Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Fluorescens-basert overvåking av PAD4 aktivitet via en Pro-fluorescens substratanalog

Published: November 5, 2014 doi: 10.3791/52114
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry, Lehigh University

Introduction

Et stort antall pattedyrproteiner er sterkt modifisert ved innvirkning av enzymer som følge av biosyntesen av proteiner ved ribosomet. Disse posttranslasjonelle modifikasjoner (PTMs) kan øke den funksjonelle mangfoldet i proteomet ved å endre størrelse, kostnad, struktur og oligomerisering staten (blant andre funksjoner) av proteiner 1-3. Som et resultat, kan endringen i proteinstrukturen føre til fysiologiske konsekvenser, for eksempel proteindegradering, celledifferensiering, signalering, genekspresjon i modulering, og protein-protein interaksjoner. Mens disse modifikasjonene er utbredt i en stor andel av alle menneskelige proteiner, avslutter terminalen på histonproteiner gjennomgå et uvanlig høyt antall kovalente modifikasjoner 4. Histonproteinene er en familie av strukturelle proteiner som letter kondensasjonen av genomisk DNA. Kovalente modifikasjoner av de ustrukturerte histone haler er gjennomført og regulert av en series av enzymer som kan katalyserer kovalent modifisering av rester (forfattere), reversere de samme modifikasjoner (viskelær), og skille mellom de endringene som blir trykt på de histone haler (lesere) 5-7. Faktisk kan de fleste av de kjente PTMs holdes innenfor denne korte segment av histon inkludert metylering, fosforylering, acetylering, sumoylation, ubikineringsinhibitor, og citrullination 8.

Citrullination involverer omdannelse av peptidyl-arginin til det ikke- t-RNA som er kodet peptidyl-citrullin (figur 1A). De proteiner, som er ansvarlige for denne sidekjede nøytralisering, er medlemmer av puten (p eptide en rginine eiminase d) proteinfamilien, som alle er kalsium-avhengige enzymer. 9,10. Til dags dato har fem medlemmer av PAD familien blitt beskrevet (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4, og PAD6). Hvert medlem av denne familien ser ut til å målrette bestemte cellulære proteiner og også viser unique vev distribusjons profiler. PAD4 er det eneste medlemmet av dette protein familien er kjent for å være lokalisert i kjernen via et kjernelokaliseringssekvens 11. Følgelig har det vist seg å deiminate en rekke kjernefysiske mål, også arginin sidekjeder på de N-terminale haler av histoner H2A argininrest 3 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17, og H3R26) og H4 (H4R3) 12, 13. Mens hver av PAD isozymer har konkrete og kritiske fysiologiske funksjoner, har PAD4 fått betydelig mer oppmerksomhet på grunn av sin rolle i en rekke menneskelige prosesser i både syke og friske celler. Nylig, PAD4 viste seg å være et medlem av pluripotency transkripsjonell nettet 14. Begge PAD4 uttrykk nivåer og aktivitet ble vist å være forhøyet ved omprogrammering og bakkestats pluripotente stater i mus. Ved å kontrollere reguleringen av stamcelle gener, kan PAD4 beholde en sentral rolle i cellulær omprogrammering effektivitet. PAD4 har også vært innblandet idannelse av nøytrofile ekstracellulære feller, som ved binding av patogener aktivere deres system klaring. Den hypercitrullination av histon proteiner ved PAD4 induserer decondensation av kromatin, som tjener som basismateriale for innkapsling av patogene bakterier hos den ekstracellulære felle, således valgkrets av bakterielle infeksjoner 15,16.

I tillegg har PAD4 blitt funnet å spille en aktiv rolle i en rekke menneskelige sykdommer. Det er tidligere blitt vist at avvikende ekspresjon av PAD4 er forbundet med utbrudd og alvorlighetsgraden av reumatoid artritt, Alzheimers, Parkinsons sykdom, multippel sklerose og 17. Faktisk nærvær av anti-protein-antistoffer citrullinert er en av de mest pålitelige og definitive diagnostiske og prognostiske biomarkører av reumatoid artritt 18.. Likeledes har dysregulerte PAD4 aktivitet har nylig blitt observert i en rekke humane kreftformer, inkludert eggstokkreft, bryst, lunge, end esophageal kreft 19-22. Koblingen mellom PAD4 og kreft har blitt vist å være mediert gjennom ELK1 onkogen eller via p53 tumor suppressor protein 22,23 og tidligere arbeid har foreslått at PAD4 kan være en ny anti-cancer terapeutisk mål 17,24,25. Som et bevis på prinsippet studie ble uttømming av PAD4 via shRNA i tykktarmskreft cellelinje HCT116 avslørt å være tilstrekkelig for å indusere apoptose og cellesyklus arrest 26. En nylig utviklet irreversible PAD4 inhibitor førte til en sytti prosent reduksjon i tumormasse i mus 27. Ganske bemerkelsesverdig, dukket PAD4 hemming å fungere som en målrettet terapi som resulterte i selektiv avliving av kreftceller mens sparsom utransformerte celler.

