Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Hemmende Synapse Dannelse i en Co-kultur Modell innlemme gabaergic Medium Tifotkreps nevroner og HEK293 Cells stabilt uttrykker GABA Published: November 14, 2014 doi: 10.3791/52115
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1UCL School of Pharmacy, University College London

Summary

De molekylære mekanismene som koordinere dannelsen av hemmende gabaergic synapser under ontogeny er i stor grad ukjent. For å studere disse prosessene, har vi utviklet en ko-kulturmodellsystem som inkorporerer embryoniske medium spiny GABAergiske neuroner dyrket sammen med stabilt transfekterte humane embryoniske nyre 293 (HEK293 celler) som uttrykker funksjonell GABAA-reseptorer.

Introduction

GABA er en av de tidligste neurotransmittere som finnes i den embryoniske hjernen, forut for den mest rikelig eksitatoriske nevrotransmitteren glutamat 1. Under utviklingen depolariserer GABA og begeistrer umodne nevroner, som spiller en nøkkelrolle i å regulere cellevekst, migrasjon og dannelsen av nevrale nettverk uten å indusere eksitotoksisitet. I den voksne hjernen reverse potensialet for GABA A reseptor-kanaler forskjøvet til mer negative potensialer på grunn av en reduksjon i den intracellulære konsentrasjonen av klorid. Denne forskyvning er forårsaket av opp-regulering av kalium-klorid ko-transportør (KCC2), som transporterer kloridet ut av cellen, og, i parallell, nedregulering av natrium-kalium-klorid transportør (NKCC1), som har motsatt effekt 2.

I hjernen, GABA binder hovedsakelig GABA til enten A- eller B-GABA-reseptorer til å mediere rask eller langsom synaptisk inhibering, respektivly. GABA A Rs er en klasse av reseptorer også kjent som heteropentameric ionotropiske eller ligand-gated Cys-sløyfe ionekanaler. To molekyler av GABA er nødvendig for aktivering av reseptoren, som er gjennomtrengelig for kloridioner og i mindre grad, bikarbonationer. Økningen i klorid ledningsevne reduserer effektiviteten depolariserende, eksitatoriske hendelser i aktivere den postsynaptiske nevron tre.

Strukturelle mangfold av GABA A Rs har lenge vært anerkjent som en viktig faktor i å bestemme deres brede spekter av funksjonelle og farmakologiske egenskaper. Native GABA A Rs er hetero-pentamerer sammensatt av underenheter med flere isoformer klassifisert som: α (1-6), β (1-3), γ (1-3), δ, ε, π og θ 3, med en felles transmembrane topologi som omfatter et stort N-terminale ekstracellulære domene, fire transmembrandomener (TMS), og en større intracellulære domenet mellom minner 3 og 4 4. Denβ3 og γ2 underenhetene er avgjørende for synaptisk hemming og organisme overlevelse, fordi mus med genetisk sletting av disse underenhetene dør etter fødselen 5,6. I motsetning til dette individuelle isoformer av α subenhet er viktige for funksjonen av spesifikke synaptiske forbindelser i hjernen som er assosiert med forskjellige virkemåter som angst, sedasjon, opphisselse, og andre, men er ikke, individuelt, essensielle for liv 7-9. GABA A Rs er de viktigste stedene i handling for en rekke legemidler med potent beroligende, hypnotisk, angstdempende og antiepileptiske effekter, som for eksempel benzodiazepiner, barbiturater, neurosteroider og bedøvelsesmidler 7,10,11.

Synaptic GABA A Rs typisk inneholde en γ2 subenhet, to β-subenheter (oftest β2 eller β3) og to α subenheter (α1, α2, α3 eller α5) 12,13. Den dominerende klasse av ekstra-synaptiske reseptorer inneholder δ subenheten i kombinasjonα med to subenheter (α4 eller α6), og to β subenheter (β2 eller β3 14). Subcellulære lokalisering av GABAA-Rs på aksonene, dendritter eller soma, og innsetting inn i plasmamembranen er avhengig av tilstedeværelsen av β-subenheter 15,16. Imidlertid selektiv innlemmelse av forskjellige GABA A R subtyper inn i forskjellige typer av synapser korrelerer godt med tilstedeværelse av spesifikke α subenheter (α1, α2, α3 eller α5) 7,17,18. Viktigere, sletting av α1 eller α2 subenheten i mus forårsaker ultra endringer på hemmende synapser 19. Dette tyder på at GABA A RS selv kan spille en direkte rolle i å regulere synapse formasjon.

Mye tyder på at GABAergic synapse utvikling er en nøyaktig koordinert hendelsesforløp, hvor både nevronale mål kontaktet av ulike typer hemmende axoner og reseptorene som er gruppert påhver klasse av hemmende synapse er selektive og funksjonelt tilpasset 17,20-22. Denne grunnleggende prinsippet om spesifisitet på gabaergic synapser reiser spørsmålet om hvordan de pre- og postsynaptiske partnere gjenkjenne hverandre under den innledende synaptiske kontakter.

In vitro-ko-kulturanalyser har blitt anvendt med hell for å studere enkelte av mekanismene for synapse for å teste formasjonen og rollen til de enkelte synaptiske spalten-dekkende proteiner i denne prosessen. En av de vanligste trans-synaptiske samhandlende protein kombinasjoner som fungerer begge veier for å megle synapse dannelse og modning, er Neurexins (Nrxns) og Neuroligins (NLS). Nrxns er presynaptiske proteiner som viser alternativ spleising innenfor sine laminin-neurexin-sex hormonbindende protein domener, som gir opphav til mange forskjellige isoformer 23. Mens Nrxns også samhandle med andre proteiner, er NLS antatt å være deres allestedsnærværende postsynaptiske partners 24. Sammen disse proteinene bidra til å holde de presynaptiske og postsynaptiske membraner i tett og stiv apposition 25. De to mest forekommende isoformer er NL-1 og NL-2 som er til stede ved eksitatoriske synapser og hemmende, henholdsvis 26.. En av de tidligste ko-kultur modellsystemer, som er utformet for å undersøke trans-synaptiske protein interaksjoner, som anvendes forskjellige typer av ikke-neuronale celler, oftest udødelige cellelinjer så som humane embryonale nyre (HEK) 293-celler, til å over-uttrykte NL- 2. Når disse celler ble dyrket med pontinske neuroner, ble en opphopning av presynaptiske proteiner i umiddelbar nærhet til overflaten av HEK-celler observert, noe som indikerer dannelse av synapse-lignende kontakter. Tilsetting av løselig β-neurexin til disse co-kulturer hemmet dannelsen av kontakter, noe som tyder på at trans-synaptiske interaksjoner mellom Nrxns og NLS er nødvendig for synaptisk kontakt dannelse 27. Videre forbigående uttrykkav β-neurexin i COS (C V-1 (Simian) i O rigin, og bærer S V40 genetisk materiale) celler co-dyrket med dissosiert hippocampus glutamaterg og gabaergic nevroner indusert uttrykk for den postsynaptiske protein gephryin og av GABA A R subenheter γ2 og α2 på kontaktpunkter mellom disse to celletyper 28. Et annet eksempel på en ko-kulturmodell som brukes for å studere dannelsen synapse involvert HEK293-celler transient transfektert med GABA A R underenheter α2 / β3 / γ2 og NL-2, og en blandet populasjon av nerveceller 29 hypothalamus. Denne studien konkluderte med at uttrykket av NL-2 er et absolutt krav for dannelsen av hemmende synapser.

Men i den siste co-kultur studie, stabilt transfektert α1 / β2 / γ2 GABA A Rs i HEK293 celler ble funnet å være tilstrekkelig til å indusere funksjonelle synapser ved samtidig dyrket med gabaergic MedIUM spiny nevroner, uten behov for ytterligere trans-synaptiske eller postsynaptiske adhesjonsproteiner. Imidlertid ble en fremtredende økning i synapse formasjon og styrke observert når NL-2 ble co-uttrykkes med GABA A Rs 30. Dette indikerer at denne ko-kultur modellsystemet har fordeler fremfor tidligere beskrevne modellsystemer, mest tydeligvis en øket følsomhet og pålitelighet av synaptisk kontakt deteksjon. To viktige faktorer som bidrar til den totale forbedring i detektering av synaptiske kontakter er: i) Bruk av stabilt transfekterte HEK293-cellelinjer med høy og stabil ekspresjon av GABA A R-underenheter på overflaten av de enkelte celler. Dette konsistens forenkler kvantitative sammenligninger mellom ulike co-kultur forhold. ii) For bruk av en ren befolkning på gabaergic medium spiny nevroner dyrket fra embryonale striatum 31 fjerner komplikasjoner og uklarheter som følge av bruk av blandede nevronale populasjoner og allows, for eksempel utvelgelse av de mest hensiktsmessige postsynaptiske GABA A R typer som kan sammenlignes med hverandre under dannelse synapse.

