Summary
Dieser Artikel beschreibt Methoden für die Synthese und die Fluoreszenzmarkierung von Nanopartikeln (NPs). Die Nanopartikel wurden in Pulse-Chase-Experimenten angewandt, um die Endo-lysosomalen System von eukaryotischen Zellen zu kennzeichnen. Eine Manipulation der endo-lysosomalen System Aktivitäten des intrazellulären Pathogen Salmonella ente wurden von Live Cell Imaging und quantifizierte gefolgt.
Abstract
Fluoreszierende Nanopartikel (NPs) mit wünschenswerten chemischen, optischen und mechanischen Eigenschaften sind versprechendsten Mittel, um intrazelluläre Organellen zu beschriften. Hier stellen wir ein Verfahren unter Verwendung von Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel, die endo-lysosomalen Systems eukaryontischer Zellen zu markieren und Manipulationen von Wirtszellwege zu überwachen, indem die intrazelluläre Pathogen Salmonella enterica. Die Nanopartikel wurden leicht durch HeLa-Zellen internalisiert und lokalisiert in späten Endosomen / Lysosomen. Salmonelleninfektion induzierte Umlagerung der Vesikel und Akkumulation von Nanopartikeln in Salmonella induzierten Membranstrukturen. Wir Einsatz der Imaris Softwarepaket für quantitative Analysen der konfokalen Mikroskopie Bilder. Die Anzahl der Objekte und ihre Größenverteilung in nicht-infizierten Zellen waren verschieden von denen in Salmonellen-infizierten Zellen, was eine überaus Umbau des endo-lysosomalen System WT Salmonellen.
Introduction
Fluoreszierende Nanopartikel (NPs), einschließlich Metall-Nanopartikel, Quantenpunkte, Polymer-Nanopartikel, Silica-Nanopartikel, Carbon Punkte usw., haben in den vergangenen Jahrzehnten 1,2 beträchtliche Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Im Vergleich zu herkömmlichen organischen Farbstoffen, fluoreszierenden Nanopartikeln zeigen wünschenswerte chemische, optische und mechanische Eigenschaften, wie starke Signalstärke, Resistenz gegen Ausbleichung und hohen Biokompatibilität 3,4. Diese Vorteile machen sie die Methode der Wahl für die intrazelluläre Erkundung und Live Cell Imaging. Darüber hinaus sind eine Vielzahl von elektronendichte Nanopartikel durch Elektronenmikroskopie (EM) zu sehen, ihre Verwendung zur korrelierten mikroskopische Analyse, die Kombination von Live-Cell-Tracking mit Lichtmikroskopie (LM) und eine höhere Auflösung bei ultrastruktureller Ebene mit EM 5 ermöglicht die Erleichterung. So wurden beispielsweise Gold-Nanopartikel lange Zeit effizient als Biosensoren in lebenden Zellen für empfindliche Diagnose sowie auf dem Gebiet der Immunmarkierung 6 verwendet wurde. Neueste sTUDIEN zeigen, dass Gold-Nanopartikel mit unterschiedlicher Größe und Form kann leicht sein, die Aufnahme durch eine Vielzahl von Zelllinien und routinemäßig durch den endosomalen Weg zu transportieren, daher haben ein großes Potenzial für die intrazelluläre Vesikel Befinden Transportverfolgung und der endo-lysosomalen System Kennzeichnung angewandt 7,8 .
Mikrobiellen Krankheitserregern wie Salmonella enterica, Shigella flexneri und Listeria monocytogenes, wurden verschiedene Mechanismen entwickelt, um nicht-phagozytischen Wirtszellen 9 einzudringen. Nachdem sie verinnerlicht, die Erreger entweder im Cytosol lokalisiert oder in membrangebundene Kompartimente abgesondert, interagieren intensiv mit ihrer Host-Umgebungen und moduliert diese auf ihr eigenes Überleben 10 begünstigen. Zum Beispiel befindet sich Salmonella enterica und repliziert in ein intrazelluläres phagosomalen Raum bezeichnet die Salmonellen-haltigen Vakuole (SCV) nach Infektion 11. Die Reifung SCVVerkehre zu den Golgi-Apparat, das fortlaufend Wechselwirkungen mit dem endocytischen und induziert die Bildung von ausgedehnten röhrenförmige Strukturen, wie Salmon -induzierte Filamente (SIF), Sortierung nexin Tubuli, Salmon -induzierte sekretorischen Trägermembranprotein 3 (SCAMP3) Tubuli, usw. . 12-14. Studium, wie diese bakterielle Erreger manipulieren Wirtszellsignalwege ist wesentlich für das Verständnis von Infektionskrankheiten.
