Abstract
Traumatismos da medula espinal (SCI) causar lesão neurológica grave e consequências psicológicas, econômicas e sociais para os pacientes e suas famílias. Clinicamente, mais de 50% da SCI afecta a coluna cervical 1. Como uma consequência da lesão primária, uma cascata de mecanismos secundários, incluindo a inflamação, a apoptose, e desmielinização ocorrem finalmente levando a cicatrização de tecidos e de desenvolvimento de cavidades intramedulares 2,3. Ambos representam barreiras físicas e químicas para o transplante de células, integração e regeneração. Portanto, moldar o ambiente inibitório e colmatar cavidades para criar um ambiente favorável para o transplante de células e regeneração é um alvo terapêutico promissor 4. Aqui, um modelo de contusão / compressão de SCI cervical usando um clipe de aneurisma é descrito. Este modelo é mais clinicamente relevantes do que outros modelos experimentais, uma vez que transection ou rupturas do cabo completo são raros. Também em COMPARAÇÃOn para o modelo de queda de peso, o que, em particular, as colunas danos no dorso, compressão circunferencial da medula espinal é vantajoso. Clipe força de fecho e tempo de exposição pode ser ajustada para atingir diferente gravidade da lesão. Uma mola anel facilita a calibração precisa e constância da força clip. Em condições fisiológicas, peptídeos auto-montagem sintéticos (SAP) de auto-montar em nanofibras e assim, estão apelando para aplicação em SCI 5. Eles podem ser injectados directamente na lesão minimizando os danos ao cabo. SAPs são estruturas biocompatíveis erguer andaimes para colmatar cavidades intramedulares e, portanto, equipar o cabo danificado por tratamentos regenerativos. K2 (QL) 6K2 (QL6) é um romance SAP introduzido por Dong et a l. 6 Em comparação com outros peptídeos, QL6 auto-monta em β-folhas de pH neutro 6 0,14 dias após a LM, após a fase aguda, SAPs são injectadas no centro da lesão e as células precursoras neurais (NPC) são injected em colunas dorsais adjacentes. A fim de suportar a sobrevivência de células, o transplante é combinado com a administração subdural contínua de factores de crescimento de micro-bombas osmóticas durante 7 dias.
Introduction
Mais de 50% das lesões da medula espinal estão relacionadas com a coluna cervical. Na clínica definindo dois principais mecanismos patofisiológicos são descritos: a contusão inicial da espinal medula e, subsequentemente, a compressão permanente causada por fracturas ósseas, hemorragias ou inchaço dos tecidos.
O clipe de aneurisma imita contusão modelo / compressão ambos os mecanismos fisiopatológicos: tirando o clipe cria uma contusão e a duração do recorte representa o componente de compressão, admitindo que a compressão em clínicas causadas por fraturas ósseas, hemorragias ou inchaço dos tecidos última significativamente maior. O clipe de aneurisma utilizado é modificado por uma mola anel garantindo força exata e reprodutível recorte. Especialmente em comparação com o hemi-transection ou o modelo de contusão, este clip de aneurisma imita modelo melhores ambientes clínicos. Enquanto pacientes com lesões torácicas sofrem de paraplegia, a maioria dos pacientes com lesão cervicaluries são tetraplégica e completamente dependente. A estrutura anatômica do cordão cervical, no entanto, apresenta diferenças significativas em relação à coluna vertebral torácica ou lombar e, portanto, é dirigida em particular neste protocolo.
O desenvolvimento de cavidades intramedulares e tecido cicatricial são obstáculos para a recuperação e regeneração. Para superar estes obstáculos à utilização de material de andaime é uma abordagem promissora. Péptidos de auto-montagem pode ser injectado directamente no epicentro da lesão. Lá eles se reúnem em andaimes nano-fibras ponte da cavidade e melhorar o ambiente inibitório, reduzindo a inflamação e cicatrização de tecidos. Enquanto materiais rígidos causar danos consideráveis da medula espinhal durante a implantação, os péptidos de fluido podem ser injectados com segurança e sem causar danos adicionais grave.
