Summary
Verletzungen des Rückenmarks ist eine traumatische Erkrankung, die schwere Morbidität und hoher Sterblichkeit führt. In dieser Arbeit beschreiben wir im Detail eine Quetschung Modell der Verletzung des Rückenmarks in Mäusen, gefolgt von einer Transplantation von neuralen Stammzellen.
Abstract
Rückenmarksverletzung ist eine verheerende klinischen Zustand, gekennzeichnet durch einen Komplex von neurologischen Störungen. Tiermodelle von Rückenmarksverletzungen können beide verwendet werden, um die biologischen Reaktionen auf Verletzungen zu untersuchen und mögliche Therapien zu testen. Prellung oder Kompression Verletzungen des Rückenmarks chirurgisch frei geliefert sind die am häufigsten verwendeten Modelle der Pathologie. In diesem Bericht werden die experimentellen Prellung wird mit dem unendlichen Horizont (IH) Impactor Gerät, das die Schaffung eines reproduzierbaren Verletzungen Tiermodell durch Definition von spezifischen Verletzungen Parameter ermöglicht geführt. Stammzell-Transplantation wird häufig als eine potenziell nützliche Strategie für die Heilung dieser schwächenden Krankheit. Zahlreiche Studien haben die Wirkung von Transplantation einer Vielzahl von Stammzellen bewertet. Hier zeigen wir eine angepasste Methode zur Verletzung des Rückenmarks, gefolgt von Schwanzveneninjektion von Zellen in CD1-Mäusen. Kurz gesagt, bieten wir Verfahren für: i) Zellmarkierung with einer lebendigen Tracer, ii) pre-operative Betreuung von Mäusen, iii) Durchführung einer kontusive Verletzung des Rückenmarks, und iv) die intravenöse Verabreichung von post mortem neuralen Vorläuferzellen. Diese Prellung Modell kann genutzt werden, um die Wirksamkeit und Sicherheit der Stammzelltransplantation in der regenerativen Medizin Ansatz bewerten.
Introduction
Eine Rückenmarksverletzung (SCI) ist die häufigste Verletzung durch energie Trauma wie Kraftfahrzeugen Unfälle, Stürze, Sport und Gewalt ein. In schweren SCI, die Verletzung Kraft zerstört oder beschädigt Nervengewebe, was zu plötzlichen Verlust neurologischer Funktionen. Traumatische SCI tritt häufig bei jungen Erwachsenen zwischen 10 und 40 Jahre alt. Es wirkt sich stark des Patienten psychische und physische Zustand und verursacht enorme wirtschaftliche Auswirkungen für die Gesellschaft 2. Die Behandlungsmethode der akuten Phase wird häufig ein Hoch Kortikosteroiddosis, chirurgischen Stabilisierung und Dekompression begrenzt, um möglicherweise weitere Schäden 3-4 dämpfen, aber die Rollen dieser Methoden auf die lokomotorische Erholung nach SCI noch umstritten. Neben akuten Gewebeverlust, traumatischen Verletzungen und zur Aktivierung von Sekundärmechanismen der Degeneration Ursache Demyelinisierung und Tod von mehreren Zelltypen 5-6. Der Grad der Wiederherstellung der Funktion könnenzehn in dem Umfang der verschont weißen Substanz an der Verletzungsstelle 7 korreliert.
Tiermodelle der SCI kann sowohl verwendet werden, um die biologischen Reaktionen des Gewebes, um Verletzungen zu untersuchen und mögliche Therapien zu testen. Darüber hinaus hat ein nützliches Tiermodell eines menschlichen Pathologie nicht nur auf einige Aspekte dieser Bedingung zu reproduzieren, sondern auch zu Vorteilen gegenüber direkten klinischen Beobachtungen und Experimente bieten. Die am häufigsten verwendeten Modelle von Rückenmarksverletzungen beinhalten Prellung oder Kompression Verletzung der chirurgisch freigelegt Rückenmark 8 geliefert. Die Entwicklung eines kontrollierten Gewichts Drop Prellung Verletzungen sind ein wichtiger Meilenstein in der Geschichte von SCI Forschung. The Ohio State University Rückenmark Forschungszentrum hat die technologische Herausforderung, ein Gerät, das verwendet werden kann, um eine bestimmte Kompression des Rückenmarks mit Parametern Auswirkungen von einem Computer 9 gesteuert induzieren verfolgt. Dies wurde ursprünglich für den Einsatz with Ratten; später wurde modifiziert, um in Richtung Mäusen 10 anzuwenden. Die Vorteile dieser Art von Ansatz sind, dass die Biomechanik der Verletzung kann eingehender untersucht werden, und die Parameter der Verletzung kann in einer vollständigeren Art und Weise, um eine reproduzierbare Versuchsmodell erhalten definiert werden und ermöglicht damit eine genauere Bewertung der Wirkung von getestet Behandlungen auf die Funktionswiederherstellungsprozess.