Dannelse av synapser er tenkt å involvere mange trans-synaptiske signaler i pre- og postsynaptiske celle adhesjon komplekser. På grunn av den to-veis natur synaptiske signalering og de rene tall av celleadhesjonsmolekyler, er det vanskelig å identifisere de viktigste komponentene som er involvert i synapse formasjon. Således transfektere en enkelt celle adhesjon protein inn i en ikke-neuronal celle (i dette tilfellet er de to mest utbredte postsynaptiske mål for GABAergiske neuroner medium pigg in vivo, α1 / β2 / γ2 eller α1 / β3 / γ2 GABA A Rs 32) sterkt reduserer kompleksiteten av trans-synaptiske signaler som er tilgjengelige på den postsynaptiske overflate og tillater presis kvantitativ analyse av effekten av dette proteinet i å fremme synapse formasjon.

Protocol

Sprague-Dawley rotter eller BAB / c innavlet mus (Harlan, UK; antall gravide kvinner som ble brukt var 30) ble plassert og ofret ifølge britiske Home Office [og europeiske fellesskaps rådsdirektiv av 24 november 1986 (86/609 / EEC) ] retningslinjer. Prosjektet ble formelt godkjent av UCL School of Pharmacy Ethics Committee.

1. Utarbeidelse av instrumenter, Culture Medium og Retter

  1. Slå på og rengjør laminær hette med 70% etanol for å arbeide under sterile forhold til alle tider.
  2. Forbered HEK293-celle kulturmedium, inneholdende Dulbeccos modifiserte Eagle-medium pH 7,4 (DMEM, 500 ml), L-glutamin (2 mM), penicillin (50 enheter / ml), streptomycin (50 ug / ml) og føtalt bovint serum (10 %).
    MERK: penicillin og streptomycin er irritanter.
  3. Klargjør det serumfrie dyrkningsmedium nevronal, inneholdende Neurobasal medium pH 7,4 (500 ml), B27 supplement (25 ml), L-glutamin (2 mM), penicillin(50 enheter / ml), streptomycin (50 ug / ml) og glukose (6 mM).
  4. Forbered 500 ml HEPES-bufret saltvannsoppløsning (HBSS) inneholdende 10 x HBSS lager (50 ml), HEPES (1 M) (5 ml) og vann (445 ml), pH 7,4.
  5. Autoklaven fosfatbufret saltvannsløsning (PBS, pH 7,4; 1 L), vann (1 L), dekkglass (13 mm i diameter) og glass Pasteur pipetter for å sterilisere dem.

2. Utarbeidelse av HEK293 Stable cellelinje som uttrykker α1 / β3 / γ2-GABA A Rs

  1. Tallerken 2x10 6 HEK293-celler i en 10 cm steril vevkulturplate og inkuber ved 37 ° С i en fuktet 5% karbondioksyd (CO 2) atmosfære (CO 2 inkubator) for å oppnå 70-90% konfluens over natten.
  2. Den følgende dag, transfektere HEK293-celler med GABA A R α1 subenhet cDNA i pcDN 3.1 (+) ekspresjonsvektor som omfatter den G418-disulfat (tabell 1) resistensgen,og GABA A R β3 subenhet cDNA i ekspresjonsvektoren som omfatter phleomycin D1 (tabell 1) resistens-genet (både under regulering av en human cytomegalovirus-umiddelbar-tidlig (CMV) promoter), ved hjelp av et kationisk liposom-preparat, som komplekser med negativt ladede nukleinsyremolekyler (Tabell 1) i henhold til produsentens protokoll.
  3. I korthet, tilsett 500 ul av redusert serummedium (pH 7,4; Tabell 1) og 7,5 ug av hver cDNA konstruere til et sterilt 15 ml sentrifugerør, etterfulgt av 15 ul av liposomal transfeksjon buffer reagens, og bland forsiktig før de forlater ved romtemperatur 5 min.
  4. Til denne blandingen, tilsett 8,75 mL av liposomal transfeksjon reagens og forsiktig bland før avreise ved romtemperatur i 30 min. Etter dette, tilsett 3 ml HEK293 cellekulturmedium (uten antibiotika), pipettere innholdet av sentrifugerøret opp og ned to ganger, transfer dråpevis til cellene som vokste i en 10 cm vevskultur fatet, og inkuber i 48 timer ved 37 ° С i en fuktet 5% CO2 atmosfære (inkubator CO 2).
  5. Vask de HEK293-celler forsiktig med sterilt PBS, pH 7,4, og fortynne HEK293 celler transfektert inn i nye 10 cm vevskulturskåler, i de følgende forhold: 1: 3, 1: 5, 1: 7, 01:10, 01:15 og 01:20. Dette sikrer at cellene ikke blir altfor konfluent.
  6. Starte utvalget av de HEK293-celler som uttrykker både GABA A R-subenheter ved tilsetning av 800 ug / ml av hvert antibiotikum seleksjonsmarkør, G418, og Phleomycin D1, til kulturmediet. Inkuber cellene ved 37 ° С i en fuktet 5% CO2 atmosfære (inkubator CO 2) og erstatte antibiotika-inneholdende medium (10 ml) hver 2 dager.
  7. Når små hvite kolonier begynne å danne (vanligvis etter ca 7 dager), nøye velge en enkelt koloni fra hver av rettene og samle det ved hjelp av en steril P1000pipettespissen. Overføre det til en brønn i en 24-brønners vevskulturplate inneholdende 500 ul medium og nøye resuspender ved pipettering av mediet opp og ned. Sørg for at nøyaktig ett koloni blir overført til hver brønn (totalt 5-20 kolonier anbefales). Inkuber cellene ved 37 ° С i en fuktet 5% CO2 atmosfære (inkubator CO 2) og erstatte antibiotika-inneholdende medium hver 2. dag.
  8. Når koloniene blir 70-80% konfluent, forsiktig pipettere mediet opp og ned for å løsne cellene fra bunnen av 24-brønners vevkulturplate. Overføre og fordele suspensjonen av celler mellom to brønner i en 6-brønns vevskulturplate. Inkuber cellene ved 37 ° С i en fuktet 5% CO2 atmosfære (inkubator CO 2) og erstatte antibiotika-inneholdende medium hver 2. dag.
  9. Når 70 til 80% konfluent, samle cellene fra en av de to brønner inneholdende celler som stammer fra samme enkelt kolony og forberede protein lysater. I korthet, vask cellene 2x med PBS, pH 7,4, og tilsett 200 ul av 2% natriumdodecylsulfat (SDS) i PBS, pH 7,4. Samle lysatet og overføre den til mikrosentrifugerør. Måle proteinkonsentrasjon ved hjelp av BCA protein-reagens (se tabell 1) i henhold til produsentens protokoll. Analyser ekspresjon av α1 og β3 subenheter av GABA-reseptorer ved SDS / PAGE og immunoblotting ved bruk av underenhetsspesifikke antistoffer (kanin-anti-α1-spesifikk og kanin-anti-β3 spesifikke GABA A R-antistoffer, se tabell 1 for informasjonen på disse antistoffer).
  10. Løsne og overføre bare positive kloner fra de resterende brønnene til større 6 cm vevskulturskåler. Inkuber cellene ved 37 ° С i en fuktet 5% CO2 atmosfære (inkubator CO 2) og erstatte antibiotika-inneholdende medium hver 2. dag.
  11. Gradvis utvide kolonier av celler under antibiotikumet utvalget ved å overføre dem til 10 cm vevskulturskåler og til slutt til vevsdyrkingskolber (T-75 flasker). Inkuber cellene ved 37 ° С i en fuktet 5% CO2 atmosfære (inkubator CO 2) og erstatte antibiotika-inneholdende medium hver 2. dag.
  12. Plate 70 000 celler fra hver koloni på dekkglass (13 mm i diameter), og fiksere cellene til å analysere celleoverflate-ekspresjon og ko-lokalisering av GABAA-R-subenheter ved immunofluorescens.
  13. Velg den positive klon av HEK293-celler som uttrykker høye nivåer av både α1 og β3 subenheter av GABA-reseptorer, plate 2 x 10 6 celler inn i en 10 cm steril vevskulturskål og inkuber ved 37 ° С i en fuktet 5% CO2 atmosfære ( CO 2 inkubator) over natten. Sørge for at cellene blir inkubert i antibiotikaholdige (G418 og Phleomycin D1) medium til alle tider.
  14. Dagen etter, transfektere HEK293 celler med GABA A R γ2s subenhet cDNA i ™ pcDNA 3.1 (+) ekspresjonsvektor som omfatter Hygromycin B resistens-genet ved anvendelse av en ikke- liposomale lipid transfeksjon reagens (tabell 1).
    MERK: Dette transfeksjonsmetoden gir bedre overlevelse og høyere uttrykk effektiviteten av fremmede proteiner i langsomt voksende stabile cellelinjer som er under kontinuerlig utvalg med antibiotika.
  15. I et sterilt 15 ml sentrifugerør, tilsett 250 ul av DNA-enhancer og kondensebuffer (tabell 1) og 1,4 ug av γ2s GABA A reseptor-underenhet cDNA. Legg 11,2 mL av enhancer og virvle i 1 sek før de forlater ved romtemperatur i 5 min.
  16. Legg 35 ul av ikke-liposomale lipid transfeksjon reagens og virvle i 10 sekunder før de forlater ved romtemperatur i 10 min. Tilsett 3 ml av G418 / Phleomycin D1-inneholdende medium og pipettere innholdet av sentrifugerøret opp og ned to ganger BEFmalm overføre det drop-messig på cellene vokser i en 10 cm vevkulturplate. Cellene inkuberes i 48 timer ved 37 ° С i en fuktet 5% CO2 atmosfære (inkubator CO 2).
  17. Vask cellene forsiktig med sterilt PBS og fortynnet dem inn i nye 10 cm vevskulturskåler, i de følgende forhold: 1: 3, 1: 5, 1: 7, 01:10, 01:15 og 01:20.
  18. Starte utvalget av α1 / β3 HEK293-celler som uttrykker γ2s subenheten ved tilsetning av 800 ug / ml av antibiotikum seleksjonsmarkør Hygromycin B til G418 / Phleomycin D1-inneholdende medium. Erstatte det gamle medium med den friske G418 / Phleomycin D1 / Hygromycin B-inneholdende medium (10 ml) hver 2 dager.
  19. Gjenta trinn 02.07 til 02.12, under kontinuerlig seleksjon i G418 / Phleomycin D1 / Hygromycin B-holdige cellekulturmedium.
  20. Lagre de positive kloner ved -140 ° C i antibiotika-fritt celledyrkningsmedium og 10% dimetylsulfoksid (DMSO) for fremtidig bruk.
  21. Test nivåav uttrykk for α1, β3 og γ2s GABA A R subenheter av immunoblotting og immunfluorescens i hvert klone etter tining, fordi uttrykket kan endres på grunn av redusert overlevelse av celler under antibiotikavalg.

3. Vedlikehold av HEK293 cellelinjer

  1. Tine en ampulle med kontroll HEK293-celler som uttrykker enten eller de α1 / β2 / γ2-GABA A-Rs (tabell 1) eller α1 / β3 / γ2-GABA A-Rs (beskrevet ovenfor) i 10 ml cellekulturmedium i et 15 ml sterilt sentrifugerør. Sentrifuger ved 440 xg i 5 minutter for å fjerne overskudd av DMSO.
  2. Fjern supernatant og resuspender cellene i 1 ml friskt cellekulturmedium.
  3. Først legge 9 ml friskt cellekulturmedium til en 10 cm vevskulturskål belagt med poly-D-lysin (0,1 mg / ml) og deretter ble 1 ml resuspenderte celler. Agitere forsiktig, side-til-side, for å dispergere cellene og inkuberes ved 37 ° С i en fuktet5% CO 2 atmosfæren (CO 2 inkubator).
  4. Den følgende dag, aspirere mediet for å fjerne eventuelle cellerester og erstatte med 10 ml frisk HEK293 cellekulturmedium.
  5. Velg stabile cellelinjer med antibiotika for å fjerne eventuelle celler som ikke uttrykker GABAA-R-subenheter, og derfor også mangler ekspresjon av antibiotiske resistensmarkører. For α1 / β2 / γ2 stabil cellelinje, erstatte vanlig medium med frisk cellekulturmedium inneholdende G418 (800 ug / ml). For α1 / β3 / γ2 cellelinje, erstatte med frisk cellekulturmedium inneholdende G418 (800 ug / ml), Phleomycin D1 (800 ug / ml) og Hygromycin B (800 ug / ml). FORSIKTIG! G418 er irriterende og hygromycin B er etsende, giftige og irriterende.
  6. Passasje av cellene inn i en ny vevskulturskål ved poding på et lavere densitet når de oppnår> 70% konfluens. Aspirer 10 ml cellekulturmedium og vaskes kort to ganger medPBS, pH 7,4. Tilsett 1 ml av trypsin-EDTA-oppløsning, en oppløsning av proteasen trypsin (0,05% trypsin) og en chelator Ca 2 + EDTA (0,02%) i PBS, pH 7,4, for å løsne cellene fra fatet. Trypsin-EDTA FORSIKTIG! Løsningen er et irritasjonsmoment.
  7. Tilsett 10 ml cellekulturmedium inneholdende de riktige antibiotika, til fatet og bortsuging av cellene. Sentrifuger cellene ved 440 xg i 5 minutter og resuspendere dem i 5 ml cellekulturmedium.
  8. Passasje cellene ved hjelp av en 1:10 fortynning inn i en ny vevskulturkolbe (T-75-kolbe) inneholdende fersk cellekulturmedium og de riktige antibiotika. Inkuber cellene ved 37 ° С i en fuktet 5% CO2 atmosfære (inkubator CO 2) og erstatte mediet annenhver dag. Passasje cellene når> 70% sammenflytende (se trinn 2.8).

4. Utarbeidelse av GABAergic Medium Spiny Neuron Kultur

  1. Under sterile betingelser fremstille en 24-vill plate med poly-L-lysin (0,1 mg / ml) -belagt Dekkglass (13 mm i diameter) og inkuberes ved 37 ° С i en fuktet 5% CO2 atmosfære (inkubator CO 2).
  2. Den følgende dag, aspireres med en pipette overskytende poly-L-lysin og vask Dekkglass med to korte og to 10 sek 5 min lange vaskinger med sterilt vann. Legg laminin (0,01 mg / ml) og inkuberes over natten ved 37 ° С i en fuktet 5% CO2 atmosfære (inkubator CO 2).
  3. Rense disseksjon området med 70% etanol og samle en rekke dissekere verktøy som buet og rett vev tang, saks og pinsett, og fyll i 70% etanol å fullt sterilisere dissecting instrumenter.
  4. Plasser den gravide rotter / mus avlives med CO 2 på ryggen og rengjør huden på buken med 70% etanol. Knip huden med pinsett og kuttet rundt magen gjennom hud, muskler og bukhinne, for å avsløre de indre organer og livmormed embryo tydelig. Pakk embryoene (E16-17) fra livmoren og plassere dem i en petriskål med kjølt PBS.
  5. Plasser embryoene i laminær hette og halshogge dem, samle hodene i en ny petriskål med kjølt HBSS.
  6. Under en dissekere mikroskop, dissekere ut hjernen ved hjelp av buet og rett tang. Plasser hjernen inn i en ny petriskål som inneholder kjølt HBSS.
  7. Skille de to hjernehalvkuler og forsiktig fjerne hjernehinnene. Kutt langs linjen i hippocampus og cortex skallet tilbake for å avdekke striatum. Observer striatum som en tverrstripet hvit struktur på fremre av halvkulen.
  8. Dissekere striatum og kutt i meget små stykker (1 - 2 mm i diameter) og bruke en flammepolert Pasteur-pipette for å samle materialet i et sterilt 15 ml sentrifugerør med et totalt volum på 1 ml. Brann polering sikrer at materialet oppsamles uten å bli skadet.
  9. Bruke brann-polert tip av Pasteur pipette, aspirer cellene og slipp dem 8-10 ganger. Tar en ny pipette med en brann-polish spissen av ca. 30% av dens opprinnelige diameter (1 mm), triturer løsningen i ytterligere 4 - 6 ganger, til det vises homogen.
  10. Filtrere cellene ved anvendelse av en 100 pm nylon celle sil inn i et friskt sterilt sentrifugerør.
  11. Tell cellene med et hemocytometer og plate 70 000 celler i 500 ul kulturmedium neuronal per brønn i en 24-brønns vevskulturplate. Agitere brønnene venstre til høyre og inkuberes ved 37 ° С i en fuktet 5% CO 2 atmosfæren (CO 2 inkubator) i 14 dager in vitro (DIV).
  12. Etter 7 dager kontrollere renheten av neuronale kulturer, og hvis gliaceller celler er til stede, tilsett cytosin β-D-arabinosid (Ara-C; 5 uM) til brønnene for å stoppe deres proliferasjon. For å gjøre dette, må du fjerne 250 mL av neuronal kultur medium (pH 7,4) fra hver brønn og tilsett 250 mL av fersk medium inneholdeing Ara-C. OBS! Ara-C er et irritasjonsmoment.

5. Co-kulturen Forberedelse

  1. På dag 11 av neuronal kultur, belegge en 6-brønns plate med poly-D-lysin (0,1 mg / ml) under sterile betingelser og inkuberes over natten ved 37 ° С i en fuktet 5% CO2 atmosfære (inkubator CO 2).
  2. Den følgende dag (dag 12 av neuronal kultur), aspirere den overskytende poly-D-lysin og vaske brønnene 2x 2x kort og i 5 minutter med sterilt vann før tilsetning av friskt cellekulturmedium (uten antibiotika) til å belegge brønnene med en liten mengde av serum fra mediet.
  3. Aspirere kulturmediet fra vevskulturkolbe (T-75). Rens cellene to ganger med PBS før tilsetning av 1 ml av Ca 2 + / Mg2 + -chelating middel EDTA (0,48 mM) som forsiktig og ikke-enzymatisk dissosierer celler. Agitere cellene for å løsne dem fra bunnen av vevet kolbe.
  4. Tilsett 10 ml cellekulturmedium (uten antibiotika som dette kan interferere med transfeksjon), bortsuging av celler og sted i et sterilt sentrifugerør. Pellet cellene ved 440 xg i 5 min ved hjelp av en lav hastighet benk-top sentrifuge.
  5. Fjern supernatanten og resuspender cellene i 1 ml friskt cellekulturmedium. Ved hjelp av et hemocytometer, telle cellene og plate ved en tetthet på 3 x 10 5 celler per brønn i en 6-brønns plate. Agitere forsiktig og inkuber i 24 timer ved 37 ° С i en fuktet 5% CO2 atmosfære (inkubator CO 2).
  6. Den følgende dag (dag 13 av neuronal kultur) forbigående transfektere de HEK293 celler med mCherry cDNA i konstrukt ekspresjon pcDNA3 ved hjelp av liposomal transfeksjon reagens. Kort, i et sterilt mikrosentrifugerør, tilsett 500 mL av redusert serum medium og 5 mikrogram av mCherry cDNA. Tilsett 5 mL av liposomal buffering reagent og forsiktig bland før avreise ved romtemperatur i 5 min.
  7. Legg 8,75 mL av liposomal transfeksjon Reagent og forsiktig bland før avreise ved romtemperatur i 30 min. Pipettere innholdet i mikrosentrifugerør opp og ned to ganger, overføring dråpevis til hver brønn på 6-brønners vevkulturplate og inkuber ved 37 ° С i en fuktet 5% CO2 atmosfære (inkubator CO 2).
  8. Den følgende dag (dag 14 av neuronal kultur), aspirere den HEK293 cellekulturmediet fra hver av de 6-brønner og hver brønn vaskes kort to ganger med PBS (pH 7,4). Tilsett 300 ul av Ca2 + / Mg2 + -chelating middel EDTA (0,48 mM) og 200 pl trypsin-EDTA (0,02 til 0,48 mM) oppløsning til hver brønn og inkuber ved 37 ° С i 5 min.
  9. Tilsett 1 ml friskt kulturmedium HEK293-celle per brønn (dette slukker trypsin), og bortsuging av frigjorte celler inn i et sterilt 15 ml sentrifugerør. Sentrifuger cellene ved 440 x g i 5 min ved romtemperatur og fjern supernatanten. Resuspender pelleten i 500 pl av neuronal kulturmedium (pH 7,4). </ Li>
  10. Ved hjelp av et hemocytometer, telle celler og frø ved en tetthet på 30.000 celler per brønn i en 24-brønners vevskulturplate inneholdende neuroner. Agitere platen for å dispergere cellene og inkuberes ko-kulturer ved 37 ° С i en fuktet 5% CO2 atmosfære (inkubator CO 2) i 24 timer.

6. Analyse av synaptiske kontakter og deres aktivitet

  1. Etter 23 timer i ko-kultur, undersøke dannelsen av "aktive" kontakter mellom GABAergiske nevroner og pigg medium HEK293-celler ved bruk av aktiviteten-avhengige opptak av anti-synaptotagmin luminal domene-spesifikt antistoff konjugert med et fluorescerende fargestoff (Cy5, se tabell 1) .
    MERK: Antistoffet vil bare få tilgang til det luminale domenet av synaptotagmin, til hvilket det binder når det er kontinuitet mellom de synaptiske vesikkel lumen og ekstracellulære rom. Dette skjer spesielt under neurotransmitterfrigivning, noe som gjør dette AntibODY en utmerket markør for de aktive presynaptiske terminaler.
  2. Først skyll co-kulturer med nevronale medium (Neurobasal En middels, pH 7,4, se tabell 1) og legge Cy5-merket mus anti-synaptotagmin antistoff, fortynnet 1:50 i nevronale medium (Neurobasal En middels, pH 7,4), til kulturer i 30 min. Inkuber cellene i løpet av denne tiden ved 37 ° С i en fuktet 5% CO2 atmosfære (inkubator CO 2).
  3. For å fjerne tilgang til antistoffet, vaske de ko-kulturer i kort tid tre ganger: først med kaldt normal PBS (pH 7,4), andre med kald PBS (pH 7,4) inneholdende 200 mM NaCl og tredje med kald normal PBS (pH 7,4)
  4. Fikser cellene med 300 ul av 4% paraformaldehyd / 4% sukrose i PBS (PFA, pH 7,4) i 10 minutter med omrøring. Vask cellene to ganger med PBS kort (pH 7,4) og deretter med to lengre vaskinger 10 min.
  5. Legg glycin (0,3 M) til hver brønn i 10 min med omrøring for å slukke PFA.
  6. Vask cellene briefly to ganger med PBS (pH 7,4) og deretter med to lengre vaskinger 10 min før tilsetning av 300 ul blokkeringsløsning (1% (w / v) bovint serumalbumin (BSA) i PBS, pH 7,4) for å redusere ikke-spesifikk binding av antistoffer.
  7. Aspirere den blokkerende løsning og tilsett marsvin anti-GABA A R-γ2 antistoff rettet mot γ2 N-terminale domene 33 (1: 3000 i PBS, pH 7,4) over natten ved 4 ° С.
  8. Den følgende dag, aspirere det primære antistoff fra brønnene, og cellene vaskes kort to ganger med PBS og deretter med to lengre vaskinger 10 min.
  9. Permeabilisere cellene ved hjelp av Triton X-100 (0,1%) i blokkeringsløsning i 30 minutter ved romtemperatur.
  10. Vask cellene to ganger med PBS kort (pH 7,4) og deretter med to lengre vaskinger 10 min før tilsetning av enten mus anti-glutaminsyre-dekarboksylase (GAD) 65-antistoff (1: 4000, tabell 1), eller til mus anti-synapsin I-antistoff ( 1: 1000, tabell 1) i 120 minutter ved værelses temperature.
  11. Vask cellene to ganger med PBS kort (pH 7,4) og deretter med to lengre vaskinger 10 min og deretter legge blokkeringsløsning i 30 minutter ved romtemperatur.
  12. Sentrifuger de passende sekundære antistoffer (typisk geite-anti-marsvin IgG konjugert til Cy5, geit-anti-mus-IgG konjugert med Alexa Fluor 488 eller geite-anti-muse-IgG-Fluor Alexa 405, som alle ved 2 ug / ml) for å fjerne aggregater av antistoffer hos 21 910 xg i 10 minutter, og tilsett antistoffer (1: 750) for å blokkere løsning. Søk om å bevilge brønner for 1 time og dekk med aluminiumsfolie for å beskytte fluoroforene fra lyseksponering og påfølgende fotobleking.
  13. Til slutt vaskes cellene kort to ganger med PBS (pH 7,4) og deretter med to lengre 10 min vaskinger for å fjerne eventuelt ubundet sekundært antistoff og monter dekkglass ved hjelp av monterings reagens (Forleng Gold, tabell 1) omtrent 10 ul pr dekkglass. Tillat 24 timer for å sette ved romtemperatur under beskyttelse mot lys før de overføres til 4° С for langtidslagring.
  14. Analysere prøver ved hjelp av en laser scanning konfokal mikroskop med en 63X olje-nedsenking målsetting. Sørg for at lys og detektor gain er justert for å unngå metning.
  15. Observer potensielle synapse-lignende kontakter som regioner av samlokalisering mellom de presynaptiske terminalene positive for GAD65, synapsin I eller Cy5-merket anti-synaptotagmin og postsynaptiske HEK293 celler visualisert ved DIC eller av mCherry fluorescerende indictor.
  16. Count potensielle synapse-lignende kontakter ved hjelp av Z-stabel serie av optiske seksjoner (8 - 10) via en dybde på 4-5 um per celle ved hjelp av bildebehandling.

Representative Results

Protokollen for dette nevron-HEK293 celle co-kultur modellsystemet har blitt finjustert for å gi optimal celleoverlevelse. I dette system dannelse av synapse-lignende kontakter og deres analyser er avhengig av stabil og konsistent ekspresjon av alle tre GABA A R-subenheter, som settes sammen til en funksjonell reseptor. Det er derfor viktig å benytte immunocytokjemisk analyse for å teste for ekspresjon underenhet ved overflaten av HEK293-celle før tilsetning av dem til neuronale kulturer. I disse eksperimentene, ble celleoverflate-ekspresjon av α1, β2 og γ2 subenheter (figur 1A), eller α1, β3 og γ2 subenheter (fig 1B), detekteres ved hjelp av underenhetsspesifikke antistoffer som binder til det ekstracellulære epitoper av slike subenheter. En høy grad av co-lokalisering mellom disse underenheter på overflaten HEK293 ble demonstrert.

Etter å ha bekreftet overflaten uttrykk og samlokalisering av GABA AR subenheter i HEK293 celler, co-kulturer ble utarbeidet etter HEK293 celler som uttrykker α1 / β2 / γ2 GABA A R subenheter og medium spiny nerveceller dyrket i 14 dager (14 dager in vitro (DIV)). Celler i co-kultur ble inkubert i 24 timer, faste og analysert ved hjelp av immunocytokjemi og konfokalmikroskopi. Analyse av kontakter indikerte at GAD65-positive GABAergiske axon terminaler dannet bare sporadiske kontakter med kontroll HEK293-celler (figur 2A, 2B). Antall kontakter som oppdages ved 4 timer var 7,3 ± 0,9 per HEK293 celle, og dette antallet ble redusert til 5,5 ± 0,5 tilkoblinger (gjennomsnitt ± SEM) per HEK293 celle på 24 timer etter å ha lagt HEK293 celler til de dyrkede nerveceller. I kontrast, GAD65-positive gabaergic axon terminaler dannet mange synapse-lignende kontakter med HEK293 celler som uttrykker GABA A Rs. Antall kontakter som oppnås ved 4 timer etter å ha lagt HEK293 celler var 28,3 ± 4,7 prosent HEK293 celle, og dette tallet var ytterligere økningd til 52.1 ± 6.3 (gjennomsnitt ± SEM) per HEK293-celle på 24 timer i ko-kultur (figur 2A, 2B).

For å avgjøre hvorvidt disse synapse-lignende kontakter var "aktiv", altså støttet vesicular senderen utgivelse, ble en vesikkel-luminal domenespesifikke anti-synaptotagmin Cy5-konjugert antistoff lagt til co-kultur medium etter 23 timers inkubering. Dette antistoffet er bare innarbeidet i presynaptiske nerveterminaler når en pore former mellom de synaptiske vesikkel lumen og den ekstracellulære væske i den synaptiske spalten i løpet av nevrotransmitter-frigjøring. Etter utgivelsen, lukker porene, forlater synaptotagmin Cy5-konjugert fluorescerende antistoff festet til synaptotagmin inne i vesikkel. På denne måte blir bare de vesikler aktivt engasjert i neurotransmitterfrigjørelse som er merket med antistoffet. I disse eksperimentene noen hvis noen kontakter mellom kontroll HEK293 celler og medium spiny nevroner terminaler var "aktiv & #8217; som vist ved den manglende co-lokalisering mellom den presynaptiske GAD65 / synaptotagmin fluorescens og mCherry fluorescens i HEK293-celler (figur 3A). Derimot ble mange "aktive" kontakter dannet mellom de mellom spiny nevroner terminaler og α1 / β2 / γ2-uttrykke HEK293 celler, som avslørt av en høy grad av samlokalisering mellom GAD65 / synaptotagmin og mCherry, uttrykt spesifikt i HEK293 celler ( Figur 3B).

For å teste om en annen subtype av GABA A R kan også fremme synapse-lignende formasjon in vitro, har vi co-kultivert α1 / β3 / γ2 uttrykke HEK293 cellene med middels spiny nevroner. Igjen, kontroll HEK293 celler sjelden mottatt kontakter med synapsin-positive presynaptiske terminaler nådde 10,8 ± 0,48 (gjennomsnitt ± SEM) kontakter per HEK293 celle etter 24 timer i co-kultur (figur 4A venstre, 4B). Men HEK293 celler uttrykkerα1 / β3 / γ2 GABA A Rs skjema betydelig mer synapse-lignende kontakter med synapsin-positive presynaptiske terminalene på mellom spiny nevroner nådde 25,3 ± 0,27 (gjennomsnitt ± SEM) kontakter per HEK293 celle etter 24 timer i co-kultur (Figur 4A rett, 4B). Dette indikerer at α1 / β3 / γ2 GABA A Rs uttrykt i HEK293-celler er også i stand til å fremme dannelsen synaptisk kontakt, enskjønt deres styrke er lavere enn styrken av α1 / β2 / γ2 inneholdende GABA-A-Rs.

Disse eksperimentene indikerer at ko-kultur modellsystem utviklet i vårt laboratorium tillater kvantitativ analyse av synaptisk kontaktdannelse in vitro, så vel som vurdering av effekten av forskjellige subtyper av GABA A Rs i denne prosessen. Disse eksperimentene ytterligere demonstrere at GABA A Rs, i tillegg til å være kritiske funksjonelle komponenter av gabaergic synapser, kan spille en nøkkelrollei ferd med anerkjennelse og dannelse av synaptiske kontakter mellom inhibitoriske neuroner og de passende neuronale målceller, uavhengig av andre synaptiske adhesjonsproteiner.

Figur 1
Figur 1. immunocytokjemisk analyse av ekspresjon av GABA A R α1 / β2 / γ2 eller α1 / β3 / γ2 i stabile HEK293-cellelinjer. Antistoffer som gjenkjenner de ekstracellulære domener av GABA A R-subenheter ble brukt til å merke reseptorer uttrykt på celleoverflaten. ( A) HEK293-cellelinje som uttrykker α1 (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) og γ2 (Cy5) på høye nivåer. (B) HEK293-cellelinje som uttrykker α1 (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) og γ2 (Cy5)subenhetene med høye nivåer. Målestokk:. 10 mm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. gabaergic medium spiny nevroner danner synapse-lignende kontakter med α1 / β2 / γ2- uttrykker HEK293 celler i co-kultur. (A) Fluorescent merking av presynaptiske terminaler med anti-GAD65 antistoffer (i grønt) og HEK293 celler med mCherry (i rødt, venstre) eller GABA A R γ2 underenhet (i blått, høyre), avslørte interessante samlokalisering mellom disse markører som indikerer dannelse av synapse-lignende kontakter etter 4 eller 24 timer i co-kultur. Målestokk:. 10 mikrometer (B) Kvantitativ analyse av synapse-lignende co ntakter. HEK293 celler ble identifisert basert på deres form som avslørt av DIC bildebehandling og / eller mCherry uttrykk, og antall kontakter mellom GAD-65 positive puncta (i grønt) og overflaten av HEK293 celler ble talt ved øyet i hver optisk del av en Z-stack-serien (8 - 10) per celle ved hjelp av bildebehandlingsprogrammer, og uttrykt som antall kontakter / celle. Grafen viser antall kontakter mellom mellom spiny nevroner og kontroll HEK293 celler (lys grå) eller α1 / β2 / γ2-HEK293 celler (svarte) etter fire og 24 timer i co-kultur (gjennomsnitt ± SEM, n = 8 i hver tilstand fra to uavhengige eksperimenter). Dette tallet har blitt forandret fra Fuchs et al. (2013) 30. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

ad / 52115 / 52115fig3highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 3. GABA A Rs fremme dannelse av aktive synaptiske kontakter. Immunolabeling av synapse-lignende kontakter dannet etter 24 timer i co-kultur mellom medium spiny nevroner terminaler positive for GAD65 (Alexa Fluor 405 cyan) og (A) kontroll HEK293 celler, eller (B) HEK293-α1 / β2 / γ2 celler, både transient transfektert med mCherry konstruere (rød). Aktive kontakter er identifisert av samlokalisering mellom vesikkel luminal domenespesifikke anti-synaptotagmin antistoff (Cy5) og GAD65-spesifikt antistoff både i presynaptiske terminaler, og mCherry uttrykt i HEK293 celler. Målestokk:. 10 mm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

igur 4 "fo: content-width =" 6in "src =" / files / ftp_upload / 52115 / 52115fig4highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 4. gabaergic medium spiny nevroner danner synapse-lignende kontakter med α1 / β3 / γ2- subenhet uttrykker HEK293 celler i co-kultur. (A) Fluorescent merking av presynaptiske terminaler med anti-synapsin I-antistoffer (i grønt), og kontroll HEK293 celler (til venstre), eller α1 / β3 / γ2 uttrykker HEK293 celler, både transient transfektert med mCherry (i rødt), avslørte interessante samlokalisering mellom disse markørene som indikerer dannelse av synapse-lignende kontakter etter 24 timer i co-kultur. Målestokk: 10 mikrometer (B). Kvantitativ analyse av synapse-lignende kontakter. HEK293-celler, ble identifisert ved ekspresjon mCherry, og antallet kontakter mellom synapsin I-positive puncta (grønt) og overflaten av HEK293-celler ble tellet ved øyet i hver optisk seksjon av en Z-stabel serien (8 - 10) per celle ved hjelp av bildebehandlingsprogrammer, og uttrykt som antall kontakter / celle. Grafen viser antall kontakter mellom mellom spiny nevroner og kontroll HEK293 celler (lys grå) eller α1 / β3 / γ2-HEK293 celler (svarte) etter 24 timer i co-kultur (gjennomsnitt ± SEM, n = 8-12 celler i hver tilstand, fra to uavhengige eksperimenter). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Selv om denne protokollen ikke er teknisk vanskelig å utføre, er det flere viktige skritt som må følges for å oppnå de mest nøyaktige og repeterbare co-kultur analyser. For det første må dyrkede medium pigg neuroner bli sådd ut ved en optimal tetthet. Hvis altfor tynt utsådd, neuroner har en tendens til å utvikle seg meget langsomt og overlevelse er sterkt redusert. På den annen side, hvis podet altfor tett, nerveceller har en tendens til å aggregere som kompromitterer analyse av kontakter med HEK293-celler. For det andre er det anbefalt å forbigående uttrykke et fluorescerende reporter, GFP eller mCherry i HEK293 celler som stabilt uttrykker GABA A Rs, før platting dem inn i co-kultur. Dette gir pålitelig anerkjennelse av HEK293 celler, som kan bli kompromittert av likhet i form og størrelse mellom disse cellene og sjeldne overlevende gliaceller celle i nevronale kulturer. For å oppnå effektiv transfeksjon med GFP eller mCherry cDNA, HEK293-cellelinjer har til å være i den eksponensielle vekstfase, ogutsådd på passende tetthet i 6-brønns plater. Sparse poding, etterfulgt av transfeksjon vil føre cellene til å vokse dårlig, mens over-seeding vil hindre cellene fra å ta opp den cDNA. Ideelt sett bør celler bli sådd ut slik at de er mellom 70-90% konfluent på dagen for transfeksjon. For det tredje må transfeksjon være optimalisert for hver cellelinje som brukes, som noen cellelinjer er mer følsom enn de andre. Dette er fordi konstitutiv GABA A R ekspresjon i HEK293-celler reduserer celleoverlevelse og evne til å gjenopprette celler etter transfeksjon. Videre overlevelse avhenger av typen av GABA A Rs uttrykt i HEK293-celler, med noen cellelinjer være betydelig mer følsom enn de andre. Transfeksjon hjelp liposomal reagens er en optimal metode for å uttrykke fremmede proteiner i raskt voksende cellelinjer, noe som gir både høy transfeksjonseffektivitet og nivå av uttrykk. Imidlertid, denne reagensen forårsaker for mye skade på langsomt voksende cellelinjer, ettersom vi jevnlig bruke en ikke-liposomal transfeksjon reagens. Dette fungerer på en lignende måte til den liposomale reagens, men den mengde DNA som er nødvendig for effektiv transfeksjon blir betydelig redusert. Dette tillater større celleoverlevelse (omtrent 80-90% sammenliknet med 60% ved hjelp av liposomal reagens), men med lavere transfeksjonseffektivitet (60%). Til slutt, / β2 / γ2 HEK293-celler som uttrykker tilsatt til neuronale kulturer må antallet styre HEK293 eller α1 å bli optimalisert. Legge for få celler kompromitterer vellykket analyse av kontakter mellom HEK293 celler og nevroner, fordi de blir svært sjelden. Motsatt, å legge for mange HEK293 celler fører nevroncelledød innen få timer.

Embryonale medium spiny nevroner kulturer bør ideelt sett være forberedt ved hjelp av striatale vev dissekert fra embryonale alder 15 - 17. Men ofte skjer det at embryoer er litt yngre eller eldre enn den optimale alder. I dette tilfellet, utsådd i kultur antall neuroner viltrenger å bli variert. Vev som er yngre enn E15 kan trenge å bli sådd ut ved en noe lavere densitet, mens vev som er eldre enn E17 kan trenge å bli sådd ut ved en høyere tetthet, for å tillate optimal celleoverlevelse. Videre kan cytosin-arabinosid (Ara-C) trenger å bli tilsatt til eldre kulturer for å hindre vekst av gliaceller, som er mer tallrike i eldre vev.

Ved oppretting av ko-kulturer, er det viktig å plate den optimaliserte antall transfektert HEK293 / eller α1 β2 / γ2 HEK293-celler som uttrykker, som nevnt ovenfor. Imidlertid kan det være nødvendig å fastslå dette for hvert enkelt cellelinje, på grunn av forskjeller i deres overlevelse. Typisk 30.000 celler i et maksimalt volum på 50 ul bør tilsettes til hver brønn i en 24-brønners skål, som allerede inneholder 500 ul av neuronal kulturmedium, da dette sikrer at det kondisjonerte medium ikke neuronal fortynnes for mye og at betingelsene innenfor hvert godt holde seg noenlunde konstant, f.eks

En av de store ulemper ved den ko-kultur teknikk er at de neuronale kulturer blir opprettet fra dissosierte celler dyrket som et monolag, slik at nervecellene er blitt fjernet fra sin normale mikromiljø, og er ikke i stand til å etablere sine normale anatomiske organisasjon. Derfor mangler de riktige tilkoblingene, innganger og skilles molekyler fra andre celler som kan påvirke den innledende fasen av synapse utvikling. For eksempel in vivo mellompigg neuroner er tett innervated av glutamaterge innganger fra cortex, thalamus og andre hjerneregioner 34, men i våre neuronale kulturer glutamaterge synapser ikke danner fordi disse innganger er skadet under dissekering av det striatale vev. Hvordan fravær av funksjonelle glutamaterge synapser i dyrkede mellom spiny nevroner AFFekter sin evne til å danne gabaergic synapser med hverandre og / eller HEK293 celler uttrykker GABA A Rs fortsatt et åpent spørsmål. Dette spørsmålet kan lett løses ved å dyrke mellom spiny nevroner sammen med kortikale glutamaterge nevroner og dermed gi dem til å danne funksjonelle synapser 35 før tillegg av HEK293 celler. En alternativ fremgangsmåte ville være å utforme en ko-kultur modellsystem basert på organotypiske skive kulturer, som opprettholder noe av cytoarchitecture noe som kan være viktig for modning og synapse formasjon. Men organotypic skive kulturer har tett og heterogen neuropil som kan kompromittere analysen gjøres her. En annen viktig ulempe ved bruk av ko-kultur-assays, er at GABA A Rs uttrykt på overflaten av HEK293-celler ikke er gruppert som de er i nerveceller, selv om dette ikke synes å være nødvendig for dannelse synapse gitt en høy nok overflateekspresjon 30. For eksempel, i rodent hjernen og i hippocampale kulturer, blir α1 GABA A R-subenheten finnes i de fleste synapser på GABAergiske alle postsynaptiske domener av pyramideceller. Imidlertid er α2 spesifikt plassert i en undergruppe av synapser på somata og dendritter, men er sterkt anriket på axon innledende segment, slik det er åpenbart ved immunofluorescens og 36 elektronmikroskopi. Gitt at synapse dannelse i ko-kulturene kan likevel pålitelig kan detekteres og analyseres 30, tyder dette på at tettheten av GABA A Rs på celleoverflaten til HEK293-celler kan være lik, eller til og med høyere enn tettheten av disse reseptorer i synaptisk klynger i nerveceller. Dette kan forklare, i det minste delvis, hvorfor synaptiske adhesjonsproteiner, slik som neuroligin, og postsynaptiske tetthet proteiner, slik som gephyrin, ikke er nødvendig for dannelsen synapse i ko-kulturer, hvis hensiktsmessig montert GABA A Rs er til stede i tilstrekkelig tetthet.

Det er godt dokumentert at GABA A Rs er strukturelt og funksjonelt heterogent, og at reseptor-underenhet-preparat bestemmer deres subcellulære lokalisering og farmakologiske egenskaper. For eksempel er innlemmelse av de to underenheter kjent for å være en forutsetning for den synaptiske lokalisering av GABAA-Rs mens subenhet er til stede i nesten utelukkende extrasynaptic GABAA-Rs. Reseptorene som inneholder kun αβ kombinasjoner er også antatt å være hovedsakelig lokalisert til extrasynaptic domener 12- 14. Hvorvidt dette spesifisitet opprettholdes i vår co-kultur system kan lett testes ved forbigående transfeksjon 2 eller subenheten cDNAs inn HEK293 cellelinjer stabilt uttrykker α og β-subenheter, før du legger dem til nevronale kulturer. Våre preliminære forsøk under anvendelse av denne tilnærmingen har antydet at synaptiske kontakter er lett dannes bare i nærvær av 2-subenhet, noe som indikerer at den specificity observert in vivo er egnet til å bli bevart in vitro (data ikke vist).

Videre er GABA A Rs som inkorporerer forskjellige subenheter α selektivt lokalisert til synaptiske kontakter dannet med bestemte typer av presynaptiske nerveceller. For eksempel, i globus pallidus, de α1-GABA A Rs er generelt funnet at striatopallidal (str-GP) og palliopallidal (GP-synapser GP), som er plassert på dendritter og somatiske regioner av de mellompigg neuroner, respektivt. De α3-GABA A Rs er lokalisert i perisomatic regioner i mellom spiny nevroner og blir kontaktet av lokale GP axon collaterals, mens α2-GABA A Rs ligger på distale dendritter av disse nevronene og kontaktet primært av innspill fra striatum 32. Uttrykket av spesifikke α subenheter i ulike typer synapser og i ulike nevrale avdelinger er også påvist i andre hjerneområder som hippocampus 21 og neocortex 18,20. Disse funnene reiser spørsmålet med hensyn til hvordan de spesifikke hemmende synapser er dannet i hjernen. Har vedheft av en bestemt type presynaptiske terminalen indusere innsetting av spesifikke GABA A R subtyper i kontaktpunktene? Prøver reseptorene trafikkert til spesifikke subcellulære steder i henhold til deres sammensetning subenhet, hvor deres plasmamembranen innsetting er en forutsetning for adhesjonen av aksonale terminaler av spesifikk opprinnelse? Til dags dato, disse spørsmålene forblir ubesvart. Bruken av reduserte modellsystemer som co-kultur modellsystem, tillate oss å begynne å svare på dette komplekse spørsmål fordi systemet er lett mottakelig for transfeksjon av DNA-konstruksjoner og bruk av reagenser, og enda viktigere, er det egnet for live cell imaging analyse 30. Således, ved hjelp av dette modellsystem kan vi begynne å teste rollen av individuelle molekyler, inkludert forskjellige typer av GABA A-Rs, vetn for å være til stede på synaptiske kontakter. En annen fordel er at synapser i dette modellsystemet skjemaet raskt, i løpet av minutter til timer, reduserer varigheten av forsøkene. Ligner co-kultur modellsystemer ble vellykket ansatt i det siste for å screene for de nye synaptogenic molekyler 27,37,38.

Forstå hvordan sentralnervesystemet utvikler, modnes og danner forbindelser mellom nevroner så intrikat til kontroll, for eksempel, atferd eller kognisjon, er av fundamental betydning. Dette fjernt mål kan kun oppnås ved opptegning av molekylære mekanismer som styrer de enkelte trinnene i anerkjennelse og celle-til-celle kommunikasjon under utvikling. På grunn av kompleksiteten, kan de molekylære detaljene i disse flere cellulære interaksjoner i dag bli studert med presisjon bare i reduserte systemer. Imidlertid, evnen til å øke kompleksiteten i disse systemer ved å uttrykke flere kombinasjoner av proteiner, og studere hvordande samvirker har noen fordeler i sammenligning med, for eksempel genetiske delesjons tilnærminger. Dette er fordi den nøyaktig tolkning av virkningene av et enkelt gen delesjon er ofte svekket av endringer forbundet med kompenserende mekanismer maske virkningene av original lesjoner, spesielt i utviklingen av hjernen. Den enkle, men informative co-kultur teknikken beskrevet her har tillatt et funn av den strukturelle rolle GABA A Rs i synapse formasjon og åpnet en mulighet til å undersøke hvordan GABA A Rs og andre celleadhesjonsmolekyler og / eller synaptiske matriksproteiner samhandle med hverandre under synaptogenesis. Synaptiske matriksproteiner er av spesiell interesse gitt at de har nylig vist seg å spille en nøkkelrolle i glutamaterg synapse formasjon 39. Videreutvikling av samarbeidskultur modeller er viktige fordi de har potensial til å fremme vår kunnskap om de molekylære mekanismene som styrer 'normal &# 8217; hjernens utvikling og dermed øke vår forståelse av hvordan disse mekanismene er endret i mange nevrologiske sykdommer, som epilepsi, schizofreni, autisme og mange andre.

Acknowledgments

Vi ønsker å takke økonomisk støtte fra MRC UK (G0800498). Vi ønsker også å takke professor JM Fritschy, University of Zurich, for å gi GABA A -R subenhet spesifikke γ2 antistoff og professor R. Harvey, UCL School of Pharmacy, for å gi pcDNA 3.1 (+) ekspresjonsvektorene inneholder antibiotikaresistens gener for fremstilling av stabilt transfekterte HEK293-cellelinjer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Life Technologies 11960-044 Warm in water bath at 37 °C before use
L-Glutamine Life Technologies 25030-024
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15070-063 Danger: irritant
FBS (Fetal Bovine Serum) Life Technologies 10106-169
Neuralbasal Life Technologies 21103-049 Warm in water bath at 37 °C before use
B27 Supplement Life Technologies 17504-044
Glucose Sigma-Aldrich G8769
HBSS (10X) Life Technologies 14180-046
HEPES (1M) Life Technologies 15630-056
PBS (1X) Life Technologies 10010-031
pcDNA 3.1(+) Mammalian Expression Vector (Geneticin-selection) Life Technologies V790-20
pcDNA 3.1(+) Mammalian Expression Vector (Zeocin-selection) Life Technologies V860-20
pcDNA 3.1(+) Mammalian Expression Vector (Hygromycin-selection) Life Technologies V870-20
Stable HEKα1β2γ2 line Sanofi-Synthelabo, Paris
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P1149
G418 disulfate salt (Geneticin) Sigma-Aldrich G5013 Danger: irritant
Phleomycin D1 (Zeocin) Life Technologies R25001
Hygromycin B Life Technologies 10687-010 Danger: toxic, irritant and corrosive
Trypsin-EDTA Life Technologies 25300-054 Warm in water bath at 37 °C before use. Danger: irritant.
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P6282
Laminin Sigma-Aldrich L2020
100 μm Nylon Cell Strainer VWR 734-0004
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) Sigma-Aldrich C1768 Danger: Irritant
Chelating agent (Versene) Life Technologies 15040-033
Liposomal transfection reagent (Lipofectamine LTX) with liposomal transfection buffering reagent (PLUS reagent). Life Technologies 15338-100 Alternative transfection method: Effectene Reagent
Non-liposomal transfection reagent (Effectene reagent) Qiagen 301425
Reduced serum medium (Opti-MEM) Life Technologies 11058-021
Mouse anti-Synaptotagmin antibody conjugated to Cy5 Synaptic Systems 105311C5
Neurobasal A Life Technologies 10888-022
Sodium Chloride (NaCl) VWR 27810.364
Glycine Sigma-Aldrich G1726
BSA (Bovine Serum Albumin) Sigma-Aldrich A3294
Guinea pig anti-γ2 GABAA receptor antibody Prof. Jean Marc Fritschy N/A (Institute of Zurich, Switzerland) Fritschy, JM and Mohler, H. J. Comp. Neurol. 359 (1), 154-194 (1995).
Triton X-100 Promega H5141
Mouse anti-Glutamate Decarboxylase (GAD)65 antibody Merck Millipore MAB351
Mouse anti-synapsin antibody Synaptic Systems 106-011
Mouse anti-β2/3 antibody (BD17) Merck Millipore MAB341
Rabbit anti-α1 GABAA receptor antibody Professor Anne Stephenson N/A (UCL School of Pharmacy, London) FA Stephenson et al. J. Comp. Neurol. 416 (2), 158-172
Goat anti-guinea pig conjugated to Cy5 antibody Merck Millipore AP1085
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody Merck Millipore AP124S
Goat anti-mouse Alexa Fluor 405 antibody Life Technologies A31553
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 antibody Life Technologies A21422
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody Life Technologies A11008
Mounting reagent (Prolong Gold) Life Technologies P36930 Use at room temperature

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, D. D., Kriegstein, A. R. Defining the role of GABA in cortical development. J Physiol. 587, 1873-1879 (2009).
  2. Ben-Ari, Y., Khalilov, I., Kahle, K. T., Cherubini, E. The GABA excitatory/inhibitory shift in brain maturation and neurological disorders. The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 18, 467-486 (2012).
  3. Structure Sieghart, W. pharmacology, and function of GABAA receptor subtypes. Adv Pharmacol. 54, 231-263 (2006).
  4. Unwin, N. Neurotransmitter action: opening of ligand-gated ion channels. Cell. 72, 31-41 (1993).
  5. Homanics, G. E., et al. Mice devoid of gamma-aminobutyrate type A receptor beta3 subunit have epilepsy, cleft palate, and hypersensitive behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 4143-4148 (1997).
  6. Gunther, U., et al. Benzodiazepine-insensitive mice generated by targeted disruption of the gamma 2 subunit gene of gamma-aminobutyric acid type A receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7749-7753 (1995).
  7. Mohler, H. GABA(A) receptor diversity and pharmacology. Cell Tissue Res. 326, 505-516 (2006).
  8. Low, K., et al. Molecular and neuronal substrate for the selective attenuation of anxiety. Science. 290, 131-134 (2000).
  9. Rudolph, U., et al. Benzodiazepine actions mediated by specific gamma-aminobutyric acid(A) receptor subtypes. Nature. 401, 796-800 (1999).
  10. Rudolph, U., Knoflach, F. Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes. Nat Rev Drug Discov. 10, 685-697 (2011).
  11. Hulst, C., Atack, J. R., Kooy, R. F. The complexity of the GABAA receptor shapes unique pharmacological profiles. Drug Discov Today. 14, 866-875 (2009).
  12. Essrich, C., Lorez, M., Benson, J. A., Fritschy, J. M., Luscher, B. Postsynaptic clustering of major GABAA receptor subtypes requires the gamma 2 subunit and gephyrin. Nat Neurosci. 1, 563-571 (1998).
  13. Schweizer, C., et al. The gamma 2 subunit of GABA(A) receptors is required for maintenance of receptors at mature synapses. Mol Cell Neurosci. 24, 442-450 (2003).
  14. Belelli, D., et al. Extrasynaptic GABAA receptors: form, pharmacology, and function. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 12757-12763 (2009).
  15. Connolly, C. N., Wooltorton, J. R., Smart, T. G., Moss, S. J. Subcellular localization of gamma-aminobutyric acid type A receptors is determined by receptor beta subunits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 9899-9904 (1996).
  16. Connolly, C. N., Krishek, B. J., McDonald, B. J., Smart, T. G., Moss, S. J. Assembly and cell surface expression of heteromeric and homomeric gamma-aminobutyric acid type A receptors. J Biol Chem. 271, 89-96 (1996).
  17. Klausberger, T., Roberts, J. D., Somogyi, P. Cell type- and input-specific differences in the number and subtypes of synaptic GABA(A) receptors in the hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2513-2521 (2002).
  18. Thomson, A. M., Jovanovic, J. N. Mechanisms underlying synapse-specific clustering of GABA(A) receptors. Eur J Neurosci. 31, 2193-2203 (2010).
  19. Fritschy, J. M., Panzanelli, P., Tyagarajan, S. K. Molecular and functional heterogeneity of GABAergic synapses. Cell Mol Life Sci. 69, 2485-2499 (2012).
  20. Ali, A. B., Thomson, A. M. Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex. Cereb Cortex. 18, 1260-1271 (2008).
  21. Thomson, A. M., Bannister, A. P., Hughes, D. I., Pawelzik, H. Differential sensitivity to Zolpidem of IPSPs activated by morphologically identified CA1 interneurons in slices of rat hippocampus. Eur J Neurosci. 12, 425-436 (2000).
  22. Nyiri, G., Freund, T. F., Somogyi, P. Input-dependent synaptic targeting of alpha(2)-subunit-containing GABA(A) receptors in synapses of hippocampal pyramidal cells of the rat. Eur J Neurosci. 13, 428-442 (2001).
  23. Treutlein, B., Gokce, O., Quake, S. R., Sudhof, T. C. Cartography of neurexin alternative splicing mapped by single-molecule long-read mRNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1291-1299 (2014).
  24. Siddiqui, T. J., Craig, A. M. Synaptic organizing complexes. Current opinion in neurobiology. 21, 132-143 (2011).
  25. Tanaka, H., et al. Higher-order architecture of cell adhesion mediated by polymorphic synaptic adhesion molecules neurexin and neuroligin. Cell reports. 2, 101-110 (2012).
  26. Krueger, D. D., Tuffy, L. P., Papadopoulos, T., Brose, N. The role of neurexins and neuroligins in the formation, maturation, and function of vertebrate synapses. Current opinion in neurobiology. 22, 412-422 (2012).
  27. Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons. Cell. 101, 657-669 (2000).
  28. Graf, E. R., Zhang, X., Jin, S. X., Linhoff, M. W., Craig, A. M. Neurexins induce differentiation of GABA and glutamate postsynaptic specializations via neuroligins. Cell. 119, 1013-1026 (2004).
  29. Dong, N., Qi, J., Chen, G. Molecular reconstitution of functional GABAergic synapses with expression of neuroligin-2 and GABAA receptors. Mol Cell Neurosci. 35, 14-23 (2007).
  30. Fuchs, C., et al. GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses. Eur J Neurosci. 38, 3146-3158 (2013).
  31. Ventimiglia, R., Lindsay, R. Culturing nerve cells: Rat striatal neurons in low-density, serum-free culture. , 2nd edn, MIT Press. 371-393 (1998).
  32. Gross, A., et al. Differential localization of GABA(A) receptor subunits in relation to rat striatopallidal and pallidopallidal synapses. Eur J Neurosci. 33, 868-878 (2011).
  33. Fritschy, J. M., Mohler, H. GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits. J Comp Neurol. 359, 154-194 (1995).
  34. Doig, N. M., Moss, J., Bolam, J. P. Cortical and thalamic innervation of direct and indirect pathway medium-sized spiny neurons in mouse striatum. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 14610-14618 (2010).
  35. Lalchandani, R. R., Vicini, S. Inhibitory collaterals in genetically identified medium spiny neurons in mouse primary corticostriatal cultures. Physiological reports. 1, (2013).
  36. Nusser, Z., Sieghart, W., Benke, D., Fritschy, J. M., Somogyi, P. Differential synaptic localization of two major gamma-aminobutyric acid type A receptor alpha subunits on hippocampal pyramidal cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 11939-11944 (1996).
  37. Linhoff, M. W., et al. An unbiased expression screen for synaptogenic proteins identifies the LRRTM protein family as synaptic organizers. Neuron. 61, 734-749 (2009).
  38. Pettem, K. L., Yokomaku, D., Takahashi, H., Ge, Y., Craig, A. M. Interaction between autism-linked MDGAs and neuroligins suppresses inhibitory synapse development. J Cell Biol. 200, 321-336 (2013).
  39. Wit, J., et al. Unbiased discovery of glypican as a receptor for LRRTM4 in regulating excitatory synapse development. Neuron. 79, 696-711 (2013).

Tags

Nevrovitenskap Developmental nevrovitenskap synaptogenesis synaptisk hemming co-kultur stabile cellelinjer GABAergic mellom spiny nevroner HEK 293 cellelinje
Hemmende Synapse Dannelse i en Co-kultur Modell innlemme gabaergic Medium Tifotkreps nevroner og HEK293 Cells stabilt uttrykker GABA<sub&gt; A</sub&gt; Reseptorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brown, L. E., Fuchs, C., Nicholson,… More

Brown, L. E., Fuchs, C., Nicholson, M. W., Stephenson, F. A., Thomson, A. M., Jovanovic, J. N. Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors. J. Vis. Exp. (93), e52115, doi:10.3791/52115 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter