Summary
개체 발생 과정 억제 GABA 성 시냅스의 형성을 좌표 공동 분자 메커니즘은 크게 알려져 있지 않다. 이러한 프로세스를 연구하기 위해, 우리는 기능 GABA의 수용체를 표현 안정적으로 형질 전환 된 인간 배아 신장 293 (HEK293) 세포와 함께 배양 한 배아 매체 가시 GABA 성 신경 세포를 통합하는 공동 문화 모델 시스템을 개발했다.
Introduction
GABA는 가장 풍부한 흥분성 신경 전달 물질 인 글루타메이트 1 항 배아 뇌에서 발견 된 초기 신경 전달 물질 중 하나이다. 개발하는 동안, GABA는 흥분 독성을 유발하지 않고 세포의 증식, 이동 및 신경 네트워크의 형성을 조절하는데 중요한 역할을 미성숙 신경 세포 탈분극 및 흥분. 성인 뇌에서 GABA 수용체 채널 반전 전위 인해 클로라이드 세포 내 농도의 감소로 더 음 전위로 시프트된다. 이러한 변화는, 병렬로, 상향 조절 세포 밖으로 클로라이드 전송 칼륨 클로라이드 공동 수송 체 (KCC2)의 의해 발생되고, 하향 조절 갖는 나트륨 - 칼륨 클로라이드 트랜스 포터 (NKCC1)의 반대의 효과 2.
뇌에서 GABA는 기본적으로 빠르거나 느린 시냅스 억제를 중재하는 GABA A 또는 GABA의 B 중 하나 수용체에, 각각의 결합LY. GABA의 루피도 량체 이온 성 또는 리간드 - Cys이고 루프 이온 채널로 알려진 수용체의 클래스이다. GABA 두 분자, 중탄산 이온 염화물 이온 및 적은 정도로 투과성 수용체의 활성화를 위해 요구된다. 염화 컨덕턴스의 증가는 시냅스 후 뉴런 (3)의 활성화에 탈분극, 흥분성 이벤트의 효과를 감소시킨다.
GABA의 루피의 구조적 다양성은 오랫동안 기능 및 약리학 적 특성의 폭의 넓은 범위를 결정하는 중요한 요소로 인식되고있다. 일반적으로 α (1-6), β (1-3), γ (1-3), π, ε, δ와 θ 3 : 기본 GABA의 루피로 분류 여러 아형과 서브 유닛으로 구성된 헤테로 펜타 있습니다 큰 N 말단 세포 외 도메인, 막 횡단 도메인 네 (TMS), 및 세 개의 TM 및도 4 (4) 사이의 주요 세포 내 도메인을 포함하는 트랜스 토폴로지.이러한 서브 유닛의 유전 삭제 베어링 마우스가 탄생 5,6 후 죽을 때문에 β3 및 γ2 서브 유닛은, 시냅스 억제 및 유기체의 생존에 필수적이다. 반대로, α 서브 유닛의 개별 이성체는 불안, 진정 작용, 각성, 등과 같은 다른 동작과 관련된 뇌의 특정 시냅스 연결 기능에 중요하지만, 개별적으로, 생명에 필수적이지 7-9이다. GABA의 루피는 강력한 진정제, 수면제, 항 불안 및 벤조디아제핀, 바르비 투르 산염, neurosteroids 및 마취제 7,10,11 등의 항 경련 효과와 약물의 다양한 행동의 주요 사이트입니다.
시냅스 GABA의 루피는 일반적으로 γ2 서브 유닛 (가장 일반적으로 β2 또는 β3)이 β 서브 유닛과 두 개의 α 소단위 (α1, α2, α3 또는 α5) 12, 13이 포함되어 있습니다. 여분 시냅스 수용체의 우세한 클래스 조합 δ 수단를 포함두 개의 α 소단위 (α4 또는 α6), 두 개의 β 서브 유닛 (β2 또는 β3) 14. 세포막에 축삭 돌기 또는 소마, 및 삽입에 GABA의 루피의 세포 내 지역화 β-서브 유닛 (15, 16)의 존재에 따라 달라집니다. 그러나, 다른 GABA R의 선택적 결합은 특정 α 소단위 (α1, α2, α3 또는 α5) 7,17,18의 존재와 관계를 잘 시냅스의 가지 유형으로 아류. 중요한 것은, 쥐에서 α1 또는 α2 서브 유닛의 삭제는 억제 시냅스 (19)의 미세 구조 변화가 발생합니다. 이 GABA가 버렸네 형성을 조절하는 직접적인 역할을 스스로 RS 제안합니다.
증거는 GABA 성 시냅스 개발 신경 목표도 다른 억제 축삭의 유형과에서 클러스터 된 수용체와 접촉하는 이벤트를 정확하게 조율 순서임을 나타냅니다억제 시냅스의 각 클래스는 선택과 17,20-22 기능적으로 적응한다. GABA 성 시냅스에서의 특이성이 기본 원칙은 사전 및 시냅스 파트너가 시냅스 접촉의 개시 동안 서로를 인식 방법에 대한 질문을 제기한다.
시험 관내에서 공동 - 배양 분석은 시냅스 형성의 메커니즘 일부를 연구하고이 과정에서 각각의 시냅스 틈새 스패닝 단백질의 역할을 테스트하기 위해 성공적으로 적용되었다. 시냅스 형성 및 성숙을 중재하기 위해 양방향으로 작동 공통 트랜스 시냅스 작용 단백질의 조합 중 하나는, Neurexins (Nrxns) 및 Neuroligins (NLS)이다. Nrxns는 다양한 아형 (23)에 상승을주는 그들의 라미닌 - neurexin-성 호르몬 결합 단백질 도메인 내에서 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)을 전시 시냅스 단백질이다. Nrxns 또한 다른 단백질과 상호 작용하는 동안, NLS는 자신의 유비쿼터스 시냅스 PA 것으로 생각된다24 rtners. 함께이 단백질은 가까운 단단한 동격 (25)의 시냅스와 시냅스 후 세포막을 유지에 기여한다. 두 개의 가장 풍부한 이소은 흥분성과 억제 성 시냅스, 각각 26 일에 존재하는 NL-1, NL-2입니다. 트랜스 - 시냅스 단백질 상호 작용을 조사하기위한 초기 공동 배양 모델 시스템 중 하나는, 비 - 신경 세포의 다른 유형을 이용, 예컨대 오버 특급 NL-로 인간 배아 신장 (HEK) 293 세포와 같은 가장 일반적 불멸 세포주 2. 이들 세포는 뇌교 뉴런 배양하면, HEK 세포의 표면에 근접 연접 단백질의 축적은 시냅스 형 콘택트의 형성을 나타내는 관찰되었다. 이러한 공동 문화에 대한 수용성 β-neurexin 첨가 Nrxns과 NLS 사이의 트랜스 시냅스 상호 작용이 시냅스 접촉 형성 (27)에 필요한 것을 건의, 연락처의 형성을 억제 하였다. 또한, 일시적인 발현COS에 β-neurexin 해리 해마 글루타메이트와 GABA 성 신경 세포 시냅스 단백질 gephryin과 GABA R 서브 유닛의 유도 식을 공동 배양 (C의 V-1 (O의 rigin에서) 유인원, 그리고 S V40 유전 물질을 운반하는) 세포의 이러한 두 가지 세포 유형 (28) 사이의 접촉 지점에서 γ2 및 α2. 시냅스 형성을 연구하는 데 공동 배양 모델의 또 다른 예는 일시적 GABA R로 α2 / β3 / γ2 및 NL-2, 및 시상 하부 뉴런 (29)의 혼합 모집단을 소단위 형질 HEK293 세포를 포함했다. 본 연구는 NL-2의 발현이 억제 시냅스 형성 용 절대 조건이라고 결론 지었다.
그러나, 최근의 공동 배양 연구에서, 안정하게 형질 α1 / β2 / γ2 GABA HEK293 세포에서 R은 기능적 시냅스를 유도하기에 충분한 것으로 밝혀졌다 때 공 배양 GABA 성 메드추가 트랜스 시냅스 또는 후 시냅스 접착 단백질 없이도 이움 가시 뉴런. NL-2 GABA RS (30)와 공동 발현 그러나 시냅스 형성과 강도의 현저한 증가가 관찰되었다. 이것은이 공동 문화 모델 시스템은 이전에 설명한 모델 시스템, 가장 분명하게 증가 감도와 시냅스 접촉 감지의 신뢰성을보다 이점이 있음을 나타냅니다. 시냅스 접촉의 검출에 전반적 개선에 기여하는 두 가지 중요한 요인은 : ⅰ) 각각의 세포의 표면에서 GABA R 서브 유닛의 높이와 일치 식으로 안정하게 형질 감염된 HEK293 세포주의 용도. 이러한 일관성은 다른 공동 배양 조건 사이의 정량적 인 비교를 용이하게한다. ⅱ) 배아 선조체 (31)로부터 배양 배지 가시 GABA 성 뉴런의 순수한 인구의 사용은 알로 합병증 및 혼합 신경 집단과의 사용으로 인한 모호성을 제거WS, 예를 들면, 시냅스 형성 동안 서로 비교 될 수있는 가장 적절한 GABA 시냅스 R 종류의 선택.
