Protocol
培養培地、サイトカインおよび糊化プレートの作製
- 高グルコースおよびピルビン酸ナトリウムをイーグル培地（DMEM）のダルベッコ改変を使用することにより、ES細胞培地を準備します。 ESC認定ウシ胎児血清（FBS）、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、1％L-グルタミン、1％HEPES緩衝液、1％非必須アミノ酸、0.1％ゲンタマイシン（50 mg / ml）を、0.1％の（20％の追加55μM）、β-メルカプトエタノール。濾過によってES細胞培地を滅菌する。
- メーカーの指示に従って粉末からアルファ最小必須培地（α-MEM）を1LにすることによってOP9メディアを準備します。 20％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを追加する。混合する反転。 2 500ミリリットルのアリコートに濾過することにより滅菌する。
注：粉から作られたメディアの使用が推奨され、改善されたOP9細胞の維持およびインビトロ分化結果にをもたらす可能性が高い。このアプローチは、私たちの標準的な手順となっている。しかし、私たちは股関節の点に注意してくださいT私たちは常に、十分な成功を収めて事前に作成された液体のα-MEMを用いてきた。 - 90％FBSを10％ジメチルスルホキシド（DMSO）を添加することにより凍結培地の準備。優しく旋回し、濾過により滅菌する。 4℃で保存。
- を10μg/ mlに完全なOP9培地中でヒト組換え体Flt-3リガンド（FLT-3L）を溶解することにより2,000x FLT-3リガンド（10μg/ mlの）を準備します。 -80℃で1.5 mlマイクロチューブに分注して保存。安定性、保存に関する供給業者の推奨事項に従ってください。
NOTE：のFlt-3Lの安定性（4℃または3ヶ月間-80℃で1ヶ月間）に短い。 - 完全なOP9メディアを使用して1,000倍のIL-7（1μg/ mlの）を準備します。 -80℃で1.5 mlマイクロチューブに分注して保存。安定性、保存上の供給元の推奨に従ってください（IL-7は、-80℃で12ヶ月まで安定である）。
- LIF iの10 7単位の1:10希釈により1,000倍白血病抑制因子（LIF）（10μg/ mlの）を準備nはES細胞培地。 4℃で保存一定分量。分量バイアルにメーカーが提供する有効期限に注意して。
注：製品は、製造日からの濃縮または希釈された形は少なくとも18ヶ月で安定している。 - 6ウェルプレートの各ウェルに0.1％ゼラチン溶液1.5mlを加えることにより糊化6ウェルプレートを準備する。コーティングのために少なくとも30分を可能にする上で蓋を室温で無菌フード内で料理をしておきます。皿はまた、加湿インキュベーター中で一晩放置してもよい。右の細胞播種の前に残っゼラチン溶液を除去します。ゼラチン溶液を完全にウェル内に乾燥させてはいけない。
フィーダー細胞とマウスの胚性幹細胞の調製とメンテナンス（MESC）
注：5％CO 2の加湿した37℃のインキュベーター内のすべてのセルをインキュベートする。
- 解凍マウス胚線維芽細胞（MEF）
- 凍結バイアル（〜5×10 6をクイック解凍
- 次第に凍結媒体からのDMSOを希釈して滴下方式で、解凍された細胞へのES細胞培地を8mlを追加します。
- 5分間、4℃で400×gで遠心分離した細胞。上清を慎重に除去し、ES細胞培地3mlに細胞ペレットを再懸濁する。
- 予め温めたES細胞培地の33ミリリットルと50ミリリットルの遠心管を準備します。 36ミリリットル最終容量をもたらすために、再懸濁したMEFの3ミリリットルを追加します。
- 2糊化6ウェルプレートの各ウェルに再懸濁させたMEFの3ミリリットルを配布します。細胞が付着し、その上にたmESCを播種する前に広がることができるように、少なくとも6時間インキュベーターにプレートを置きます。彼らのメディアは2〜3日ごとに変更された場合は、これらの有糸分裂逮捕フィーダー層は、最初の播種後数日間使用可能であってもよい。
NOTE：新鮮逮捕MEFを使用することもできる。 </オール>
- 播種たmESC
- 37℃の水浴中の凍結MESCクローンでバイアルをクイック解凍し、2.1.1-2.1.3に記載されているように細胞を調製する。