Bruken av små molekyler for å slå av funksjonen til PAD4 kan vise seg å være en kraftig ny strategi for å målrette kreftceller eller å forsterke eksisterende kreft kjemoterapeutika 28. Dessverre, en potelt reversibel PAD4 inhibitor har ennå å bli oppdaget. Et antall kovalente inhibitorer har blitt utviklet ved hjelp av klor / fluor imidin håndtak som etterligner arginin substratet 27,29,30 og har vist seg å være praktiske verktøy for å forstå rollen til PAD4 i både friske og syke celler tilstand. Imidlertid er disse molekyler inhibere alle de aktive elektroder med lik potens. Derfor er det behov for en lettvint assay som rapporterer på aktiviteten av PAD4 avgjørende. Til dags dato har PAD4 analyser blitt beskrevet som knytter frigjøring av ammoniakk fra reaksjonen til en kolorimetrisk avlesning 31, benytte en fluorescensmerket chloroamidine substratanalog for fluorescens-polarisasjon assay 32, er avhengige av den syre-assistert reaksjon mellom glyoksal og citrullin 33, og par av PAD4 aktiviteten til et fluorescens dequenching trinn 34. Av disse er bare den kovalente modifier haloacetamidine strategien har vist seg å være kompatible med high-throughput skrEning plattformer 32,35,36. Vi beskriver en lettvinte fluorescens basert assay som på en pålitelig måte måler aktiviteten av PAD4. Analysen, som viser et sterkt signal-til-støy-forhold, hastighet for analyse, og robusthet for måling, har potensial til å oppdage en virkelig potent og selektiv inhibitor PAD4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. PAD4 Transformation, Expression, og rensing

  1. For PAD4 Transformation, forvandle pGEX plasmid som inneholder PAD4 GST fusjon i kjemisk kompetente E. Coli (BL21 (DE3)) celler for protein uttrykk ved hjelp av følgende prosedyre. Forbered kjemisk kompetent (kalsiumklorid) E. Coli (BL21 (DE3)) celler i henhold til standard protokoller.
    1. Tine 50 pl på forhånd fremstilt kjemisk kompetente BL21 (DE3) celler på is og blandes med 1 pl av den pGEX plasmid inneholdende genet PAD4 i en 5 ml kultur-rør. Inkuber blandingen på is i 10 minutter under forsiktig risting hvert 2 min.
    2. Varmesjokk cellene ved å plassere blandingen i et 42 ° C vannbad i 40 sekunder. Umiddelbart plassere celle-plasmid blandingen tilbake på is i 2 min for å tillate cellene å komme seg. Tilsett 1 ml steril LB-næringsløsning til blandingen, og plassere på is i 1 min.
    3. Inkuber cellene varmesjokkbehandlet ved 37 ° C risting ved 250 rpm i 1hr. Pipetter 75 ul av de transformerte celler på en ampicillin resistent agar plate og inkuberes ved 37 ° C i 15 timer. Butikkplaten ved 4 ° C.
  2. PAD4 Expression.
    1. Plukk en koloni av BL21 (DE3) celler fra en agar-plate og ampicillin sted i 5 ml LB inneholdende 1 x ampicillin. Plass i inkubatoren og rist O / N ved 37 ° C.
    2. Overfør 5 ml av LB (starter) i 1 liter sterilt LB inneholdende 1 x ampicillin-trihydrat (MW 403,45 g / mol). Vekst sted i en 37 ° C rysteinkubator. Overvåk OD 600 av veksten. Når veksten når en OD 600 på 0,3, flytte vekst i 16 ° C risteinkubator.
    3. Ved å nå en OD 600 på 0,6, indusere cellene med 0,3 mM isopropylthiagalactoside (IPTG, MW 238,30 g / mol). Tillate cellene å riste i 15 timer ved 16 ° C.
    4. Høste cellene ved sentrifugering ved 4000 xg i 20 min ved 0 ° C. Hell av supernatanten og pelleten lagre ved -80 ° C.
  3. PAD4 Rensing
    1. Re-suspendere pelleten inneholdende den uttrykte PAD4 i BL21 (DE3) celler i en buffer av 50 mM NaCl (MW 58,44 g / mol), 300 mM NaH 2PO 4 (MW 119,98 g / mol), 10 mM imidazol (MW 68,077 g / mol), 0,1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF, MW 174,94 g / mol) og 1 mM ditiotreitol (DTT, 154,25 g / mol), pH = 8,0.
    2. Lysere cellene via ultralydbehandling i 15 minutter ved 4 ° C. Etter sonikering, sentrifuger cellelysat ved 20.000 xg i 20 min ved 0 ° C. Hell av og lagre supernatant. Batch supernatanten med glutation (GSH) agarosekuler i 30 minutter ved RT.
    3. Renne supernatant fra GST perler / kolonne via tyngdekraften. Vasking av perler med 4 x 25 ml av 1 x PBS (fosfatbufret saltvann, pH = 8,0) ved romtemperatur.
    4. Elute PAD4 med 2 x 10 ml elueringsbuffer, 50 mM tris (hydroksymetyl) aminometan (Tris Base, MW 121,14 g / mol), 10 mM glutation (GSH, MW 307,32 g / mol), pH = 8,0.
    5. Konsentrer PAD4 bruker 100k MW cut-off sentrifugerør og sentrifuger ved 4000 xg i 20 min ved 4 ° C. Delmengde protein i 200 mL volumer i 1,0 ml mikrosentrifugerør og oppbevar ved -80 ° C.

