Abstract
Inneboende processer av Drosophila PUPP utveckling kan skifta och snedvrida ögat epitel på ett sätt som gör enskilda cellens beteende är svårt att spåra under levande cell imaging. Dessa processer inkluderar: retinal rotation, celltillväxt och organism rörelse. Dessutom oegentligheter i topologi epitel, inklusive subtila stötar och veck ofta infördes som puppan är förberedd för avbildning, gör det svårt att förvärva i-fokus bilder av mer än ett par ommatidia i ett enda fokalplan. Arbetsflödet som beskrivs här botemedel dessa frågor, vilket möjliggör enkel analys av cellulära processer under Drosophila PUPP ögonens utveckling. Lämpligt-iscensatt puppor är anordnade i ett avbildningsrigg som lätt kan monteras på de flesta laboratorier Ubiquitin-DE-cadherin.: GFP och GMR-GAL4 driven UAS-α-catenin: GFP användes för att visualisera cellgränser i ögat epitel 1 -3. Efter dekonvolution ärtillämpas på fluorescerande bilder som tagits vid flera fokalplan, är maximal projektionsbilder genereras för varje tidpunkt och förbättras med hjälp av bildbehandlingsprogram. Inriktnings algoritmer används för att snabbt stabilisera överflödig rörelse, vilket gör individuella cellens beteende lättare att spåra.
Introduction
Föreningen Drosophila ögat kännetecknas av den stereotypa arrangemanget av dess ~ 750 ommatidia åtskilda av en bikakestruktur-gitter av accessoriska pigmentceller 4,5. Dessa pigmentceller är mönstrade med en samordnad kombination av händelser: lokala cellrörelser, celltillväxt, förändringar i cellform, och apoptos. Live visning av denna epitel gör att man kan studera de molekylära mekanismerna som ligger till grund dessa händelser i en fysiologiskt relevant och oberörd tredimensionell sammanhang.
I motsats till tidigare protokoll 6,7, den teknik som beskrivs här innefattar en effektiv metod för att stabilisera främmande vävnad rörelse som inte kan kopplas bort från avbildningsprocessen. Denna metod förbättrar studier av cellbeteende i utvecklings Drosophila PUPP ögon epitel - en vävnad som växer, roterar, och skift under loppet av avbildning. Dessutom rörelse-stabiliseringsteknik debeskrivs här kommer att vara användbart för att studera celler i andra sammanhang där främmande rörelse förekommer.
Att visualisera cellgränser i Drosophila retinal fältet, var transgena fluglinor genereras som uttrycker UBI-DE-Cadherin: GFP samt UAS-α-catenin: GFP under kontroll av ögat-drivrutin GMR-GAL4 1-3. Användningen av två GFP-märkta membranmarkörer möjliggör visualisering av cellgränser vid lägre intensitet ljus. Detta minimerar vävnadsskada och fotoblekning vid upprepad exponering för hög energi våglängder, som möjliggör ökad bildfrekvens och filmtiden. För att öka effektiviteten av RNAi transgener, UAS-DCR-2 inkorporerades också i en andra lina 8.
I en tredje uppdatering från tidigare protokoll, är en enklare bildbehandling rigg som lätt monteras i de flesta laboratorier som beskrivs. Denna apparat undanröjer kravet på att ha en specialiserad avbildning rIG genereras av ett universitet s "verkstad" eller liknande tjänst. Denna avbildning riggen är liknande den som används för att avbilda andra PUPP vävnader 9,10.
Presenterade här är en enkel live-cell bildprotokoll som kan användas för att direkt bedöma de morfogenetiska händelser som bidrar till ögat mönstring från ~ 17 till 42 h efter puparium bildning (hr APF). Specifikt möjliggör detta protokoll en att fastställa konsekvenserna av att modifiera genuttryck under PUPP utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figur 3 visar en sammanfattning av den experimentella proceduren.
1. Vävnadsberedning
- För att fastställa konsekvenserna av modifierat uttryck av en gen av intresse, inrätta följande kors i två exemplar och hålls kvar vid 25 ° C: UAS-transgen (hanar) X GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, UBI-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b (jungfru honor) OBS: För att få kontroll vävnadskors UAS-lacZ hanar till GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, UBI-DE-Cad: GFP honor. β-galaktosidas genererar inga defekter i cellbeteende i näthinnan.