시냅스의 형성은 사전 및 시냅스 후 세포 접착 복합체 내의 많은 트랜스 시냅스 신호를 포함하는 것으로 생각된다. 인해 시냅스 시그널링 및 세포 부착 분자의 투명 번호 양방향 특성으로는 시냅스 형성에 관여하는 주요 구성 요소를 식별하는 것이 곤란하다. 따라서, 비 - 신경 세포 내로 단일 세포 부착 단백질을 형질 (이 경우, 생체 내에서 GABA 성 중간 가시 뉴런위한 두 가지 가장 널리 시냅스 대상, α1 / β2 / γ2 또는 α1 / β3 / γ2 GABA 루피 32) 크게 시냅스 표면에서 사용 가능한 트랜스 시냅스 신호의 복잡성을 감소시키고, 시냅스 형성을 촉진하는이 단백질의 효능의 정확한 정량 분석을 할 수있다.
Protocol
스프 라그 - 돌리 쥐 또는 BAB / C 근친 마우스, 영국 홈 오피스 [와 1986년 11월 24일의 유럽 공동체위원회 지침에 따라 보관 및 희생 (할란, 영국 사용 임신 한 여성의 수는 30이었다) (609분의 86 / EEC) ] 가이드 라인. 이 프로젝트는 공식적으로 약국 윤리위원회의 UCL 대학에 의해 승인되었습니다.
악기, 문화 매체, 그리고 요리 1. 준비
- 켜고 항상 무균 조건에서 작동하기 위해 70 % 에탄올과 층류 후드 청소.
- (L 글루타민 (2 mM)을, 페니실린 (50 유닛 / ㎖), 스트렙토 마이신 (50 ㎍ / ㎖), 및 소 태아 혈청 둘 베코 변형 이글 중간 산도 7.4 (DMEM, 500 ml)에 함유 10 HEK293 세포 배양 배지를 준비 %).
참고 : 페니실린과 스트렙토 마이신은 자극이다. - 로 Neurobasal 배지의 pH가 7.4 (500 ㎖), B27 보충제 (25 ㎖), L - 글루타민 (2 mM)을 페니실린을 함유하는 무 혈청 신경 세포 배양 배지를 준비(50 단위 / ㎖), 스트렙토 마이신 (50 ㎍ / ㎖), 및 글루코스 (6 ㎜).
- HBSS 10 배 스톡 (50 ㎖), HEPES (1 M) (5 ml) 및 물 (445 ㎖), pH 7.4의 함유 HEPES 완충 식염수 용액 (HBSS) 500 ㎖에, 준비한다.
- 멸균 인산 완충 식염수 (PBS, pH 7.4의 1 L), 물 (1 L), 커버 글라스 (직경 13mm)를 찾아 살균 유리 파스퇴르 피펫.
HEK293 안정적인 세포주 2. 준비 α1 / β3 / γ2-GABA의 R을 표현
- 10cm 멸균 조직 배양 플레이트에 플레이트 2 × 6 HEK293 세포는 하룻밤 70-90%의 포화 상태에 도달하기 위해 가습 5 % 이산화탄소 (CO 2) 분위기 (CO 2 인큐베이터)에서 37 ° С에서 배양한다.
- 다음날, G418의 설페이트 (표 1) 저항성 유전자를 통합 pcDN 3.1 (+) 발현 벡터 GABA R α1 서브 유니트 cDNA로 HEK293 세포를 형질및 phleomycin D1 통합 발현 벡터에서 GABA R β3 소단위의 cDNA (표 1) 내성 유전자 (모두 인간 사이토 메갈로 바이러스의 즉시 초기 (CMV) 프로모터의 조절 하) 음으로 복합체 양이온 성 리포좀 제제를 사용하여, 제조사의 프로토콜에 따라 충전 된 핵산 분자 (표 1).
- (pH 7.4의, 표 1) 간략하게, 감소 된 혈청 배지 500 ㎕를 추가하고 7.5 μg의를 cDNA를 리포좀 형질 버퍼링 시약 15 ㎕를 다음 멸균 15 ml의 원심 분리 관으로 구성하고, 부드럽게 실온에서 떠나기 전에 혼합 각 5 분.
- 이 혼합물에, 리포좀 형질 감염 시약 8.75 μl를 추가하고 부드럽게 30 분 동안 실온에서 떠나기 전에 혼합한다. 이 후, (항생제없이) HEK293 세포 배양 배지 3 ㎖을 추가 회 상하 transfe를 원심 관의 내용을 피펫R은 드롭 현명한 10cm 조직 배양 접시에서 성장하는 세포 상 및 가습 5 % CO 2 분위기 (CO 2 배양기)에서 37 ° С에서 48 시간 동안 배양한다.
- 다음과 같은 비율로, 멸균 PBS, pH를 7.4으로 가볍게 HEK293 세포를 씻으십시오, 새로운 10cm 조직 배양 접시에 형질 전환 된 HEK293 세포를 희석 : 1 : 3, 1 : 5, 1 : 7, 1:10 1:15 1:20. 이것은 세포가 지나치게 융합 될 수없는 것을 보장한다.
- 배양 배지에, 각각의 항생제 선별 마커, G418 및 Phleomycin D1 800 ㎍ / ml에 첨가하여 GABA R 서브 유닛 모두를 발현하는 HEK293 세포의 선택을 시작한다. 가습 된 5 % CO 2 분위기 (CO 2 배양기)에서 37 ° С에서 세포를 품어 항생제 함유 배지 (10 ml)을 2 일마다 교체합니다.
- 작은 흰색 식민지 (일반적으로 약 7 일 후)를 형성하기 시작하면, 조심스럽게 요리의 각각에서 하나의 식민지를 선택하고 멸균 P1000을 사용하여 수집피펫 팁. 상하 매체 피펫 팅하여 재현 탁 신중 500 ㎕의 배지를 함유하고, 24 웰 조직 배양 플레이트의 한 웰에 전송. 정확히 하나의 식민지 (5-20 식민지의 총이 좋습니다) 잘 각각에 전송되어 있는지 확인합니다. 가습 된 5 % CO 2 분위기 (CO 2 배양기)에서 37 ° С에서 세포를 품어 항생제 함유 배지를 2 일마다 교체합니다.
- 콜로니 70-80 %의 컨 플루 언트하게되면 부드럽게 24- 웰 조직 배양 플레이트의 바닥으로부터 세포를 이동시키다 상하 매체 피펫. 옮기고 6- 웰 조직 배양 플레이트에서 2 웰 사이의 세포 현탁액을 나눈다. 가습 된 5 % CO 2 분위기 (CO 2 배양기)에서 37 ° С에서 세포를 품어 항생제 함유 배지를 2 일마다 교체합니다.
- 일단 70 - 80 % 합류, 동일한 단일 결장 유래 세포를 함유하는 웰 (2) (1)로부터의 세포를 수집y를 준비 단백질 용 해물. 간략하게, 세포를 PBS, pH 7.4의 2 배속으로 세척하고, PBS, pH 7.4의 2 % 소듐 도데 실 설페이트 (SDS) 200 μl를 추가한다. 해물을 수집하고 microcentrifuge 관에 전송합니다. BCA 단백질 시약을 사용하여 단백질 농도를 측정 제조사의 프로토콜에 따라 (표 1 참조). 이들에 대한 정보는 표 1을 참조 SDS / PAGE에 의해 GABA 수용체의 α1 및 β3 서브 유닛의 발현을 분석하고 (토끼 반 α1 별과 토끼 반 β3 별 GABA R 항체 서브 유닛 특정 항체를 사용하여 면역 항체).
- 이동시키다 큰 6cm 조직 배양 접시에 남아있는 우물에서 유일한 긍정적 인 클론을 전송합니다. 가습 된 5 % CO 2 분위기 (CO 2 배양기)에서 37 ° С에서 세포를 품어 항생제 함유 배지를 2 일마다 교체합니다.
- 점차적으로 세포 U의 식민지를 확장10cm 조직 배양 접시에 마지막으로 조직 배양 플라스크 (T-75 플라스크)로 전송하여 항생제 선택 파인더. 가습 된 5 % CO 2 분위기 (CO 2 배양기)에서 37 ° С에서 세포를 품어 항생제 함유 배지를 2 일마다 교체합니다.
- 커버 글라스에 각 식민지에서 70,000 세포 (직경 13 mm)를 판과 면역에 의해 GABA R 서브 유닛의 세포 표면 발현과 공동 현지화를 분석하기 위해 세포를 고정합니다.