Melhorar o ambiente inibitório com peptídeos de auto-montagem antes do transplante de células-tronco, assim, apoiar a célula integração, diferenciação e, finalmente, a recuperação funcional após a lesão da medula espinal cervical.
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Protocol
Nota: Os seguintes protocolo experimental foi aprovado pelo comitê de cuidados com os animais da University Health Network (Toronto, Canadá) e está em conformidade com as políticas estabelecidas no guia para o cuidado e uso de animais de experimentação preparado pelo Conselho Canadense de cuidados com os animais .
1. Cervical Aneurysm Clipe Contusão / Compression Modelo
- Antes de instrumentos e autoclave cirurgia manter condições estéreis durante todo o procedimento surgcial, colocando os instrumentos em um banho de álcool a 70%.
- Anestesiar ratos machos Wistar (250-270 g) com uma combinação de oxigénio (O2), óxido nitroso (N2O) (1: 1), e 1,8-2,2% de isoflurano e suportar a respiração espontânea, através de uma máscara de anestesia de gás. Para a indução de anestesia começar com 5% de isoflurano durante 1 minuto e depois reduzir. Antes de iniciar a cirurgia, a profundidade da anestesia controle, dando um estímulo doloroso (ex. Nas patas). Aplicar pomadas gordasnos olhos para evitar a secura e a prevenção de infecções subsequentes.
- Coloque os ratos sobre uma almofada de aquecimento (37 ° C) e fixar a cabeça em um quadro estereotáxico.
- Raspar a região cirúrgica ao redor da coluna cervical e desinfectar com iodopovidona e 70% de álcool.
- Faça uma incisão na linha média acima da espinha da vértebra cervical (C2) chegando ao processus proeminente do corpo vertebral torácica 2 (T2).
- Corte através da camada externa dos músculos da coluna diretamente na linha média (para evitar o sangramento) no sentido crânio-caudal e mais dissecar as camadas musculares mais profundas sem rodeios até chegar ao spinosus processus e as lâminas. Insira afastadores.
- Orientar o proeminente spinosus processus do T2 corpo vértebra para observar os níveis direcionados para laminectomy. Após a identificação e preparação de micro-cirúrgica das lâminas selecionado, cortar o flavae ligamenti para soltar a lâmina e do spinosus processus. Finalmente, cut através das lâminas com um cortador de osso de lateral para a medula espinhal e remover aqueles suave, evitando qualquer compressão da medula espinhal em si.
NOTA: O mais comum são os níveis C5 / 6, C6 / 7, ou C7 / T1. A taxa de mortalidade peri-operatória aumenta o mais rostral do nível da lesão. Sangramento do seio venoso paravertebral é comum e pode ser abordada por compressão cuidado com esponja. - Antes de inserir o clipe para traumatizar a cabo, identificar emergente raízes nervosas para poupá-los a partir de recorte (especialmente a nível C5 / 6).
- A fim de garantir a indução grampo liso, soltar a dura-máter do lado ventral dorsal dos corpos vertebrais com um gancho e preparar um corredor para o grampo.
- Finalmente, insira o clipe aberto e deixá-lo tirar fechada (fechamento rápido) para alcançar uma contusão. Clipe força de fecho e duração de encerramento clipe determinar a intensidade do trauma e o grau de compressão. Comumente usado são forças clipe de entre 15-35 g e um clippiduração ng de por exemplo 1 min. (Figura 1).
- Após a remoção do clipe, adaptar-se os músculos em duas camadas e fechar a ferida.
- Pare de anestesia e deixar o rastro dos animais sob sua observação contínua até que ele recupere a consciência suficiente para decúbito esternal. Por último, coloque o rato em uma gaiola individual e siga as diretrizes de tratamento pós-operatório.
- Dado que os animais lutam com a gravidade deste tipo de lesão, você deve prestar atenção especial para tratamentos pós-operatórios:
- Administrar analgésicos (buprenorfina e meloxicam durante 3 dias e 5 dias, respectivamente, e de acordo com os sintomas clínicos).