Viele Studien haben die Transplantation Wirkungen einer Vielzahl von Stammzellen in SCI Modelle 11 ausgewertet. Wir haben vor kurzem nach dem Tod der Maus Spender 12-13 isoliert adulten neuralen Stammzellen aus dem Teil ventrikuläre Zone (SVZ) mehrere Stunden. Dieses Verfahren stellt eine Population von neuralen Stammzellen, die so genannte Post-mortem-neuralen Vorläuferzellen (PM-NPCs), die vorteilhaft in einem regenerativen Medizin Ansatz zur Heilung von SCI zu sein scheinen. Wir werden in diesem Papier zeigen: i) das Protokoll für die Markierung von Zellen mit dem lebenswichtigen Tracer PKH26, ii) die surgchemischen Verfahrens auf trauma SCI durchzuführen, und iii) die intravenöse (iv) Verabreichung der markierten Zellen. Darüber hinaus wird in dieser Arbeit zeigen wir, dass transplantierte Zellen migrieren, um Querschnittlähmung Websites und differenzieren meist in Mikrotubuli-assoziierten Protein (MAP) 2-positiven Zellen. Ferner ist der die Differenzierung durch die Förderung eines stabilen Rückgewinnung der Hinterextremität Funktion begleitet.
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Protocol
HINWEIS: Alle Verfahren wurden vom Prüfungsausschuss der Universität Mailand genehmigt und erfüllt die italienischen Richtlinien für Versuchstiere in Übereinstimmung mit den Europäischen Gemeinschaften Richtlinie vom November 1986 (86/609 / EWG).
1. Vorbereitung der Zellen für die Transplantation
HINWEIS: Verwenden Sie neuralen Stammzellen zwischen dem 5. und dem 9. Passage in Kultur für diese Experimente; bevor sie zur Transplantation bezeichnet die Kulturen für die Proliferation und Differenzierung Fähigkeit zu testen. Bestimmen das Ausmaß der Differenzierung durch Immunzytochemie 12.
- Die Zellen in einer Konzentration von 1 x 10 6 Zellen / 150 & mgr; l (Transplantation 1 x 10 6 Zellen pro Maus). Vorbereiten mindestens 1,2 x 10 6 Zellen pro Maus, weil ein Überschuß von Zellen ist für Spritzenladezwecke erforderlich.
- In einem 10 ml konischen Röhrchen waschen Zellen 3 mal mit neuralen Stammzellenmedium 13. In jedemWaschschritt Präzipitat Zellen durch Zentrifugation (500 × g für 5 min, RT).
- Zählen Sie die Zellen vor der letzten Spin.
- Zentrifugieren Sie die Zellen (500 xg für 5 min) und dann den Überstand aspirieren, darauf achten, daß alle Zellen zu entfernen, aber verlassen nicht mehr als 25 & mgr; l des Überstands.
- Bereiten Sie eine 2x Zellsuspension durch Zugabe von 1 ml Diluent C zu dem Zellpellet resuspendieren mit sanften Pipettieren.
- Unmittelbar vor dem Färben, bereiten eine 2x Farbstofflösung (4 x 10-6 M) in Diluent C durch Zugabe von 4 ul der PKH26 Ethanol Farbstofflösung zu 1 ml Diluent C in einem Rohr und gut mischen, um zu dispergieren.
- Schnell die 1 ml 2x Zellsuspension zu 1 ml 2x Farbstofflösung hinzufügen und sofort mischen die Probe durch Pipettieren (Endzelldichte werden 1,2 × 10 7 Zellen / ml und 2 x 10 - 6 M PKH26).
- Inkubieren der Zell / Farbstoffsuspension für 1-5 min.
- Stoppen Sie die Färbung durch Zugabe eines gleichen Volumens (2ml) von 1% BSA-Lösung in HBSS und Inkubation für 1 min.
- Centrifuge Zellen (500 g für 10 min) und entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
- Resuspendieren Zellpellet in 10 ml HBSS und Zentrifuge (500 × g für 5 min).
- Wasche das Zellpellet 2 weitere Male mit 10 ml Komplettmedium zur Entfernung von ungebundenem Farbstoff zu gewährleisten.
- Zellpellet in 10 ml Vollmedium für die Beurteilung der Erholung der Zellen, Zelllebensfähigkeit und der Fluoreszenzintensität. Wenn Zellen für eine Transplantation benötigt, waschen und resuspendieren sie in einer sterilen physiologischen Lösung mit einer Konzentration von 3,3 x 10 5 Zellen / 50 ul.