注：私たちは、6ウェルプレートのコンフルエント井戸からMESCの2バイアルを凍結する。 - 逮捕MEF単層（ステップ2.1.5で調製）で6ウェルプレートの（MESCクローンあたり）つのウェルから培地を除去し、MEF単層の上にたmESCの3ミリリットルをシード。 1,000倍LIF（10 ng / mL）を、3を添加する。インキュベーターに皿を返します。
- 37℃の水浴中の凍結MESCクローンでバイアルをクイック解凍し、2.1.1-2.1.3に記載されているように細胞を調製する。
- ES細胞の維持およびトリプシン仲介通過
注：MESCの合流点に基づいて、日単位のメディアを変更し、または分割。最適には、収穫および分割/再プレート細胞隔日。- ES細胞培地を除去し、PBS 2mlでたmESCを洗う。 PBSを除去します。 0.25％トリプシンを1mlを加え、3〜5分間37℃でインキュベートする。
- トリプシン処理した細胞を収集し、15ミリリットルの遠心管に転送します。激しくメートルの塊を破壊するために、細胞懸濁液をピペットESCは。トリプシンを中和し、細胞懸濁液に完全なES細胞培地2 mlを加える。
- 4°Cで5分間400×gで細胞をスピン。上清を除去し、3ミリリットルのES細胞培地でペレットを再懸濁します。
- 準備逮捕MEF単層を含む6ウェルプレートから培地を除去。播種するために、各ウェルにES細胞培地3ml中の（所望の分割比に基づいて）細胞懸濁液の適当な量を加える。 1,000倍LIFの3を添加する。うまく分割コンフルエントMESC 1：図6は、2日間で通過させるための準備が整います。
- OP9 / OP9-DL1細胞の維持
- OP9細胞のバイアルを解凍（手順に従って2.1.1-2.1.3 OP9メディアを使用）
- 10cmの組織培養皿に7ミリリットルのOP9メディアを追加します。プレート全体に細胞を分配、一滴ずつの方法で再懸濁した細胞の3ミリリットルを追加します。インキュベーター内で一晩細胞を配置します。
- 翌日OP9細胞の合流点を確認してください。料理は多くの死んだ浮遊細胞が含まれている場合は、レモメディアVEの、新鮮なOP9メディアの10ミリリットルを追加します。ほぼ完全な合流点が観察されていない場合、インキュベーターに皿を返します。 4近くコンフルエントOP9単層：スプリット1（トリプシンを用いて）。
注：プレートを約2日後にもう一度同じ合流レベルに達する必要があります。 OP9細胞が過コンフルエントになるさせないように注意してください。 - 拡張ストックとしてOP9細胞の初期の継代をフリーズします。
注：私たちはコンフルエント10cmディッシュに近いものからOP9細胞の2のバイアルを凍結する。拡張ストックの各バイアルは、さらに後述MESC共培養実験で使用されるワーキングストックを作成するために増殖させることができる。変動温度はマイナスのフリーズの品質に影響を与える可能性があるので、むしろ-80℃の冷凍庫でも液体窒素中で凍結し、すべてのOP9ストックを保管してください。
3 OP9-DL1共培養手順
- 共培養の準備
- 約1週間前に、共培養の開始に、MEFは、たmESCとOP9細胞作業STO解凍CKS。 OP9-DL1細胞を共培養8日目までは必要としないことから、共培養開始後の最初の3日間OP9-DL1細胞を解凍。必要に応じて、すべての細胞を維持または凍結。
- 実験の規模に基づいて共培養0日目に80％のコンフルエンスに到達するために用意OP9細胞単層を10cmプレートの最初の数を決定する（ 例えば 、MESCクローンの数は、に分化し、共培養の時点の数する）を分析すること。 2日後に控え単層が必要とされるときの6：4と1：共培養の準備をするために、1との間でOP9細胞のコンフルエント皿の近くに分割します。
注：一つは、ESCクローンごとに少なくとも1つのプレートが必要になります。 （以下に記載するように）一般的に、単一のESCクローンは0日目に、単一のプレートに播種し、5日目の通路で6枚のプレートに播種するのに十分な細胞が得られるはずです。毎日5板は、1次の分析の時刻が有効になります。 - OP9単層を継続的に共培養継代のために必要とされるので、常にmaintaに注意してください共培養と並行して、追加のOP9培養プレートの十分な数の。
- 0日目：共培養の開始
- 2.3.1-2.3.4のようMESCを収集します。細胞を数える。
- 各MESCクローンの場合はプレート当たりOP9培地10ml中に5×10 4 MESCを準備します。
