Protocol
1 Voorbereiding van Cultuur Media, cytokines en Verstijfselde Plates
- Bereid ES celmedium met Dulbecco's modificatie van Eagle's Medium (DMEM) met hoge glucose en natrium pyruvaat. Voeg 20% ESC gekwalificeerd foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline / streptomycine, 1% L-glutamine, 1% HEPES buffer, 1% niet-essentiële aminozuren, 0,1% gentamicine (50 mg / ml) en 0,1% ( 55 uM) β-mercaptoethanol. Steriliseren ES-cel media door middel van filtratie.
- Bereid OP9 media door 1 L Alpha Minimum Essential Medium (MEM-α) van poeder volgens de instructies van de fabrikant. Voeg 20% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine. Omkeren om te mengen. Steriliseer door filtratie in twee 500 ml porties.
Opmerking: het gebruik van media uit poeder wordt aanbevolen en vaak beter OP9 celonderhoud en in vitro differentiatie resultaten op. Deze aanpak heeft onze standaard procedure geworden. Echter, we ook rekening mee that wij hebben soms gebruikt pre-made vloeibare α-MEM met voldoende succes. - Bereid bevriezing media door toevoeging van 10% dimethylsulfoxide (DMSO) met 90% FBS. Roer voorzichtig en steriliseer door filtratie. Bewaren bij 4 ° C.
- Bereid 2,000x Flt-3 ligand (10 ug / ml) door het oplossen van humaan recombinant Flt-3-ligand (Flt-3L) in volledige OP9 media tot 10 ug / ml. Aliquot in 1,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -80 ° C. Volg de aanbevelingen van de leverancier met betrekking tot de stabiliteit en de opslag.
OPMERKING: De stabiliteit van Flt-3L kort (1 maand bij 4 ° C of 3 maanden bij -80 ° C). - Bereid 1000x IL-7 (1 ug / ml) met volledige OP9 media. Aliquot in 1,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -80 ° C. Volg de aanbevelingen van de leverancier op de stabiliteit en de opslag (IL-7 is stabiel gedurende maximaal 12 maanden bij -80 ° C).
- Bereid 1000x Leukemie Remmende Factor (LIF) (10 ug / ml) van een 1:10 verdunning van 10 7 eenheden LIF in ES-cel media. WINKEL monster bij 4 ° C. Zorg ervoor dat u de vervaldatum van de fabrikant op de hoeveelheid flesjes mee.
OPMERKING: Het product is stabiel in geconcentreerde of verdunde vorm ten minste 18 maanden na de datum van fabricage. - Bereid ontsloten 6-well platen met voeg 1,5 ml 0,1% gelatine-oplossing in elk putje van een 6-wells plaat. Zonder vaten in de steriele kap bij kamertemperatuur met deksels op, waardoor ten minste 30 min voor coating. De gerechten kunnen ook worden achtergelaten in een bevochtigde incubator 's nachts. Verwijder eventuele resterende gelatine-oplossing vlak voor cel zaaien. Laat de gelatine-oplossing volledig uit te drogen in de put.
2 Voorbereiding en onderhoud van Feeder Cellen en muis embryonale stamcellen (mES)
Opmerking: Incubeer alle cellen in een bevochtigde 37 ° C incubator met 5% CO2.
- Ontdooien muis embryonale fibroblasten (MEF)
- Quick-ontdooien van een bevroren flesje (~ 5 x 10 6
- Voeg 8 ml van ES-cel media om de ontdooide cellen, in een drop-wise fashion geleidelijk verdunnen de DMSO uit de bevriezing medium.
- Centrifugeer cellen bij 400 x g bij 4 ° C gedurende 5 minuten. Verwijder voorzichtig het supernatant en resuspendeer de cel pellet in 3 ml van ES-cel media.
- Bereid een 50 ml centrifugebuis met 33 ml voorverwarmde ES-celmedium. Voeg 3 ml geresuspendeerde MEF tot het uiteindelijke volume op 36 ml te brengen.
- Verdeel 3 ml van de geresuspendeerde MEFs in elk putje van twee verstijfseld 6-well platen. Plaats de platen in de incubator gedurende ten minste zes uur om de cellen hechten en verspreiden vóór het zaaien mESCs daarop. Deze mitotisch aangehouden feeder lagen kunnen bruikbaar voor enkele dagen na de eerste zaaien, als de media werden elke 2-3 dagen.
OPMERKING: Vers gearresteerd MEF kunnen ook worden gebruikt. </ Ol>
- Zaaien mESCs
- Quick-dooi een flacon met een bevroren mES kloon in de 37 ° C waterbad en cellen te bereiden zoals beschreven in 2.1.1-2.1.3.