2. Vorbereitung für die Chirurgie
- Reinigen und desinfizieren Chirurgiegeräte.
- Bereiten Sie den OP-Bereich durch Abwischen mit einem aseptischen Mittel. Richten Sie die IH Impactor Gerät.
- Bereiten Sie die Anästhesiegeräte: Die Aktiv-Gas-Reiniger mit VetScav Filterwägen Gerät, kontinuierlichen Fluss Induktionskammer, Sauerstoff Genetor, Low Flow O 2 Meter für Mäuse. Reinigen Sie die Induktionskammer und die Maske während der Operation eingesetzt.
- Anesthetize Tiere mit 2,5% (v / v) Isofluran in Sauerstoff (1 l / min), und warten Sie 5 Minuten, nachdem der Strominduktion für das Medikament wirksam werden. Überprüfen Sie, ob die Whisker Zucken oder wenn es langsam hinteren Gliedmaßen Rücktritt als Reaktion auf das Einklemmen des Fußballen. Während der Operation reduzieren Isoflurankonzentration bis 2,0% (v / v) Isofluran in Sauerstoff (1 l / min).
3. Herstellung der Mäuse für Chirurgie und Transplantation
- Halten Sie den männlichen Erwachsenen CD1-Mäusen (25-30 g) für mindestens 3 Tage vor den Experimenten in Standardbedingungen (22 ± 2 ° C, 65% Luftfeuchtigkeit und Kunstlicht zwischen 8.00 bis 08.00 Uhr).
HINWEIS: Das gesamte Verfahren von der Vorbereitung bis zur chirurgischen Naht wird etwa 40 Minuten dauern.- Um das Tier zu identifizieren, markieren Sie den Schwanz durch wasserfeste Farbtinte.
- Verwenden Sie einen elektric Klipper, den Rückenhaar der Maus aus dem Hals zu schneiden, etwa bei T2 Ebene, um den Lendenbereich.
- Sterilisieren Sie die vorbereitete Fläche mit einer Jodid-Lösung und Ethanol (70% in sterilem Wasser).
- Behandlung des Tieres mit einer subkutane (sc) Injektion von 200 & mgr; l Gentamycin (1 mg / ml in steriler Kochsalzlösung).
- Bewerben Augen Schmiermittel auf beide Tieraugen, um ein Austrocknen zu verhindern und zu injizieren Buprenorphin (subkutan 0,03 mg / kg), um Schmerzen zu lindern.
4. Laminektomie
- Platzieren Sie die Maus auf einer Folie wärmer, das Problem der Unterkühlung während der Operation zu vermeiden. Positionieren Sie das Tier mit der Rückenseite nach oben.
- Machen Sie einen vertikalen Schnitt mit dem Skalpell in der Region von Interesse, von T7 bis T12.
- Halten Sie die Haut und oberflächliche Fettpolster unter Verwendung von Standardzange (in der Regel in den Raum zwischen dem 5. und 6. Brustrücken Prozesse gefunden).
- Zählen Sie die Verfahren unter dem Behälter als T6dann T7 bewegen.
- Setzen Sie ein wenig Einfluss unter der ventralen Seite der Maus, um die Krümmung der Wirbelsäule zu erhöhen. Immobilisieren, das Rückenmark durch die Blockierung mit den Graefe Pinzette.
- Schneiden Sie die paravertebralen Muskeln bilateral von T7 und T10 Wirbelebene erfolgen, indem das Skalpell, bis der dorsalen Oberfläche der Lamelle in Kontakt mit dem Skalpell Spitze.
- Verwenden Sie das Skalpell abhaken die Kreuzung von T7 bis T10. Stoppen Sie in den Raum zwischen T8 und T9 stacheligen Vorsprünge. Schneiden Sie das Gewebe zwischen T8-T9 und T9-T10 mit den Mikro Schere.
- Verwenden Sie die Rongeur die T9-Prozess zu entfernen. Setzen Sie die Kreuzung durch vorsichtiges Abschaben des Muskelschicht mit den Mikro Schere. Fortfahren, bis Knochen freigelegt wird.
- Verwenden Sie die Pinzette, um Muskeln aus der Lamina zu entfernen, und öffnen Sie einen kleinen Raum zwischen den Wirbeln. Sanft legen Sie die Mikro Schere unter der Knochen, schneiden Sie die Lamelle auf beiden Seiten, und dieser Teil mit einer Pinzette entfernen.
- Entfernen Sie die Lamellen mit dem forceps um das Kabel freizulegen. Achten Sie darauf, dass keine freien oder gezackte Knochensplitter hinter sich lassen; entfernen Sie sie mit dem Rongeur.
- Verwenden Sie die kleine Spitze Pinzette, um die Knochenhaut sowie alle Knochenfragmente oder Muskeln, die in der Nähe der Schnittführung sein kann, zu entfernen.
- Entfernen Sie die obere Hälfte des T9 dorsalen Verfahren und fahren Sie mit dem IH Impactor Geräteprotokoll.
5. IH Impactor Device Protocol (Prellung)
- Platzieren Sie die Maus in die Mitte des Stabilisierungsplattform des IH Impactor Gerät.
- Blockieren Sie das Tier mit den beiden Zahnzange mit der Stabilisierungsplattform durch zwei gemeinsame Positionierung Armen (linker Arm für die Brustwirbel, den rechten Arm für Halswirbel).
- Verwenden Sie die rostral Arm, um die Seitenkante des rostralen Wirbelkörper (T8) zu erfassen.
- Bearbeiten Sie die Schwanz Arm in der gleichen Weise, um den Wirbelkörper T10 erfassen.
- Legen Sie die Stabilisierungsplattform im Gerät und senken Sie die Spitze (Durchmesser 0,75mm) so nahe wie möglich am Kabel, ohne es zu berühren.
- Heben Sie die Spitze drei Umdrehungen vor dem Start der Auswirkungen.
- Führen Sie die Quetschung mit dem Impaktor gesetzt, um eine Kraft von 60 kdyn auf 100 mm / s zu liefern.
6. Nahtmaterial und Post-Pflege
- Nähen Sie den Schnitt mit einem 4/0 resorbierbaren Faden. Decken Sie die freiliegende Rückenmark an der Stelle entfernt Lamina; Naht der Gewebe an den Enden des Schnittes mittels einer kleinen Nadel. Legen Sie die beiden Stiche unmittelbar über und unter der Website des Rückenmarks Exposition.
- Schließen Sie die Haut mit zwei oder drei Reflex Clips ohne Abklemmen der darunter liegenden Muskeln.
- Hydrat der Maus nach der Operation mit 2 ml Kochsalzlösung subkutan in den unteren Rücken gespritzt.
- Platzieren Sie die Maus wieder in einem vorgewärmten Käfig zu Unterkühlung während der chirurgischen Wiederherstellung zu vermeiden. Platz Käfigen auf Heizkissen.
- Überwachen Sie die Mäuse während der akuten Phase nach der Verletzung, indem Sie dieGröße der Blase, das Nahtmaterial und das Tiergewicht zweimal täglich. Drücken Sie vorsichtig Blase (zweimal täglich über 7 Tage), um Harnwege-Infektionen ist (Urin könnten trübe, blutig oder keine Niederschläge enthalten ist) zu vermeiden.
- Saures Mäusen einmal am Tag mit einer Kochsalzlösung-Injektion (2 ml für zwei Tage nach der Operation subkutane Injektion) und Antibiotika (Gentamycin 0,2 ml; sc Injektion) für fünf Tage nach der Verletzung.
- Gönnen Mäuse für die postoperative Analgesie mit Buprenorphin (0,1 mg / kg; zweimal täglich) für 3 Tage nach der Verletzung.
7. Schwanzveneninjektion von Zellen
HINWEIS: In der folgenden Stufe das Verfahren zum Injizieren der Zellen in die Schwanzvene demonstriert. Zellen könnten auch mit einer intraspinalen Transplantation unter Verwendung eines stereotaktischen Rahmen 15-16 verabreicht werden oder in die Cisterna magna 17. Es ist wichtig zu beachten, dass auch andere Zelltypen konnte mit dieser Methode transplantiert werden, wie beispielsweise mesenchymale Stromazellen(ZB Knochenmark mesenchymale Stammzellen aus Fettgewebe abgeleitete Stammzellen, Amnionzellen). Weiterhin können auch andere Behandlungsmöglichkeiten wie Nanopartikel über die Schwanzvene nach der Verletzung des Rückenmarks eingespritzt werden.
- Verwenden 70% Ethanol und PBS, um die Nadel vor Gebrauch zu reinigen. Behandeln Sie die Nadel und Spritze nur mit sterilen Handschuhen.
- Die Zellen in dem Testrohr und der Last 75 ul Zellen in einer 0,3 ml Spritze (29 G Nadel und 0,33 cc Spritze).
- Darauf achten, dass keine Luftblasen in der Zellsuspension vorhanden sind. Die Spritze in eine horizontale Position, um die Zell Sedimentation zu vermeiden.
- Platzieren Sie die Maus unter der Wärmelampe, die Schwanzvenen erweitern.
- Besorgen Sie sich die Maus und ziehen Sie es vorsichtig in die Maus Rainer, um die laterale Schwanzvene als schmale blaue Linie sichtbar zu machen.
- Reinigen Sie den Schwanz mit einem Alkoholtupfer. Nachdem die Vene sichtbar, greifen die Schwanzvene zwischen dem Mittelfinger und Daumen der linken Hand.
- Bringen die Nadel an der Oberfläche in einem Winkel von 15 ° vom Horizont und sicherzustellen, dass die Abschrägung auf.
- Injizieren 50 ul Zellen bei einer Rate von 0,33 l / s an. Nach der Injektion verzögern das Zurückziehen der Nadel um 10 Sek. Kanüle zurückziehen langsam und achten Sie auf den möglichen Austritt von Zellsuspension.
- Reinigen Sie die Spritze wie in Schritt 7.1 von Lasten.
8. Verhaltenstests und Hind Gliedmaßen Funktion
- Platzieren Sie die Maus auf dem freien Feld.
- Bewerten Bewegungsfunktion und hinteren Gliedmaßen Erholung nach Prellung mit der offenen Feldtest nach dem Basso Maus Skala (BMS) 18.
HINWEIS: Neurologische Funktion muss in regelmäßigen Abständen, ab dem 3. Tag nach der Verletzung von 4 Wochen 18 ausgewertet werden.
9. Perfusion
- Am Ende des Versuchszeitraums, zu betäuben Tieren durch intraperitoneale Injektion von Natriumpentobarbital (65 mg / kg). Verwenden Zeh drückt auf evaluate die Anästhesie-Ebene und erst dann anlaufen, Maus reagiert nicht auf die Schmerzreize.
- Zurückhalten, das Tier in Rückenlage auf einer Chirurgie-Ebene.
- Durch die Hülle und Bauchwand direkt unter dem Brustkorb zu schneiden. Trenne die Membran aus der Leber.
- Verwenden Sie die Schere, um die Membran geschnitten, um die Brusthöhle aus.
- Schneiden Sie die Seiten des Brustkorbs, bis die Schlüsselbeine.
- Verwenden Sie die Hämostatika, die Schwertfortsatz Knorpel klemmen und legen Sie die Gefäßklemme über den Kopf.
- Halten Sie das untere Drittel des Herzens auf einem transversalen Ebene mit der Zange. Führen Sie die Nadel in die linke Herzkammer.
- Verwenden Sie eine Gefäßklemme, um das Herz zu klemmen. Dies sichert die Nadel und verhindert Leckagen.
- Verwenden Sie die Schere, um den rechten Vorhof geschnitten.
- Lassen Sie die PBS durch den Tierpumpe (18 ml / min). Pflegen Sie diesen Druck während der Pufferinfusionsdauer (3-4 min; entspricht ca. 70 ml PBS). Fortfahren, bis das Herz ist rein.
- Schalten Sie den Wasserhahn, um die Fixierungsmittel (4% Paraformaldehyd in destilliertem Wasser, 4% PFA) durch die Pumpe zu ermöglichen. Den 4% PFA durch die Tier für ca. 8-10 min (300 ml) zu pumpen. Erhöhe graduell den Druck bis maximal 30 ml / min zu erreichen. Eine gehärtete Leber ist der beste Beweis für eine erfolgreiche Perfusion.
10. Gewebe Erhebung und Verarbeitung, Histologie und Iimmunohistochemistry
- Sezieren Rückenmark von T5 bis L1. Dann nach der Fixierung des Gewebes in 6 ml in 4% PFA (O / N bei 4 ° C).
- Setzen des gleichen Gewebes in einer Lösung mit 30% Saccharose 72 Stunden bei 4 ° C, um cryo schützen und die Bildung von Kristallen während des Einfrierens zu verhindern.
- Schnell frieren Sie das Kabel mit Trockeneis und bewahren Sie sie bei -80 ° C.
- Abschnitt mittels eines Kryostaten mit 15 um Dicke und sammeln Schnitte auf Glasobjektträger und weiterhin für Immunzytochemie.
- Mit 200 ul PBS für je s Spülen AbschnitteLide (3mal; jeweils 5 min, RT).
- Permeabilisieren jede Folie mit 200 ul 10% NGS und 0,2% Triton X-100 in PBS für 1 h bei RT.
- Spülen Abschnitte mit 200 ul PBS für jede Folie (3 mal, jeweils 5 min, RT).
- Blockieren nichtspezifischer Stellen mit 200 ul Blockierungslösung für Schlitten (5% NGS, 0,1% Triton X-100 in PBS) für 30 min (RT).
- Inkubieren Sie jede Folie mit 200 ul primären Antikörpern O / N bei 4 ° C (verdünnte Antikörper in 5% NGS; 0,1% Triton X-100 in PBS).
- Auswaschbereiche mit 200 ul PBS für jede Folie (3mal; jeweils 5 min; RT).