- För att öka effekten av RNAi transgener, män kors UAS-RNAi till GMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-cat: GFP, UBI-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b jungfru honor.
OBS: Enstaka defekter i cellens beteende i retinae uttrycker ektopisk DCR-2 har observerats (data visas ej). Vaksamhet rekommenderas om du använder denna metod. - Sutvalda vita pre-puppor av lämpliga genotyper och placera i 1,5 ml mikrocentrifugrör. Om puppor uttrycker DCR-2 väljer du antingen manliga eller kvinnliga puppor: uttryck av UAS-DCR-2, en insats på X-kromosomen, är starkare hos män. Puppor bör könsbestämmas vid 0 hr APF före pigmentering av PUPP fallet - könskörtlarna hos män är synliga som stora genomskinliga glober på de laterala sidorna av puppan (ungefär en tredjedel från den bakre).
- Inkubera mikrocentrifugrör innehåller puppor, i en ren plastspets-box vid 25 ° C. För att förhindra uttorkning av puppor plats en 10 cm 2 bit vävnad, indränkt i destillerat vatten, in i spetsen-rutan.
OBS: Om fuktigheten i spetsen-rutan blir för högt PUPP fallet kan bli blöt och svår att dissekera i efterföljande steg. - Inkubera i lämplig tid. För att fånga cell beteenden förknippade med mönstring ögat, förbereda puppor för avbildning på runt 17 timmar APF, 20 timmar APF eller 24 hr APF. Se Representativa resultat för vidare diskussion om när specifika cell beteenden bäst observeras.
- Placera en bit färsk dubbelhäftande tejp på en svart Sylgard dissektion skålen. Placera en puppa, ryggsidan uppåt, med chefen för puppan anslutit sig till dubbelhäftande tejp (Figur 1A) .Try inte att fästa bröst- och buken regioner i puppan till dubbelhäftande tejp. Med pincett lyft försiktigt och ta bort gällocket att exponera PUPP huvudet. Riv längs sidan av PUPP fallet att exponera området runt ett öga.
- Ta försiktigt bort puppan från tejpen. Om puppan förblir vidhäftande, applicera en liten mängd destillerat vatten till korsningen mellan PUPP fallet och tejp för att försvaga vidhäftningen.
2. Montering
- Konstruera en liten 15 mm 2 ram från läskpapper och stansa ett hål i middlethat är 5,5 mm i diameter (Figur 1B). Fördjupa i destillerat vatten och placera icentrum av ett objektglas. Med hjälp av en 30 cc spruta, pressa ut en enhetlig ring vaselin att omge läskpapper ramen. Kontrollera att vaselin ringen är marginellt högre än bredden på puppan och att diametern av ringen är marginellt mindre än bredden på ett täckglas.
- Tillsätt en liten vulst av vaselin direkt på objektglaset, i hålet stansat till läskpapper (Figur 1C) .Carefully ordna puppan, på sin sida, som stöds av vaselin vulsten (figur 1D).
- Placera på ett täckglas ovanpå vaselin ringen så att den kommer i kontakt epitelet ovanför ögat neuroepitelet (figur 1D). Komprimera försiktigt beredningen att täta täck mot vaselin och generera en liten platt kontaktyta mellan PUPP ögonregionen och täckglas.
3. Fluorescens Imaging
- Bild PUPP preparatet med hjälp av enfluorescerande mikroskop. Varje 7 min fånga seriesektioner genom den apikala domänen av ögat neuroepitelet, i regionen av adherens korsningar.
OBS: a) Lämpliga seriella sektioner är vanligtvis 4-5 per z-stack består av 0.2 um z-steg. b) Oegentligheter i topologi epitel, inklusive milda stötar och veck, kan göra det svårt att skaffa i-fokus bilder av stora områden av vävnad. Medan avbildning, kan man hitta en del av ett område av intresse för att vara i fokus, och en grannregion att vara out-of-fokus. Inklusive en liten droppe destillerat vatten mellan PUPP ögat och täckglas kan eliminera vissa akuta vävnads veck men inte den milt ojämn topologi karakteristisk för de tidiga stadierna av PUPP ögon morfogenes. I dessa fall översampelklocka vävnaden genom att förlänga z-stack fram i-fokus skivor förvärvas för hela området. c) Att fånga seriesnitt varje 7 min bör möjliggöra levande avbildning för 3-4 timmar utan en betydande reduInsatser i intensiteten av GFP-fluorescens, som kan äventyra bildkvaliteten. Kortare tidsintervaller kan reducera den totala tiden för avbildning. - Fortsätt avbildning för 3-4 timmar. Använd inte en automatisk fokus och tidsfunktion som är tillgänglig på många fluorescerande mikroskop sedan PUPP tillväxt och pumpning av hemolymfa flyttar positionen av näthinnan och vaksamma omorientering krävs varje 14-21 min. OBSERVERA att avbildning bortom fyra timmar kan bromsa eller stall morfogenes i ögat.