- Dê subcutaneamente solução salina adicional durante 3 dias (2 vezes por dia, 5-10 mililitros (ml)).
- Fornecer antibióticos em água potável 2 dias antes e até sete dias após a cirurgia (por exemplo, moxifloxacina)
- Aperte a bexiga urinária 2-3 vezes ao dia até que a recuperação da função da bexiga é constantely aparente.
- Observe déficits neurológicos e condição fisiológica dos animais operados pelo menos uma vez por dia.
2. A injeção de SAPs e NPCs (14 dias após a lesão)
- Induzir a anestesia, conforme descrito no item 1.1. para 1,3, fixar a cabeça do rato em um quadro estereotáxico, retirar os pontos ou clipes de feridas, e desinfectar a ferida e a área cirúrgica com iodopovidona e 70% de álcool.
- Dissecar cuidadosamente os músculos paravertebrais, insira afastadores, remover o tecido cicatricial microscopicamente da dura-máter, e re-expor o local da lesão.
- Prepare SAPs em uma concentração de 1% (w / v) para executar um gel de matriz extracelular. SAPs QL6 tem um pH fisiologicamente compatível e não precisam de ser tamponada, antes da injecção. Para a visualização de PAE na medula espinhal, usar um derivado fluorescente de QL6 (QL6-FITC).
- Injectar SAPs (5 microlitros (ul) para o centro da lesão, distribuídos em duas porções, cada2,5 ul bilateral da linha média. Usando uma seringa de Hamilton ligada à armação estereotáxica com um micro capilar de vidro (100 micrómetros (um) de diâmetro externo (OD)). Abra a dura-máter cuidadosamente com a ponta de uma agulha afiada, e inserir o tubo capilar de vidro estereotaxicamente 2 milímetros (mm) para a medula espinhal traumatizado.
- Após a injecção de 1/3 do volume, remover a agulha a uma profundidade 1,5 mm, e após mais 1/3 a 1 mm. Após a injecção de todo o volume, e antes da remoção da seringa, esperar 5 minutos para estabilizar a formação de gel.
- Para gerar NPCs, use camundongos adultos DsRed (ou YFP camundongos positivos, verde) e isolar e cultivar-los da zona paraventrical 4,18,21.
- Avaliar a viabilidade de NPCs por coloração com azul de tripano, indicando a presença de ~ 90% de células vivas na suspensão de células. Diluir as células em meio de crescimento (50 x 103 células vivas / l) e, em seguida, usá-los para o transplante de células.
- Faça quatro 2 ul (8 ul vo total delume, contendo 4 x 10 5 NPCs) injeções intra-espinhal bilateralmente a 2 mm rostral e caudal do local da lesão. Após a abertura da dura-máter, inserir o micro capilar de vidro Hamilton 1,5 milímetros abaixo da superfície dorsal da medula espinal e injectar 2 ul de suspensão de células. Escolha uma velocidade de injecção de cerca de 0,5 ul / min (min).
- No final de cada injecção e antes da remoção do capilar para fora do cabo, para esperar pelo menos 1 min permitir que o tecido estica para acomodar o volume da célula nova. (Figura 2)
3. Implantação de subdural Bombas para Growth Factor Aplicação
- A fim de enriquecer o cerebral fluido espinhal (CSF) com fatores de crescimento apoiando a sobrevivência da célula, use bombas de micro-osmótica diluindo fatores de crescimento sub-durally ao longo de 7-14 dias, com uma taxa de diluição de 0,5 l / h, um diâmetro de 0,04 cateter cm OD, e um volume do reservatório de 100 ul.
- Escolha factores de crescimento preferidos(Por exemplo, factor de crescimento derivado do cérebro (BDGF), o factor de crescimento epidérmico (EGF), factor de crescimento de fibroblastos (FGF)), encher as bombas de 6-10 horas antes da implantação, bombas e equilibrar num banho de água a 37 ° C.
- Imediatamente após injeções NPC, preparar um recesso subcutânea para colocar a bomba. Locais preferidos são os flancos laterais da toracotomia região abdominal evitar maior desconforto local provocada pela própria bomba.