- (10cm 무균 조직 배양 접시에 GABA 수용체, 판 2 × 10 6 세포의 두 α1 및 β3 서브 유닛의 높은 수준을 발현하는 HEK293 세포의 긍정적 인 클론을 선택하고 가습 된 5 % CO 2 분위기에서 37 ° С 부화 CO 2 배양기) 하룻밤. 세포가 항상 항생제 함유 (G418 및 Phleomycin D1) 배지에서 배양되어 있는지 확인합니다.
- 다음 날, HEK를 형질GABA R 293 세포 pcDNA 벡터 ™ 3.1 (+) 비 리포솜 지질 형질 감염 시약 (표 1)를 사용하여 하이 그로 마이신 B 내성 유전자를 통합 발현 벡터 소단위의 cDNA를 γ2s.
참고 :이 형질 전환 방법은 더 나은 생존과 항생제 지속적인 선택을 받고있다 느린 성장 안정적인 세포주 외국 단백질의 높은 발현 효율을 할 수 있습니다. - 멸균 15 ml의 원심 분리 튜브에 250 ㎕의 향상제 및 DNA 축합 완충액 (표 1)과 γ2s의 GABA 1.4 μg의 수용체 소단위의 cDNA를 추가한다. 5 분 동안 실온에서 떠나기 전에 1 초 동안 11.2 증강의 μL와 소용돌이를 추가합니다.
- 10 분 동안 실온에서 떠나기 전에 10 초 동안 비 리포좀 지질 형질 전환 시약와 소용돌이의 35 μl를 추가합니다. G418 / Phleomycin D1 함유 배지 3 ㎖을 첨가하고, 회 BEF 상하 원심 분리 튜브의 함유량을 피펫광석은 10cm 조직 배양 플레이트에서 성장하는 세포에 드롭 현명한 전송. 가습 된 5 % CO 2 분위기 (CO 2 배양기)에서 37 ° С에서 48 시간 동안 세포를 품어.
- 다음과 같은 비율로, 멸균 PBS로 부드럽게 세포를 씻고 새로운 10cm 조직 배양 접시로 희석 : 3, 1 : 1 ~ 5, 1 : 7, 1:10 1:15 1:20.
- γ2s 서브 유닛을 표현 / β3-HEK293 세포 / Phleomycin 매체 D1이 함유 G418에 항생제 선택 마커 하이 그로 마이신 B의 800 ㎍ / ㎖를 추가하여 α1의 선택을 시작합니다. 신선한 G418 / Phleomycin D1 / 하이 그로 마이신 B 함유 배지 (10 ml)을 2 일 간격으로 기존 매체를 교체합니다.
- 반복 G418 연속 선택에 따라, 2.7-2.12 단계 / Phleomycin D1 / 하이 그로 마이신 세포 배양 배지를 B 함유.
- 항생제가없는 세포 배양 배지 및 나중에 사용하기 위해 10 %의 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 -140 ° C에서 양성 클론을 보관.
- 레벨 테스트표현 때문에 항생제 선택에 따라 세포의 감소 생존 변경할 수 있기 때문에 α1, β3의 발현, 해동 다음 각 클론의 면역과 면역에 의해 GABA R 서브 유닛을 γ2s.
HEK293 세포주 3. 유지 보수
- 15 ml의 멸균에 세포 배양 배지 10 ㎖로 (전술) 제어 HEK293 세포의 유리 병 또는 그 표현 α1 중 / β2 / γ2-GABA의 루피 (표 1) 또는 α1 / β3 / γ2-GABA의 R을 해동 원심 분리기 튜브. 5 분 440 XG에 원심 분리기를 초과 DMSO를 제거합니다.
- 신선한 세포 배양 배지 1 ml의 상등액과 세포를 분리에 resuspend.
- 우선 폴리 D 리신 (0.1 ㎎ / ㎖)에 재현 탁하고 세포를 다음 1 ㎖의 코팅 10cm 조직 배양 접시에 신선한 세포 배양 배지 9를 가하여. , 옆으로, 부드럽게 선동 세포를 분산하고 가습에 37 ° С 부화5 % CO 2 분위기 (CO 2 인큐베이터).
- 다음날, 어떤 세포 파편을 제거하고 신선한 HEK293 세포 배양 배지 10 ㎖로 교체 매체 대기음.
- GABA R 서브 유닛을 표현하기 때문에 또한 항생제 내성 마커의 발현이 부족하지 않는 세포를 제거하는 항생제 안정적인 세포주를 선택합니다. α1 / β2 / γ2 안정적인 세포주를 들어, G418 (800 ㎍ / ㎖)에 포함 된 신선한 세포 배양 매체와 일반 매체를 교체하십시오. α1 / β3 / γ2 세포주의 경우, 신선한 세포 배양 배지는 G418 께 (800 ㎍ / ㎖) 함유 교체 Phleomycin D1 (800 ㎍ / ㎖), 하이 그로 마이신 B (800 ㎍ / ㎖).주의! G418은 자극성이고 하이 그로 마이신 B는, 부식성 독성 및 자극이다.
- 통로 낮은 밀도로 파종하여 새로운 조직 배양 접시에 세포들은> 70 %의 컨 플루 언시를 달성되면. 기음 10 세포 배양 배지 ㎖의 짧게 두번 세척한다PBS, pH가 7.4. 1 트립신 EDTA 솔루션, 단백질 분해 효소 트립신 용액 (0.05 % 트립신)와 PBS에서 칼슘 킬레이트 EDTA (0.02 %), pH가 7.4, 접시에서 세포를 분리 할 수 ml의.주의! 트립신 - EDTA 추가 솔루션은 자극이다.
- 접시, 올바른 항생제를 함유하는 세포 배양 배지 10 ㎖를 첨가하고, 세포를 흡인. 5 분 440 XG에 세포를 원심 분리 세포 배양 배지 5ml에이를 재현 탁.
- 통로 신선한 세포 배양 배지 및 올바른 항생제를 함유하는 새로운 조직 배양 플라스크 (T-75 플라스크)로 1:10 희석하여 세포. 가습 된 5 % CO 2 분위기 (CO 2 배양기)에서 37 ° С에서 세포를 품어 매체마다 이일을 교체합니다. 통로 셀 때> 70 % 합류 (단계 2.8 참조).
GABA 성 중간 가시 뉴런 문화 4. 준비
- 무균 조건 하에서 24 우리를 준비폴리 L 리신 (0.1 ㎎ / ㎖)와 LL 플레이트 커버 슬립을 코팅 처리 (직경 13mm) 및 가습 된 5 % CO 2 분위기 (CO 2 인큐베이터)에서 37 ° С에서 배양한다.
- 다음 날, 기음 피펫 초과 폴리 -L- 라이신과 두 개의 짧은 10 초 멸균 물이 5 분 긴 세척으로 된 커버를 씻는다. 하룻밤 라미닌 (0.01 ㎎ / ㎖)를 첨가하고, 가습 된 5 % CO 2 분위기 (CO 2 배양기)에서 37 ° С에서 품어.
- 70 % 에탄올로 해부 영역을 소독 및 곡선과 직선 조직 집게, 가위와 핀셋으로 해부 도구의 배열을 수집, 완전히 해부기구를 소독하기 위해 70 % 에탄올에 배치합니다.
- 그 뒷면에 CO 2 안락사 임신 한 쥐 / 마우스를 놓고 70 % 에탄올과의 복부 피부를 청소합니다. 내부 장기와 자궁을 공개, 핀셋으로 피부를 조이고 피부, 근육과 복막을 통해 복부 절단분명히 배아와. 자궁에서 배아 (E16-17)를 추출하고 냉장 PBS와 페트리 접시에 놓습니다.
- 층류 후드에서 배아를 놓고 냉장 HBSS로 새로운 배양 접시에 머리를 수집, 그들 목을 벨.
- 해부 현미경, 곡선과 직선 집게를 사용하여 뇌를 해부. 냉장 HBSS를 포함하는 새로운 배양 접시에 두뇌를 놓습니다.
- 두 대뇌 반구를 분리하고 조심스럽게 수막을 제거합니다. 해마의 선을 따라 잘라 선조체을 공개하는 피질을 벗겨. 반구의 전방에 가로 무늬 흰색 구조와 선조체 (striatum)을 준수하십시오.
- 선조체 (striatum)를 해부 매우 작은 조각으로 잘라 (1 - 직경 2 mm)의 1 ml의 총 부피와 멸균 15 ㎖의 원심 분리 관으로 자료를 수집하기 위해 화재 광택 파스퇴르 피펫을 사용합니다. 화재 연마 재료가 손상되지 않고 수집 보장합니다.
- 화재 연마 TI를 사용하여파스퇴르 피펫의 p는 세포를 흡인하고 그들에게 8 릴리스 - 10 회. 이 균질 나타날 때까지 6 회 - 원래의 직경 (1mm)의 약 30 %의 불 닦으 팁 새로운 펫을 가지고가는 것은, 해결책 추가 4 씹다.