Hier wurden Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel als Flüssigkeit Tracer verwendet, um die Wirtszellen endo-lysosomalen System kennzeichnen, und der menschlichen Magen-Erreger Salmonella enterica Serovar Typhimurium (Salmonella) wurde als Modellbakterium verwendet, um die Wechselwirkungen des Erregers mit dem Studium Gastgeber endocytischen. Intrazellulären Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel in nichtinfizierten Zellen und Zellen, die mit WT oder Mutante Salmonella-Stämmen infiziert wurden mit einem konfokalen Laserscanning Mikroskop (CLSM) abgebildet.Dann wurde Imaris Software verwendet, um die Verteilung von Nanopartikeln zu quantifizieren, was anzeigt, daß Salmonella-Infektion induzierten extreme Umlagerung der Endosomen / Lysosomen. Nach der Beschreibung dieser Methode kann analoge Experimente entwickelt, um langfristige Schicksal der internalisierten NPs zu verfolgen und um den Einfluss der verschiedenen exogenen Substanzen oder endogenen Faktoren auf die endocytischen von eukaryontischen Zellen zu untersuchen.
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Protocol
1. Synthese von 10 nm Goldnanopartikel (Gold-Nanopartikel) 15
- Bereiten Lösung A: 2 ml 1% ige wässrige Goldchlorid in 160 ml Milli-Q oder doppelt destilliertes Wasser.
- Bereiten Lösung B: 8 ml 1% Trinatriumcitrat x 2 H 2 O und 160 ul 1% Gerbsäure in 32 ml Milli-Q oder doppelt destilliertes Wasser.
- Warm up-Lösung A und B auf 60 ° C und mischen sie unter Rühren. Beachten Sie eine dunkelblaue Farbe sofort. Beachten rot nach ca. 15 min. Dann heizen bis zu 95 ° C, 5 Minuten zu halten und die Lösung auf RT.
- Fügen Sie einen Tropfen des NP Suspension auf eine kohlenstoffbeschichteten Netz und lassen an der Luft trocknen. Überprüfen Sie die Größe und Morphologie der NPs durch Transmissionselektronenmikroskopie.
2. Beschichtung von Gold-Nanopartikel, die mit BSA und Markierung mit Rhodamin N-Hydroxysuccinimidylester (NHS) 16
- Hinzufügen 900 ul NPs in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen, Zentrifuge bei 15.000 × g für 30 min. Opnational, bereiten mehrere Rohre auf einmal.
- Überstand verwerfen, resuspendieren Sie das Pellet in 900 ul sterilisiert Milli-Q-Wasser und fügen Sie 100 ul 2 mg / ml BSA / PBS, Mischen auf einem Vortex bei 800 Upm für 30 min.
- So entfernen Sie überschüssiges BSA, zentrifugieren Sie das Präparat bei 15.000 · g für 60 min.
- Überstand verwerfen und neu zu suspendieren die Gold-BSA-Nanopartikel in 125 ul PBS, fügen 12,5 ul 1 M Bicarbonat.
- Unmittelbar vor der Anwendung bereiten eine 10 mg / ml-Lösung von Rhodamin NHS / DMSO, fügen Sie 30 ul Rhodamin NHS / DMSO-Lösung des Gold-BSA-Nanopartikel-Suspension 1 ml. Inkubieren Sie die Reaktion für 2 Stunden (oder O / N) bei RT bei 800 Umdrehungen pro Minute Misch, vermeiden Belichtung.
- Reinigung der Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel durch Dialyse gegen PBS bei 4 ° C mit 5 Pufferänderungen über den Zeitraum von 36 bis 48 h.
- Zur Stabilisierung NPs, fügen Sie 10 ul der 200 mg / ml BSA / PBS in jeden 1 ml Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel. Um die freien oder frei BSA-Rhodamin, Zentrifuge bei 15 zu entfernen,000 × g für 60 min. Das Pellet in 2 mg / ml BSA / PBS, messen OD 520, und bei 4 ° C, vermeiden Belichtung.
- Verdünnen Sie die NPs 10 mal mit Milli-Q bzw. doppelt destilliertes Wasser, einen Tropfen auf ein kohlenstoffbeschichtetes Gitter, und lassen Sie sie an der Luft trocknen lassen. Prüfen Größe und Morphologie der Nanopartikel durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM).
Hinweis: alle für NP Herstellung verwendeten Materialien wurden sterilisiert und der Vorgang wurde in einem Zellkulturhaube oder auf einer Bank neben einer Flamme durchgeführt.