- Använd lämplig deconvolution programvara för att reducera bakgrunds och öka kontrasten av seriesektionsbilder. För varje z-stack-fil, utför följande i LAS AF programvara (se tabell för material): Navigera till verktygspanelen, välja 3D Deconvolution och klicka på Verkställ.
- Generera en maximal projektion (MP) bild för varje deconvoluted stack fil: Navigera till verktygspanelen, välja 3D Projection och klicka på Verkställ.
OBS: den största projektionen algoritmen kan misslyckas med att generera en enhetligly i-fokus bilden för vävnad som har översamplas. En teknik för att vässa out-of-focus regionerna skisseras i steg 5.2.
4. Post-avbildning PUPP Rescue och Fenotyp Verifiering
- För att ta itu om artefakter infördes eller puppan skadas under avbildning, försiktigt bort puppan från bild riggen: använder pincett bort täck och överföra puppan till en ren flaska med mat. Förvara vid rumstemperatur eller 25 ° C tills den vuxna flugan träder.
- Noggrant undersöka fenotypen av den vuxna ögat och jämför med ögonen på vuxna flugor som kommer från den ursprungliga flyga kors.
5. Bildbehandling
- Automatisk bildjustering:
OBS: Den levande Drosophila vävnaden kommer att flytta och växa genom hela bildprocessen. Följaktligen centra bilderna samlats vid successiva tidpunkter kanske inte motsvarar samma punkt i Drosophila vävnaden. DessutomHela retinal skivan roterar ca 30 ° mellan ~ 21 och 23 tim APF. För att belysa enskilda cell beteenden och minska störningar orsakade av organism tillväxt, justera varje MP image.While detta kan utföras manuellt, bildredigeringsprogrammet som används här (se tabell för material) har inbyggda algoritmer som kan påskynda processen.- Från fliken Arkiv i huvudmenyn, öppna skript och välj Load filer i stapel.
- Importera MP bildfiler till lasten panelen Lager och välj OK. Se till att försöket att automatiskt justera källbilder alternativet inte är markerat.
OBS: Om det här alternativet är markerat, kan programvaran använda ett justeringsalgoritm som snedvrider bilddata. - När alla MP-filer har laddats in i rutan Lager, se till att alla bilder är i kronologisk ordning så att den tidigaste tidpunkten är på toppen av lagerstapeln. Om lagren är inte i rätt ordning, dra och släpp dem tills de är beställdakorrekt.
- Välj Justera lager automatiskt på fliken Redigera i huvudmenyn. Välj Flytta och klicka på OK.
- Om Auto-Align algoritmen inte orientera ramarna till en relevant brännpunkt, göra smärre justeringar med hjälp av flyttverktyget.
- Komposit Skärpning:
OBS: Out-of-fokus regioner i en initial MP bild kan slipas med "beskärning" motsvarande deconvoluted stack i LAS AF programvara. Beskära en stapel fil gör att man kan begränsa intervallet av en z-stack som utsätts för den största projektionen algoritmen manuellt.- Leta reda på Beskär funktionen på verktygspanelen (under fliken Process). Begränsa manuellt de inledande och avslutande skivor så att de spänner bara vidhäftningsbandet inom den ursprungligen out-of-fokusområdet. Klicka på Verkställ för att generera en ny bunt fil som är optimerad för denna region.
- Generera en ny Maximal Projection för lokalt optimerad stacken och export som en TIFF-fil.
- I the bildbehandlingsprogram (se tabell för material), öppna skript (som ligger i fliken Arkiv i huvudmenyn) och välj Ladda filer i stapel.
- Importera den inledande MP bildfil och lokalt optimerad MP-fil för en viss tidpunkt i Last panelen Lager och välj OK. Se till att försöket att automatiskt justera källbilder alternativet inte är markerat.
