella SCV içinde çoğaltır ve SIF hızlı uzantısı veya daralma hareketi tabi. Başka bir bölümü halen serbest geç endozomlar / lizozomlarda bulunan ise, bu zaman noktasında, NP bir kısmı, SCV ve SIF 'de tespit edilmiştir. 8 saat pi de (Şekil 3, WT 8 saat pi), SIF stabilize edilmiş bir ağ oluşturulmuştur ve sadece çok küçük bir kısmı ücretsiz geç endozomlar / lizozomlarda yer kalmıştır en NPler, tüp şekilli yapıların içinde biriken bulunmuştur. mutant soylar Δ ssaV ve Δ şifa farklı davranışlar göstermiştir. Şekil 3 (Δ ssaV) 'de gösterildiği gibi, herhangi bir SIF oluşturulmuş yapılar ise, 8 saat pi de, Δ ssaV SCV içinde kapatıldı. Bazı NPler somon çevreleyen gözlendiSCV içinde Ella, ancak NP çoğunluğu hala özgür geç endozomlar / lizozomlarında yer bulundu. Δ ŞİFA suşu (Şekil 3, Δ ŞİFA) için, sitoplazma içine Salmonella kaçış oluştu, ve NP ve bakteri arasında bir ilişki gözlenmedi.
Önceki çalışmada bulundu ki SIF ekran son derece dinamik enfeksiyonun erken dönemde özellikleri (3-5 saat pi), fakat daha sonraki dönemde (> 8 saat pi) 12 stabilize olur. Enfeksiyonun erken ve geç dönemde Salmonella içi NP dağılımını yeniden düzenlemek için karşılaştırılabilir yeteneğine sahip olup olmadığı, bu nedenle, biz merak ediyor. Içsel NP en biriken gözlenen tüm durumlarda 1 saat - (7 saat pi 1), Şekil 4'te gösterildiği gibi, altın NPler HeLa hücrelerinde O / N enfeksiyondan önce veya enfeksiyon sonrasında farklı zaman noktalarında ile kuluçkalanmıştır SCV veya SIF.
Mikroskopik Gözlemkus konak hücrelerin Endo-lizozomal sistemin büyük yeniden düzenlenmesi Salmonella sonuçları olduğu enfeksiyon saptandı. Bir sonraki adım olarak, biz bir nicel bir şekilde Salmonella teşvikli konak hücre fenotipleri analiz Imaris yazılım paketi kullanılır. Bir örnek olarak 8 saat pi az bir enfekte HeLa hücre imajını kullanarak, kantitatif analiz için bir adım-adım talimat Şekil 5'te gösterilmektedir. 15 bir yoğunluk eşik ve 'voksellerin sayısı> 10' filtre, 3D sayesinde nesneler, orijinal görüntü dosyası çıkarıldı. nesneler altın BSA-rodamin NPS ile yer olan hücre içi yapılar olması gerekiyordu. Bu örnekte, 67 nesne 1,974.64 mikron 2 gibi özetlenebilir alana sahip, toplam ekstre edildi. Diğer 50 um'den daha küçük 2 ise SIF ağı ile birlikte lokalize büyük nesne, 1,836.23 um 2 arasında bir alana sahiptir. Karşılaştırma için, bir örnek kant gösterenolmayan enfekte hücre itative analiz sonucu verilmiştir. Burada, 431 nesneler toplam ekstre edildi, içinde alan ortalama değeri 5 um 2 olduğu ve büyük bir nesne 34 mikron 2 arasında bir alana sahiptir. Nesnelerin özetlenebilir alan Şekil 4'te enfekte olmuş bir hücreye (1,975 um 2) ile karşılaştırılabilir 2252 mikron 2 vardır. Bununla birlikte, nesne sayısını Salmonella ile indüklenen boru şekilli yapılarla vesiküller, büyük ölçüde füzyon gösteren başka bir (431 ve 67 amaçları, sırasıyla), çok daha büyüktür.