3. Kultur von HeLa-Zellen
- HeLa Zellen LAMP1-GFP exprimieren, sind dauerhaft in DMEM mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) kultiviert und bei 37 ° C in einer Atmosphäre mit 5% CO 2 gezüchtet.
- Samen, die Zellen in einer Dichte von 50.000 pro Vertiefung in einem 8-Well-Kammerobjektträger (Ibidi) und Inkubation O / N.
4. Kultur von Bakterien
- Verwenden Salmonella enterica Serovar Typhimurium NCTC 12023 wild-Typ (WT) Belastung. Zum Vergleich verwenden Mutantenstämmen Δ ssaV im SPI2-T3SS und Δ SIFA defekt fehlt Schlüssel Effektor SIFA für SIF. Verwenden Stämme Plasmid pFPV25.1 für konstitutive Expression verstärkt GFP.
HINWEIS: Die Bakterienstämme sind routinemßig gezüchtet in Luria-Bertani-Brühe (LB), mit Zusatz von 50 ug / ml Carbenicillin (WT) und LB unter Zusatz von 50 ug / ml Carbenicillin und / oder 50 & mgr; g / ml Kanamycin (Δ ssaV, Δ Şifa ) der erforderlich ist, um Plasmide zu erhalten. - Impfen Sie eine einzelne Bakterienkolonie in 3 ml LB mit geeigneten Antibiotika und wachsen O / N bei 37 ° C unter Schütteln Bedingungen für die Belüftung, dann verdünnen 01.31 in frischem LB und das Wachstum weiterhin 3,5 Stunden. Zu diesem Zeitpunkt, erreichen die Kulturen der späten log-Phase und Bakterien sehr invasiv. A 'Bandage "ist bequem, Reagenzglas Kulturen mit Belüftung inkubiert.
5. Die Infektion von HeLa-Zellen durchSalmonellen and Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel Pulse Chase-Kennzeichnung (siehe Abbildung 1 für Schema)
- Messen OD 600 der Unter kultivierten Bakterien und verdünnt in 1 ml PBS (~ 3 × 10 8 cfu / ml) OD 600 = 0,2, fügen geeignete Mengen von Bakterien an HeLa-Zellen in 8-Well-Kammerobjektträgern, eine Vielzahl von zu erzielen Infektion (MOI) von 100.
- Inkubieren für 30 Minuten in der Zelle Inkubator, waschen 3 Mal mit PBS, um nicht internalisierte Bakterien zu entfernen (dieser Zeitpunkt wurde als 0 Stunden nach der Infektion oder 0 h pi festgelegt). Werden 300 ml frisches Kulturmedium, das 100 ug / ml Gentamicin und aufrechtzuerhalten für 1 h. Dann ersetzen Sie das Medium durch frisches Medium, das 10 ug / ml Gentamicin für den Rest der Inkubationszeit.
- Nach Inkubation mit Kulturmedium, das 100 ug / ml Gentamicin für 1 h wird das Medium durch Abbilden Medium ersetzt (Eagles MEM ohne FCS, L-Glutamin, Phenolrot und Natriumbicarbonat, mit 30 mM HEPES, pH 7,4) containing 10 ug / ml Gentamicin. Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel werden in HeLa-Zellen gegeben, um eine Endkonzentration von OD 520 = 0,1 erhalten.
HINWEIS: Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel können auch auf Zellen vor der Infektion, oder zu verschiedenen Zeitpunkten zugegeben werden pi - Nach 1 h Inkubation Entfernen des Mediums, Waschen 3x mit PBS, und 300 ml frisches Bilderzeugungsmedium, enthaltend 10% FCS und 10 ug / ml Gentamicin für den Rest der Inkubationszeit.
HINWEIS: Dauer der Inkubationszeit kann je nach Konzentration von Nanopartikeln und Zelllinien variieren. Für Makrophagen RAW264.7 beobachteten wir, dass 30 min Inkubation mit Nanopartikeln in einer Konzentration von OD 520 = 0,05 erhalten ausreichend Internalisierung.
6. Imaging
- Verwenden eines konfokalen Abbildungssystems, wie einem konfokalen Laser-Scanning (CLSM) oder Spinnscheibe (SD) Mikroskop mit einer feuchten Umgebung Kammer hochauflösende Abbildung zu unterschiedlichen Zeitpunkten.