- 신선한 멸균 원심 관에 100 ㎛ 나일론 세포 여과기를 사용하여 세포를 필터.
- 혈구와 세포를 세어, 24 웰 조직 배양 플레이트에 웰 당 신경 세포 배양액 500 ㎕를 세포에 70,000 접시. 우물 권리와 체외 (DIV)에서 14 일 동안 가습 된 5 % CO 2 분위기 (CO 2 배양기)에서 37 ° С에서 부화 왼쪽 선동.
- 후 7 일, 연결을 문화의 순도를 확인하고, 글 리아 세포가 존재하는 경우, 시토신 β-D-아라 비노 시드 추가 (아라-C를 5 μM) 우물 증식을 중지합니다. 이렇게하려면 각 우물에서 신경 세포의 배양 배지 (PH 7.4) 250 μL를 제거하고 신선한 매체의 250 μL 포함 추가ING 아라-C.주의! 아라-C는 자극이다.
5. 공동 문화 준비
- 신경 문화의 날 11 일, 코트 멸균 조건에서 폴리 -D- 라이신 (0.1 ㎎ / ㎖)와 6 웰 플레이트 및 가습 된 5 % CO 2 분위기 (CO 2 배양기)에서 37 ° С에서 하룻밤 배양한다.
- 다음날 (신경 세포 배양 12 일째), 과량의 폴리 D 라이신 대기음 소량 코팅 (항생제없이) 웰을 새로운 세포 배양 배지를 첨가하기 전에 멸균 수로 5 분 동안 웰을 2 배 짧게 배 씻어 매체에서 혈청.
- 조직 배양 플라스크 (T-75)에서 배양액을 기음. 칼슘 1 ㎖를 첨가하기 전에 PBS로 두 번 세포를 씻어 / Mg를 2+ -chelating 에이전트 EDTA 부드럽게 비 - 효소 적 세포 해리 (0.48 mm)이다. 티슈 플라스크의 바닥으로부터 이들을 분리 세포를 선동.
- (세포 배양 배지 10 ㎖를 추가이 같은 항생제) 형질 방해 할 수없는 멸균 원심 분리 튜브에 세포 및 장소 대기음. 저속 벤치 탑 원심 분리기를 이용하여 5 분 동안 440 XG에 세포 펠렛.
- 상등액을 제거하고 신선한 세포 배양 배지 1 ㎖로 세포를 재현 탁. 혈구를 사용하여 6 웰 플레이트에 웰 당 3 × 105 세포의 밀도로 세포 플레이트를 계산. 부드럽게 교반 및 가습 된 5 % CO 2 분위기 (CO 2 배양기)에서 37 ° С에서 24 시간 동안 배양한다.
- 다음 날 (신경 문화의 날 13) 일시적으로 리포좀 형질 전환 시약을 사용하여 pcDNA3 식 구조에 mCherry의 cDNA와 HEK293 세포를 형질. 간단히, 멸균 microcentrifuge 관에서, 감소 혈청 배지 500 μL 및 mCherry의 cDNA의 5 μg의를 추가합니다. 리포좀 버퍼링 시약 5 μl를 첨가하고, 온화하게 5 분 동안 실온에서 떠나기 전에 혼합한다.
- 리포좀 형질 reag의 8.75 μl를 추가엔트 부드럽게 30 분 동안 실온에서 떠나기 전에 혼합한다. (CO 2 인큐베이터) 전사 적가 웰 6- 웰 조직 배양 플레이트의 각 행 및 가습 된 5 % CO 2 분위기하에 37 ° С 부화 회 상하 microcentrifuge 관의 내용을 피펫.
- 다음날 (신경 세포 배양 14 일째), 6- 웰 각각으로부터 HEK293 세포 배양 배지를 흡인하고 PBS (pH 7.4의) 각 웰 짧게 두번 씻어. 칼슘의 300 μl를 추가 ㎎ / 2 + -chelating 에이전트 EDTA (0.48 mM의) 및 트립신 EDTA 200 μL (0.02-0.48 mM)을 잘 각 솔루션 및 5 분 동안 37 ° С에서 배양한다.
- 멸균 15 ml의 원심 분리 튜브에 세포를 웰 당 신선한 HEK293 세포 배양 배지 1 ㎖를 추가 (이 트립신을 소멸) 및 기음. 실온에서 5 분 동안 440 XG에 세포를 원심 분리 상층 액을 제거한다. 신경 세포 배양 배지 (pH 7.4의) 500 μL에 펠렛을 재현 탁. </ 리>
- 혈구를 사용하여 신경 세포를 함유하는 24 웰 조직 배양 플레이트에 웰 당 30,000 세포의 밀도로 세포 및 종자를 계산. 24 시간 동안 (CO 2 배양기를) 세포를 분산하고 가습 된 5 % CO 2 분위기에서 37 ° С에서 공동 문화를 배양 할 수있는 판을 선동.
시냅틱 연락처와 활동 6. 분석
- 공동 문화 23 시간 후, GABA 성 중간 가시 뉴런과 HEK293 세포에 형광 염료가 결합 방지 synaptotagmin 내강의 도메인 특정 항체의 활동에 의존 흡수하여 사이에 '활성'접촉의 형성 조사 (Cy5에를, 표 1 참조) .
참고 : 항체는 synaptotagmin의 내강 도메인에 대한 액세스를 얻을 것입니다에 시냅스 소포 루멘과 세포 외 공간 사이의 연속성이 때 결합하는. 이는 특히이 antib을 만드는 신경 전달 물질 방출시 발생활성 시냅스 터미널의 우수한 마커를 멜로디. - 신경 세포 배지에서 1:50으로 희석 Cy5에 표지 마우스 항 - synaptotagmin 항체 (로 Neurobasal 매체, 산도 7.4)을 추가,에, 첫째로 신경 매체와의 공동 문화 (표 1 참조 매체, pH를 7.4로 Neurobasal)을 씻어 문화, 30 분. 가습 된 5 % CO 2 분위기에서 37 ° С에서이 시간 (CO 2 배양기) 동안 세포를 품어.
- 공동 문화를 씻어 항체의 액세스를 제거하기 위해 잠시 동안 세 번 : 첫 번째, 두 번째 차가운 PBS (PH 7.4), 200 mM의 NaCl을 함유하는, 차가운 정상 PBS로 세 번째 감기 정상 PBS (PH 7.4)와 (PH 7.4)
- 교반과 함께 10 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드 / 4 % 자당의 300 μL (PFA, 산도 7.4)로 세포를 고정합니다. 두 개의 긴 10 분 세척과 함께 다음 PBS (PH 7.4) 짧게 두 번 세포를 씻으십시오.
- PFA을 해소하기 위해 교반과 함께 10 분 동안 잘 각각 글리신 (0.3 M)를 추가합니다.
- 세포를 씻으 brieflY 회 후 PBS (pH 7.4의) 두 이상 10 분 세척과의 비특이적 결합을 감소시키기 용액 (/ v)의 소 혈청 알부민 PBS에서 (BSA), pH 7.4의 승 1 % () 블로킹의 300 μl를 추가하기 전에 항체.
- 차단 솔루션을 대기음 기니피그에게 γ2 N- 말단 도메인 (33)에 대하여 지시 안티 GABA R-γ2 항체 추가 : 4 박 ° С에서 (1 PBS에서 3000, 산도 7.4).
- 다음 날, 우물에서 일차 항체를 기음과 두 개의 긴 10 분 세척과 함께 다음 PBS로 간단히 두 번 세포를 씻으십시오.
- 실온에서 30 분 동안 차단 용액에서 트리톤 X-100 (0.1 %)을 사용하여 세포를 Permeabilize 하시려면.
- 마우스 항 글루타민산 탈 탄산 효소를 첨가하기 전에 두 개의 긴 10 분 세척하여 후 PBS (pH 7.4의) 짧게 두 번 세포를 씻어 (GAD) 65 항체 (1 : 4000, 표 1) 또는 마우스 항 synapsin의 I 항체 ( 1 : 1,000, 방 t에서 120 분 표 1)칼 럼.
- 두 개의 긴 10 분으로 세척 한 후 PBS (pH 7.4의) 짧게 두 번 세포를 씻어 준 후 30 분 동안 실온에서 차단 용액에 추가.
- 원심 분리기에서 항체의 집계를 제거하는 (일반적으로 2 ㎍ / ㎖의에서 알렉사 플 루어 488 또는 염소 항 - 마우스 IgG 알렉사 플 루어 (405), 모든 접합 방지 기니 Cy5에 접합 돼지의 IgG, 염소 항 - 마우스 IgG를 염소) 적절한 보조 항체 차단 솔루션에 : 21910 10 분 동안 XG, 그리고 항체 (750 일)를 추가합니다. 1 시간 동안 우물을 적절한 빛 노출과 이에 따른 광표백에서 형광을 보호하기 위해 알루미늄 호일 커버에 적용됩니다.