注：私たちはそれを使用していないが、私たちは代替α-MEMからなる培地、10％のFBS、5×10 -5 Mのβ-メルカプトエタノールも分化共培養の使用が報告されていることに注意してください10。 - OP9皿から古いメディアを取り出して、プレート全体に均一に細胞を分配するために注意しながら、皿にMESC懸濁液の10ミリリットルを追加します。 37℃のインキュベーターに皿を置きます。
- 3日目：メディアの変化
- インキュベーターから皿を取り出し、顕微鏡下で観察します。コロニーは光沢を失い、平らに現れ始める必要があります。
- 皿から培地を除去し、穏やかに新鮮なOP9 10mlのを追加メディア。
- インキュベーターに共培養皿を返します。視覚的にコロニーの80〜90％は、視覚的に中胚葉様の形態を表示する〜まで行われるべきではない次の継代（5日目）にOP9フィーダー単層製剤のタイミングを通知するために、毎日の中胚葉様コロニー形成を監視します。 5日目の細胞の転写工程の最大延期は2日です。
- 5日目：めっき前とトリプシン仲介通過。
注：最適なコンフルエントOP9細胞を事前に10cmの皿の十分な数を用意してください。共培養は、視覚的にステップ3.3.3で説明されている機能が表示された場合にのみ次のステップに進みます（これも代表的な結果を参照してください）。- 共培養皿からメディアを取り出します。洗浄するために4ミリリットルのPBSを追加します。 PBSを旋回し、削除します。 0.25％トリプシンの4ミリリットルを加え、約5分間インキュベーター内で皿を置きます。
- まで、過剰な気泡を導入しないように注意しながら、激しいピペッティングによりトリプシン処理した細胞層を乱す均質で、主に単一細胞懸濁液が達成される。
- 完全なOP9メディアの4ミリリットルを加え、ピペッティングにより混和する。 OP9細胞はシャーレに付着させ、30分間インキュベーター内で新しい空の10cmディッシュ、所定の位置に細胞を移す。この「プレめっき」のステップは、共培養の次のステップに移し、OP9細胞の数を減少させる。
- 40μmのセルストレーナーで50ml遠心管を準備します。
- 事前メッキディッシュから非接着細胞を収集し、チューブにセルストレーナーを介してそれらを渡します。 PBSを6ミリリットルで軽く、皿を洗って、同じストレーナーに通し、背後に付着したOP9細胞を残す。
- 4℃で400×gで 5分間で遠心細胞。上清を除去し、完全なOP9培地3mlにペレット化した細胞を懸濁します。細胞を数える。
- 最適コンフルエントOP9細胞との10cmプレートから培地を除去。
- 各分析時点について、OP9モノに5×10 5細胞を播種10ミリリットル最終容量層。
- 5 / mlのヒト組換え体Flt-3Lを加え、インキュベーター内で皿を置きます。
- 8日目：造血前駆細胞（HPC）のコレクション
注：これらはこのステップの時間が〜80％コンフルエントになるように、OP9またはOP9-DL1細胞単層が予め6ウェルプレートの十分な数を用意してください。- 40μmのストレーナーで50ml遠心管を準備します。
- インキュベーターから皿を取り出し、顕微鏡下で観察します。のHPCのシャイニークラスタは緩くOP9単層に接続する必要があります。ピペットでOP9単層と皿上の既存のメディアを洗う（ただし、過度に崩壊されていない）により、可能な限りこれらの細胞の多くを収集します。発泡しないようにするには、常にこのHPC収集/洗浄工程の間にピペットの先端でメディアの少なくとも1ミリリットルのままにしておきます。
- チューブに40μmのストレーナーを通して細胞を渡します。もし、すべてのHPCを同一プレートに8ミリリットルのPBSを追加し、顕微鏡下で確認してください、私たち再収集。 （必要ならば）より多くの強力な洗浄をPBSで洗浄/回収ステップを繰り返します。すでに同じプレートからの細胞を含むチューブに細胞株。
- 4°Cで5分間400×gで遠心分離細胞。
- 5 ngのOP9培地の3ミリリットルのマスターミックスを（プレートあたり5日目に播種）の準備/ mlの体Flt-3Lおよび1ng / mlのIL-7。
- 体Flt-3L + IL-7マスターミックス（処理された各10cmディッシュ用3ml）でOP9培地で上清と再懸濁ペレットを削除します。 OP9細胞を6ウェルプレートの1ウェルに各プレートから採取した細胞を転送します。
- 単球に向けて細胞を駆動するために、B細胞または赤血球系統は、OP9細胞上に回収した細胞を播種する。 T細胞を誘導するために、OP9-DL1細胞単層上に細胞を播種する。