- Markera båda lagren i Lager fönstret och välj sedan Blanda lager automatiskt (finns på fliken Redigera i huvudmenyn) för att automatiskt dölja lämpliga områden i de två bilderna, vilket ger en enhetligt i-fokus retinal fält. Spara denna sammansatta bilden som en TIFF-fil.
- Upprepa steg 5.2.1 till 5.2.5 för alla suboptimala MP bilder.
- Ytterligare justeringar: Rotera, beskära och justera nivåerna av filmen Lager:
- Med alla lager markerat använder du verktyget Omforma (Redigera> Omforma fritt) att rotera bilderna så att ryggens-ventral axel näthinnan är inriktadtill y-axeln av filmen ramen.
- Om det behövs, använd verktyget Beskär för att minska synfältet till önskad storlek och form.
- Använd justering (av enskilda bildrutor) nivå för att hjälpa till att förbättra kontrasten mellan cellmembranet och cellkroppen.
- För stilist ändamål och för att betona specifika cell beteenden, införa falsk färg för att markera platser av intresse i varje bildruta.
- Animation: Konvertera bilder till en film:
- Öppna Animation rutan på fliken Windows i huvudmenyn. Välj Gör Ramar från lager på menyn i det övre högra hörnet av Animation fönstret.
- Notera att skikten läggs till animeringen rutan i sekventiell ordning med början från botten av traven. För att vända ordningen på ramarna, först markera alla ramar och sedan väljer Omvänd Ramar från animeringsfönstret menyn.
- Välj en ram fördröjningstiden för varje bildruta genom att använda rullgardinsmenyn under ramen tummenspik.
OBS: Ramen fördröjning för filmer 1 till 4 presenteras i denna uppsats är 0,8 sek. - Från fliken Arkiv i huvudmenyn, öppna Export och välj Återge video. Välj QuickTime-export i Filalternativ och välj önskat videoformat. Under Render Alternativ inställd Frame Rate till Anpassad, ange en bildfrekvens på 15, och klicka Render.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Live-avbildning av PUPP ögat är en framgångsrik strategi för att observera cell beteenden som bidrar till mönstring av neuroepithelium. Rollen av specifika proteiner kan lätt bedömas genom att uttrycka transgener som modifierar proteinnivåer under ögonens utveckling. För att göra detta GMR-GAL4 används för att driva transgenexpression bakom morfogenetisk fåran. Detta ger fördelen att inte störande tidigare händelser som etablerar ögonområdet under de två första larv instars. Dessutom kräver många RNAi transgener betydande tid att effektivt minska proteinnivåer (data nu visas). Därför kör RNAi transgener med GMR-GAL4 drivrutin linjen gör ofta tredje larv stadiet ögonens utveckling och eversion av ögonskivorna under metamorfos att fortsätta oskadda och minskar proteinnivåer först senare, under PUPP ögon morfogenes. Om larvutveckling är dock störs av en mycket effektiv RNAi transgen, flyga kors kanhållas vid 18 ° C för att reducera transgenexpression och puppor fördes till 25 ° C vid 0 h APF. För att ta itu med effekten av RNAi transgen uttryck, utskrift eller proteinnivåer bör bedömas i etapp matchade puppor användning av standardtekniker (t.ex. kvantitativ-PCR, immunofluorescens, immunoblotting).
Under larvutveckling, är ljusmätare kärnor vardera ommatidium rekryterats som en våg som färdas från den bakre till främre sidan av ögat skivan 11. Denna utvecklings gradient behölls i PUPP ögat. Det är när avbildas på 22,5 tim APF, mönstring av GMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-cat: GFP, UBI-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b retinae var markant mer mogen i den bakre regionen (Figur 2). Fenotypen av dessa retinae var jämförbar med den för vildtyp gylf stammar (data ej visade). Traditionellt PUPP ögat morfogenes beskrivs enligt utvecklingstiden (t.ex.HR APF). Men på grund av den uttalade utvecklings gradienten vi föreslår beskriver ögon mönstring enligt följande händelser:
1 ° omslag (Figur 2 och Movie 1): Initialt så många som åtta celler direkt kontaktade fotoreceptor buntar. Två celler - vanligtvis de främre och bakre celler - rekryterades som primär (1 ° s). Dessa 1s snabbt omringade fotoreceptor buntar, ansluter till varandra för att bilda stabila korsningar. Odifferentierade interommatidial celler (IC) låg i ett oorganiserat sätt mellan varje ommatidial gruppering. Samtidig med 1 ° cellrekrytering, apoptos beskäras ca 5% av IC poolen som tidigare beskrivits (ej kommenterad i Movie 1) 12.