Canlı hücre görüntüleme için HeLa hücrelerinin hazırlanması için, Şekil 1, Şema. HeLa hücreleri, oda slaytlar tohumlandı sözde-enfekte edilmiş ya da 30 dakika süre ile, çeşitli Salmonella türlerinin ile enfekte edilmiştir, daha sonra incubat, 3 kez PBS ile yıkandı, ortam 1 saat boyunca 100 ug / ml gentamisin içeren ed. Bundan sonra, medyum ihtiva eden bir ortam görüntüleme ile ikame Deneyin geri kalan NP içermeyen ortam ile 1 saat boyunca inkübe edilmiş ve daha sonra takip 10 nm altın BSA rodamin NPler (OD 520 = 0.1) ve 10 ug / ml gentamisin, . Canlı hücre görüntüleme farklı zaman noktalarında yapıldı enfeksiyon (pi) sonrası. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil önce kolloidal altın NPlerin 2. TEM görüntüleri (a) ve etiketleme (b) sonra. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Hücre içi Salmonella. HeLa hücreleri tarafından konak hücre endo-lizozomal sistem Şekil 3. Tadilat sahte-enfekte 10 nm altın BSA-rodamin NP ile mutant suşlar ve darbe / kovalamaca, veya Salmonella WT, Δ ssaV veya Δ ŞİFA ile enfekte edildi ( Şekil 1 'de tarif edildiği gibi, OD = 0.1 520) gerçekleştirildi. CLSM Z yığınlarının maksimum yoğunluğu projeksiyonları gösterilmiştir. Ölçek barlar, 10 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil Salmonella enfeksiyonu çeşitli aşamalarında Endo-lizozomal sistemi 4. Erişilebilirlik. HeLalHücreler, 10 nm altın BSA rodamin NP ile pulse edilmiştir (OD 520 = 0.1) O / N önce enfeksiyonu ya da belirtildiği gibi çeşitli zaman noktaları pi 1 saat karıştırıldı. Gösterilir CLSM Z-yığınlarının 9 saat pi Maksimum yoğunluk projeksiyonlar - Canlı hücre görüntüleme 8 gerçekleştirildi. Ölçek barlar, 10 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bir örnek olarak 8 saat pi bir enfekte HeLa hücre bir görüntü kullanılarak Imaris tarafından kantitatif analiz için adım öğretim Şekil 5. Adım. (A) 'Aç' tıklayarak ve dosyayı seçerek veriyi açın. Aşmak bakış nesneleri araç çubuğunda (B) Yeni bir yüzey öğesi ekleyin. (C), sonra segmenti bir yatırım getirisi seçin, bir yatırım getirisi analiz etmek. (D) y, ilgili x- değerleri girin, ve z-alanlar veya (E) doğrudan büyüklüğü ve ROI konumunu değiştirmek için önizleme dikdörtgenin içinde okları tıklatın. Bu örnekte, bir ROI gerek ve bütün görüntü analiz edilmiştir. Bir kaynak kanalı olarak (F) Kanal 3 (Altın-BSA-Rodamin NPlerin sinyali) seçin. Elde edilen alanın düzgünlüğü kurmak için yumuşak seçeneği işaretleyin. Elle bir değer tanımlayın veya otomatik olarak oluşturulan değeri kabul. Burada, 0.1 um kullanılmıştır. 'Eşik' için 'Mutlak Yoğunluk' seçeneğini seçin. Eşik ayarı için (G) manuel seçeneğini seçin ve bir değer ayarlayın (bu örnekte 15 kullanılmıştır). Görüntüleme alanında bir yüzey eşik önizleme gri görüntülenir. Sekmesinde 'sınıflandırır Yüzeyler' Ortaya çıkan yüzey üzerinde (H), çeşitli kriterlere göre filtre edilebilir. Bir varsayılan filtre 'voksellerin> 10 sayısıdır' olduğunu.Filtre yeni bir değer girin ayarlanabilir ve diğer filtreler eklenebilir. Bu örnekte, biz filtre 'voksellerin> 10 sayısı' tuttu. (I) 'Bitir' Yüzey oluşturma tıklayınız tamamlamak için. Nesne listesinde artık un onay et Hacmi ve yeni oluşturulan yüzey için kutu kırmızı bölgeyi inceleyen görüntülenir. Konuların rengi alanlarına göre kırmızı mor değişir Aşan görünümünde (J). (K) 'Arsa Numaraları Alan' masa istatistik bilgilerini gösterir. Bir Excel dosyasına ihracat istatistikleri. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Olmayan bir enfekte hücrenin Şekil 6. Kantitatif analiz sonucu. (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