- Inkubieren mit einem geeigneten sekundären Antikörper für 2 Stunden bei RT.
- Auswaschbereiche mit 200 ul PBS für jede Folie (3mal; jeweils 5 min; RT).
- Stain Kerne mit 200 ul 4 ', 6-diamidin-2-phenilindole (DAPI) (1 ug / ml Endkonzentration, 10 min bei RT).
- Montieren Sie mit der FluorSave Reagenz und durch konfokale Mikroskopie analysiert.
HINWEIS:Steuerbestimmungen, primären Antikörpern muss weggelassen und mit äquivalenten Konzentrationen von nicht verwandten IgG derselben Unterklasse ersetzt werden. Mikrotubuli-assoziierten Protein 2 primären Antikörper verwendet.
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Representative Results
Die Gesamtzahl der transplantierten Zellen ist 1 x 10 6 Zellen wurde in drei aufeinanderfolgende Injektionen in die Schwanzvene unterteilt. Wir verabreichten 3,3 x 10 5 Zellen in 50 & mgr; l Phosphatpufferlösung (PBS). Die erste Injektion wurde innerhalb von 30 Minuten nach der Verletzung der zweite 6 Stunden später wurde die letzten 18 Stunden nach der Verletzung durchgeführt werden, und. Die Wahl einer Frist von 18 Stunden nach der SCI für das Verabreichen PM-NPC wurde durch die optimale Durchlässigkeit der Bluthirnschranke zu diesem Zeitpunkt 14 bestimmt. Um die Wirkung von Stammzellen Injektions auszuwerten wäre es nützlich sein, positive Kontrolle Laminektomien Tiere (n = 14) und PBS als Negativkontrolle (n = 14) injizierten Tieren.
PM-NPCs verbessern Rückgewinnung von Hind Gliedmaßen Funktion, wandern Läsion und differenzieren in MAP-2-positiven Zellen
Die T9 Prellung verursachte den vorübergehenden Verlust des hinteren Gliedmaßen Funktion gefolgt von einer fortschreitenden gradual Recovery (Abbildung 1). Innerhalb von 2-3 Wochen, verbessert PBS-behandelten verletzten Mäusen und Hintergliedmaße Funktion 3 Punkte von BMS (entsprechend plantar Platzierung der Pfote mit oder ohne Gewichtsentlastung oder gelegentlich, häufig oder konsequente Rückenschritt, aber nicht plantar Schritt 18) erreicht . Stattdessen im gleichen Beobachtungszeitraum, verletzt Mäuse mit PM-NPCs behandelt wurden, zeigten eine höhere Rückgewinnung und erreichte 4,5 Punkte von BMS (entsprechend häufiges oder konsequente plantar Schritt ohne Koordination oder häufige oder konsequente plantar Schritt mit etwas Koordination). Der Verhaltens Verbesserung war in der Zeit zwischen Tag 7 und Tag 14 nach der SCI besonders deutlich. Keine Anzeichen von Allodynie artigen Vorderbein erhöhte Empfindlichkeit 19 wurden zu jeder Zeit in jeder Versuchsgruppe in der gesamten Beobachtungsdauer von 30 Tagen aufgezeichnet.
Die meisten transplantierten PM-NSC, mit PKH26 (Figur 2) bezeichnet, an den Kanten der akkumulierteLäsion Bildung von Clustern (Abbildung 3) aus der Frühzeit der Verwaltung. Dann wurden die transplantierten Zellen entlang der Läsion Kanten und in einer diffusen Art und Weise, wenn sie differenziert allmählich vorausgesetzt die asymmetrische Zell Konformation Neuronen migriert. An 30 Tage nach Läsion und Transplantation, der Zellkörper der PM-NPCS erhöht in Größe und in den meisten Zellen dendritische ähnlichen Prozessen lagen auf der Hand und voll von den spezifischen Antikörpern immun auf (Abbildung 4)-2 KARTE. Das Erreichen der morphologischen Komplexität und die Positivität MAP2 von transplantierten PM-NSC wahrscheinlich wegen Fusion mit lebenden Wirtsrückenmarksneuronen, die in ihrer klar differenzierte Morphologie und der Abwesenheit von beiden Kerne in einem einzelnen markierten Zell ersichtlich ist.
Abbildung 1. PM-NPCs verbessern Funktions RECOVery in verletzte Tiere. Der offene Bereich Fortbewegung war die für die Bestimmung der motorischen Funktion Recovery 18 eingesetzten Test. Die Tiere wurden am Tag vor der Quetschung getestet und erzielte 9 Punkte in der BMS-Skala. Am ersten Tag nach der Verletzung in den lädierten Tieren verringerte sich die BMS-Score auf Null. Die Erholung der Hintergliedmaße Funktion der verletzten Mäuse zeigten eine bemerkenswerte und lang anhaltende Verbesserung, wenn Tiere mit PM-NPCs behandelt. Die Analyse wurde in doppelblind durchgeführt wird, und jede Gruppe bestand aus 14 Tieren zusammen. Die Werte stellen Mittelwert ± SEM. Wir stellten fest, die statistischen Unterschiede mit Hilfe von ANOVA-Test, gefolgt von Tukey-post-Prüfung. *** P <0,001; ** P <0,01 vs PBS.