IC inskjutning (Figur 2 och Movie 2): Som en ° s inslagna och förseglade om varje fotoreceptor bunt, lokal cell rörelser omorganiserade IC grupperade på rygg och ventrala sidor av varje ommatidium. ICS inskjutna från flera (vanligtvis två) rader till en enda rad. Målet ställning rörliga IC kunde tryggt förutspådde i vild vävnadstyp genom att observera riktnings projektion av stora "cellulära tillägg". Tillväxten av de 1 ° cellerna tillsammans och sannolikt bidragit till IC interkalering 13. Många IC kommer att gå på att differentiera som sekundära celler (2 ° s) (visas ej).
3 ° tävling (Figur 2 och Movie 3): Efter inskjutning, tävlade tre IC att ockupera den tertiära (3 °) nisch. I denna dynamiska strid, celler ockuperade ofta 3 ° nisch för så lite som 5 till 10 min innan de fördrivna. Så småningom en enda cell etablerat en stabil 3 ° nisch.
Slutlig beskärning (Figur 2 och Movie 4): En våg av apoptos 3,15-18 minskat antalet IC till det minimum som krävs för att effektivt generera en snygg sexkantig IC gitter över föreningen ögat 5,14: tre 3 ° s och sex 2 ° s runt varje ommatidium. Såsom tidigare noterats, vanligtvis de överskridande IC liggande närmast borsten eliminerades genom apoptos 7. Vi observerade celldöd samtidig med IC interkalering och 3 ° nisch etablering och föreslår att beskärning av överskottsceller bidragit till effektiviteten i dessa händelser. Dessutom var subtila omplacering borst organules ofta observeras som IC var beskäras.
Figur 1:. PUPP dissekering och bildbehandling (A) Den gällock tas bort från en Drosophila puppa (visas här på 23 tim APF) att exponera huvudet av enNimal. Streckade linjen representerar en bit dubbelsidig tejp. (B) Illustration av den enkla färsk imaging rigg. (C och D) Med huvud exponerad, är puppan placerad vid ca 35 ° vilar på vaselin pärlan. (D) Högre förstoring bild av en puppa placerad ovanpå vaselin pärla. Placeringen av täckglas och målet illustreras (inte ritade i skala). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: En gradient av utveckling i hela PUPP ögat. (A) En enda bild av en PUPP öga avbildas på 22,5 tim APF. Adherens korsningar är märkta av DE-Cad: GFP och αCat: GFP. Förpackad region kommenterad i (C). (B) Illustrationer av mellanstadiet och fullt mönstrade ommatidia, vid 24 och 41 tim APF respektive. Två 1 ° s (blå) omger en central gruppering av fyra kon celler (vita). Genom 41 tim APF mönstringen av interommatidial celler (ljusgrå) är klar: tre 3 ° s ockupera alternativa hörn och en enda 2 ° bildar varje sida av hexagon. Tre borst organules (mörkgrå) omger varje ommatidium. (C) Notering av en liten region i ögat (från A). Två 1 ° celler (exempel pseudo-färgad ljusblå) expanderar att omringa varje ljusmätare bunt. IC (grön, gul, röd och mörkblå) intercalate till enstaka rader. Vid varje alternativ vertex tre celler tävlar (beskrivs i rosa) att ockupera 3 ° nisch (orange färg). Se filmer 1-4 att observera dessa händelser utspelas. Klicka här för att se en större version av denna figure.
Figur 3:. Sammanfattning av den experimentella proceduren Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1 :. 1 ° Primär inslag celler väljs från den pool av celler som omger varje spirande ommatidium. Som två 1 ° s omger varje ommatidium och anslut, adherens korsningar snabbt bilda (rosa linjer). De raka 1 °: 1 ° cell korsningar expandera och en ° s börjar växa, isolerande fotoreceptor buntar från de omgivande IC. Initialt fotoreceptorerna lyser klart, tät GFP märkning arbetade adherens korsningar. Morfologiska förändringar graför sig drar dessa fotoreceptor korsningar under plan avbildning och X-formade korsningar mellan varje uppsättning fyra apikala kon celler ovanpå varje ommatidium bli tydligare. Originalbilder på vänster; pseudo-färg och anteckningar införs i paneler på höger. Ögon avbildas från 21 tim APF.