- 마지막으로, 어떤 언 바운드 차 항체를 제거하고 장착 시약 (연장 골드, 표 1) 커버 슬립 당 약 10 μL를 사용 된 커버를 장착하는 두 개의 긴 10 분 세척과 함께 다음 PBS (PH 7.4) 짧게 두 번 세포를 씻으십시오. (4)에 전송하기 전에 빛으로부터 보호하면서 실온에서 24 시간 설정 허용장기 저장을 위해 С을 °.
- 63X 오일 침지 목적으로 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 샘플을 분석한다. 빛 수준을 확인하고, 검출기 이득이 포화를 방지하기 위해 조정됩니다.
- I 또는 Cy5에 표지 항 synaptotagmin synapsin GAD65에 대한 긍정적 인 시냅스 터미널, 및 DIC 또는 mCherry 형광 지시약으로 시각화 시냅스 HEK293 세포 사이의 공동 현지화의 지역 잠재적 인 시냅스와 같은 연락처를 관찰한다.
- 이미징 소프트웨어를 사용하여 셀 당 5 μm의 - (4)의 깊이를 통해 - 광학 부 (108)의 Z-스택 시리즈를 사용하여 시냅스 전위 형 콘택트 카운트.
Representative Results
이 뉴런 HEK293 세포 공동 배양 모델 시스템에 대한 프로토콜은 미세 최적 세포 생존을 허용하도록 조정되었다. 이 시스템에서, 시냅스와 같은 접점의 형성과 분석 기능 수용체에 조립 세 GABA R 서브 유닛의 안정적이고 일관성있는 표현을 사용합니다. 이는 신경 세포 배양 물에 추가하기 전에 HEK293 세포의 표면에서 발현 소단위 시험 면역 세포 화학 분석을 사용하는 것이 중요하다. 이들 실험에서, α1, β2 및 γ2 서브 유닛 (도 1a) 또는 α1, β3 및 γ2 소단위 (도 1b)의 세포 표면 발현은, 이들 서브 유닛의 세포 외 에피토프에 결합 단위체 특이 항체를 사용하여 검출 하였다. HEK293 표면에서 이러한 서브 유닛 사이의 공동 지방화의 높은 수준의 입증되었다.
GABA의 표면 발현과 공동 현지화를 확인한 후,HEK293 세포, 공동 문화 R 소단위는 α1 / β2 / γ2 GABA R 소단위 14 일 (체외에서 십사일 (DIV)) 배양 매체 가시 신경 세포를 발현하는 HEK293 세포를 이용하여 제조 하였다. 공동 - 배양에서의 세포를 고정, 24 시간 동안 배양 및 면역 세포와 공 촛점 현미경을 사용하여 분석 하였다. 콘택트 분석 GAD65 양성 GABA 성 축삭 터미널 제어 HEK293 세포 (도 2A, 2B) 만 산발적 접촉을 형성 것으로 나타났다. 4 시간에서 검출 접점의 수는 HEK293 세포 당 7.3 ± 0.9이고,이 숫자는 배양 된 신경 세포로 HEK293 세포를 첨가 한 후 24 시간에 HEK293 세포 당 5.5 ± 0.5 연결부 (± SEM을 의미)로 감소 하였다. 대조적으로, GAD65 양성 GABA 성 축삭 단자 GABA의 R을 발현하는 HEK293 세포 수많은 시냅스 형 콘택트 형성. HEK293 세포를 첨가 한 후 4 시간에서 획득 컨택 수는 HEK293 세포 당 28.3 ± 4.7이고,이 숫자는 더 증가했다52.1 ± 6.3 D 공동 문화에서 24 시간 (그림 2A, 2B)에서 HEK293 세포 당 (± SEM을 의미).
이러한 시냅스 같은 접촉되었는지 여부를 확인하려면 '활성'즉 기공을 송신기 릴리스를 지원, 소포 - 내강의 도메인 특정 안티 synaptotagmin Cy5에 접합 된 항체는 배양 23 시간 후 공동 배양 배지에 첨가 하였다. 이 항체는 시냅스 전 신경 말단에 혼입되면 시냅스 소포 루멘 및 신경 전달 물질 방출시 시냅스 틈새에서 세포 외액 간의 기공 형성된다. 릴리스에 따라, 기공은 Cy5에 접합 된 형광 항체 소포 내부 synaptotagmin에 부착 된 synaptotagmin를 떠나, 닫습니다. 이러한 방법으로, 적극적으로 신경 전달 물질의 방출에 종사하는 만 소포는 항체로 표시되어 있습니다. 몇 가지 실험에서 어떤 컨트롤 사이의 접촉 HEK293 세포와 중간 가시 신경 단자가 있다면 '액티브 & #8217; HEK293 세포에서 시냅스 GAD65 / synaptotagmin 형광 및 mCherry 형광 (도 3A) 사이의 공동 현지화의 부족에 의해 도시 된 바와 같이. 대조적으로, 다수의 '액티브'접점 매체 가시 뉴런 단자 α1 / β2 / γ2 발현 GAD65 / synaptotagmin 및 mCherry 간의 공동 지역화 고도에 의해 계시 된 HEK293 세포, 특히 HEK293 세포에서 발현 (사이에 형성했다 그림 3B).
중간 가시 뉴런과 HEK293 세포를 표현 GABA R의 다른 하위 유형은 또한 체외에서 시냅스와 같은 형성을 촉진 할 수 있는지 여부를 테스트하기 위해, 우리는 한 공동 배양 α1 / β3 / γ2. 또, 제어 HEK293 세포는 거의 도달 synapsin 양성 시냅스 단말기와 연락처를받지 ± 0.48 10.8 공동 문화 (그림 4A 왼쪽, 4B)에서 24 시간 후 HEK293 세포 당 연락처 (± SEM을 의미)를. 그러나, HEK293 세포는 발현synapsin - 긍정적 인 시냅스의 공동 문화의 24 시간 후 HEK293 세포 당 25.3 ± 0.27 (± SEM을 의미) 접점에 도달하는 중간 가시 뉴런의 터미널 (그림 4A 오른쪽과 시냅스 같은 연락처 α1 / β3 / γ2 GABA 루피 양식 훨씬 더 많은, (b)). 그들의 힘은 α1 / β2 / γ2 함유 GABA의 R을의 힘보다 낮은이기는하지만이 α1 / β3 / γ2 GABA 루피는 HEK293 세포에서 발현을 나타냅니다 것은, 또한 시냅스 접촉 형성을 촉진 할 수 있습니다.
이 실험은 우리의 실험실에서 개발 된 공동 문화 모델 시스템은이 과정에서 GABA의 루피의 다른 아형의 효과를 정량적으로 체외에서 시냅스 접촉 형성의 분석뿐만 아니라 평가를 허용하는 것을 나타냅니다. 이 실험은 또한, GABA 성 시냅스의 중요한 기능적 구성 요소를 일뿐만 아니라 그 GABA의 R을 입증 핵심적인 역할을 할 수있다인식과 독립적으로 다른 시냅스 접착 단백질의 억제 뉴런 및 신경 적절한 표적 세포 간의 연접의 형성 공정.