Abbildung 2. PKH26 Kennzeichnung von PM-NPCs. Nach dem Markierungsverfahren mit PKH26, PMNPCS sind visu mit dem Live-Bild Mikroskop sierte EVOS fl und Mikrofotografie wurde mit dem gleichen Instrument (Maßstab = 50 um) übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. Lokalisierung von PM-NSC in der Läsionsstelle. PKH26-markierten PM-NSC (rot) sind in den Rändern der Läsionsstelle bei 30 Tagen nach intravenöser Injektion anwesend. Die Abbildung steht stellvertretend für 1 Maus, aber ähnliche Bilder wurden für mindestens 5 Tieren (Maßstab = 50 um) erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Abbildung 4. MAP2-Expression in transplantierten PM-NPCs. Die meisten PKH26 markierten PM-NPCs (rot) erwarb neuronale ähnliche Form mit dendritischen artigen Prozesse und hatte MAP-2-positiven Zellen (grün) differenziert. Die Zellkerne sind blau (DAPI) gefärbt. Die Abbildung steht stellvertretend für 1 Maus, aber ähnliche Bilder wurden für mindestens 5 Tieren (Maßstab = 25 um) erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Discussion
In diesem Papier haben wir eine Methode, um ein reproduzierbares Modell der traumatischen Rückenmarksverletzungen erhalten, mit einem unendlichen Horizont Impactor bei einer Kraft von 70 Kdyne (schwere). Mit einer größeren Kraft Paradigma (80 Kdyne), können wir eine schwere Verletzung, die leider mit höheren Mäuse Mortalität führen. Um dieses Problem zu vermeiden, wählen wir im Allgemeinen eine moderate Kraft Paradigma (70 Kdyne), die auf eine wiederholbare Läsion mit einer allmählichen Erholung der Funktion und eine geringere Sterblichkeit verbunden ist. Um eine solche stabile Verletzungen ist es sehr wichtig, besonders auf die korrekte Fixierung des Tiers auf der Impaktor Plattform bezahlen zu erzeugen; insbesondere das Rückenmark sind am Impaktor Spitze zentriert werden, und die beiden Teile der Schlagkörper ist parallel zueinander sein. Außerdem muss die Aufmerksamkeit bei der Blockierung des Tieres mit den Impaktor Pinzette, als die Wirbelkörper eingeklemmt werden und das Kabel kann durch die Spitzen der Zange beschädigt genommen werden. Die Positionierung der animal nach der Laminektomie ist kritisch, und die Behandlung der Tiere während dieser Prozedur ist auch sehr wichtig. Besondere Aufmerksamkeit muss auch der Laminektomie Verfahren, die stets an der gleichen Stelle und die gleiche Ausdehnung durchgeführt werden muss angegeben werden. Wenn diese Verfahren während der Laminektomie durchgeführt werden, ist eine weitere methodische Frage zur Überwachung der Verringerung der Gefahr einer Beschädigung der Kabel bei der Verwendung von Mikro-Schere, Rongeur oder Pinzette Knochen geschnitten und befreien Sie das Kabel durch die Entfernung der Lamina, um die Beseitigung verbleibenden seitlichen Knochenvorsprünge und Fragmente, und die Knochenhaut zu entfernen. Der Einsatz von Mikro-Schere und Rongeur mit Spitzen nach oben wird das Risiko von Begegnung mit den zuvor genannten Probleme zu verringern.
Eine wichtige Einschränkung dieser Methode ist die hohe Wahrscheinlichkeit, dass die Tiere möglicherweise interne und externe schweren Infektionen der Harnwege in der Post Verletzungen Zeitraum zu entwickeln. Aufgrund der Unfähigkeit der läsionierten Mäusen mo die externe Infektion istve mit Hinterbein Gewichtsentlastung. Im Gegensatz dazu kann der interne Harnwegsinfektion durch die Unfähigkeit der verletzten Mäuse unabhängig urinieren verursacht werden. Um diese Probleme ist es unbedingt erforderlich, die Tiere mit dem angegebenen Antibiotika injizieren zu vermeiden und um die Größe der Blase zweimal am Tag während der Tierpflegeverfahren der ersten Woche. Der Flüssigkeitsstatus und das Gewicht muss während der ersten drei Wochen nach der Läsion genau zu prüfen.