Film 2 :. Interommatidial cell intercalaction De interommatidial celler (IC) markerade i rött, blått, gult och grönt initialt bilda en kvadrant separera en dorsal (överst) och ventrala (nederst) ommatidium med ett avstånd av två celler. De röda och gula IC sträcka ventralt och dorsalt respektive (från t = 42 min), ta kontakt med målet 1 ° s med 56 minuter. De blå och gröna IC likaledes omfatta rikta motsatta ommatidium. "Nya" 1 °: IC korsningar växa snabbt i sidled. Vid 112 min ursprungliga kvadranten av IC har fullt inlagrad GEnerate en enda rad av celler. Originalbilder på vänster; pseudo-färg och anteckningar införs i paneler på höger. Ögon avbildas från 23 tim APF.
Film 3 :. Tertiär konkurrens Vid alternerande hörn två eller tre celler (beskrivs i rosa) tävlar om att ockupera 3 ° nisch. Synas till "push" sina grannar åt sidan, celler genererar stora utökningar som når mot motsatt ommatidia. Upptar 3 ° nisch (färgad orange) är ofta flyktiga och celler antingen dra tillbaka eller skjuts ur position med sina grannar. I slutet av denna 217 minuter film, verkar många 3 ° nischer etablerad. Originalbilder på vänster; pseudo-färg och anteckningar införs i paneler på höger. Ögon avbildas från 23 tim APF.
Movie 4:. Slutlig Beskärning Celler i närheten av borst organules avlägsnas genom apoptos. Exempel är markerade i lila, rött, gult och blått. Under avbildning, borttagande av celler kvar bara en 2 ° längs varje horisontell arm av IC hexagon. Beskärning av överskjutande celler på de diagonala sidorna av IC hexagon var inte i den här filmen. I denna genotyp Ofta noterades smärre fel i placeringen av borstgrupper (jämför med figur 2B). Två av de tre borstgrupper manövreras in i hörn nischer under avbildning: omplacering verkade underlättas genom borttagning och förflyttning av grann IC. Originalbilder på vänster; pseudo-färg och anteckningar införs i paneler på höger. Ögon avbildas från 26 tim APF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrivningen av vildtyp utveckling (ovan) utgör grunden för jämförelser av mönstring händelser i RNAi eller överuttryck genotyper. Jämförelser av levande vävnad utveckling är ovärderligt när man fast exakt vilka cell beteenden regleras av ett protein av intresse. Vidare, och inte beskrivs här, gör levande cell imaging en att göra kvalitativa och / eller kvantitativa beskrivningar av rollen av en gen av intresse för de händelser som mönster ögat. Genom 30-32 tim APF flesta pigmentceller har förvärvat stabila positioner och apoptos har beskäras skjutande celler från retinala fältet. Efter detta är det bara små förändringar observeras som pigmentcellerna anta sina karakteristiska former: den 3 ° s blir sexkantiga och som en ° s subtilt expandera, bredden på de angränsande rektangulära 2 ° celler minskar. Efterföljande generation av pigment och linsmaterialet sannolikt hämmar framgångsrik avbildning av adherens korsningar.
Även en valuable strategi måste flera fallgropar komma ihåg när avbildning av levande PUPP ögat. Först, ta bort den främre PUPP fallet gör djuret särskilt utsatta för uttorkning, överhettning och skada under montering och bildbehandling. Förolämpningar som dessa kan förbrylla uppgifter genom att inducera atypisk vävnad utveckling som inte är relevant för genotyp under granskning. För det andra, det protokoll som beskrivs här kräver att ett täckglas ta direktkontakt med den PUPP huvudet epitel. Vi har observerat att retinal utveckling stannar om överdrivet tryck appliceras när man trycker täck mot ögat. Faktiskt exogen mekaniska krafter har visats i andra system för att påverka utvecklingsprocesser inklusive vävnadsarkitektur 19,20. Av dessa skäl är det viktigt att mycket försiktigt placera täckglaset mot ögat. Dessutom bör avbildas puppor räddas från bild riggen och tillåts växa fram som vuxna: artefakter introduceras under avbildning kanofta upptäckas genom att jämföra den avbildade ögon av dessa vuxna med ögon åldersmatchade flugor från den ursprungliga korset. Vidare måste data från flera avbildning sessioner jämföras att verifiera cell beteenden. Slutligen bör standard immunofluoresence användas för att avgöra om arrangemanget, storlek och antalet celler i etapp matchade vävnad är desamma.