memeli hücrelerinin bir endo-lızozomal sistemi besin alımı, hormon-kaynaklı sinyal iletimi, immün gözetim ve antijen sunumu 17 de dahil olmak üzere önemli fizyolojik işlemleri kontrol eder. Şimdi, belirteçlerin çeşitli endositik yolu ve izleme çalışmaları etiketlenmesi için kullanılmıştır kadar. Örneğin, Lysotracker probları seçici düşük iç pH hücre bölmesi içinde birikir ve etkin bir şekilde, nanomolar konsantrasyonlarda 18 de canlı hücreleri etiketlemek olabilir lizozom etiketleme için Molecular Probes (Life Technologies, ABD) tarafından geliştirilen floresan acidotropic probları vardır. Bununla birlikte, hücreler Lysotracker problarının uzun süre inkübasyonu lızozomal pH'ta bir artışa neden olmakta ve lizozomlar 19 potansiyel fizyolojik değişikliklere yol açabilir. Bu tür fluoroforla işaretlenmiş dekstranlar gibi bazı büyük biyomoleküller, aynı zamanda sık sık endozom / lizozomlar etiketlemesi için kullanılır. Ancak, düşük fotostabilite kısa dolaşımdaki ömrü ve pfiksasyon sırasında oor tutma uzun vadeli canlı hücre görüntüleme uygulamaları engelleyen ve bağlaşık mikroskop 16,19 inceler. Burada, altın BSA-rodamin NPler konak hücresel endo-lizozomal sistemi etiketlemek için sıvı izleyiciler olarak kullanılmıştır. Yüksek alım verimlilik ve güçlü hücre içi floresan sinyalleri gözlendi. Çok geç endozomlar / lizozomlarda zarı üzerine zenginleştirilmiş lizozomal glikoprotein LAMP1 ile NP neredeyse tamamen ko, NP ile Endo-lizozomal sisteminin düzgün etiketleme doğrulandı. Böyle Lysotracker gibi diğer işaretleri ile floresan NPlerin kullanımını birleştiren konak hücre veziküler ticareti ve olgunlaşma ile ilgili tamamlayıcı bilgiler verebilir.
Bu NPlerin hücresel içselleştirilmesi fiziksel boyutları ve kimyasal bileşenleri oldukça bağımlı olduğunu belirtmek için değer. Bir 5 nm, 10 nm, 15 nm ve 30 nm büyüklüğü ve benzeri hücre içi dağılımı ile altın-BSA-rodamin NP test ettikYan HeLa hücreleri (sonuçlar gösterilmemiştir) gözlenmiştir. Salmonella enfeksiyonu çalışmaları için uygun bir hücre soyu olarak HeLa hücreleri kullanılmıştır. Bununla birlikte, altın, BSA-rodamin NPler da kolaylıkla çeşitli hücre çizgileri tarafından içselleştirilir ve birincil hücreler uygundurlar edilebilir. Örneğin, Salmonella CHO NP, COS-7, CaCo2, veya 3T3 hücreleri tarafından boru şekilli yapılar ve etiketleme indüklenen, hem de interferon-γ-uyarımlı RAW264.7 makrofaj benzeri hücre hattı hücreleri veya birincil sıçangil makrofaj ve gözlenen dendritik hücreler. Ancak, her hücre çizgisi enfeksiyonu ve darbe / kovalamaca protokolleri ayarlanmasını gerektirir.
Bu boya tutulmuş silika NPler biyolojik olarak uyumlu, uzun yaşam ve yüksek ışığa karşı lizozom işaretleyici 19 olarak kullanılabilir olduğu bildirilmiştir ve aynı zamanda değişen boyutlarda rodamin katkılı silika NP davranışını karşılaştırılmıştır (30 - 1000 nm). S NP enfekte edilmemiş hücreler ve birikimi silika NP sonlarında endozomlar / lizozomların uygun etiketlemeSalmonella ile enfekte olan hücrelerde CV ve SIF gözlendi. Bununla birlikte, NP ya da tek silika NP büyük boyutu Salmonella ile indüklenen boru şekilli yapılar ile NP dağılımı agrega oluşumu nedeniyle (veriler gösterilmemiştir) üniform değildir.