Die Anwendung der beschriebenen Verfahren konnten wir reproduzierbare Defizite der Hintergliedmaße Funktion, die durch eine spezifische Verhaltenstest von Basso und Kollegen (BMS) 18 entwickelt bewertet wurden erhalten. Unmittelbar nach der Verletzung der Hintergliedmaße der Funktionsverlust abgeschlossen ist, was durch eine allmähliche Erholung, die in den ersten 2-3 Wochen wichtigsten ist, gefolgt wird. Der Verhaltensbesserung erreicht ein höheres Niveau bei verletzten Mäuse wurden mit erwachsenen PM-NPCs (Abbildung 1 behandelt (Abbildung 3). Wir schätzten, dass die Gesamtzahl der lebenswichtigen gepfropft PM-NPCs größer als die gepfropft WSR und Erwachsenen NSCs wie zuvor von unserer Arbeitsgruppe 20-21 berichtet wird. An vier Wochen nach Läsion und Transplantation, haben die meisten PM-NPCs größere Körper und besitzen erweiterte dendritischen ähnliche Prozesse, die in vollem Umfang von den spezifischen Antikörpern immun werden (Abbildung 4)-2 KARTE.
Der große Vorteil dieses Modells von traumatischen Verletzungen des Rückenmarks ist die Standardisierung der Verletzung. Eine reproduzierbare zeitlichen Verlauf der hinteren Gliedmaßen Wiederherstellung der Funktion wird auch erreicht. Solche Reproduzierbarkeit ermöglicht es, Proof-of-Principle-Studien für die untersuchten Behandlungen einschließlich Transplantation von Zellen für die regenerative Medizin studie definierens mit einer reduzierten Anzahl von Fällen. Zusätzlich können verschiedene Aspekte der Pathophysiologie von Verletzungen des Rückenmarks im Detail analysiert werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, keinen Wettbewerb finanzielles Interesse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PKH26GL-1KT | Sigma | 091M0973 | |
| Infinite horizon (IH) Impactor device | Precision Systems and Instrumentation, LLC | Model 0400 Serial 0171 | |
| Gentamycin 10 mg/ml | Euroclone | ECM0011B | 1 mg/ml in sterile saline solution |
| Isoflurane-Vet 250 ml | Merial | B142J12A | |
| Blefarolin POM OFT 10 g | |||
| Slide Warmer | 2Biological Instruments | HB101-sm-402 | |
| Scalpel, size 10 | Lance Paragon | 26920 | |
| Small Graefe Forceps | 2Biological Instruments | 11023-14 | |
| Rongeur | Medicon Instruments | 07 60 07 | |
| Micro scissors | 2Biological Instruments | 15000-00 | |
| Absorbable sutures (4/0) | Safil Quick | C0046203 | |
| Hemostat | 2Biological Instruments | 13014-14 | |
| Reflex 7 wound clip applicator | 2Biological Instruments | 12031-07 | |
| 7 mm Reflex wound clips | 2Biological Instruments | 12032-07 | |
| NGS | Euroclone | ECS0200D | |
| Triton X 100 | Merck Millipore | 1086431000 | |
| Anti Microtubule Assocoated Protein (MAP) 2 | Millipore | AB5622 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | |
| FluorSave Reagent | Calbiochem | 345789 | |
| Neural stem cells medium | DMEM-F12 medium (Euroclone) containing 2 mm l-glutamine (Euroclone), 0.6% glucose (Sigma-Aldrich), 9.6 gm/ml putrescine (Sigma-Aldrich), 6.3 ng/ml progesterone (Sigma-Aldrich), 5.2 ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich), 0.025 mg/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.1 mg/ml transferrin (Sigma-Aldrich), and 2 μg/ml heparin (sodium salt, grade II; Sigma-Aldrich), bFGF (human recombinant, 10 ng/ml; Life Technologies) and EGF (human recombinant, 20 ng/ml; Life Technologies) | ||
| DMEM-F12 | Euroclone | ASM5002 | |
| l-glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| putrescine | Sigma-Aldrich | P5780-25G | |
| progesterone | Sigma-Aldrich | P6149-1MG | |
| Sodium-selenite | Sigma-Aldrich | S9133-1MG | |
| transferrin | Sigma-Aldrich | T 5391 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | |
| Heparin sodium-salt | Sigma-Aldrich | H0200000 | |
| bFGF | Life Technology | PHG0024 | |
| h-EGF | Life Technology | PHG6045 | |
| Syringe 0.33 cc 29 G | Terumo | MYJECTOR | |
| buprenorphine | Schering Plough SpA | TEMGESIC | |
| eye gel | Bausch & Lomb | LIPOSIC |
References
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