Ektopisk DCR-2 används ofta för att öka effekten av RNAi. Men i närvaro av ektopisk DCR-2, IC inlagring, stabilisering av 3 ° nisch och apoptos var ibland störs (data visas ej). DCR-2 uttryck bör därför användas med försiktighet.
Protokollet som beskrivs här utnyttjar GFP till etiketten adherens korsningar och bedöma morfogenes av pigmentceller i PUPP ögat. Denna strategi skulle lätt kunna modifieras för andra ändamål (t.ex. för att bedöma ljusmätare morfogenes). För en strategi dubbelmärkning, ytterligare UAS transgener som märka andra cellulära komponenter av intresse (t.ex. sekreterare vesikler, endoplasmatiska nätverket, nucleus) med icke-GFP taggar skulle kunna införlivas. Men intensiteten och livslängd av dessa transgener kräver bedömning: RFP, DsRed och mCherry, till exempel, har visat sig vara dåliga etiketter för avbildning PUPP öga för de långa perioder som krävs för att fånga pigmentcell mönstring (data visas ej). Om utreda snabba cellbeteenden (t.ex. sekre) protokollet som beskrivs här lätt kan modifieras för konfokalmikroskopi av lämpliga fluorescerande proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| Scotch double stick tape | 3M | 665 | |
| Black Sylgard dissection dish | Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 hr to polymerize | ||
| Sylgard | Dow Corning | SYLG184 | |
| Sylgard (Black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Glass petri dish | Corning | 7220-85 | |
| 25 x 75 x 1 mm glass microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| 22 x 40 mm glass coverslip | VWR | 48393-172 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Whatman 3mm Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-713-336 | |
| Vaseline | Fisher Scientific | 19-086-291 | Or purchase at local pharmacy. |
| 30 ml syringe | Fisher Scientific | S7510-30 | |
| Leica TCS SP5 DM microscope | Leica Microsystems | ||
| LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software | Leica Microsystems |
References
- Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. J. Cell. Sci. 114, 493-501 (2001).
- Oda, H., Tsukita, S. Dynamic features of adherens junctions during Drosophila embryonic epithelial morphogenesis revealed by a Dalpha-catenin-GFP fusion protein. Dev. Genes Evol. 209, 218-225 (1999).
- Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87, 651-660 (1996).
- Cagan, R. Cell fate specification in the developing Drosophila. retina. Dev Suppl. , 19 (1993).
- Bate, M., Arias, A. M. Pattern formation in the Drosophila. retina. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 1277-1325 (1993).
- Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing. Drosophila pupal retina. Mech. Dev. 125, 223-234 (2008).
- Monserrate, J. P., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death Differ. 14, 209-217 (2007).
- Lee, Y. S., et al. Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways. Cell. 117, 69-81 (2004).
- Zitserman, D., Roegiers, F. Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae. J. Vis. Exp. (51), 2706 (2011).
- Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).
- Sato, M., Suzuki, T., Nakai, Y. Waves of differentiation in the fly visual system. Dev. Biol. 380, 1-11 (2013).
- Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mech. Dev. 121, 1523-1530 (2004).
- Larson, D. E., Johnson, R. I., Swat, M., Cordero, J. B., Glazier, J. A., Cagan, R. L. Computer simulation of cellular patterning within the Drosophila pupal eye. PLoS Comput. Biol. 6, e1000841 (2010).
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Dev. Biol. 136, 346-362 (1989).
- Cagan, R. L., Ready, D. F. Notch is required for successive cell decisions in the developing Drosophila retina. Genes Dev. 1099, 1112 (1989).
- Miller, D. T., Cagan, R. L. Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina. Development. 125, 2327-2335 (1998).
- Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development. Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).
- Yu, S. Y., et al. A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye. Development. 129, 3269-3278 (2002).
- Liu, Z., et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 9944-9949 (2010).
- Miyake, Y., Inoue, N., Nishimura, K., Kinoshita, N., Hosoya, H., Yonemura, S. Actomyosin tension is required for correct recruitment of adherens junction components and zonula occludens formation. Exp. Cell Res. 312, 1637-1650 (2006).