Yanı sıra SIF SCV karakteristik özelliği, LAMP1 12 gibi oldukça bol lizozomal glikoproteinler varlığıdır. Burada, kararlı bir şekilde LAMP1-GFP ifade eden bir HeLa hücre hattı, endo-lizozomal sistemi ve canlı hücre görüntüleme kolaylık sağlamak için SCV ve SIF yapıları kullanılmıştır. Kurucu geliştirilmiş GFP sentezleyen Salmonella türlerinde bakteri konumunu belirtmek için enfeksiyon deneylerde kullanıldı . Nedeniyle hücre içi bakteri tek bir boyut ve şekli, genel olarak bakteriyel GFP flöresanmm, Endo-lizozomal membran GFP etiketten kolayca ayırt edilebilir. Ancak, gelecekteki deneyler için bakteri ve membran pr floresan hangi sinyalioteins tam farklılaştığında, diğer floresan füzyon proteinleri, örneğin, mTurquoise olması gerekir, entegre edilmesi tavsiye edilir. Bu, ancak, canlı hücre deneylerinde yüksek foto-hasar riskini taşıyan, aydınlatma ve görüntü alımı ek turlarında sonuçlanır.
Bakteriyel patojenler konak hücre yolları işlemek için gerekli genleri ve mekanizmaları öğrenmek için, çok sayıda mutantlar oluşturulması gerekir ve onların performansları dikkatle karşılaştırıldığında gerekir. Örneğin, Salmonella mutant soylar Δ ssaV ve Δ şifa yüksek sistemik hastalık oluşturma ve hücre içi çoğaltma 20,21 de zayıflatılmaktadır. Hem Δ ssaV ve Δ ŞİFA suşları SIF neden başarısız, ve ayrıca Δ ŞİFA Salmonella enfeksiyonu 12 sırasında SCV membran kaybedersiniz. WT fenotipleri ve mutant suşlar karşılaştırılması r Salmonella yeteneğini anlamak vesile olanemodel konak hücre veziküler trafik. Mikroskopik inceleme dayanarak, WT, Salmonella Δ ssaV ve Δ şifa mutant türler ile karşılaştırıldığında çok daha yüksek bir oranda bir ev sahibi hücre endositik yollar alt üst açıktır. Bu fonksiyon, hücre içi yaşam ve çoğaltma için daha fazla besin elde etmek için hücre içi Salmonella olanak olabilir.
Mikroskopisi görüntüleri açıkça hücre içi bakteriler tarafından konak hücre endo-lizozomal sisteminin yenileme göstermektedir. Bununla birlikte, görüntü kantitatif analiz kesin karşılaştırma için gereklidir. Burada anlatılan yöntemde, Imaris yazılım floresan Kanal 3> 15 yoğunluğu ve bu nesneler Altın-BSA-Rodamin NPs içeren hücre içi membran yapılar olması gerekiyordu voksellerin> 10. sayıda 3D nesneler ayıklamak için kullanılır. Floresan yoğunluğu, eşik ve filtreler görüntü kalitesine göre tanımlanmıştır, ancak shoul edilebilirFarklı koşullar veya suşları karşılaştırarak sabit tutulmalıdır d. Olmayan bir enfekte hücrenin ve sırasıyla, ekstre 431 ve 67 nesnelerle 8 saat pi bir WT Salmonella ile enfekte hücrenin, örnekleri burada gösterilir. Hücrelerin büyüklüğü aynı değildir çünkü belirgin farklılığa rağmen, bu, nesnelerin sadece sayısını karşılaştırmak için rasyonel değildir. Bir solüsyonu (bu örnekte 2252 um 2 ve 2 um 1975, sırasıyla) toplanır alan nesne sayısını normalize etmek veya hücre içinde nesneleri floresan şiddeti toplamıdır. Seçenek olarak ise, enfeksiyon farklı aşamalarında NP dağılımını karşılaştırmak için bir enfeksiyondan önce hücre, farklı zaman noktaları pi de izlemek de mümkündür.