- Schalten Sie den Temperatur control System und warten, bis er stabil ist. Optimieren Sie die Bildeinstellungen, wie Vergrößerung, Scangeschwindigkeit, Auflösung, Z-Stapel usw. Verwenden Sie geeignete Anregungs- / Emissions Einstellungen für GFP und Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel. Aus diesem Protokoll, mit einem 400 Hz Scangeschwindigkeit, Auflösung von 512 x 512 Bildpunkten und Z-Schrittgröße von 0,25 um. Erregt GFP und Gold-BSA-Rhodamin Verwendung eines Ar-Lasers (488 nm) und einen HeNe-Laser (543 nm) sind. Fügen Sie eine Hellfeld (BF) Kanal für die Beobachtung der Form der Zellen. Bei anderen Mikroskopsystemen und Infektionsbedingungen die Einstellung muss entsprechend angepasst werden.
HINWEIS: Die gleichen Ar-Laser als die Lichtquelle der BF Kanal und Signal wurde mit einem Photomultiplier (PMT) Detektor erfaßt. - Bei der angegebenen Zeitpunkten pi, montieren Sie die 8-Well-Kammer-Objektträgern, die infizierten Zellen auf dem Mikroskoptisch und speichern.
7. Analyse der Bilder
- Verwenden Mikroskopie Bildanalyse-Software (siehe
HINWEIS: Alternativ können Open-Source-Softwarepakete wie ImageJ oder FIJI quantitative Bildanalysen verwendet werden. - In der Symbolleiste Objekte des auf das Icon Surpass Sicht
um eine neue Oberfläche Artikel hinzuzufügen. Klicken Sie auf 
(Nächster). - So analysieren Sie eine Region of Interest (ROI), wählen Sie Segment ein ROI. In einer Bildfläche wird ein Rechteck umrandeten Abschnitt Bild überlagert, die den ROI. Geben Sie die Werte in der entsprechenden x-, y- und z-Felder, oder klicken Sie direkt auf die Pfeile in der Vorschau Rechteck, um Größe und Position der ROI ändern. Klicken Sie dann auf
= "/ Files / ftp_upload / 52.058 / 52058icon2.jpg" /> (Next).
- Als Quellkanal, wählen Sie Kanal 3 (Signal for Gold-BSA-Rhodamin NPs). Überprüfen Sie die glatte Option zum Einrichten der Glätte der resultierenden Fläche. Wert manuell festlegen oder den automatisch generierten Wert zu übernehmen. Für Threshold, wählen Sie die Option Absolute Intensität.
- Für die Schwelleneinstellung, wählen Sie die manuelle Option wählen und Wert. Im Anzeigebereich wird eine Oberflächengrenze Vorschau grau dargestellt.
- Auf der Registerkarte Classify Oberflächen können die resultierende Oberfläche nach verschiedenen Kriterien gefiltert werden. Ein Standardfilter ist "Anzahl der Voxel> 10 'und andere Filter können auch durch Klicken auf" Hinzufügen "aufgenommen werden. Wenn eine Filterung nicht notwendig ist, dann alle Filter zu löschen, indem Sie auf die Schaltfläche Löschen. Klicken (Nächster).
- Um Oberflächen Erstellung abzuschließen, klicken Sie auf/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg "/> (Fertig stellen). In der Liste Objekt jetzt deaktivieren Sie das Kontrollkästchen für das Element Volume und erstellt neue Oberfläche in Sichtbereich angezeigt.
- Exportieren Sie die Statistiken. Jetzt, in der Surpass Ansicht die Farbe der Themen variieren von violett bis rot nach ihrem Bereich. Und die "Plot Zahlen Raums" Tabelle zeigt die Statistikinformationen (zB ID-Nummer und Fläche von Objekten). Exportieren Sie alle Statistiken der Oberfläche 1 in eine Excel-Datei durch Klick
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Representative Results
Gold-Nanopartikel wurden durch ein gut etabliertes Verfahren durch Reduktion von Chlorwasserstoffsäure von Citrat und Gerbsäure erzeugt. Wie in 2A gezeigt, waren die synthetisierten NPs quasi-kugelförmiger Gestalt mit einer Größe von etwa 10 nm. BSA-Beschichtung und Rhodamin-Markierung nicht beeinflussen die Morphologie und Größe (2B).