- Para ganhar a maior concentração de fatores de crescimento, garantir que a ponta do cateter aberto termina próximo ao local da lesão. Portanto, executar um salto-laminectomy do nível superior ou inferior adjacente. Por exemplo, se o SCI é a C7 / T1, realizar uma pequena laminectomia de C5.
- Coloque a bomba no recesso subcutânea, encurtar o cateter com o comprimento necessário, e prenda-o com várias suturas (6.0) nos músculos paravertebrais evitando qualquer luxação associada à circulação.
- Após abertura da dura (por exemplo, em C5) com a ponta afiadade uma agulha, introduzir o cateter no espaço subdural e deixá-lo deslizar em direção caudal, sem qualquer resistência e sem ferir o cabo. A lâmina pulada de eg C6 serve como ponto adicional de fixação e estabilização do cateter.
- Certifique-se de que o cateter corra bem e não se dobra.
- Fechar músculos por camada, e pele, com suturas ou grampos. (Figura 3)
- Pare de anestesia e deixar o rastro dos animais sob sua observação contínua até que ele recupere a consciência suficiente para decúbito esternal. Por fim, colocá-los de volta em uma única gaiola e siga as diretrizes de tratamento pós-operatório.
- Fornecer tratamento pós-operatório especial, embora, os animais poderiam ter recuperado parcialmente a este ponto-time:
- Administrar analgésicos (Buprenorthine e meloxicam durante 3 dias e 5 dias, respectivamente, e de acordo com os sintomas clínicos).
- Fornecer antibióticos em garrafas de água até 2 dias antes7 dias pós-cirurgia (por exemplo, moxifloxacina).
- Continue apertando a bexiga urinária, se ainda for necessário.
- Dê fluidos por via subcutânea adicionais, se os ratos aparecem desidratado.
- Mantenha observando a função neurológica e estado fisiológico dos animais operados pelo menos uma vez por dia.
- Administrar tratamento de imunossupressão dois dias antes da injecção NPC e até 7 dias após o transplante (minociclina) e até o sacrifício (Sandimmune), respectivamente.
Avaliação 4. Tissue
- Sacrificar os animais no final do período de observação (por exemplo. 4 semanas após a SCI) em anestesia profunda (5% de isoflurano durante 2-3 min) e perfundir-los transcardíaca com 50 ml de solução salina fria (4 ° C), seguido por 150 ml de 4 frias % de paraformaldeído em 0,1 M de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
- Remover a medula espinhal e colocá-lo em 4% de paraformaldeído em 0,1 M de solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 24 horas.
- Fornecer criocortes longitudinais com uma espessura de <30 um.
- Para coloração imuno-histoquímica de todos os núcleos de células-proporcionando um uso do fundo DAPI (1: 1.000). DsRed NPCs positivos aparecem em vermelho, QL-6 FITC aparece verde, e ambos, portanto, não precisa de ser marcadas especialmente. (Figura 4).
- Para a microscopia eletrônica de varredura (SEM) deixe amostras de molho em glutaraldeído a 4 ° C, durante 2 horas, desidratam-los lentamente em passos de 10% de incremento de etanol durante 5 minutos e coloque-os em um pressurizado líquido CO 2 sifão para a 1 hora. Scaffolds revestimento com ouro usando um revestidor por crepitação. Tire fotos com a Hitachi S-3400N microscópio eletrônico de varredura. (Figura 5)
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Representative Results
Ao executar o procedimento acima descrito, irá obter um andaime SAP colmatar a cavidade e que oferece uma melhoria do ambiente inibitório, menos tecido cicatricial, e um aumento na sobrevivência NPC. A Figura 4 mostra uma secção longitudinal de uma medula espinal de rato obtido no local da lesão 6 semanas após SCI e 4 semanas após a injeção QL6 SAP e transplante NPC. Peptídeos QL6 foram injetados com êxito ao cabo, agregadas no epicentro e difusa rostro-caudal na penumbra. Microscópio Eletrônico de imagiologia mostra ainda, na Figura 5, a montagem de 1% (w / v) peptídeos QL6 para um andaime de nanofibras dentro de 2 hr diluído em soluções PBS.
Esta matriz proporciona uma melhoria do ambiente inibitório contribuindo para o aumento da sobrevida celular e diferenciação celular, menos cicatrizes de tecido e, finalmente, leva a uma melhor chance de recuperação funcional.
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Figura 1: Grampo modelo aneurisma contusão / compressão (A) fotografia através do microscópio cirúrgico após laminectomy de C7 / T1 e clipe de contusão / compressão da medula espinhal de um rato (B) Imagem do clipe com a mola anel garantindo preciso.. fechando vigor.
Figura 2: pontos de injeção de SAPs e das células estaminais ilustração gráfica dos pontos de injeção.: 2 injeções SAP estereotaxicamente realizados no epicentro da lesão, seguido de 4 injeções de NPCs nas colunas dorsais adjacentes, com uma distância de 2 milímetros caudal e rostral a partir do epicentro.
Figura 4: O sucesso da entrega SAPs e NPCs na medula espinhal cervical de coloração fluorescente (DAPI fundo, azul) de uma secção longitudinal de uma medula espinal de um rato traumatizada.. SAPs marcado (QL6-FITC, verde) foram agregadas no epicentro da lesão. NPCs injetados (DsRed positivo, vermelho) têm difundido emdireções rostral e caudal. Barra de escala refere-se até 5 mm.
Figura 5:. Nanofibras andaime formação microscópio eletrônico de varredura (SEM) imagem que mostra a formação de andaime de nanofibras de SAPs montados. Barra de escala refere-se a 1 mm).
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Discussion
Este protocolo foi desenvolvido para permitir que o leitor para realizar um modelo de lesão cervical em ratos e usar uma abordagem de tratamento combinado com SAPs e NPCs que promovem uma melhor recuperação após SCI cervical.
Particularmente em relação a outros modelos de trauma cervical, como o (hemi) -transection modelo ou os modelos de queda de peso e de concussão, o modelo clipe contusão / compressão representa tanto importantes mecanismos de trauma fisiopatológicos - portanto, imita melhores condições clínicas contusão e compressão que e. Enquanto é bem estabelecido para a utilização em rato e ratinho espinha torácica 7-11, foi recentemente adaptado para utilização na coluna cervical. Este foi um passo importante, pois lesões na medula espinhal cervical são as mais freqüentes na clínica e anatomia cervical varia significativamente de coluna torácica. Além disso, pacientes com LME cervical que sofrem de tetraparesia estão ansiosos para recuperar, pelo menos parcial do motor função de suas extremidades superiores.
Aspectos desafiadores de um SCI cervical experimental, no entanto, são a alta taxa de mortalidade que aumenta em uma direção rostral de C7 a C5 e pode atingir até 20-30% na coluna cervical médio e superior. Além disso, as raízes nervosas emergentes (especialmente em C5 / 6) são sensíveis a manipulação, e no caso que não são conservados, danos e irritação pode causar mastigação das patas frontais, resultando na necessidade de um sacrifício precoce dos animais. Em geral, os animais com lesão medular cervical precisam de muita atenção e cuidados pós-operatórios e mostrar um curso mais longo de recuperação. Por outro lado, para além da preparação cirúrgica cuidadosa, estes problemas podem ser parcialmente abordados através da adaptação da gravidade da lesão, seleccionando uma força de fecho clipe apropriado (por exemplo, 15 a 35 g) e um tempo de corte adequado (por exemplo, 1 min). Modificando esses parâmetros levar a diferentes gravidades do ferimento (leve, moderate, ou grave SCI). Além disso, pode haver um risco de dependência cirurgião ou uma distribuição desigual dos danos. Para resolver estes problemas da utilização de um aplicador de clipe é uma opção quando o clipe é libertado sempre fechada e, portanto, com a mesma velocidade e, portanto, de velocidade. Antes de tirar o clipe é obrigatório para garantir que o clipe tem a sua posição correta e envolve toda a medula espinhal de forma igual. Desafio cirúrgico especial reside no re-exposição do sítio de lesão remover o tecido cicatricial da dura-máter. Recomenda-se que este procedimento é executado micro-cirurgia, utilizando preparação afiada, e evitando qualquer tipo de pressão ou de puxar o cabo fixo.
Peptídeos auto-montagem foram identificadas tendo potenciais para colmatar a cavidade e, além disso, para melhorar o ambiente inibitório no local da lesão, finalmente, levando até mesmo à regeneração axonal e brotando 5, 12,13,14. QL-6 nanofibras montar andaimes para pontea cavidade intramedular e, portanto, pode proporcionar uma matriz para germinação e a regeneração axonal e melhorar o meio ambiente inibidor antes do transplante de células. As vantagens destes péptidos reside na sua baixa viscosidade (fluido) e a pH neutro. Especialmente em comparação com hidrogéis ou andaimes de tecidos de alta viscosidade, SAPs podem facilmente injectado na medula lesionada e lesões adicionais derivadas a partir da injecção em si são limitados.
Embora QL6 nanofibras si pode melhorar a sobrevivência da célula 4,15, no entanto, o uso de fatores de crescimento parece ser 16,17,18,19,20,21 vantajosa. Eles podem ser administrados quer por hidrogéis libertam factores de crescimento 22, ou por aplicação por meio de bombas osmóticas (como descrito acima). As bombas osmóticas ligados aos cateteres subdurais oferecem a vantagem de uma libertação contínua e controlada e, portanto, o enriquecimento do colo do útero de fluido espinal (CSF). Colocando o cateter subdural, no entanto, é challenging especialmente com respeito à grande cicatriz que pode ter ocorrido depois de algumas semanas após a lesão.
A fim de proporcionar boas condições de tecido para NPC sobrevivência e integração, vários estudos têm escolhido pontos de injeção na substância branca adjacente, 2 milímetros rostral ou caudal para o local da lesão e não diretamente no epicentro da lesão 4,15,18. Lá, NPCs têm uma melhor chance de sobrevivência, integração e diferenciação em astrócitos, oligodendrócitos ou neurônios, e podem migrar em direção ou na lesão, resultando em axônios e melhor conectividade axonal.
Depois de dominar essas técnicas este poder protocolo proposto para ser adotado pelos usuários individuais de acordo com as suas necessidades e interesses que abrangem modificações do nível e da gravidade da lesão, o uso de diferentes tipos de células ou factores de crescimento, ou a adição de outras substâncias neuro-protetor .
Emresumo, o tratamento combinado com SAPs e NPCs podem oferecer uma nova e promissora abordagem superar os obstáculos mais difíceis do tratamento da SCI: cavidades e tecido cicatricial.
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Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer o apoio de financiamento para este trabalho a partir do Canadian Institutes of Health Research (CIHR), a Fundação Krembil Família, o Presidente Halbert em Neural Repair and Regeneration, Phillip e Peggy DeZwirek, e Gordon Yao para a contribuição para a Figura 2 . Klaus Zweckberger foi financiado por uma doação da "Deutsche Forschungsgesellschaft" (DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aneurysmal clip | SharpTech | ||
| Surgical microscope | Leica | ||
| Micro injection system | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | ||
| Hamilton syringe | Hamilton company | ||
| Subdural pumps |  Alzet osmotic micro pump 1007D |
||
| Surgical instrument | Fine Science tools | ||
| Isoflurane USP | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | ||
| 0.9% Sodium Chloride injection USP | Baxter | ||
| 7.5% Povidone iodine | Purdue Pharma | ||
| 70% Isopropyl alcohol USP | GreenField Ethanol Inc. | ||
| QL6 SAP | Covidien | ||
| 0.4% Trypan blue | Gibco | ||
| Platelet-Derived Growth Factor (PDGF) | Sigma | ||
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | ||
| Fibroblast Growth Factor (FGF) | Sigma |
References
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