Sonuç olarak, bu yöntemde, altın, BSA-rodamin NPler ökaryotik hücrelerin endo-lızozomal sistemi etiket uygulandı. Bir intracellula konak hücre endo-lizozomal sistemi manipülasyonr patojen canlı hücre CLSM ve kantitatif analiz sonuçları gözlenmiştir geç endozomlardan aşırı düzenlenmeleri belirtilen / WT Salmonella. Salmonella tarafından lizozomlar bir modeli bu çalışmada patojen, ancak Shigella flexneri ve Listeria monocytogenes gibi diğer bakteriyel patojenler, hücre içi davranış olarak kullanıldı Ayrıca bu yaklaşım kullanılarak incelenebilir. Prensip olarak, altın, BSA-rodamin NPler, bu nedenle genel olarak farklı içsel veya dışsal maddelerle endositik yolunun etkileşimini inceleyen çalışmalarda uygulanan umut verici hücre kuşaklarının büyük bir çeşitlilik içselleştirilmelidir olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 520918 | |
| Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| Tri-sodium citrate | Sigma | C8532 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| NHS-Rhodamine | Pierce | 46406 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Gentamicin | Applichem | A1492 | |
| Kanamcyin | Roth | T832 | |
| Carbenicillin | Roth | 6344 | |
| 8-well chamber slides | Ibidi | 80826 | tissue culture treated, sterile |
| Imaris Software | Bitplane | version 7.6 | various configurations available |
References
- Coto-Garcia, A. M. Nanoparticles as fluorescent labels for optical imaging and sensing in genomics and proteomics. Anal. Bioanal. Chem. 399, 29-42 (2011).
- Xie, J., Lee, S., Chen, X.
- Ruedas-Rama, M. J., Walters, J. D., Orte, A., Hall, E. A. Fluorescent nanoparticles for intracellular sensing: a review. Anal. Chim. Acta. 751, 1-23 (2012).
- Wu, C., Chiu, D. T. Highly fluorescent semiconducting polymer dots for biology and medicine. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 3086-3109 (2013).
- Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nat. Methods. 2, 743-749 (2005).
- Kumar, D., Saini, N., Jain, N., Sareen, R., Pandit, V. Gold nanoparticles: an era in bionanotechnology. Expert Opin. Drug Deliv. 10, 397-409 (2013).
- Dykman, L. A., Khlebtsov, N. G. Uptake of engineered gold nanoparticles into mammalian cells. Chem. Rev. 114, 1258-1288 (2014).
- Chithrani, B. D., Ghazani, A. A., Chan, W. C. Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells. Nano Lett. 6, 662-668 (2006).
- Finlay, B. B., Cossart, P. Exploitation of mammalian host cell functions by bacterial pathogens. Science. 276, 718-725 (1997).
- Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens. Nature. 449, 827-834 (2007).
- Malik-Kale, P., et al. Salmonella - at home in the host cell. Front. Microbiol. 2, 125 (2011).
- Rajashekar, R., Liebl, D., Seitz, A., Hensel, M. Dynamic remodeling of the endosomal system during formation of Salmonella-induced filaments by intracellular Salmonella enterica. Traffic. 9, 2100-2116 (2008).
- Schroeder, N., Mota, L. J., Meresse, S.
- Drecktrah, D., Knodler, L. A., Howe, D., Steele-Mortimer, O. Salmonella trafficking is defined by continuous dynamic interactions with the endolysosomal system. Traffic. 8, 212-225 (2007).
- Slot, J. W., Geuze, H. J. A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry. Eur. J. Cell Biol. 38, 87-93 (1985).
- Zhang, Y., Hensel, M. Evaluation of nanoparticles as endocytic tracers in cellular microbiology. Nanoscale. 5, 9296-9309 (2013).
- Pollard, T. D., Earnshaw, W. C., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 22. Cell Biology. , (2007).
- LysoTracker and LysoSensor Probes. , Life Technologies Corporation. Carlsbad, CA. (2013).
- Shi, H., He, X., Yuan, Y., Wang, K., Liu, D. Nanoparticle-based biocompatible and long-life marker for lysosome labeling and tracking. Anal. Chem. 82, 2213-2220 (2010).
- Hensel, M. Genes encoding putative effector proteins of the type III secretion system of Salmonella pathogenicity island 2 are required for bacterial virulence and proliferation in macrophages. Mol. Microbiol. 30, 163-174 (1998).
- Beuzon, C. R., et al. Salmonella maintains the integrity of its intracellular vacuole through the action of SifA. EMBO J. 19, 3235-3249 (2000).