Es wurde berichtet, dass die Gold-Nanopartikel können leicht von verschiedenen Säugerzellen aufgenommen und am Ende in den endocytischen Systeme 7 werden. In Übereinstimmung mit früheren Arbeiten, leuchtend roten Fluoreszenzsignale wurden in HeLa-Zellen nach 1 Stunde Inkubation mit Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel (Abbildung 3, WT 5 h pi) beobachtet, was effektive Internalisierung der Nanopartikel von Zellen. Die meisten der roten Signale wurden gefunden kolokalisiert mit grünen Signale, die zeigen, dass den nationalen Parlamenten in späten Endosomen bzw. Lysosomen beschränkt. Doch im Gegensatz zu gleichmäßige Verteilung der Nanopartikel in späten Endosomen / Lysosomenin nicht infizierten Zellen (Abbildung 3, Mock) wurden ihre Positionen weitgehend WT Salmonellen infizierten Zellen neu angeordnet. In der frühen Phase der Infektion (Abbildung 3, WT 5 h pi), Salmonellen repliziert innerhalb des SCV und SIF unterziehen schnelle Erweiterung oder Kontraktionsbewegung. Zu diesem Zeitpunkt wurde eine Fraktion der nationalen Parlamente in SCV und SIF gefunden, während ein anderer Teil noch im freien späten Endosomen / Lysosomen entfernt. Bei 8 h pi (Abbildung 3, WT 8 h pi), ein stabilisiertes Netzwerk von SIF gebildet wurde, und die meisten NPs gefunden innerhalb der röhrenförmigen Strukturen akkumuliert, während nur ein sehr geringer Anteil blieb im freien späten Endosomen / Lysosomen befinden. Die Mutantenstämme Δ ssaV und Δ SIFA ausgestellt deutliche Verhaltensweisen. Wie in 3 (Δ ssaV) dargestellt, in 8 h pi, Δ ssaV wurde in SCV beschränkt, während keine SIF Strukturen gebildet wurden. Einige Nanopartikeln beobachtet umliegenden Salmonella innerhalb des SCV, aber die Mehrheit der NPs waren noch im freien späten Endosomen / Lysosomen entfernt. Für die Δ SIFA Belastung (Abbildung 3, Δ SIFA), Austritt von Salmonellen in Zytoplasma stattgefunden hat, und keine Verbindung zwischen NPs und Bakterien beobachtet.
In unserer früheren Untersuchung wurde festgestellt, dass SIF Anzeige hohe Dynamik in der frühen Phase der Infektion (3-5 h pi), werden aber in der späteren Periode (> 8 Stunden pi) 12 stabilisiert. Deshalb werden wir die Frage, ob Salmonellen in frühen und späten Phasen der Infektion haben vergleichbare Fähigkeit, Verteilung der intrazellulären NPs ändern. (- 7 h pi 1) für 1 h in allen Fällen die meisten der internalisierten NPs wurden beobachtet in sammelt, wie in Figur 4 gezeigt, wurden Gold-Nanopartikel mit HeLa-Zellen O / N vor der Infektion, oder zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion inkubiert SCV oder SIF.
Mikroskopische observtionen gezeigt, dass Infektionen mit Salmon führt zu massiven Umstellung der endo-lysosomalen System der Wirtszellen. Als nächsten Schritt haben wir die Imaris Softwarepakets von Salmonellen -induzierte Wirtszelle Phänotypen in einer quantitativen Art und Weise zu analysieren. Verwendung des Bildes von einem infizierten HeLa-Zellen bei 8 h pi als Beispiel wird ein Schritt-für-Schritt-Anleitung für die quantitative Analyse in 5 dargestellt. Durch einen Intensitätsschwellenwert von 15 und einer "Anzahl von Voxeln> 10 'Filter, 3D Gegenstände wurden aus der Originalbilddatei extrahiert. Die Gegenstände sollten intrazelluläre Strukturen, in denen das Gold-BSA-Rhodamin NPs befindet. In diesem Beispiel wurden 67 Gegenstände insgesamt extrahiert, mit einer summierten Umgebung 1,974.64 & mgr; m 2. Das größte Objekt, das mit dem SIF Netzwerk kolokalisiert, hat eine Fläche von 1,836.23 & mgr; m 2, während die anderen sind kleiner als 50 & mgr; m 2. Zum Vergleich: ein Beispiel, das die Quantitative Analyseergebnis von einer nicht infizierten Zelle wurde in angegeben. Dabei wurden 431 Objekte insgesamt extrahiert, in dem der Mittelwert der Bereich ist 5 & mgr; m 2 und das größte Objekt hat eine Fläche von 34 & mgr; m 2. Die summierte Fläche der Objekte 2.252 & mgr; m 2, was vergleichbar mit der infizierten Zelle in Figur 4 (1,975 & mgr; m 2) ist. Jedoch ist die Anzahl der Objekte, viel größer als der andere (431 und 67 Objekte bezeichnet), die weitgehend Fusion von Vesikeln mit den Salmonellen -induzierte röhrenförmigen Strukturen zeigt.
Abbildung 1. Schema zur Herstellung von HeLa-Zellen in Lebendzell Bildgebung. HeLa-Zellen wurden in Kammer-Objektträgern beimpft, mock-infiziert oder mit verschiedenen Salmonella-Stämme für 30 Minuten infiziert, mit PBS gewaschen, 3-mal, so INCUBAT ed mit Medium, das 100 ug / ml Gentamicin 1 Std. Anschließend wurde das Medium durch Abbilden Medium ersetzt, das 10 nm Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel (OD 520 = 0,1) und 10 ug / ml Gentamycin, 1 h durch NP-freiem Medium für den Rest des Experiments inkubiert und dann vertrieben . Live Cell Imaging wurde zu verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt, nach der Infektion (pi). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2. TEM-Aufnahmen von kolloidalem Gold-Nanopartikel vor (a) und nach der Markierung (b). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. Remodeling des Host zellulären endo-lysosomalen System durch intrazelluläre Salmonellen. HeLa-Zellen wurden scheininfizierten oder mit Salmonellen WT, Δ ssaV oder Δ SIFA infiziert Mutantenstämme und Puls / Chase mit 10 nm Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel ( OD 520 = 0,1) wurde wie in Figur 1 beschrieben, durchgeführt. Die maximale Intensität Projektionen CLSM Z-Stapel gezeigt. Maßstabsbalken, 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 4. Erreichbarkeit des Endo-lysosomalen System in verschiedenen Phasen der Salmonellen-Infektion. HeLaZellen wurden mit 10 nm Gold-BSA-Rhodamin NPs gepulst (OD 520 = 0,1) O / N vor Infektion oder für 1 Stunde bei verschiedenen Zeitpunkten Pi, wie angegeben. 9 h pi Maximale Intensität Projektionen CLSM Z-Stapel angezeigt - Live Cell Imaging wurde auf 8 durchgeführt. Maßstabsbalken, 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 5. Schritt für Schritt- Anleitung für die quantitative Analyse von Imaris Verwendung eines Bildes von einem infizierten HeLa-Zellen bei 8 h pi als Beispiel. (A) Öffnen Sie die Daten, indem Sie auf "Öffnen" und wählen Sie die Datei. (B) in der Objekte-Symbolleiste des Surpass Ansicht eine neue Oberfläche Element hinzuzufügen. (C) zu analysieren, eine ROI, und wählen Sie Segment einen ROI. (D) Geben Sie die Werte in der entsprechenden x-, y- und z-Felder oder (E) direkt klicken Sie auf die Pfeile in der Vorschau Rechteck, um die Größe und die Position der ROI ändern. In diesem Beispiel wurde ein ROI müssen und das gesamte Bild analysiert. (F) als Quellkanal wählen Sie den Kanal 3 (Signal of Gold-BSA-Rhodamin NPs). Überprüfen Sie die glatte Option zum Einrichten der Glätte der resultierenden Fläche. Wert manuell festlegen oder den automatisch generierten Wert zu übernehmen. Hier wurden 0,1 & mgr; m verwendet. Für 'Threshold' die Option 'Absolute Intensity ". (In diesem Beispiel 15 verwendet wurde) (G) Für die Schwelleneinstellung wählen Sie die manuelle Option wählen und Wert. Im Anzeigebereich wird grau eine Oberfläche Schwelle Vorschau angezeigt. (H) auf der Registerkarte "Classify Surfaces 'die resultierende Oberfläche kann nach verschiedenen Kriterien gefiltert werden. Ein Standardfilter ist "Anzahl der Voxel> 10 '. DieFilter kann durch einen neuen Wert eingestellt werden und andere Filter können hinzugefügt werden. In diesem Beispiel gehalten wir die Filter "Anzahl der Voxel> 10 '. (I), um Oberflächenerstellung klicken Sie auf "Fertig stellen" beenden. In der Liste Objekt jetzt deaktivieren Sie das Kontrollkästchen für das Element Volume und erstellt neue Oberfläche in Sichtbereich rot dargestellt. (J) In der Surpass Ansicht die Farbe der Themen variieren von violett bis rot nach ihrem Bereich. (K) Die 'Plot Zahlen Raums "Tabelle zeigt die Statistikinformationen. Exportstatistik in eine Excel-Datei. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Figur 6 Quantitative Analyseergebnis eines nicht-infizierte Zelle. (
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Discussion
Die endo-lysosomalen System von Säugerzellen steuert wichtige physiologische Prozesse, einschließlich der Nahrungsaufnahme, Hormon-vermittelten Signaltransduktion, Immunüberwachung und Antigen-Präsentation 17. Bisher wurde eine Vielzahl von Markern für die Kennzeichnung von endocytischen und Tracking-Studien verwendet. Beispielsweise Lysotracker Sonden fluoreszierend acidotropic Sonden von Molecular Probes (Life Technologies, USA) zum Lysosom Kennzeichnung entwickelt, das sich selektiv anreichernde in zellulären Kompartimenten mit niedrigen internen pH und effektiv zu markieren lebenden Zellen bei nanomolaren Konzentrationen 18. Jedoch kann lange Inkubation Lysotracker Sonden mit Zellen eine Zunahme der lysosomalen pH induzieren und zu potenziellen physiologischen Veränderungen der Lysosomen 19. Einige große Biomoleküle, wie zum Beispiel Fluorophor-markierte Dextrane, werden auch häufig für Endosomen / Lysosomen Markierung verwendet. Allerdings Niederphotostabilität, kurze Umlauf Leben und pBoden Bindung während der Fixierung behindern ihre Anwendungen in der langfristigen Live Cell Imaging und Korrelat Mikroskop studiert 16,19. Hier wurden Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel als Flüssigkeit Tracer verwendet, um die Wirtszellen endo-lysosomalen System zu kennzeichnen. Hohe Aufnahmeeffizienz und starke intrazelluläre Fluoreszenzsignale beobachtet. Die fast vollständige Kolokalisation von Nanopartikeln mit lysosomale Glykoprotein LAMP1, die stark auf der Membran der späten Endosomen / Lysosomen angereichert wird, überprüft die ordnungsgemäße Kennzeichnung des Endo-lysosomalen System von den Nanopartikeln. Die Kombination der Verwendung von fluoreszierenden Nanopartikeln mit den anderen Marker wie Lysotracker können ergänzende Informationen zu Wirtszelle Vesikeltransport und Reifung werden.
Es lohnt sich zu erwähnen, dass zelluläre Internalisierung NPs ist stark abhängig von ihrer physikalischen Abmessungen und chemische Komponenten. Wir haben Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel mit einer Größe von 5 nm, 10 nm, 15 nm und 30 nm, und ähnliche intrazelluläre Verteilung in getestetSeiten HeLa Zellen beobachtet (Ergebnisse nicht gezeigt). Wir verwendeten HeLa-Zellen so bequem Zelllinie für die Salmonellen-Infektion Studien. Aber Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel können auch leicht durch verschiedene andere Zelllinien internalisiert werden und Primärzellen zugänglich sind. Beispielsweise beobachteten wir Salmon -induzierten Röhrenstrukturen und Kennzeichnung von NP in CHO, COS-7, CaCo2 oder 3T3-Zellen als auch in IFN-γ stimulierten RAW 264.7-Makrophagenzelllinie Zellen oder primären murinen Makrophagen und dendritischen Zellen. Allerdings wird jede Zelllinie Anpassung der Infektion und Puls / chase Protokolle erfordern.
Es wurde berichtet, daß der Farbstoff-eingeschlossenem Siliciumdioxid-Nanopartikel können als biokompatibles, langlebig und hoch licht Lysosom Marker 19 verwendet werden, und wir haben auch im Vergleich des Verhaltens von Rhodamin-dotierten Silica-Nanopartikeln mit variierenden Größe (30 - 1000 nm). Die richtige Kennzeichnung späten Endosomen / Lysosomen durch Silica-Nanopartikel in nicht infizierten Zellen und Ansammlung von Nanopartikeln in SLebenslauf und SIF in Salmonellen infizierten Zellen beobachtet. Aufgrund der Bildung von Aggregaten von NPs oder der Größe des Einzel Siliciumdioxid-Nanopartikel, die Verteilung von Nanopartikeln mit Salmon -induzierte Rohrkonstruktionen war jedoch nicht einheitlich ist (Daten nicht gezeigt).
Ein charakteristisches Merkmal des SCV sowie SIF ist das Vorhandensein von sehr reichlich lysosomalen Glykoproteine wie LAMP1 12. Hier wurde ein HeLa-Zelllinie, die stabil LAMP1-GFP für die Bequemlichkeit der lebenden Zellen des endo-lysosomalen System und die SCV und SIF-Strukturen verwendet. Salmonella-Stämmen erhöhte GFP konstitutiv exprimierten, wurden in den Experimenten verwendet, um Infektionen Lage von Bakterien zeigen . Durch die gleichmäßige Größe und Form der intrazellulären Bakterien, die bakterielle GFP-Fluoreszenz im Allgemeinen von der GFP-Markierung auf endo-lysosomalen Membranen leicht unterscheidbar. Jedoch für zukünftige Experimente, in denen Fluoreszenzsignal von Bakterien und Membran proteins müssen genau differentiate, andere fluoreszierende Fusionsproteine, beispielsweise mTurquoise können, wird empfohlen, integriert werden. Dies führt jedoch zu zusätzlichen Runden der Beleuchtung und Bilderfassung, mit dem Risiko höherer Photoschäden Experimente mit lebenden Zellen.
Um herauszufinden, essentielle Gene und Mechanismen für die bakterielle Krankheitserreger, um Wirtszellpfade manipulieren, müssen zahlreiche Mutanten geschaffen und sorgfältig vergleichen ihre Leistungen benötigen. So werden beispielsweise Salmonmutantenstämme Δ ssaV und Δ Şifa hoch systemischen Virulenz und intrazelluläre Replikation 20,21 gedämpft. Beide Δ ssaV und Δ SIFA Stämme nicht, SIF zu induzieren, und zusätzlich Δ SIFA Salmonellen verlieren die SCV-Membran im Laufe der Infektion 12. Vergleicht Phänotypen von WT und Mutanten-Stämme ist maßgeblich für das Verständnis der Fähigkeit von Salmonella zu remodel Wirtszelle vesikulären Verkehr. Auf der Basis der mikroskopischen Untersuchung, ist es offensichtlich, dass WT Salmonellen unterlaufen Wirtszell endozytischen Wege zu einem viel höheren Maße als Δ ssaV und Δ SIFA Mutantenstämmen. Mit dieser Funktion kann die intrazelluläre Salmonellen ermöglichen, mehr Nährstoffe für ihre intrazellulären Überleben und die Replikation zu erhalten.
Die konfokale Mikroskopie Bilder zeigen deutlich die Umgestaltung des Wirtszell endo-lysosomalen System von intrazellulären Bakterien. Jedoch wird die quantitative Analyse der Bilder zur präzisen Vergleich benötigt. In dem hier beschriebenen Verfahren wird Imaris Software zum Extrahieren von 3D-Objekten, die Fluoreszenzintensität in Kanal 3> 15 und die Anzahl der Voxel> 10. Diese Aufgaben werden soll intrazelluläre Membranstrukturen, die Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel werden verwendet haben. Die Fluoreszenzintensitätsschwelle und Filter können je nach der Qualität der Bilder definiert werden, aber should für den Vergleich verschiedener Bedingungen oder Belastungen konstant gehalten werden. Hier gezeigten Beispielen aus einem nicht-infizierten Zelle und einer WT Salmonellen-infizierten Zellen in 8 h pi, mit 431 und 67 Objekte extrahiert sind. Trotz der offensichtlichen Unterschiede ist es nicht vernünftig, nur die Anzahl der Objekte zu vergleichen, da die Größe der Zellen nicht die gleichen sind. Eine Lösung ist, die Anzahl der Objekte, die der summierten Bereich normalisiert (bei diesem Beispiel, 2,252 & mgr; m 2 und 1,975 & mgr; m 2 ist) oder die Summe der Fluoreszenzintensitäten der Gegenstände innerhalb der Zellen. Alternativ ist es auch möglich, eine Zelle vor der Infektion und zu verschiedenen Zeitpunkten Pi, um die Verteilung der Nanopartikel in den verschiedenen Phasen der Infektion zu vergleichen verfolgen.
Zusammenfassend wird in diesem Verfahren Gold-BSA-Rhodamin NPs wurden angewandt, um das endo-lysosomalen Systems eukaryontischer Zellen zu markieren. Die Manipulation der Wirtszell endo-lysosomalen System durch ein intracellular Erreger wurde von lebenden Zellen CLSM und quantitative Analyse Ergebnisse beobachtet angegeben extreme Umstellungen der späten Endosomen / Lysosomen von WT Salmonellen. Salmonellen wurde als Modell Erreger in dieser Studie, aber die intrazelluläre Verhalten von anderen bakteriellen Erreger wie Shigella flexneri und Listeria monocytogenes verwendet könnte auch unter Verwendung dieses Ansatzes untersucht werden. Im Prinzip könnte Gold-BSA-Rhodamin NPs durch eine große Vielzahl von Zelllinien internalisiert werden, sind daher vielversprechend ist weitgehend in Studien, die Wechselwirkung der endocytischen mit divergierenden endogene oder exogene Substanzen angewendet.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 520918 | |
| Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| Tri-sodium citrate | Sigma | C8532 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| NHS-Rhodamine | Pierce | 46406 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Gentamicin | Applichem | A1492 | |
| Kanamcyin | Roth | T832 | |
| Carbenicillin | Roth | 6344 | |
| 8-well chamber slides | Ibidi | 80826 | tissue culture treated, sterile |
| Imaris Software | Bitplane | version 7.6 | various configurations available |
References
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