- インキュベーターに6ウェルプレートを置きます。
- 10日目：メディアの変化
- 各個別MESCクローンフィーダーセル型COMBINA用の15ミリリットルの遠心管を準備する共培養中のる。
- 体Flt-3Lの5 ng / mlのおよびIL-7の1 ng / mlのでOP9メディアのマスターミックスを調製する。各ウェルについて3ミリリットルを準備します。
- 穏やかに同じESCクローンフィーダー細胞タイプの組み合わせを含む複数のウェルから培地を組み合わせる6ウェルプレートの各ウェルから培地を収集する。
- 各ウェルに（3.6.2を参照）OP9メディアマスターミックスの2ミリリットルを追加します。
- 遠心し、4℃で5分間400×gで収集したメディア。ウェルあたりOP9メディアマスターミックス1ml中各ペレット（可視の場合、非常に小さい）（3.6.2を参照）へのステップ3.6.3に集めて上清を除去し、懸濁します。
- よく戻って各への細胞の1ミリリットルを配布メディアは、もともと3ミリリットルを各ウェルにボリュームを持っ収集された。インキュベーターに皿を返します。
- 12日目：いいえトリプシン通路
注：これはsの彼らは最適の時間でコンフルエントされるように、事前にOP9またはOP9-DL1細胞と6ウェルディッシュの十分な数を用意TEP。 12日目には、赤血球、単球、および初期段階のT細胞の開発の分析、フローサイトメトリーに最適です。- マスターミックスのFlt-3Lの5 ng / mlのおよびIL-7の1 ng / mlのでOP9メディアの（共培養で継続され、各ウェルのために3ミリリットル）を準備します。
- 40μmのストレーナー（共培養中の各ESCクローンフィーダー細胞型の組み合わせごとに1つ）で50mlの遠心管を準備します。
- 激しくウェル中に（単層を含む）のすべてのセルを分解するために、各ウェル内の既存のメディアをピペット。単一細胞懸濁液に似た状態が達成されるまで、力強いピペット操作を続行します。
- チューブにストレーナーを通して採取した細胞を渡します。残りのすべての細胞を洗浄し、収集するために各ウェルに3mlのPBSを追加します。同じストレーナーを通して細胞を渡します。同じESCクローンフィーダー細胞タイプの組み合わせを含む複数のウェルから細胞を結合します。
- 使用セルストレーナーを破棄し、1ウェルにアリコート相当を削除（〜6ミリリットル）、任意のためのフローサイトメトリー（または他の）は、その日に行わなければ分析する。使用前に氷の上にこれらのアリコートに保管してください。
- 4°Cで5分間400×gで遠心分離細胞。上清を取り除きます。ウェル当たりマスターミックス3mlに50mlの遠心分離管からのペレットを再懸濁し、再播種する。適切なフィーダー細胞型への各細胞懸濁液ウェルあたり3ミリリットルを加え、インキュベーター内で皿を置きます。
- 14日目：メディアの変化
- セクション3.6で説明されている手順に従ってください。
- 16日目：いいえトリプシン通路
注：このステップのために、事前に最適なコンフルエントOP9またはOP9-DL1細胞の6ウェル皿を準備します。
注：16日目は、Bリンパ球および中段T細胞の解析、フローサイトメトリーに最適です。- 3.7節で説明されている手順に従ってください。
- 18日目：メディアの変化
- セクション3.6で説明されている手順に従ってください。
- 20日目：いいえトリプシン通路
注：20日目私フローサイトメトリーのための理想的なのは、T細胞の開発後期半ばの分析。- 3.7節で説明されている手順に従ってください。必要に応じて、培地交換なしトリプシンを交互過去20日目分化する細胞を運ぶリンパ球の拡大率を毎日モニターしながら、日おき通路。
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Representative Results
LIFの存在下で、MEF上で増殖させた場合、たmESCは、未分化状態に維持することができる。理想的な条件下では、それらは位相差顕微鏡（ 図1）に光沢のあるハローに囲まれた細胞のコンパクトなコロニーとして見える。これらの培養物を毎日監視する必要があります。細胞のコンフルエンスに応じて、メディアを変更することができ、または細胞が分割することができる。隣接MESCコロニーは互いに接触点に来るべきではありません。未分化たmESCの正常な、健康な培養物は、 インビトロ T細胞分化に必須の出発点である。共培養を開始すると、それは細胞が過密することなく、完全にコンフルエントにすることをお勧めします。 OP9単層上に細胞を播種するために回収した細胞の大部分が（むしろフィーダー細胞以外）MESCであるようにするためである。合流点での主な違いは、0日に区別される各種MESCクローン間で観察されている場合、それはTISに予め付着によりMEFにを除去することがベストです共培養シードにたmESCをカウントする前に、（完全なES細胞培地を使用してステップ3.4.3-3.4.6のように）培養皿を訴える。
（セクション2.4を参照）OP9細胞は、先行共培養開始を維持しなければならない。加えて、OP9細胞は長期培養および/ またはそれらの増殖率の顕著な増加にそのプロパティの一部を失うと考えられている7が 1を超えて分割比率の回避：OP9細胞の維持の間、5、および6週間後に連続OP9培養を破棄、これらの落とし穴を避けるのに役立ちます。
初期細胞播種およびセル転送共培養する段階（0日目、5、8、12、16）で、OP9単層を合流点の最適な範囲内にあるべきである。 図2（図2A）、低および高（ 図を示している図2（b））共培養単層として使用するための賢明OP9細胞コンフルエンスの範囲を終了します。過剰コンフルエントなプレートの例を図5に示すURE 2Cを。最適なコンフルエンスに維持しないと、大量に、負に共培養に影響を与えることができる、脂肪細胞（ 図2D）の形成を誘導することができる。
中胚葉形成をOP9細胞に好まれているので、0日目に、共培養はOP9細胞ではなく、OP9-DL1細胞上で開始されます。細胞は、T細胞産生を誘導することが8日目に開始OP9-DL1細胞単層上にプレーティングする。いくつかのMESCクローンが視覚的に共培養の5日目までに中胚葉様コロニーの堅牢かつ定量的（〜90％）の形成（ 図3A-B）を表示しますが、他の人は、このステップ（ 図3C-F）で遅延を表示することができます。顕微鏡下で、このアッセイにおいて中胚葉由来の様コロニーを可変ワゴンホイールまたはクレーター（ 図4A）またはスターバーストまたは小花（ 図4B）に似ているとして記載されている。
公開されたOP9-DL1プロトコルは、定量的な中胚葉フォーマのノルムを反映しているが共培養の5日目によるションは、7私たちは 、すべてのESCクローンがこの時間枠内でそのノルムを達成しないことがわかります。これらのケースでは、5日目に培地を変更し、「5日目」は、細胞の収穫/転送プロトコルを実施する前にさらに1〜2日待ってください。この遅延の目的は、転送する前に視覚的になる中胚葉へ〜ES細胞コロニーの80〜90％を可能にすることである。これは80〜90％の図は、共培養皿でコロニー形態の単純な位相差顕微鏡検査によって厳密に視覚的な基準を反映して識別できることを明確にすることが重要です。それは、図4に示したものに似ているESCコロニーの割合を指す。それはいくつかのESCクローンであっても二日間の遅延の後に、この視覚的判定基準に到達しない可能性がある。以前に記載されているような場合には、あるFlk-1 +細胞について細胞選別、フローサイトメトリーを用いて血液形成中胚葉前駆体を富化することが可能である。いずれにせよ6,11、saのためにKE命名の利便性、私たちは "時計をリセット」と「5日」と中胚葉様コロニー移転の日を参照してください。
複数のESCクローンが並列に分化されているとき、それは他の人が遅れている間、いくつかの共培養は、時間に5日目通過のための準備ができていることが可能である。この場合には、より低速のクローンが他の人に追いつくまで、すべての共培養の通過を遅らせることをお勧めします。遅延は、「オンタイム」の共培養に害をしないようだが、遅いクローン大量のその後の分化に利益をもたらす。
8日目（ すなわち 、中胚葉コロニー移転後3日）は、HPCのの出現および蓄積を見ている。 HPCは緩くOP9フィーダー細胞（ 図5）に付着している細胞の光沢のあるクラスターとして表示されます。残しながら慎重に洗浄操作を、ピペットや皿上のメディアを使用して、切り離し、HPCのを収集するOP9単層、ほとんど無傷で（ 図6A-C）。これはおそらく、プロトコルの中で最も技術に敏感なステップです。これは、フィーダー層の中断を最小限に抑えるとのHPCの最大収穫の所望のバランスを達成するために、適切な運動とメディア吐出圧を見つけるためにいくつかの練習が必要です。 OP9単層の一部がリフトオフした場合の浮遊単層の大半はフィルタリング後40μmのナイロンメッシュで捕捉されますので、それは。 図6Dが必要以上に大きい単層の破壊につながる過剰なピペッティングした後、単層を示し、許容可能である。この洗浄工程の間に、それはすべてのHPCが収集されたか否かを顕微鏡下でチェックし、それに応じて、洗浄圧力を調整することが重要である。
共培養の進行は、フローサイトメトリーによってモニターすることができる。特にESCの非赤血球造血子孫を分析するためには、生きたCD45 +細胞上の第一ゲートすることが重要です。これは、ステップの画面外分析からのOP9細胞を、DAPIまたは他の核染色色素の使用は、非生存細胞の排除を可能にしている。 12日目では、小さくて丸い、光沢のある細胞の多くのクラスターが表示されるはずです。これは、この段階で細胞を計数する必要はない。しかし、私たちは生きている、ゲート制御フローサイトメトリーのイベント数はよく、12日目の共培養あたり1〜3×10 5の範囲が一般的であることを観察した。フローサイトメトリーは、赤血球が得られるOP9単層上で差別化生依存性細胞（CD45のNEG、TER119 +）および単球（CD45 +、CD11bのハイ ）の系統（ 図7A）の分析。 OP9-DL1の単層上での差別のライブ、CD45 +細胞の分析は、CD4 / CD8ダブルネガティブ（DN）-1（CD44 +、CD25のNEG、CD4のNEG、CD8の負 ）に特徴的なマーカーを明らかにし、DN2（CD44 +、CD25 +、必要がありますCD4のNEG、CD8の負 ）ステージT細胞（ 図7B NG>）。 16日目では、培養中の小さくて丸い、光沢のある細胞の量の有意な増加があります。 OP9-DL1sでは、T細胞分化製品はDN3（CD44のNEG、CD25 +、CD4のNEG、CD8の負 ）とDN4（CD44のNEG、CD25のNEG、CD4のNEG、CD8の負 ）の段階へと進行する。いくつかのDP（CD4 +、CD8 +）T細胞はまた、16日目（ 図7B）の出現を開始することができる。 HPCははOP9細胞上に播種OP9-DL1-MESC共培養の第20日では一日16でB細胞（CD19 +）が得られ、DP T細胞と現在シングルポジティブ（SP）CD8 + T細胞（大容量のがあるでしょう図7B）。図8は、共培養中に、上記の手順の重要なステップを要約図を提供し、提案され、分析の時点。
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MEF単層（100×倍率）の上に成長する未分化たmESCの図1の位相差顕微鏡像（シャープエッジコロニー）。
図2：オーバーコンフルエントOP9単層のOP9単層の密集度の位相差顕微鏡像（A）共培養通路/播種（40倍の倍率）のための賢明最低と（B）最高密集度レベル（C）の例（40X倍率）。（D）オーバーコンフルエントOP9単層（200X倍率）脂肪細胞形成（大、小胞を含有する細胞）である。
図3：位相コントラストmicroscop共培養の"5日目"での中胚葉様コロニー形成のyの画像。（A）、40Xおよび（B）> 90％の中胚葉分化コロニーとの共培養プレートの100X景色。これらのプレートは、5日目を通過させるための準備ができています。転送（C＆E、40X倍率、D＆F、100倍の倍率）の前に1-2日の延期を必要とする5日目の共培養プレートの（CF）の例。
図4：共培養の5日目に中胚葉様コロニーの形成の多様な位相差顕微鏡像（A）「クレーター」またはと呼ばれるコロニー形態（B）と呼ばれるコロニー形態」ワゴンホイール。 " 「スターバースト」または「小花」（200×倍率）である。
OP9単層（40X倍率）に小さな、丸い、光沢のHPCのクラスタと8日目の共培養プレートの図5の位相差顕微鏡像。
図6：共培養8日目のHPCコレクション後OP9単層（AC）のHPCを収穫する入念な洗浄の後OP9単層の破壊の適正範囲（D）日までにかけて破壊されているOP9単層の一例。 8 HPC収穫手順。
図7：代表的なフローサイトメトリー（FACS）の中に特定の時点で解析in vitroでの MESC分化。赤血球のための（A）染色（左）、単球（中央）、およびB細胞示されるように、12日目または16にMESC-OP9共培養（右）製品。（B）の示された時点でのT細胞を開発するための染色MESC-OP9-DL1共培養。免疫表現の詳細な説明のためのテキストを参照してください。
MESC-OP9共培養手順のステップの図8図（A）共培養の最初の8日間の主要な細胞転写工程。細胞のおよその数は日をゼロにOP9細胞上に播種し、5が示されている。（B）8日目の転写工程と共培養の重要な時点で、フローサイトメトリーによって検出された期待細胞分化の製品を。免疫表現の詳細な説明のためのテキストを参照してください。
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Discussion
OP9-DL1共培養系幹細胞からの血液細胞型の発達中のさまざまな遺伝子産物の役割を研究するために利用されている。8,12,13また、遺伝子調節DNAの機能を研究するための有効なモデルを証明して細胞分化の間に。9,14全体のマウスモデルの代替としてこの方法を使用すると、造血における多くの基本的な質問に対応した実験の時間とコストでかなりの節約をもたらすことができる。しかし、これらの目的のためにこのプロトコルの適合は、これらの手順で使用されるであろうMESCクローン間の潜在的な変動性の認識が必要である。公開されたプロトコルのタイムラインは、手入れの行き届いた、非操作さMESCライン、平均値から期待できる。7また、キメラマウスの作製のために選択されMESCクローンは通常、より高品質のものであり、OP9共培養では非常に堅牢に実行されます。一方、MESCクローンが安定から直接出現異所的に組み込まれた導入遺伝子を用いたトランスフェクションは、平均から平均以下の範囲の初期分化効率のさまざまな程度を表示します。ここに記載されているプロトコルは、in vitroでの造血の誘導に先立ってこれらの潜在的な違いを均等に5日目の通過段階の戦略的な1-2日の遅延を提供します。
8日目の通路は、このプロトコルの実行がエラーの最も可能性を秘めていれるステップである。忍耐、練習や注意深い観察がOP9単層の中断を最小限に抑えながら、HPCの収穫を最適化する技術を開発することを可能にします。キー5日目および8日目の手順を超えて、重要なパラメータは、プロトコルにおいて使用される試薬に細心の細胞培養の維持、（上述のように、特にOP9細胞）および特別な注意を必要とする。最も重要な試薬はFBSである。 FBSの明確な多くは、この手順をサポートする能力が著しく変化します。複数のロットは、Oで試験されなければならないこのアッセイにおいて強固な差別化を生み出すかを決定するRDER。
この共培養系には限界がある。たとえば、このモデルは、単一陽性CD4細胞の分化をサポートしていません。この理由の一つは、OP9細胞における主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスII抗原提示インフラストラクチャの発現の欠如である。MHCクラスIIによる抗原の1の細胞表面提示は、CD4 SP細胞の適切な発達に必要とされる。成熟および未熟CD8のSP胸腺細胞ステージの組み合わせを表して出てくるんCD8 SP細胞。MESCの1また、移植の成功は、マウスにT細胞の前駆細胞に由来する胎児胸腺器官培養を通して前に通過する必要があります。1それにもかかわらず、この技術は、その証明されているVで探索する以前は可能であった血液や免疫系の発達における細胞および分子の質問の両方への強力な調査手法として期待IVO。このように、脇にこれらの質問に対するより迅速な進歩を遂げるための新規な方法を提供するから、OP9-ESC共培養系の広い採用は、実験動物の使用を削減するより広範な影響を与えることになる。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 15-013-CV | |
| Stem cell qualified FBS | Gemini | 100-125 | Heat inactivated |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| L-alanyl L-glutamine | Corning | 25-015-CI | |
| HEPES buffer | Millipore | TMS-003-C | |
| Non-Essential Amino Acids | ThermoScientific | SH30853.01 | |
| Gentamicin Regent Solution (50 mg/ml) | Life Technologies | 15750-060 | |
| β-mercaptoethanol (55 mM) in DPBS | Life Technologies | 21985-023 | |
| Filter Unit | Millipore | SCGPU05RE | 0.22 μm PES membrane |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CM | |
| α-MEM | Life Technologies | 12000-022 | Powder, reconstitute per manufacture recommendation |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| FBS | ThermoScientific | SH 30396.03 | Testing of individual lots required |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma | D2650 | |
| Recombinant Human Flt-3 Ligand | R&D Systems | 308-FK | |
| Recombinant Murine IL-7 | PeproTech | 217-17 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | |
| Utrapure water with 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| MEFs mitomycin C treated | Millipore | PMEF-CF | Any mitotically arresteded MEFs can be used |
| DPBS | Corning | 21-031-CV | |
| Cell strainer (40 μm) | Fisher | 22363547 | |
| Tissue culture dish 100 x 20 mm | BD Falcon | 353003 | |
| Multiwell 6-well | BD Falcon | 353046 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | Tubes for FACS |
| ES R1 cells | ATCC | SCRC-1011 | |
| OP9 cells | Cells can be obtained from the Riken Laboratory Cell Repository (Japan). | ||
| OP9-DL1 cells | Cells can be requested from the Zúñiga-Pflücker laboratory. | ||
| FlowJo software | Tree Star | FACS data analyses | |
| Flow Cytometer | BD | FACScan, FACSCalibur and FACSVantage have been used in our lab |
References
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- Pui, J. C., et al. Notch1 expression in early lymphopoiesis influences B versus T lineage determination. Immunity. 11, 299-308 (1999).
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- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
- Chen, J., Lansford, R., Stewart, V., Young, F., Alt, F. W. RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 4528-4532 (1993).
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