2. Å Stock Løsninger for buffere

  1. Vei ut natriumklorid (NaCl, 58.44 MW g / mol) og fremstille en 2 M oppløsning. Bland løsningen inntil klart.
  2. Vei ut Tris (hydroksymetyl) aminometan (Tris Base, MW 121,14 g / mol) og fremstille en 2 M-løsning, pH = 8,0. Bland løsningen inntil klart.
  3. Vei ut kalsiumklorid-dihydrat (CaCl2 2 H 2 O, MW 147,01 g / mol) og fremstille en 500 mM oppløsning. Bland løsningen inntil klart.
  4. Vei ut Tris (2-karboksyetyl) fosfin (TCEP, MW 250,19 g / mol) og fremstille en 200 mM oppløsning. Bland løsning inntil klar og oppbevar ved -20 ° C.
  5. Vei ut ditiotreitol (DTT, MW 154,25 g / mol) og fremstille en 1 M oppløsning. Bland løsning inntil klar og oppbevar ved -20 ° C.
  6. Forbereden 0,5% løsning av Triton X-100.
  7. Vei ut etylendiamintetraeddiksyre (EDTA, MW 292,24 g / mol) og fremstille en 100 mM oppløsning. Bland løsningen inntil klart.
  8. Vei ut Z- Arg Arg 7- amido- 4- metylkumarin-hydroklorid (ZRcoum, MW 621,69 g / mol) og fremstille en 10 mM oppløsning i dimetylsulfoksyd (DMSO).

3. PAD4-analysen ved 37 ° C

  1. Fra 10 mM ZRcoum lager, forberede en 125 mikrometer løsning av ZRcoum i vann. Denne 125 mikrometer ZRcoum løsningen vil være Løsning A.
  2. Tilbered en buffer på 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl2, 6,25 mM DTT og 5 uM PAD4 (pH = 8,0). Dette vil være Solution B.
  3. Tilbered en buffer på 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl2, og 6,25 mM DTT (pH = 8,0). Dette vil være Løsnings C.
  4. Vei ut Trypsin, krystallinsk (fra bovin pankreas) og fremstille en 10 mg / ml i 100 mM EDTA. Bland løsning inntil klar og oppbevar ved -20° C. Dette vil være Solution D.
  5. Få tak i en 96-brønns plate og utpeke et antall brønner for kontroller (ingen PAD4) og testbrønner (+ PAD4).
  6. Pipetter 160 mL av løsning B i testbrønner og pipette 160 ul oppløsning C i kontrollbrønner. Inkuber i 15 minutter ved 37 ° C.
  7. Pipetter 40 mL av Oppløsning A i alle brønner og inkuber ved 37 ° C i 45 minutter.
  8. Pipetter 10 mL av dH 2 O til halvparten av kontrollbrønnene og halvparten av testbrønnene. Til den andre halvparten av kontrollbrønner og test kontroller, pipettes 10 ul oppløsning D. Inkuber i 10 minutter ved 37 ° C.
  9. Skaff en fluorescens lesing på en multimodal leseren med en eksitasjon bølgelengde på 345 nm og en emisjon bølgelengde på 465 nm.

4. PAD4 analysen ved RT

  1. Fra 10 mM ZRcoum lager, forberede en 50 mikrometer løsning av ZRcoum i vann. Denne 50 M ZRcoum løsningen vil være Løsning A.
  2. Forbered en buffer på 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2, 2 mM TCEP, 0,02% Triton X-100 og 8 pM PAD4 (pH = 8,0). Dette vil være Solution B.
  3. Tilbered en buffer av 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2, 2 mM TCEP, og 0,02% Triton X-100 (pH = 8,0). Dette vil være Løsnings C.
  4. Vei ut Trypsin, krystallinsk (fra bovin pankreas) og fremstille en 10 mg / ml i 100 mM EDTA. Bland løsning inntil klar og oppbevar ved -20 ° C. Dette vil være Solution D.
  5. Få tak i en 384-brønn plate og utpeke brønner for kontroller (ingen PAD4) og testbrønner (+ PAD4).
  6. Pipetter 25 mL av løsning B i testbrønner og pipette 25 ul oppløsning C i kontrollbrønner. Tillat buffer med / uten PAD4 å inkubere i brønnene i 20 minutter ved RT.
  7. Pipetter 25 ul av løsnings C inn i alle brønnene og inkuber i 45 min ved RT.
  8. Pipetter 10 mL av dH 2 O til halvparten av kontrollbrønnene og halvparten av testbrønnene. Til den andre halvparten av kontrollbrønner og test kontroller, pipettE 10 mL av Oppløsning D. Inkuber ved RT i 10 min.
  9. Skaff en fluorescens lesing på en multimodal leseren med en eksitasjon bølgelengde på 345 nm og en emisjon bølgelengde på 465 nm.

5. PAD4 Tidsforløpet Analyser ved 37 ° C og RT

  1. Fra 10 mM ZRcoum lager, forberede en 125 mikrometer løsning av ZRcoum i vann. Denne 125 mikrometer ZRcoum løsningen vil være Løsning A.
  2. Tilbered en buffer på 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl2, 6,25 mM DTT og 5 uM PAD4 (pH = 8,0). Dette vil være Solution B.
  3. Vei ut Trypsin, krystallinsk (fra bovin pankreas) og fremstille en 10 mg / ml i 100 mM EDTA. Bland løsning inntil klar og oppbevar ved -20 ° C. Dette vil være Løsnings C.
  4. Skaff to 96-brønners plater og pipette 160 ul oppløsning B i # mengde brønner (# brønner vil avhenge av hvor mange tidspoeng).
  5. Inkuber i en 96-brønners plate ved 37 ° C. Inkuber den annen 96-brønners plate ved RT.
  6. PipEtte 40 pl av løsning A i alle brønner i både 96-brønners plater og umiddelbart pipettere 10 mL av Oppløsning C til t = 0 min brønnene. Fortsett tilsetning av 10 ul av løsnings C ved bestemte tidspunkter inntil alle brønner har blitt slukket.
  7. Skaff en fluorescens lesing på en multimodal leseren med en eksitasjon bølgelengde på 345 nm og en emisjon bølgelengde på 465 nm.

6. PAD4 inhibisionsanalvse ved RT

  1. Fra 10 mM ZRcoum lager, utarbeide en 83 mikrometer løsning av ZRcoum i vann. Denne 83 mikrometer ZRcoum løsningen vil være Løsning A.
  2. Vei ut Cl-amidine (MW 424,8 g / mol) og forberede en 100 mikrometer stamløsning. Dette vil være Solution B.
  3. Tilbered en buffer av 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2, 2 mM TCEP, 0,02% Triton X-100 og 8 pM PAD4 (pH = 8,0). Dette vil være Løsnings C.
  4. Tilbered en buffer av 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2, 2 mM TCEP, og 0,02% Triton X-100 (pH = 8,0). Ther vil være Solution D.
  5. Vei ut Trypsin, krystallinsk (fra bovin pankreas) og fremstille en 10 mg / ml i 100 mM EDTA. Bland løsning inntil klar og oppbevar ved -20 ° C. Dette vil være Løsning E.
  6. Få tak i en 384-brønn plate og utpeke brønner for kontroller (ingen PAD4), testbrønner (+ PAD4) og hemming brønner (PAD4 + Cl-amidin-).
  7. Pipetter 25 mL av løsning C til testbrønner og pipette 25 ul oppløsning D i kontrollbrønner. Tillat buffer med / uten PAD4 å inkubere i brønnene i 20 minutter ved RT.
  8. Pipetter 10 mL av løsning B i hemming brønner og inkuber i 20 min på RTE.
  9. Pipetter 15 pl av løsning A til alle brønnene og inkuber i 45 min ved RT.
  10. Pipetter 10 mL av Solution E til alle brønnene. Inkuber ved RT i 10 min.
  11. Skaff en fluorescens lesing på en multimodal leseren med en eksitasjon bølgelengde på 345 nm og en emisjon bølgelengde på 465 nm.

7. Crude cellelvsat analysenved RT

  1. Etter høsting av celler fra PAD4 1 L vekst, resuspender cellene i 10 ml 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 0,1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF, MW 174,94 g / mol) og 1 mM ditiotreitol (DTT, 154,25 g / mol), pH- = 8,0.
  2. Lysere cellene via ultralydbehandling i 15 minutter ved 4 ° C. Sentrifuger cellelysatet ved 20.000 xg i 20 min ved 0 ° C. Konsentrer den klare supernatant til det halve volum ved sentrifugering ved 4000 rpm ved 4 ° C ved anvendelse av 100k MW cut-off-sentrifugerør.
  3. Fra 10 mM ZRcoum lager, forberede en 250 mikrometer løsning av ZRcoum i vann. Denne 250 mikrometer ZRcoum løsningen vil være Løsning A.
  4. Tilbered en buffer av 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2 og 2 mM TCEP (pH = 8,0). Dette vil være Solution B.
  5. Vei ut Trypsin, krystallinsk (fra bovin pankreas) og fremstille en 10 mg / ml i 100 mM EDTA. Bland løsning inntil klar og oppbevar ved -20 ° C. Dette vil være Løsnings C.
  6. Få tak i en svart 384-brønners plate og designspiste brønner for kontroller (ingen celle lysat) og testbrønner (+ celle lysat).
  7. Pipetter 100 mL av løsning B til alle brønnene og pipette 60 mL av cellelysat i testbrønner. Inkuber i 20 min ved RT.
  8. Pipetter 40 mL av Oppløsning A i alle brønner og inkuber i 45 min ved RT.
  9. Pipetter 10 mL av Oppløsning C til alle brønner. Inkuber ved RT i 10 min.
  10. Skaff en fluorescens lesing på multimodal leseren med en eksitasjon bølgelengde på 345 nm og en emisjon bølgelengde på 465 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Innledningsvis ble det vist at ZRcoum kan rapportere om aktiviteten av PAD4 i en 96-brønn plate-format. Brønner ble inkubert med substratet ZRcoum og i nærvær / fravær av PAD4. Etter en inkubasjonsperiode på 45 min ved 37 ° C, ble fluorescensen målt med en 340/40 - 475/15 nm filter (figur 2A). Som ventet holdt seg lav som Fluoroforen innen ZRcoum (eller citrullinert ZRcoum) fluorescens nivåer forble i låst tilstand. Ved tilsetning av overskudd av trypsin / EDTA til løsningen, fluoroforene var frigjort fra ZRcoum men holdt seg stort sett uforandret i nærvær av PAD4. Tilsetningen av EDTA er ment å bistå ved opphør av PAD4 reaksjonen på grunn av sin evne til å chelatere nødvendige kalsiumioner. Fra disse data ble en 5,2-gangers nedgang i fluorescens observert utgang i nærvær av PAD4. Neste, kompatibility av den nyutviklede analysen med high-throughput screening plattformer ble demonstrert. Det var av primær interesse å analysere reaksjons fire variabler som vil være mest gunstig for screeningformål (1) den videre miniatyrisering av analysevolumet (2) muligheten for å utføre analysen ved RT (3) stabiliteten av proteinet og bufferblanding før du fullfører analysen og (4) den potensielle forstyrrelser av organiske løsemidler / vaskemidler.

For midt-eller high-throughput screening innsats, er høy tetthet brønnplater vanligvis benyttes i små molekyl skjermer. Det ble bekreftet at analysen kan utføres nesten identisk i en 384-brønners plate i forhold til en 96-brønns plate (figur 2B). I videre å bestemme arbeidsforholdene for analysen i en high-throughput format, var det viktig å undersøke om PAD4 aktivitet kan overvåkes i en rimelig tidsramme på RT. Siden ikke alle flytende-håndtering instrumentene haren temperaturkontroller, kan det bli tungvint og kostbart å ha et inkuberingstrinn ved forhøyet temperatur. Videre kan regnskap for svingninger i temperatur være en årsak til avvik mellom plater og løper. For å bestemme effekten av lavere temperaturer for analysen som er beskrevet her, ble en lignende analyse utført ved RT. Det ble funnet at de signaler som var tilnærmet uforandret mellom 37 ° C og RT (figur 3). For å optimalisere ytelsen ytterligere assay ved å minimere den nødvendige inkubasjonstid mellom PAD4 og substratet, ble kinetikken til reaksjonen analysert. PAD4 aktivitet ble overvåket over tid både ved RT og 37 ° C. Som ventet, viser det seg at PAD4 er mer aktiv ved 37 ° C (i overensstemmelse med human fysiologisk temperatur) med reaksjons hovedsakelig fullført etter 20 min. Tilfredsstillende måte, er reaksjonen ikke sterkt påvirket av reduksjonen i temperaturen ned til romtemperatur. Reaksjonen forløper ved omtrent halvparten av den hastighet som vedforhøyet temperatur, og er egentlig ferdig 40-45 min etter innvielsen. Fra den tiden kurset analyser, ble kinetikk konstanter beregnet og parametrene (K M = 397 mikrometer, k cat = 2.98 sek -1, k cat / k M = 7.400 sek -1 M -1) ble funnet å være lik andre PAD4 substrater. 31. Med kinetikken til reaksjonen karakterisert, ble alle etterfølgende assayer redusert til 1 time fra begynnelsen til målepunktet.

Deretter ble stabiliteten av PAD4 ble evaluert når det er oppløst i reaksjonsbuffer i løpet av en forlenget tidsperiode. Realistisk, vil high-throughput screening krever reagenser å være generelt stabilt i mange timer mens instrumentet er å fullføre skjermen. Hvis enkelte reagenser har en relativ holdbarhet av minutter, kan det være ganske dyrt og tidkrevende å terminere skjermen for å forberede ferske reagenser. Avhengig av analysebetingelser, er det ikkeuvanlig for noen analyser for å være uforenlig med høy gjennomstrømning screening for denne svært grunn. Med denne ideen i tankene, ble stabiliteten av PAD4 i buffer overvåkes i løpet av flere timer. Nesten ikke noe tap i enzymatisk aktivitet ble observert over hele tidsperioden, således indikerer at proteinet er stabilt selv etter å ha sittet ved RT i løpet av 15 timer (figur 4A). Deretter ble det vurdert om analysen kjøres under miniatyriserte betingelser og ved RT ville fortsatt å reagere på nærværet av et PAD4. Ved inkubering av den kjente PAD4 inhibitor, chloroamidine (Cl-amidin), førte til en komplett restaurering av den fluorescens-signalet i samsvar med den fullstendige inhibering av PAD4 (figur 4B). Endelig ble det også bekreftet at tilstedeværelsen av det organiske løsningsmiddel DMSO, som vanligvis anvendes i stamløsninger av små molekyler, opp til 3% som sluttvolum, ikke interferere med analysen (data ikke vist). Likeledes, tilsetning av 0,01% Triton X-100 resulterte i simIlar fluorescens trender (data ikke vist).

Etter å ha vist at analysen er tolerant overfor en rekke forhold som vanligvis påtreffes i småmolekylære legemiddel innsats, ble en preliminær screening av forbindelser 80 utført, og en robust Z 'verdi på 0,71 ble identifisert. For å fremme potensialet av analysen, ble selektiviteten av PAD4 / ZRcoum reaksjonen fremhevet ved å utføre reaksjonen i rå helcellelysater. E. coli-celler inneholdende GST-PAD4 ekspresjonsvektor ble indusert med IPTG, i likhet med fremgangsmåten anvendt for isolering av GST-PAD4. Etter avbrudd av cellemembranen via sonikering, ble cellerester separeres ved sentrifugering under dannelse av et klaret cellelysat. Når PAD4 holdige cellelysat ble sendt til de samme analysebetingelser som den rensede GST-PAD4 analysen, fluorescens signalet varieres i samråd med tilstedeværelse av aktive PAD4 i løsning ( > Figur 5). Cellelysater inneholder en rekke biomacromolecules ved høye konsentrasjoner som eventuelt kunne forstyrre aktiviteten av PAD4, de fluorescerende egenskapene til ZRcoum, og trypsin trinn. Oppdagelsen av at analysen var funksjonelt i rå cellelysater indikerer at det er en høy selektivitet i reaksjonen mellom PAD4 og ZRcoum. For ytterligere å demonstrere at signalet reduksjon i nærvær av rå cellelysater var spesifikk for tilstedeværelse av aktiv PAD4, effekten av Cl-amidin, en etablert PAD4 kovalent inhibitor, ble evaluert. Tilsetningen av Cl-amidin førte til en gjenopprettelse i fluorescens-signal, i samsvar med inaktiveringen av PAD4 (figur 5). Til sammen ble det demonstrert at analysen kan ytterligere forenkles ved å benytte rå cellelysater for overvåking av PAD4 aktivitet.

2114 / 52114fig1highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 1. PAD4 og utformingen av dets fluorescens-basert assay. (A) tegneserie representasjon av histon sammenstillinger som utgjør den grunnleggende enhet av en nucleosome. PAD4 katalyserer citrullination av et antall argininrester på histonproteinene. (B) ZRcoum kledde med de innfødte substrat (skjult for klarhet) av PAD4 (tiltredelse kode 2DW5). (C) representasjon av trinnene i en typisk PAD4 assay. Citrullination ved PAD4 av underlaget ZRcoum reduserer dens mottakelighet for trypsin-mediert amidhydrolyse, og dermed forårsaker en endring i fluorescens nivåer. Klikk her for å se en større versjon av figuren.

Figur 2 Figur 2. PAD4 analyse i 96-brønners og 384-brønn plate-format. Fluorescens ble målt (345 nm eksitasjon / emisjon 465 nm) i både en 96-brønns-format (A) og 384-brønnformat (B) med de angitte betingelser (37 ° C). Tilsetningen av protease trypsin fører til en stor økning i fluorescens-nivåer i brønner uten PAD4 og forblir tilnærmet uendret for brønner med PAD4. Data er representert som gjennomsnitt + SD (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av figuren.

Figur 3
Figur 3. Tidsforløp analyse av PAD4 assay. Fluorescens ble målt (345 nm eksitasjon / emisjon 465 nm) med jevne mellomrom i en 96-brønners plateformat i løpet av 70 min med protein blir inkubert enten ved 37° C (A) eller ved romtemperatur (B). Data er representert som gjennomsnitt +/- SD (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av figuren.

Figur 4
Figur 4. Protein stabilitet og inhiberingen. (A) Aktiviteten av PAD4 ble målt etter de angitte tidsintervaller. For sammenligning, er fluorescens nivåene vist i fravær av PAD4. Fluorescens nivåer er vist tidligere (rød) og følgende (grønn) tilsetning av trypsin. (B) innføring av den kjente inhibitor PAD4 Cl-amidin (100 pM) førte til en gjenopprettelse av den fluorescerende signal i en 384-brønners plateformat ved RT. Fluorescens nivåer er vist tidligere (rød) og følgende (grønn) tilsetning av trypsin. Alle data er represented som gjennomsnitt +/- SD (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av figuren.