그림 1. 면역 세포 GABA R의 α1의 발현 분석 / β2 / γ2 또는 안정한 HEK293 세포주 α1 / β3 / γ2. GABA R 서브 유닛의 세포 외 도메인을 인식하는 항체는 세포 표면에 발현 라벨 수용체로 사용 하였다. ( A) HEK293 세포주 표현 α1 (알렉사 플 루어 488), β2 (알렉사 플 루어 555)과 높은 수준의 γ2 (Cy5에). (B) HEK293 세포주 표현 α1 (알렉사 플 루어 488), β2 (알렉사 플 루어 555)과 γ2 (Cy5에)높은 수준의 서브 유닛. 스케일 바 :. 10 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. GABA 성 중간 가시 뉴런 공동 문화 HEK293 세포를 표현하는 α1 / β2 / γ2-와 시냅스와 같은 접점을 형성한다. (A) (오른쪽 파란색) 형광 항 GAD65 항체와 시냅스 터미널의 라벨 (녹색) 및 또는 GABA R γ2 서브 유닛 (빨간색 왼쪽) mCherry와 HEK293 세포는 이들 사이의 공동 현지화 점을 밝혀 공동 문화에 4 또는 24 시간 후 시냅스와 같은 접점의 형성을 나타내는 표식. 스케일 바 :. 10 μm의 (B) 시냅스와 같은 공동의 정량 분석 ntacts. 각각의 광학적 부분에서 눈으로 계수 하였다 DIC 이미징 및 / 또는 mCherry 발현 및 GAD-65 양성 눈물 점 (녹색) 및 HEK293 세포의 표면 사이의 접촉의 수에 의해 계시 된 HEK293 세포는 그들의 형상에 기초하여 식별 된 Z 스택 시리즈 (8-10) 이미징 소프트웨어를 사용하여 셀 당, 및 콘택트 / 셀의 수로 표현. 그래프는 공동 문화 4, 24 시간 후 중간 가시 뉴런 및 제어 HEK293 세포 (라이트 그레이) 또는 α1 / β2 / γ2-HEK293 세포 (검은 색) 사이의 접촉의 수를 표시합니다 (± SEM을 의미, N = 각 8 두 개의 독립적 인 실험에서 조건). 이 수치는 Fuchs의 등에서 수정되었습니다. (2013) 30. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 3. GABA의 R과는 시냅스 같은 GAD65에 대한 긍정적 인 중간 가시 신경 단자 사이의 공동 문화에서 24 시간 후에 형성 연락처 (알렉사 플 루어 (405) 시안) 및 (A) 제어 HEK293 세포. Immunolabeling을 활성화 연접의 형성을 촉진, 또는 (B) HEK293-α1 / β2 / γ2 세포, 일시적으로 mCherry로 형질 모두 (빨간색)를 구축합니다. 활성 연락처 시냅스 터미널에서 모두 소포 내강 도메인 별 안티 synaptotagmin 항체 (Cy5에) 및 GAD65 특정 항체 사이의 공동 현지화로 식별하고, mCherry는 HEK293 세포에서 발현. 스케일 바 :. 10 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 4. GABA 성 중간 가시 뉴런 공동 문화 HEK293 세포를 표현하는 α1 / β3 / γ2- 서브 유닛과 시냅스와 같은 접점을 형성한다. (A) 방지 synapsin (왼쪽) I 항체 (녹색), 및 제어 HEK293 세포, 또는 α1과 시냅스 터미널의 형광 라벨 / β3 / γ2 HEK293 세포를 표현, 모두 일시적으로 (빨간색) mCherry로 형질이 곳을 밝혀 공동 배양 24 시간 후 시냅스 형 접촉의 형성을 나타내는 이들 마커 간의 공동 지역화. 스케일 바 : 10 μm의 (B). 시냅스 형 콘택트의 정량 분석. HEK293 세포 mCherry 식에 의해 식별하고, synapsin의 I 양성 눈물 점 (녹색) 및 HEK293 세포의 표면 사이의 접촉의 수 Z 스택 시리즈의 각 광학 부재에 눈으로 계수 하였다 (8-10) 이미징 소프트웨어를 사용하여 셀 당 및 연락처 / 셀의 수로 표현. 그래프는 중간 가시 뉴런 및 제어 HEK293 세포 (라이트 그레이) 또는 α1 / β3 / γ2-HEK293 세포 (검은 색)의 공동 문화의 24 시간 후 사이의 접촉의 수를 표시합니다 (± SEM을 의미, N = 8 ~ 12 세포에서 두 개의 독립적 인 실험에서 각 조건). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 프로토콜을 수행 할 기술적으로 어려운 것은 아니지만, 가장 정확하고 반복 가능한 공동 배양 분석을 달성하기 위해 따라야하는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 배양 매체 가시 뉴런은 최적의 농도로 접종해야합니다. 너무 드문 드문 시드 경우, 신경 세포는 매우 느리게 개발하는 경향이 생존이 크게 감소한다. 너무 조밀하면 시드 한편, 뉴런 HEK293 세포에 들어갔을 분석하는 응집을 저해하는 경향이있다. 둘째, 그것은 일시적으로 안정적 전에 공동 문화로를 platting에, GABA의 R을 발현하는 HEK293 세포에서 형광 기자, GFP 또는 mCherry을 표현하는 것이 좋습니다. 이는 이들 세포와의 연결을 문화에서 드문 생존 아교 세포의 세포 사이의 모양과 크기에 유사성에 의해 손상 될 수 있습니다 HEK293 세포의 신뢰성 인식 할 수 있습니다. GFP 또는 mCherry cDNA로 형질 감염 효율을 달성하기 위하여, HEK293 세포주 지수 성장기에 있어야하고6 웰 플레이트에 적절한 밀도로 시드. 형질 다음에 스파 스 시드를 통해 시딩의 cDNA를 복용 세포를 방지 할 수있는 동안 세포가 제대로 성장하게됩니다. 형질 날에 90 % 합류 - 그들은 70 사이되도록 이상적으로, 세포를 시딩한다. 어떤 세포주가 다른 것보다 더 민감 셋째로, 형질 전환은, 사용 된 각 세포주에 대해 최적화되어야한다. 구성 적 GABA는 HEK293 세포에서 R 발현 세포 생존 및 형질 감염 후 복구 세포의 능력을 감소하기 때문이다. 또한, 생존 일부 세포주 크게 다른 것보다 더 민감하여, HEK293 세포에서 발현 GABA의 루피의 유형에 따라 달라진다. 리포좀 시약을 사용하여 형질 감염은 빠르게 성장 세포주에 외래 단백질을 발현하는 형질 높은 효율 및 발현 수준을 모두 제공하기위한 최적의 방법이다. 그러나,이 시약에 대해, 천천히 성장하는 세포주에 너무 많은 손상을 야기이는 우리가 정기적으로 비 리포좀 형질 전환 시약을 사용합니다. 이것은 리포좀 시약 유사한 방식으로 작동하지만 효율적인 형질 필요한 DNA의 양은 상당히 감소된다. 이것은 큰 세포 생존을 허용 (대략 80~90% 60 % 사용하여 리포좀 시약과 비교)하지만 낮은 형질 전환 효율 (60 %)로. 마지막으로, 제어 HEK293 또는 α1의 수 / β2 / γ2 HEK293 신경 세포 배양 물에 첨가 발현 세포하여 최적화 될 필요가있다. 그들은 매우 드문되기 때문에 너무 적은 수의 세포를 추가하면, HEK293 세포와 신경 세포 사이의 접촉의 성공적인 분석을 손상시킨다. 반대로, 너무 많은 HEK293 세포를 첨가하여 몇 시간 이내에 신경 세포 사멸을 야기한다.
배아 매체 가시 신경 세포 문화가 이상적으로 배아 15 세에서 해부 선조체 조직을 이용하여 제조한다 - 그러나 17, 종종 배아 최적의 나이보다 약간 젊은 이상인 것을 발생합니다. 이 경우, 뉴런의 수가 배양에 접종 것변화 될 필요가있다. E15보다 어리다 조직은 E17 최적의 세포 생존 할 수 있도록, 더 높은 밀도로 접종 할 필요가 있습니다보다 나이가 조직하는 동안, 약간 낮은 밀도에서 시드 할 필요가있다. 또한, 시토신 아라 비노 시드 (아라-C)은 나이가 조직에 더 풍부 아교 세포의 성장을 방지하기 위해 이전의 문화에 추가해야 할 수도 있습니다.
공동 배양을 생성 할 때 상술 한 바와 같이, 그것은, 형질 감염된 HEK293 또는 α1 / β2 / γ2 HEK293 발현 세포의 수를 최적화 도금하는 것이 중요하다. 그러나 때문에 생존의 차이, 각 세포주에 대해이 결정을 할 필요가있다. 이 조절 신경 매체가 너무 희석되지 않도록하고 전형적으로 50 μL의 최대 음량에 30,000 셀들은 이미 신경 세포 배양 배지 500 μl를 함유하는 24 웰 접시의 각 웰에 첨가한다 조건 해당 각 내에서 잘, 예를 비교적 일정하게 유지
공동 배양 기술의 주요 단점 중 하나는 신경 세포 배양 물 뉴런 정상적인 미세 환경으로부터 제거하고 정상적인 해부학 적 조직을 확립 할 수없는되었음을 의미 단층, 성장 중 해리 된 세포로부터 생성된다는 점이다. 그러므로 그들은 시냅스 개발의 초기 단계에 영향을 미칠 수있는 다른 셀들로부터의 적절한 연결 입력 및 분비 분자 부족하다. 예를 들어, 생체 내 중간 가시 뉴런 조밀 이러한 입력은 선조체 조직을 절개 중에 손상되기 때문에 글루타메이트 시냅스 형성하지 않는 우리의 신경 세포 배양에서, 그러나, 피질, 시상 및 다른 뇌 영역 (34)로부터 글루타메이트 입력에 의해 신경 지배된다. 어떻게 배양 매체 가시 뉴런의 기능 글루타메이트 시냅스의 부재 AFFECTS GABA R을 표현하는 서로 및 / 또는 HEK293 세포와 GABA 성 시냅스를 형성 할 수있는 능력은 의문으로 남아있다. 이 질문은 쉽게 피질 글루타메이트 신경함으로써 그들이 35 종래 HEK293 세포의 부가 기능에 시냅스를 형성 할 수 있도록 함께 중간 가시 뉴런을 배양함으로써 해결 될 수있다. 대안적인 접근법은 성숙 및 시냅스 형성에 중요 할 수 cytoarchitecture의 일부를 유지 Organotypic 슬라이스 배양에 기초 공동 배양 모델 시스템을 설계하는 것이다. 그러나 Organotypic 슬라이스 문화는 여기에 수행 된 분석을 손상시킬 수 조밀하고 이기종 neuropil 있습니다. 이는 충분히 높은 표면 발현 (30)를 소정의 시냅스 형성에 필요하지 나타나지만 공동 배양 분석을 사용하는 또 다른 중요한 단점은, GABA 루피들이 뉴런 그대로 클러스터되지 HEK293 세포의 표면에서 발현한다는 것이다. 예를 들면, R에odent 뇌와 해마 문화에서, α1 GABA R 서브 유닛은 피라미드 세포의 모든 시냅스 도메인에 가장 GABA 성 시냅스에서 발견된다. 그러나, α2는 특히 세포체에 시냅스와 수상 돌기의 부분 집합에 위치하고 있지만, 면역 형광 및 전자 현미경 (36)에 의해 계시 고, 축삭 초기 세그먼트에 충실. 공동 배양에 시냅스 형성이 여전히 신뢰성있게 검출 할 수 있음을 감안할 때, 30 분석이 HEK293 세포의 세포 표면에서 GABA의 루피의 밀도가 시냅스 내에서 이러한 수용체의 밀도보다 비슷하거나 심지어는 더 높을 수 있음을 시사 신경 세포의 클러스터. 이것은 적어도 같은 gephyrin 등 neuroligin 같은 시냅스 접착 단백질 및 시냅스 밀도 단백질, 적절하게 조립 GABA R과 충분한에 존재하는 경우, 공동 문화 시냅스 형성에 필요하지 않은 이유 부분에서 설명 할 수 밀도.
그것은 잘 GABA의 R과 구조적 및 기능적 이종 것으로 설명되고, 수용체 아 단위 조성물은 세포 내 현지화 및 약리학 적 특성을 결정한다는. 서브 유닛이 거의 독점적으로 현재 extrasynaptic GABA의 루피에있는 동안 예를 들어, 2 개의 서브 유닛의 결합은 GABA의 RS의 시냅스 현지화을위한 전제 조건으로 알려져있다. 단지 조합 αβ 통합 수용체는 주로 extrasynaptic 도메인 12 (14) 지역화 할 것으로 생각된다. 이 특이성은 우리의 공동 배양 시스템에서 유지되는지의 여부를 쉽게 일시적 신경 세포 배양 물에 추가하기 전에, 안정적으로 α 및 β 서브 유닛을 발현하는 HEK293 세포주에 2 개 소단위의 cDNA를 형질 감염에 의해 시험 될 수있다. 이 방법을 사용하는 우리의 예비 실험은 연접 용이 정시 나타내는 만이 서브 유닛의 존재 하에서 형성되는 것이 제안생체 내에서 관찰 ficity이 시험 관내에서 유지 될 가능성이있다 (데이터는 미도시).
또한, 다른 α 서브 유닛을 통합 GABA의 R은 선택적으로 시냅스 전 뉴런의 특정 유형의 형성 연접 언어로 번역. 예를 들어, 글로 버스 pallidus에서, α1-GABA의 R은 일반적으로 striatopallidal (STR-GP) 각각 수상 돌기 및 중간 가시 신경 세포의 체세포 지역에있는 palliopallidal (GP-GP) 시냅스에서 찾을 수 있습니다. α3-GABA의 루피는 중간 가시 뉴런의 perisomatic 지역에있는 이러한 뉴런의 말단 수상 돌기에 위치하며, 선조체 (32)로부터 입력에 의해 주로 접촉 α2-GABA의 루피 동안, 지역 GP 축삭 담보로 연락한다. 시냅스 및 다른 신경 세포 구획에서 다른 유형의 특정 α 서브 유닛의 발현은 또한 HIPP 같은 다른 뇌 영역에서 입증되었다ocampus 21과 18, 20 신피질. 이러한 결과는 특정 억제 시냅스가 뇌에서 형성되는 방법에 대한 의문을 제기. 시냅스 단말기의 특정 유형의 접착력은 접촉점에 특정 GABA R 아형의 삽입을 유도 하는가? 수용체는 세포막 삽입 특정 출처의 축삭 터미널의 접착을위한 필수 조건이다 자신의 서브 유닛 구성에 따라 특정 세포 내 위치에 인신 매매? 지금까지 이러한 질문에 답이 남아있다. 이러한 공동 배양 모델 시스템으로 환원 모델 시스템의 사용은 시스템이 중요한 DNA 작 제물 및 시약의 적용 형질 쉽게 순종하며 때문에 우리는이 복잡한 질문에 대답 시작할 수 있도록, 그것은 생균 영상 분석에 적합 30. 따라서,이 모델 시스템을 이용하여 우리가 알고, GABA의 루피의 다른 유형을 포함하여 개별적인 분자의 역할을 테스트 시작할 수n은 연접에 존재합니다. 또 다른 장점은 분 이내 시간 급속이 모델 시스템 형태 시냅스, 실험 지속 기간을 감소시키는 점이다. 유사 공동 배양 모델 시스템이 성공적으로 신규 synaptogenic 분자 27,37,38 스크리닝하는 과거에 사용되었다.
중추 신경계가 어떻게 발전하는지 이해, 성숙하고 예, 행동이나 인식에 대한 제어에 매우 복잡 뉴런 사이 형태의 연결은, 기본적인 중요하다. 이 먼 목표는 개발 기간 동안 인식과 세포 간 통신의 각 단계를 제어하는 분자 메커니즘의 윤곽에 의해 달성 될 것이다. 때문에 복잡성에, 이러한 여러 세포 상호 작용의 분자 세부 사항은 현재는 감소 된 시스템에서 정밀하게 공부하실 수 있습니다. 그러나, 능력은 단백질의 여러 조합을 표현하는 방법과 연구함으로써 이러한 시스템의 복잡성을 증가시키기이들은 예를 들어, 유전자 결실 접근 방식에 비해 몇몇 장점을 가지고 상호 작용한다. 하나의 유전자 결실 효과의 정확한 해석은 종종 특히 뇌 발달에, 원래 병변 효과 마스킹 보상 메커니즘과 연관된 변화에 의해 손상되기 때문이다. 여기서 설명하는 단순하면서도 유익한 공동 배양법은 시냅스 형성, GABA의 루피의 구조적 역할의 검색을 허용 GABA의 루피와 다른 세포 부착 분자 및 / 또는 시냅스 기질 단백질이 서로 어떻게 상호 작용 하는지를 조사 할 가능성을 열었다 synaptogenesis에 중. 시냅틱 기질 단백질들은 최근 글루타메이트 시냅스 형성 (39)에서 중요한 역할을하는 것으로 입증되었다 주어진 특히 관심이다. 그들은 '정상 가이드 분자 메커니즘에 대한 지식을 사전에 잠재력을 갖고 있기 때문에 공동 배양 모델의 추가적인 개발이 중요# 8217; 두뇌 발달에 따라서는 이러한 메커니즘은 간질, 정신 분열증, 자폐증 스펙트럼 장애와 많은 다른 사람과 같은 많은 신경 발달 질환에서 변경하는 방법에 대한 우리의 이해를 높일 수 있습니다.
Acknowledgments
우리는 MRC 영국 (G0800498)에서 재정 지원을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 항생제 내성을 포함하여 pcDNA 3.1 (+) 발현 벡터를 제공하기 위해, GABA -R 서브 유닛 별 γ2 항체 교수 R. 하비, 약국의 UCL 학교를 제공하기 위해, 교수 JM Fritschy, 취리히 대학에 감사드립니다 안정하게 형질 감염된 HEK293 세포주의 생산을위한 유전자.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Life Technologies | 11960-044 | Warm in water bath at 37 °C before use |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Danger: irritant |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | 10106-169 | |
| Neuralbasal | Life Technologies | 21103-049 | Warm in water bath at 37 °C before use |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| HBSS (10X) | Life Technologies | 14180-046 | |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-056 | |
| PBS (1X) | Life Technologies | 10010-031 | |
| pcDNA 3.1(+) Mammalian Expression Vector (Geneticin-selection) | Life Technologies | V790-20 | |
| pcDNA 3.1(+) Mammalian Expression Vector (Zeocin-selection) | Life Technologies | V860-20 | |
| pcDNA 3.1(+) Mammalian Expression Vector (Hygromycin-selection) | Life Technologies | V870-20 | |
| Stable HEKα1β2γ2 line | Sanofi-Synthelabo, Paris | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P1149 | |
| G418 disulfate salt (Geneticin) | Sigma-Aldrich | G5013 | Danger: irritant |
| Phleomycin D1 (Zeocin) | Life Technologies | R25001 | |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | Danger: toxic, irritant and corrosive |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | Warm in water bath at 37 °C before use. Danger: irritant. |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| 100 μm Nylon Cell Strainer | VWR | 734-0004 | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C1768 | Danger: Irritant |
| Chelating agent (Versene) | Life Technologies | 15040-033 | |
| Liposomal transfection reagent (Lipofectamine LTX) with liposomal transfection buffering reagent (PLUS reagent). | Life Technologies | 15338-100 | Alternative transfection method: Effectene Reagent |
| Non-liposomal transfection reagent (Effectene reagent) | Qiagen | 301425 | |
| Reduced serum medium (Opti-MEM) | Life Technologies | 11058-021 | |
| Mouse anti-Synaptotagmin antibody conjugated to Cy5 | Synaptic Systems | 105311C5 | |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888-022 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | VWR | 27810.364 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G1726 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Guinea pig anti-γ2 GABAA receptor antibody | Prof. Jean Marc Fritschy | N/A | (Institute of Zurich, Switzerland) Fritschy, JM and Mohler, H. J. Comp. Neurol. 359 (1), 154-194 (1995). |
| Triton X-100 | Promega | H5141 | |
| Mouse anti-Glutamate Decarboxylase (GAD)65 antibody | Merck Millipore | MAB351 | |
| Mouse anti-synapsin antibody | Synaptic Systems | 106-011 | |
| Mouse anti-β2/3 antibody (BD17) | Merck Millipore | MAB341 | |
| Rabbit anti-α1 GABAA receptor antibody | Professor Anne Stephenson | N/A | (UCL School of Pharmacy, London) FA Stephenson et al. J. Comp. Neurol. 416 (2), 158-172 |
| Goat anti-guinea pig conjugated to Cy5 antibody | Merck Millipore | AP1085 | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody | Merck Millipore | AP124S | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 405 antibody | Life Technologies | A31553 | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 antibody | Life Technologies | A21422 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | Life Technologies | A11008 | |
| Mounting reagent (Prolong Gold) | Life Technologies | P36930 | Use at room temperature |
References
- Wang, D. D., Kriegstein, A. R. Defining the role of GABA in cortical development. J Physiol. 587, 1873-1879 (2009).
- Ben-Ari, Y., Khalilov, I., Kahle, K. T., Cherubini, E. The GABA excitatory/inhibitory shift in brain maturation and neurological disorders. The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 18, 467-486 (2012).
- Structure Sieghart, W. pharmacology, and function of GABAA receptor subtypes. Adv Pharmacol. 54, 231-263 (2006).
- Unwin, N. Neurotransmitter action: opening of ligand-gated ion channels. Cell. 72, 31-41 (1993).
- Homanics, G. E., et al. Mice devoid of gamma-aminobutyrate type A receptor beta3 subunit have epilepsy, cleft palate, and hypersensitive behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 4143-4148 (1997).
- Gunther, U., et al. Benzodiazepine-insensitive mice generated by targeted disruption of the gamma 2 subunit gene of gamma-aminobutyric acid type A receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7749-7753 (1995).
- Mohler, H. GABA(A) receptor diversity and pharmacology. Cell Tissue Res. 326, 505-516 (2006).
- Low, K., et al. Molecular and neuronal substrate for the selective attenuation of anxiety. Science. 290, 131-134 (2000).
- Rudolph, U., et al. Benzodiazepine actions mediated by specific gamma-aminobutyric acid(A) receptor subtypes. Nature. 401, 796-800 (1999).
- Rudolph, U., Knoflach, F. Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes. Nat Rev Drug Discov. 10, 685-697 (2011).
- Hulst, C., Atack, J. R., Kooy, R. F. The complexity of the GABAA receptor shapes unique pharmacological profiles. Drug Discov Today. 14, 866-875 (2009).
- Essrich, C., Lorez, M., Benson, J. A., Fritschy, J. M., Luscher, B. Postsynaptic clustering of major GABAA receptor subtypes requires the gamma 2 subunit and gephyrin. Nat Neurosci. 1, 563-571 (1998).
- Schweizer, C., et al. The gamma 2 subunit of GABA(A) receptors is required for maintenance of receptors at mature synapses. Mol Cell Neurosci. 24, 442-450 (2003).
- Belelli, D., et al. Extrasynaptic GABAA receptors: form, pharmacology, and function. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 12757-12763 (2009).
- Connolly, C. N., Wooltorton, J. R., Smart, T. G., Moss, S. J. Subcellular localization of gamma-aminobutyric acid type A receptors is determined by receptor beta subunits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 9899-9904 (1996).
- Connolly, C. N., Krishek, B. J., McDonald, B. J., Smart, T. G., Moss, S. J. Assembly and cell surface expression of heteromeric and homomeric gamma-aminobutyric acid type A receptors. J Biol Chem. 271, 89-96 (1996).
- Klausberger, T., Roberts, J. D., Somogyi, P. Cell type- and input-specific differences in the number and subtypes of synaptic GABA(A) receptors in the hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2513-2521 (2002).
- Thomson, A. M., Jovanovic, J. N. Mechanisms underlying synapse-specific clustering of GABA(A) receptors. Eur J Neurosci. 31, 2193-2203 (2010).
- Fritschy, J. M., Panzanelli, P., Tyagarajan, S. K. Molecular and functional heterogeneity of GABAergic synapses. Cell Mol Life Sci. 69, 2485-2499 (2012).
- Ali, A. B., Thomson, A. M. Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex. Cereb Cortex. 18, 1260-1271 (2008).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P., Hughes, D. I., Pawelzik, H. Differential sensitivity to Zolpidem of IPSPs activated by morphologically identified CA1 interneurons in slices of rat hippocampus. Eur J Neurosci. 12, 425-436 (2000).
- Nyiri, G., Freund, T. F., Somogyi, P. Input-dependent synaptic targeting of alpha(2)-subunit-containing GABA(A) receptors in synapses of hippocampal pyramidal cells of the rat. Eur J Neurosci. 13, 428-442 (2001).
- Treutlein, B., Gokce, O., Quake, S. R., Sudhof, T. C. Cartography of neurexin alternative splicing mapped by single-molecule long-read mRNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1291-1299 (2014).
- Siddiqui, T. J., Craig, A. M.
- Tanaka, H., et al. Higher-order architecture of cell adhesion mediated by polymorphic synaptic adhesion molecules neurexin and neuroligin. Cell reports. 2, 101-110 (2012).
- Krueger, D. D., Tuffy, L. P., Papadopoulos, T., Brose, N. The role of neurexins and neuroligins in the formation, maturation, and function of vertebrate synapses. Current opinion in neurobiology. 22, 412-422 (2012).
- Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons. Cell. 101, 657-669 (2000).
- Graf, E. R., Zhang, X., Jin, S. X., Linhoff, M. W., Craig, A. M. Neurexins induce differentiation of GABA and glutamate postsynaptic specializations via neuroligins. Cell. 119, 1013-1026 (2004).
- Dong, N., Qi, J., Chen, G. Molecular reconstitution of functional GABAergic synapses with expression of neuroligin-2 and GABAA receptors. Mol Cell Neurosci. 35, 14-23 (2007).
- Fuchs, C., et al. GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses. Eur J Neurosci. 38, 3146-3158 (2013).
- Ventimiglia, R., Lindsay, R. Culturing nerve cells: Rat striatal neurons in low-density, serum-free culture. , 2nd edn, MIT Press. 371-393 (1998).
- Gross, A., et al. Differential localization of GABA(A) receptor subunits in relation to rat striatopallidal and pallidopallidal synapses. Eur J Neurosci. 33, 868-878 (2011).
- Fritschy, J. M., Mohler, H. GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits. J Comp Neurol. 359, 154-194 (1995).
- Doig, N. M., Moss, J., Bolam, J. P. Cortical and thalamic innervation of direct and indirect pathway medium-sized spiny neurons in mouse striatum. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 14610-14618 (2010).
- Lalchandani, R. R., Vicini, S. Inhibitory collaterals in genetically identified medium spiny neurons in mouse primary corticostriatal cultures. Physiological reports. 1, (2013).
- Nusser, Z., Sieghart, W., Benke, D., Fritschy, J. M., Somogyi, P. Differential synaptic localization of two major gamma-aminobutyric acid type A receptor alpha subunits on hippocampal pyramidal cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 11939-11944 (1996).
- Linhoff, M. W., et al. An unbiased expression screen for synaptogenic proteins identifies the LRRTM protein family as synaptic organizers. Neuron. 61, 734-749 (2009).
- Pettem, K. L., Yokomaku, D., Takahashi, H., Ge, Y., Craig, A. M. Interaction between autism-linked MDGAs and neuroligins suppresses inhibitory synapse development. J Cell Biol. 200, 321-336 (2013).
- Wit, J., et al. Unbiased discovery of glypican as a receptor for LRRTM4 in regulating excitatory synapse development. Neuron. 79, 696-711 (2013).