LET OP: We bevriezen 2 flesjes van mES uit een samenvloeiing putje van een 6-well plaat. - Verwijder media ve vormt (per mES kloon) van de 6-well plaat met gearresteerde MEF monolagen (bereid in stap 2.1.5) en de zaad 3 ml mESCs bovenop de MEF monolaag. Voeg 3 ul van 1000x LIF (10 ng / ml). Terug vaat in de incubator.
- Quick-dooi een flacon met een bevroren mES kloon in de 37 ° C waterbad en cellen te bereiden zoals beschreven in 2.1.1-2.1.3.
- ES celonderhoud en trypsine gemedieerde passage
OPMERKING: Verander media dagelijks, of gesplitst op basis van samenloop van mES. Optimaal, oogst en split / re-plaat van de cellen om de andere dag.- Verwijder ES celmedium en was mESCs met 2 ml PBS. Verwijder PBS. Voeg 1 ml van 0,25% trypsine en incubeer bij 37 ° C gedurende 3-5 minuten.
- Verzamel getrypsiniseerd cellen en overbrengen naar een 15 ml centrifugebuis. Krachtig pipet de celsuspensie te breken klonten van mSER. Voeg 2 ml compleet ES celmedium aan de celsuspensie om de trypsine te neutraliseren.
- Spin cellen bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder en resuspendeer de pellet in 3 ml ES-cel media.
- Verwijder het afdrukmateriaal uit 6-well platen met voorbereid gearresteerd MEF monolagen. Voeg de juiste hoeveelheid van de celsuspensie (gebaseerd op het gewenste split ratio) in 3 ml ES celmedium aan elk putje worden gezaaid. Voeg 3 pi 1000x LIF. Een samenvloeiing mES goed verdeeld 1: 6 klaar voor de passage in 2 dagen zal zijn.
- OP9 / OP9-DL1 celonderhoud
- Dooi een flacon van OP9 cellen (volg de stappen 2.1.1-2.1.3 behulp OP9 media)
- 7 ml OP9 media tot 10 cm weefselkweek schotel. Voeg 3 ml geresuspendeerde cellen in een druppelsgewijze wijze verdelen cellen in de plaat. Leg de cellen 's nachts in de incubator.
- Controleer de samenvloeiing van de OP9 cellen de volgende dag. Als het gerecht bevat veel dode drijvende cellen, remove de media en voeg 10 ml vers OP9 media. Zet de schotel naar de couveuse of bijna vol samenloop niet wordt nageleefd. Split (met behulp van trypsine) 1: 4 de buurt van samenvloeiende OP9 monolaag.
OPMERKING: De platen moeten dezelfde samenloop niveau weer te bereiken in ongeveer 2 dagen. Zorg ervoor dat u OP9 cellen over-samenvloeiende laten. - Bevries de vroege passages van OP9 cellen als voorraden expansie.
LET OP: We bevriezen 2 flesjes van OP9 cellen van de ene in de buurt van samenvloeiende 10 cm schotel. Elke flacon expansie voorraad kan verder worden doorgegeven aan werkvoorraden die later worden gebruikt in mES co-cultuur experimenten creëren. Houd alle OP9 voorraden ingevroren in vloeibare stikstof in plaats van in de -80 ° C vriezer, omdat wisselende temperaturen kan een negatieve invloed hebben op de kwaliteit van het bevriest.
3 OP9-DL1 Co-cultuur Procedure
- Co-cultuur voorbereidingen
- Ongeveer een week voorafgaand aan de start van een co-cultuur, ontdooien MEF, mESCs en OP9 cel werken stocks. Sinds OP9-DL1 cellen niet nodig zijn totdat co-cultuur dag 8, ontdooien de OP9-DL1 cellen tijdens de eerste drie dagen na de co-cultuur initiatie. Handhaven of te bevriezen alle cellen als nodig is.
- Bepaal het aanvankelijke aantal 10 cm platen met OP9 celmonolagen bereid 80% confluentie dag 0 op basis van de omvang van het experiment bereiken co-kweek (bijvoorbeeld aantal mES klonen te onderscheiden en het aantal co-kweekperiode punten worden geanalyseerd). Voor te bereiden op een co-cultuur, opgesplitst in de buurt van samenvloeiende schotel van OP9 cellen tussen 1: 4 en 1: 6 twee dagen voorafgaand aan wanneer de monolagen nodig zal zijn.
OPMERKING: Men zal ten minste een plaat per ESC kloon nodig. Typisch, een ESC kloon gezaaid op een enkele plaat (zoals hieronder beschreven) op dag 0 moeten voldoende cellen opleveren met zes platen zaad op dag 5 passage. Elke dag 5 plaat zal een verdere analyse tijdstip mogelijk te maken. - Sinds OP9 monolagen zal voortdurend worden die nodig zijn voor co-cultuur passage, zorg altijd maintaadequaat aantal extra OP9 kweekplaten in parallel met de co-cultuur.
- Dag 0: Inleiding van co-cultuur
- Verzamel mES als in 2.3.1-2.3.4. Tel de cellen.
- Voor elke kloon mES bereiden 5 x 10 4 mES in 10 ml OP9 media per plaat.
Opmerking Hoewel we niet gebruikt we dat een alternatief medium bestaande uit α-MEM, 10% FBS en 5 x 10 -5 M β-mercaptoethanol is ook vermeld voor gebruik bij differentiatie co-kweken 10. - Verwijder de oude media uit OP9 gerechten en voeg de 10 ml mES schorsing aan de gerechten en zorg ervoor dat de cellen gelijkmatig over de plaat verdelen. Leg de schalen in de 37 ° C incubator.
- Dag 3: Media veranderen
- De schaaltjes worden uit de couveuse en observeren onder de microscoop. Kolonies moeten beginnen te glimmen te verliezen en er geplet uitzien.
- Verwijder het afdrukmateriaal uit gerechten en voorzichtig 10 ml verse OP9media.
- Terug de co-cultuur schalen in de broedstoof. Visueel controleren mesoderm-achtige kolonievorming dagelijks aan de timing van OP9 feeder monolaag voorbereiding kennis voor de volgende doorgang (dag 5), die niet totdat ~ 80-90% van de kolonies visueel mesoderm morfologie weer plaatsvinden. Maximale uitstel van de dag 5 cel overdracht stap is 2 dagen.
- Dag 5: trypsine gemedieerde passage met pre-plating.
OPMERKING: Maak vooraf een voldoende aantal van 10 cm schalen met optimaal samenvloeiende OP9 cellen. Ga verder met de volgende stappen alleen uit wanneer de co-culturen visueel de in stap 3.3.3 beschreven functies weer te geven (zie ook Representatieve resultaten).- Verwijder het afdrukmateriaal uit de co-cultuur gerechten. Voeg 4 ml PBS te wassen. Zwenk de PBS en te verwijderen. Voeg 4 ml van 0,25% trypsine en plaats de gerechten in incubator voor ~ 5 min.
- Verstoren de laag getrypsiniseerde cellen door heftig pipetteren, zorg ervoor dat u overmatig luchtbellen te introduceren, tot er eenhomogeen, meestal enkele celsuspensie wordt verkregen.
- Voeg 4 ml van complete OP9 media en meng door pipetteren. Transfer cellen in een nieuwe, lege 10 cm schotel en plaats in de incubator gedurende 30 minuten om de OP9 cellen om zich te houden aan het gerecht. Deze "pre-plating" stap vermindert het aantal OP9 cellen overgebracht naar de volgende stap van co-cultuur.
- Bereid 50 ml centrifugebuizen met 40 micrometer cel filters.
- Verzamelen van niet-hechtende cellen uit de pre-plated schotel en geef ze door de cel zeef in de buis. Was de schaal voorzichtig met 6 ml PBS en deze door dezelfde zeef, waardoor de bijgevoegde OP9 cellen achter.
- Centrifugeer cellen bij 400 x g 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder de supernatant en resuspendeer pellet cellen in 3 ml compleet OP9 media. Tel de cellen.
- Verwijder de media uit 10 cm platen met optimaal samenvloeiende OP9 cellen.
- Voor elke analyse tijdstip, zaad 5 x 10 5 cellen op de OP9 monolaag in 10 ml eindvolume.
- Voeg 5 ng / ml humaan recombinant Flt-3L en plaats de gerechten in de broedstoof.
- Dag 8: hematopoietische Cell (HPC) collectie
OPMERKING: Maak vooraf een voldoende aantal 6-well platen met OP9 of OP9-DL1 celmonolagen zodat ze zullen worden ~ 80% samenvloeiing in de tijd voor deze stap.- Bereid 50 ml centrifugebuizen met 40 micrometer filters.
- Verwijder de gerechten uit de couveuse en observeren onder de microscoop. Glanzende clusters van HPC losjes worden gehecht aan de OP9 monolaag. Verzamel zoveel mogelijk van deze cellen mogelijk door het wassen van (maar niet overdreven te verstoren) de OP9 monolaag met een pipet en de bestaande media op de schotel. Om schuimvorming te voorkomen, laat altijd minimaal 1 ml van de media in de punt van de pipet tijdens deze HPC collectie / wasstap.
- Passeren de cellen door de 40 micrometer zeef in een buis. Voeg 8 ml PBS met dezelfde plaat en controleer onder de microscoop als alle HPCs weopnieuw verzameld. Herhaal het wassen / verzamelstap met PBS en (indien nodig) met krachtiger wassen. Zeef de cellen in de buis al de cellen van dezelfde plaat bevat.
- Centrifugeer cellen bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Bereid een master mix van 3 ml (per plaat gezaaid op dag 5) van OP9 medium met 5 ng / ml Flt-3L en 1 ng / ml IL-7.
- Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in OP9 media met Flt-3L + IL-7 master mix (3 ml voor elke 10 cm schotel verwerkt). Breng de verzamelde cellen van elke plaat in een putje van een 6-wells plaat met OP9 cellen.
- Om cellen rijden richting monocyt, B cel of erytroïde lineages, zaaigoed de verzamelde cellen op OP9 cellen. T-cellen af te leiden, het zaad van de cellen op OP9-DL1 celmonolagen.
- Plaats de 6-well platen in incubator.
- Dag 10: Media veranderen
- Bereid een 15 ml centrifugebuis voor elke afzonderlijke kloon mES-feeder celtype combinaking in co-cultuur.
- Bereid een master mix van OP9 medium met 5 ng / ml Flt-3L en 1 ng / ml IL-7. Bereid 3 ml voor elke wel.
- Verzamel media uit elk putje van de 6-well plaat combineert inhoud van meerdere putjes die dezelfde kloon ESC-feeder celtype formatie.
- Voeg 2 ml van OP9 media master mix (zie 3.6.2) in elk putje.
- Centrifugeer de verzamelde media bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder en resuspendeer elke pellet (zeer klein indien zichtbaar) in 1 ml van OP9 media master mix (zie 3.6.2) per well oorspronkelijk zijn verzameld in stap 3.6.3.
- Verdeel 1 ml cellen terug in elk putje waarvan de media oorspronkelijk werd verzameld waardoor het volume in elk putje tot 3 ml. Breng de schalen in de broedstoof.
- Dag 12: Geen trypsine passage
OPMERKING: Bereid vooraf een voldoende aantal 6 putjes met OP9 of OP9-DL1 cellen zodat ze optimaal worden confluent in tijd voor stap. Dag 12 is ideaal voor flowcytometrie analyse ontwikkelen erythroïde, monocyt, en jonge T-cellen.- Bereid een master mix (3 ml voor elke wel die verder worden co-kweek) van OP9 medium met 5 ng / ml Flt-3L en 1 ng / ml IL-7.
- Bereid 50 ml centrifuge buizen met 40 urn zeven (een voor elke kloon ESC-feeder celtype combinatie in co-kweek).
- Krachtig pipet bestaande media in elk putje om alle cellen (inclusief monolaag) te splitsen in de put. Ga verder met krachtig pipetteren totdat een toestand lijkt op een enkele celsuspensie wordt verkregen.
- Leid de verzamelde cellen door de zeef in de buis. Voeg 3 ml PBS in elk putje te wassen en alle resterende cellen te verzamelen. Ga cellen door dezelfde zeef. Combineer cellen uit meerdere putjes die dezelfde ESC kloon-feeder celtype combinatie.
- Gooi de gebruikte cel zeef en verwijder een hoeveelheid gelijk aan een goed (~ 6 ml) voor elke gewenstestroomcytometrie (of andere) analyses op die dag worden uitgevoerd. Bewaar deze monsters op ijs voor gebruik.
- Centrifugeer cellen bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder supernatant. Resuspendeer de pellet van 50 ml centrifugebuisjes in 3 ml van master mix per putje opnieuw worden gezaaid. Voeg 3 ml per putje van elke cel schorsing voor het juiste type feeder cel en plaats de gerechten in de couveuse.
- Dag 14: Media veranderen
- Volg de stappen die worden beschreven in paragraaf 3.6.
- Dag 16: Geen trypsine passage
OPMERKING: Bereid vooraf 6 putjes van confluente optimaal OP9 of OP9-DL1 cellen voor deze stap.
OPMERKING: Dag 16 is ideaal voor flowcytometrie analyse van B lymfocyten en middenfase T-cellen.- Volg de stappen die worden beschreven in paragraaf 3.7.
- Dag 18: Media veranderen
- Volg de stappen die worden beschreven in paragraaf 3.6.
- Dag 20: Geen trypsine passage
OPMERKING: Dag 20 is ideaal voor flowcytometrie analyses van midden tot laat stadium de ontwikkeling van T-cellen.- Volg de stappen die worden beschreven in paragraaf 3.7. Indien gewenst voeren differentiërende cellen afgelopen dag 20 afwisselende media verandering en geen trypsine doorgangen om de twee dagen, met een dagelijkse controle van de lymfocyten expansie tarief.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wanneer gekweekt op MEFs in aanwezigheid van LIF, kan mESCs worden gehandhaafd in een ongedifferentieerde toestand. Onder ideale omstandigheden, verschijnen ze als compacte kolonies van cellen omgeven door een glanzende halo fasecontrast microscopie (figuur 1). Deze culturen moet dagelijks worden gecontroleerd. Afhankelijk van de samenvloeiing van de cellen, kan media worden gewijzigd of cellen kunnen worden gesplitst. Naburige mES kolonies moet niet komen tot het punt van contact met elkaar. Een normale, gezonde kweek van ongedifferentieerde mESCs een essentieel uitgangspunt voor in vitro T-cel differentiatie. Bij het initiëren van mede-cultuur, is het aanbevolen dat de cellen volledig samenvloeiing zonder overvol. Dit is dus de meerderheid van de cellen geoogst zaaien cellen op OP9 monolagen mES (in plaats van feeder-cellen). Als grote verschillen in samenloop worden waargenomen tussen de verschillende mES klonen te onderscheiden op dag 0, dan zou het best zijn om MEF verwijderen door pre-naleving tissue cultuur gerechten (zoals in stap 3.4.3-3.4.6 met volledige ES-cel media) voor het tellen van de mESCs voor co-cultuur zaaien.
OP9 cellen moeten ook vooraf worden onderhouden de co-cultuur initiatie (zoals beschreven in paragraaf 2.4). Bovendien wordt gedacht dat OP9 cellen inboeten hun eigenschappen bij langdurige kweek en / of uitgesproken verhogingen van hun proliferatiesnelheid 7 vermijden split ratio dan 1. 5 tijdens onderhoud van OP9 cellen en weggooien continue OP9 kweken na zes weken, zal helpen deze valkuilen te vermijden.
Bij de eerste zaaien van cellen en celoverdracht stappen van de co-kweek (dag 0, 5, 8, 12, 16), moet OP9 monolagen binnen een optimaal bereik van samenvloeiing. Figuur 2 toont de laag (figuur 2A) en hoog (figuur 2B) uiteinden van de reeks OP9 cel confluentie wenselijk voor gebruik als co-kweek monolagen. Een voorbeeld van een over-confluente plaat wordt getoond in Figure 2C. Niet-optimale samenvloeiing handhaven kan vorming van adipocyten (figuur 2D) die in grote hoeveelheden, kan een negatieve invloed hebben op de co-kweek induceren.
Op dag 0, is de co-cultuur begon op OP9 cellen in plaats van OP9-DL1 cellen sinds mesoderm vorming wordt bevorderd op OP9 cellen. Cellen worden uitgeplaat op OP9-DL1 cellen monolagen beginnend op dag 8 T-cel productie te induceren. Terwijl sommige mES klonen visueel robuust en kwantitatieve (~ 90%) de vorming van mesoderm-achtige kolonies op dag 5 van de co-cultuur (figuur 3A-B) wordt weergegeven, kan anderen vertragingen bij deze stap (Figuur 3C-F) weer te geven. Onder de microscoop zijn de mesoderm-achtige kolonies afgeleid in deze test is variabel beschreven als lijkend wagenwielen of kraters (Figuur 4A) of, starbursts of roosjes (Figuur 4B).
Terwijl de gepubliceerde OP9-DL1 protocol geeft een norm van kwantitatieve mesoderm formatie op dag 5 van de co-cultuur, 7 vinden we dat niet alle ESC klonen bereiken die norm binnen dit tijdsbestek. In deze gevallen het medium op dag 5 veranderen we en wacht nog eens 1-2 dagen voor het uitvoeren van de "dag 5" celoogst / overdrachtsprotocol. Het doel van deze vertraging is om ~ 80-90% van ES-cel kolonies visueel worden mesodermale vóór de overdracht. Het is belangrijk om duidelijk te maken dat dit cijfer 80-90% het gevolg van een strikt visuele criterium onderscheiden door eenvoudige fase contrast microscopische inspectie van de kolonie morfologie in de co-cultuur gerechten. Het verwijst slechts het deel van ESC kolonies die die getoond in figuur 4 lijken. Het is mogelijk dat sommige ESC klonen deze visual criterium bereikt, zelfs na een vertraging van twee dagen. In dat geval is het mogelijk om te verrijken voor bloedvormende mesodermale precursoren middels flowcytometrie celsortering voor Flk-1 + cellen, zoals eerder beschreven. 6,11 in ieder geval voor de sake van de nomenclatuur gemak hebben we "de klok reset" en verwijzen naar de dag van mesoderm-achtige kolonie overdracht als "dag 5"
Wanneer meerdere ESC klonen worden gedifferentieerd in parallel, is het mogelijk dat sommige co-kweken klaar voor de dag 5 passage over tijd, terwijl anderen achterblijven. In dit geval is het raadzaam om de doorgang van de co-kweken stellen tot de langzamere klonen inhalen anderen. De vertraging lijkt geen kwaad om het "op tijd" co-culturen niet te doen, maar komt de volgende differentiatie van de tragere klonen een geweldige deal.
Dag 8 (dat wil zeggen, drie dagen na mesodermale kolonie transfer) ziet het ontstaan en de accumulatie van HPCs. HPC zichtbaar als glanzende clusters van cellen die losjes gehecht aan de OP9 feeder-cellen (Figuur 5). Een zorgvuldige wassen procedure, met behulp van een pipet en de media op de schotel, zal losmaken en het verzamelen van de HPC's terwijlde OP9 monolaag grotendeels intact (Figuur 6A-C). Dit is misschien wel de meest gevoelige techniek-stap van het protocol. Het vergt enige oefening om de juiste bewegingen en media uitwerpen druk vinden om de gewenste balans tussen maximale oogst van HPC's met een minimale verstoring van de feeder-laag te bereiken. Het is aanvaardbaar als enkele OP9 monolaag lanceert, aangezien het merendeel van verdwaalde monolaag wordt meegenomen in de 40 urn nylon mesh na filtering. Figuur 6D toont een monolaag na extreem pipetteren tot grotere monolaag verstoring dan noodzakelijk. Tijdens deze wasstap is het belangrijk om te controleren onder de microscoop of alle HPC verzameld, en de juiste wasdruk.
Voortgang van de co-cultuur worden gecontroleerd door flowcytometrie. Om specifiek wat de niet-erytroïde hematopoietische nageslacht van het ESC, is het belangrijk om eerste poort aan levende CD45 + cellen.Deze stap schermen de OP9 cellen uit de analyse, terwijl het gebruik van DAPI of andere nucleaire kleuring kleurstof maakt de uitsluiting van niet-levensvatbare cellen. Per dag 12, moet veel clusters van kleine, ronde, glanzend cellen zichtbaar zijn. Het is niet noodzakelijk om de cellen te tellen in dit stadium. Maar we hebben waargenomen dat leeft, gated doorstroomcytometrie geval telt typisch in het traject van 1-3 x 10 5 per dag 12 co-kweekputje. Flowcytometrie analyse van de live-gated cellen gedifferentieerd op OP9 monolaag zal erythroide opleveren (CD45 neg, TER119 +) en monocytaire (CD45 +, CD11b hi) lijnen (Figuur 7A). Analyses van de live, CD45 + cellen differentiëren op OP9-DL1 monolagen moet markers kenmerk van CD4 / CD8 dubbel negatief onthullen (DN) -1 (CD44 +, CD25 neg, CD4 neg, CD8 neg) en DN2 (CD44 +, CD25 +, CD4 neg, CD8 neg) stage T-cellen (Figuur 7B ng>). Overdag 16, is er een aanzienlijke toename van het aantal kleine, ronde, glanzende cellen in de kweken. Op OP9-DL1s, T-cel differentiatie producten voortgang aan de DN3 (CD44 neg, CD25 +, CD4 neg, CD8 neg) en DN4 (CD44 neg, CD25 neg, CD4 neg, CD8 neg) fasen. Sommige DP (CD4 +, CD8 +) T-cellen kunnen ook beginnen nieuwe dag 16 (Figuur 7B). HPC gezaaid op OP9 cellen verkregen B-cellen (CD19 +) door dag 16 Bij dag 20 van OP9-DL1-mES co-cultuur, zal er grote hoeveelheden DP T-cellen en enkel positieve (SP) CD8 + T cellen aanwezig ( Figuur 7B). Figuur 8 verschaft een diagram waarin de belangrijkste stappen van de bovenstaande procedures, en de voorgestelde analyse tijdstippen tijdens co-kweek.
ghres.jpg "/>
Figuur 1 Fase contrast microscopie beeld van ongedifferentieerde mESCs (scherpe kolonies) groeit op een MEF monolaag (100X vergroting).
Figuur 2:. Fase contrast microscopie afbeeldingen OP9 monolaag confluentie (A) voordeligste en (B) confluentie hoogste niveaus wenselijk voor co-kweek passage / seed (40x vergroting) (C) Voorbeeld van een over-confluente monolaag OP9 (40X vergroting. ). (D) Over-samenvloeiende OP9 monolaag (200X) met adipocyte vorming (grote, blaasje bevattende cellen).
Figuur 3: Fase contrast microscoopy afbeeldingen mesoderm-achtige kolonievorming bij "dag 5" van co-kweek. (A) 40x en (B) 100X uitzicht co-kweekplaten bij> 90% mesodermale colony differentiatie. Deze platen zijn klaar voor dag 5 passage. (CF) Voorbeelden van Dag 5 co-cultuur platen die 1-2 dag uitstel vóór de overdracht (C & E, vergroting van 40x, D & F, 100X vergroting) vereisen.
Figuur 4: Fase contrast microscopie beelden van de verscheidenheid van mesoderm-achtige kolonie formaties op dag 5 van de co-cultuur (A) De aangeduid als "kraters" of kolonie morfologie (B) De onder koloniemorfologie. "Wagenwiel." als "starburst" of "bloemen" (200X vergroting).
Figuur 5 Fase contrast microscopie afbeelding van dag 8 co-cultuur plaat met clusters van kleine, ronde, glimmende handheld-pc op een OP9 monolaag (40x vergroting).
Figuur 6:.. OP9 monolaag na HPCs verzameling van co-cultuur dag 8 (AC) Geschikte waaier van verstoring van OP9 monolaag na zorgvuldig wassen om te oogsten HPC (D) Een voorbeeld van een OP9 monolaag die is over-verstoord door de dag 8 HPC oogsten procedure.
Figuur 7: Representatieve stroomcytometrie (FACS) analyses op bepaalde tijdstippen tijdensmES differentiatie in vitro. (A) Kleuring voor erytroïd (links), monocytisch (midden) en B-cel (rechts) producten van mES-OP9 co-cultuur op dag 12 of 16, zoals aangegeven. (B) Kleuring voor de ontwikkeling van T-cellen op de aangegeven tijdstippen van mES-OP9-DL1 co-cultuur. Zie tekst voor gedetailleerde beschrijvingen van de immunofenotypes.
Figuur 8 Schematische weergave van de stappen van de mES-OP9 co-cultuur procedure. (A) De belangrijkste cel overdracht stappen van de eerste acht dagen van de co-cultuur. Het geschatte aantal cellen gezaaid op OP9 cellen op dag nul en vijf zijn aangegeven. (B) De dag 8 overdrachtstap en de verwachte celdifferentiatie producten gedetecteerd door stromingscytometrie op belangrijke tijdstippen van co-cultuur. Zie tekst voor gedetailleerde beschrijvingen van de immunofenotypes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De OP9-DL1 co-kweeksysteem is gebruikt om de rol van verschillende genproducten te bestuderen bij de ontwikkeling van bloedcellen types van stamcellen. 8,12,13 Het is ook bewezen een effectief model om de functie van gen-regulatoire DNA bestuderen gedurende de celdifferentiatie. 9,14 Met deze benadering als alternatief geheel muismodellen kunnen aanzienlijke besparingen op in tijd en kosten van experimenten die vele fundamentele vragen hematopoiese pakken. Echter, aanpassing van het protocol voor deze doeleinden vereist kennis van de mogelijke variabiliteit onder mES klonen die worden gebruikt bij deze procedures. De tijdlijn van het gepubliceerde protocol is te verwachten van het gemiddelde goed onderhouden, niet-gemanipuleerde mES lijn. 7 Bovendien mES klonen geselecteerd voor het genereren van chimere muizen meestal hogere kwaliteit en zo robuust uitvoeren OP9 co-kweek . Anderzijds, mES direct klonen die uit stabieltransfectie met een ectopisch geïntegreerd transgen zullen een verschillende mate van initiële differentiatie efficiency gemiddeld tot onder het gemiddelde weer. Het hier beschreven protocol voorziet in een strategische 1-2 dag vertraging van de dag 5 passage stap om zelfs uit deze potentiële verschillen voorafgaand aan inductie van hematopoiesis in vitro.
De dag 8 passage is de stap die de uitvoering van dit protocol heeft de meeste kans op fouten. Geduld, praktijk en zorgvuldige observatie in staat zal stellen de ene naar de techniek die HPC oogst optimaliseert, terwijl het minimaliseren OP9 monolaag verstoring ontwikkelen. Naast de belangrijkste dag 5 en dag 8 stappen, de kritische parameters beslaan zorgvuldige celkweek onderhoud (vooral OP9 cellen, zoals hierboven beschreven) en vooral op de reagentia die bij het protocol. De meest kritische reagens de FBS. Verschillende veel FBS zal sterk verschillen in hun vermogen om deze procedure te steunen. Meerdere partijen moeten worden getest in oestellen bepalen waar betrouwbare differentiatie op in deze assay.
Deze co-cultuur systeem heeft zijn beperkingen. Bijvoorbeeld, dit model ondersteunt de differentiatie van enkel positief CD4 cellen. Een reden hiervoor is het gebrek aan expressie van de major histocompatibility complex (MHC) klasse II antigeen presentatie infrastructuur in de OP9 cellen. 1 celoppervlak presentatie van antigenen door MHC klasse II vereist voor een goede ontwikkeling van CD4 SP cellen. De CD8 SP cellen doen ontstaan vormen een mix van rijpe en onrijpe CD8 SP thymocyten fasen. 1 Voorts succesvolle transplantatie van mES afgeleide T-cel voorlopers in een muis is voorafgaande passage door foetale thymus weefselcultuur. 1 Toch is deze technologie biedt duidelijk beloven als een krachtige onderzoekende benadering van zowel de cellulaire en moleculaire vragen in het bloed en het immuunsysteem ontwikkeling die voorheen alleen mogelijk om te verkennen in v warenivo. Dus, afgezien van het leveren van een nieuwe manier om sneller vooruitgang te boeken op deze vragen, bredere toepassing van de OP9-ESC co-cultuur systeem zal de bredere impact van het verminderen van het gebruik van proefdieren moeten maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 15-013-CV | |
| Stem cell qualified FBS | Gemini | 100-125 | Heat inactivated |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| L-alanyl L-glutamine | Corning | 25-015-CI | |
| HEPES buffer | Millipore | TMS-003-C | |
| Non-Essential Amino Acids | ThermoScientific | SH30853.01 | |
| Gentamicin Regent Solution (50 mg/ml) | Life Technologies | 15750-060 | |
| β-mercaptoethanol (55 mM) in DPBS | Life Technologies | 21985-023 | |
| Filter Unit | Millipore | SCGPU05RE | 0.22 μm PES membrane |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CM | |
| α-MEM | Life Technologies | 12000-022 | Powder, reconstitute per manufacture recommendation |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| FBS | ThermoScientific | SH 30396.03 | Testing of individual lots required |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma | D2650 | |
| Recombinant Human Flt-3 Ligand | R&D Systems | 308-FK | |
| Recombinant Murine IL-7 | PeproTech | 217-17 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | |
| Utrapure water with 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| MEFs mitomycin C treated | Millipore | PMEF-CF | Any mitotically arresteded MEFs can be used |
| DPBS | Corning | 21-031-CV | |
| Cell strainer (40 μm) | Fisher | 22363547 | |
| Tissue culture dish 100 x 20 mm | BD Falcon | 353003 | |
| Multiwell 6-well | BD Falcon | 353046 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | Tubes for FACS |
| ES R1 cells | ATCC | SCRC-1011 | |
| OP9 cells | Cells can be obtained from the Riken Laboratory Cell Repository (Japan). | ||
| OP9-DL1 cells | Cells can be requested from the Zúñiga-Pflücker laboratory. | ||
| FlowJo software | Tree Star | FACS data analyses | |
| Flow Cytometer | BD | FACScan, FACSCalibur and FACSVantage have been used in our lab |
References
- Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
- Pui, J. C., et al. Notch1 expression in early lymphopoiesis influences B versus T lineage determination. Immunity. 11, 299-308 (1999).
- Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265, 1098-1101 (1994).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
- Chen, J., Lansford, R., Stewart, V., Young, F., Alt, F. W. RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 4528-4532 (1993).
- de Pooter, R. F., Cho, S. K., Carlyle, J. R., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cell-derived prehematopoietic progenitors. Blood. 102, 1649-1653 (2003).
- Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009, (2009).
- Arsov, I., et al. A role for autophagic protein beclin 1 early in lymphocyte development. J Immunol. 186, 2201-2209 (2011).
- Lahiji, A., et al. Complete TCR-alpha gene locus control region activity in T cells derived in vitro from embryonic stem cells. J Immunol. 191, 472-479 (2013).
- Hirashima, M., Kataoka, H., Nishikawa, S., Matsuyoshi, N., Nishikawa, S. Maturation of embryonic stem cells into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis. Blood. 93, 1253-1263 (1999).
- Nishikawa, S. I., Nishikawa, S., Hirashima, M., Matsuyoshi, N., Kodama, H. Progressive lineage analysis by cell sorting and culture identifies FLK1+VE-cadherin+ cells at a diverging point of endothelial and hemopoietic lineages. Development. 125, 1747-1757 (1998).
- de Pooter, R. F., et al. Notch signaling requires GATA-2 to inhibit myelopoiesis from embryonic stem cells and primary hemopoietic progenitors. J Immunol. 176, 5267-5275 (2006).
- Watarai, H., et al. Generation of functional NKT cells in vitro from embryonic stem cells bearing rearranged invariant Valpha14-Jalpha18 TCRalpha. 115, 230-237 (2010).
- Pipkin, M. E., et al. Chromosome transfer activates and delineates a locus control region for perforin. Immunity. 26, 29-41 (2007).