Figur 5
Figur 5. Rå cellelysat assay. Assayet ble utført i fravær og nærvær av rå cellelysater i en 384-brønn plate-format ved RT. Fluorescens nivåer er vist tidligere (rød) og følgende (grønn) tilsetning av trypsin. Cl-amidin (100 uM) forårsaket også en økning i fluorescens-signal under disse betingelser. Alle data er representert som gjennomsnitt +/- SD (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI) Amresco J106-2KG http://www.amresco-inc.com
Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP902-25  http://www.fishersci.com
Isopropylthiagalactonse (IPTG) Life Technogolies 15529-019 http://www.lifetechnologies.com
All Buffer Salts  Fisher Scientific Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc.
Protino Glutathione (GSH) agarose  Machery-Nagel 745500.10 Store at 4 °C; http://www.mn-net.com/
Chloroamidine  Cayman Chemical  10599 Store at -20 °C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML www.sigmaaldrich.com
Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384) Purchase from Corning; Sigma-Aldrich
Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software www.tecan.com
Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter http://www.perkinelmer.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jensen, O. N. Interpreting the protein language using proteomics. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 391-403 (2006).
  2. Sims, R. J. 3rd, Reinberg, D. Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 815-820 (2008).
  3. Pandey, A., Mann, M. Proteomics to study genes and genomes. Nature. 405, 837-846 (2000).
  4. Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447, 407-412 (2007).
  5. Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D. Binary switches and modification cassettes in histone biology and beyond. Nature. 425, 475-479 (2003).
  6. Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 1025-1040 (2007).
  7. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 473-483 (2006).
  8. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403, 41-45 (2000).
  9. Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease. Bioessays. 25, 1106-1118 (2003).
  10. Gyorgy, B., Toth, E., Tarcsa, E., Falus, A., Buzas, E. I. Citrullination: a posttranslational modification in health and disease. Int. J. Biochem. Cell Biol. 38, 1662-1677 (2006).
  11. Nakashima, K., Hagiwara, T., Yamada, M. Nuclear localization of peptidylarginine deiminase V and histone deimination in granulocytes. J. Biol. Chem. 277, 49562-49568 (2002).
  12. Hagiwara, T., Hidaka, Y., Yamada, M. Deimination of histone H2A and H4 at arginine 3 in HL-60 granulocytes. Biochemistry. 44, 5827-5834 (2005).
  13. Kearney, P. L., et al. Kinetic characterization of protein arginine deiminase 4: a transcriptional corepressor implicated in the onset and progression of rheumatoid arthritis. Biochemistry. 44, 10570-10582 (2005).
  14. Christophorou, M. A., et al. Citrullination regulates pluripotency and histone H1 binding to chromatin. Nature. 507 (7490), 104-108 (2014).
  15. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  16. Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. J. Exp. Med. 207, 1853-1862 (2010).
  17. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J. Cell. Biol. 184, 205-213 (2009).
  18. Wang, S., Wang, Y. Peptidylarginine deiminases in citrullination, gene regulation, health and pathogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 1829, 1126-1135 (2013).
  19. Trouw, L. A., Mahler, M. Closing the serological gap: promising novel biomarkers for the early diagnosis of rheumatoid arthritis. Autoimmun. Rev. 12, 318-322 (2012).
  20. Chang, X., Fang, K. PADI4 and tumourigenesis. Cancer Cell Int. 10, 7 (2010).
  21. Wang, L., Chang, X., Yuan, G., Zhao, Y., Wang, P. Expression of peptidylarginine deiminase type 4 in ovarian tumors. Int. J. Biol. Sci. 6, 454-464 (2010).
  22. Chang, X., et al. Investigating the pathogenic role of PADI4 in oesophageal cancer. Int. J. Biol. Sci. 7, 769-781 (2011).
  23. Zhang, X., et al. Genome-wide analysis reveals PADI4 cooperates with Elk-1 to activate c-Fos expression in breast cancer cells. PLoS Genet. 7, (2011).
  24. Tanikawa, C., et al. Regulation of histone modification and chromatin structure by the p53-PADI4 pathway. Nat. Commun. 3, 676 (2012).
  25. Cui, X., et al. The induction of microRNA-16 in colon cancer cells by protein arginine deiminase inhibition causes a p53-dependent cell cycle arrest. PLos One. 8, (2013).
  26. Jones, J. E., Causey, C. P., Knuckley, B., Slack-Noyes, J. L., Thompson, P. R. Protein arginine deiminase 4 (PAD4): Current understanding and future therapeutic potential. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, 616-627 (2009).
  27. Li, P., et al. Regulation of p53 target gene expression by peptidylarginine deiminase 4. Mol. Cell Biol. 28, 4745-4758 (2008).
  28. Wang, Y., et al. Anticancer peptidylarginine deiminase (PAD) inhibitors regulate the autophagy flux and the mammalian target of rapamycin complex 1 activity. J. Biol. Chem. 287, 25941-25953 (2012).
  29. Slack, J. L., Causey, C. P., Thompson, P. R. Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy. Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).
  30. Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation. J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).
  31. Knuckley, B., et al. Substrate specificity and kinetic studies of PADs. Biochemistry. 1, 4852-4863 (2010).
  32. Knipp, M., Vasak, M. A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline. Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).
  33. Knuckley, B., et al. A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors. Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).
  34. Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination. J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).
  35. Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).
  36. Jones, J. E., et al. Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors. ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).
  37. Dreyton, C. J., et al. Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).
  38. Shimoyama, S., et al. Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).
  39. Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. Biochemistry. 45, 11727-11736 (2006).

Tags

Kjemi PAD4 PADI4 citrullination arginin post-translasjonell modifikasjon HTS analyse fluorescens citrulline
Fluorescens-basert overvåking av PAD4 aktivitet via en Pro-fluorescens substratanalog
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sabulski, M. J., Fura, J. M., Pires, … More

Sabulski, M. J., Fura, J. M., Pires, M. M. Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog. J. Vis. Exp. (93), e52114, doi:10.3791/52114 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter