Abstract
يمكن أن تتولد من صنع الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs) مع منهجيات إعادة برمجة القائم على lentiviral. ومع ذلك، آثار الجينات يحتمل أنكجنيك المتبقية في مناطق كتب بنشاط من الجينوم، والحد من قدرتها على استخدامها في التطبيقات العلاجية الإنسان 1. بالإضافة إلى ذلك، مستضدات غير البشرية المستمدة من إعادة برمجة الخلايا الجذعية أو التمايز في المشتقات ذات الصلة علاجية تمنع هذه hiPSCs من أن تستخدم في سياق السريري الإنسان 2. في هذا الفيديو، نقدم إجراء لإعادة برمجة وتحليل hiPSCs خالية من عامل خال من الجينات المحورة الخارجية. هذه hiPSCs ثم يمكن تحليلها للشذوذ التعبير الجيني في إنترون المتضمنة لالفيروسة البطيئة. يمكن إجراء هذا التحليل باستخدام حساس البلمرة الكمية التفاعل (PCR)، والتي لديها ميزة على أقل التقنيات الحساسة المستخدمة سابقا للكشف عن الخلافات التعبير الجيني 3. تحويل كامل فيالسريرية الصف الممارسات التصنيعية الجيدة (GMP) الشروط، تسمح أهمية سريرية الإنسان. يوفر بروتوكول لدينا أن معايير آمنة-الميناء الحالية سوف توسع وتشمل السمات التي تميزت المشتقات المالية القائمة hiPSC خالية من عامل للتطبيقات العلاجية لالبشرية الناجمة hiPSCs GMP الصف، والتي ينبغي القضاء على أي خطر المناعية نتيجة لمستضدات غير البشرية المقدمة منهجية أخرى. هذا البروتوكول هو الواجب التطبيق على نطاق واسع لlentiviral برمجتها خلايا من أي نوع، ويوفر طريقة استنساخه لتحويل الخلايا المعاد برمجتها في الظروف GMP الصف.
Protocol
ملاحظة: وقد استخدم هذا الأسلوب في البحث عنها في الرهبة وآخرون 10.
1. إعادة برمجة الخلايا الليفية الجلدية الكبار الإنسان مع STEMCCA
- الخلايا الليفية الجلدية ذوبان الجليد الكبار الإنسان (HUFs)، مرور 4 أو أقل، في 37 ° C حمام الماء لمدة 2 دقيقة، مع الحرص على عدم غمر رأس القنينة بالماء.
- وضع الطين 1 مل من الخلايا الليفية الإنسان في قارورة 15 مل المخروطية ومكان ببطء 4 مل من معيار وسائل الإعلام HUF، تسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية، بطريقة الإفلات من الحكمة، لتخفيف من سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) و إعادة تعليق الخلايا.
- أجهزة الطرد المركزي القارورة في 200 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نضح طاف واعادة تعليق الخلايا في حجم كاف من وسائل الاعلام لخلق تعليق 100،000 خلية / مل ثم قم بإضافة 2 مل في بئر واحدة من لوحة ستة جيدا، قبل المغلفة لمدة 20 دقيقة مع 0.2٪ الجيلاتين.
ملاحظة: أخت جيدا مع عدد متساو من الخلايا في كل سطر وحالة تحتاج إلى المصنف FOص عد خلية / وافر من العدوى (وزارة الداخلية) الحساب. - صخرة الجانب لوحة إلى جنب وذهابا وإيابا لتوزيعها بالتساوي الخلايا. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 في حاضنة مرطب.
- في يوم تنبيغ، الحصول على عدد خلايا (ق) من شقيقة جيدا (ق) ما يقرب من 24 ساعة بعد الطلاء HUF الأولي.
- ذوبان الجليد من 2 × 10 8 TU، أو ما يعادلها، والتركيز lentiviral (STEMCCA) وتمييع إلى 1 × 10 8 TU / مل في HUF سائل الإعلام.
- تنبيغ الخلايا في نسبة 10-MOI في HUF سائل الإعلام تستكمل مع 8 ميكروغرام / مل وكيل ترنسفكأيشن. مزيج الآبار transduced بالتساوي واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 في حاضنة مرطب.
- ما يقرب من 24 ساعة بعد تنبيغ lentiviral، والتبديل وسائل الإعلام HUF لمعيار الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (PSC) متوسطة.
- في أيام من 2 إلى 6، وتغيير وسائل الاعلام يوميا مع المتوسطة PSC البشري.
- في يوم 6، لوحة اثنين من 0.2٪ الجيلاتين المغلفة لوحات 10 سم، من1،5 حتي 1،75 × 10 6 MEFS المستمدة من CF1 الفئران في HUF سائل الإعلام 12.
- في يوم 7، والحرص على عدم الطرد المركزي أكثر من 100 x ج، واستخدام درجة حرارة الغرفة التربسين لرفع قبالة يوم 7 الليفية برمجتها من بئر واحدة من لوحة ستة جيدا والمرور بنسبة 01:16، عن طريق الطلاء بالتساوي بين جميع الخلايا كل منهما 10 سم لوحات، مع وسائل الإعلام PSC البشري الطازج، والتي تم مطلي مع MEFS في اليوم السابق. توزيع المجاميع خلية في حركة لولبية في اتجاه عقارب الساعة والمكان في 37 ° C، 5٪ CO 2 مرطب حاضنة بين عشية وضحاها.
- ما يقرب من 48 ساعة بعد البذر الخلايا المعاد برمجتها على MEFS وكل يوم بعد ذلك، تغير من وسائل الإعلام PSC الإنسان الذي يقضيه مع وسائل الإعلام الجديدة.
- بعد 3 إلى 4 أسابيع، واختيار المستعمرات الفردية مع نموذجي ESC مثل التشكل مع إبرة عيار 21 وsubclone للخروج الى لوحة 24-جيدا من خلال وضع ما يقرب من 8 إلى 10 القطع الفردية من المستعمرات محددة في الآبار الفردية في 0.2٪ الجيلاتين المغلفة 24 لوحة جيدا قبل البذورإد مع MEFS المستمدة من الفئران CF1 في المتوسط PSC البشري.
ملاحظة: بعد توسيع المستعمرات اختار، المستعمرات لا بد من وصفها بأنها المحفزة من قبل تشكيل هيئة مضغي الشكل وتحليل التعبير عن علامات تعدد القدرات على مستوى البروتين.
2. ناقل التكامل تحليل الموقع وSTEMCCA الختان
- تحليل الموقع التكامل STEMCCA من قبل غير المقيدة التضخيم الخطية PCR كما هو موضح 10.
- بعد معايرة لضمان التكامل واحد في المنطقة المرغوب فيه من الجينوم، المكوس STEMCCA بواسطة الشفط من العمر المتوسط ESC البشري. ثم، والجمع بين 45 ميكرولتر من المركز فيروس الغدة-لجنة المساواة العرقية-PuroR مع 8 ميكروغرام / مل وكيل ترنسفكأيشن في 3 مل من وسائل الإعلام PSC القياسية لمدة 24 ساعة.
- بعد فترة حضانة المرض على مدار 24 ساعة، ونضح قبالة طاف الفيروسي المختلط وغسل الخلايا مرتين مع وسائل الإعلام PSC الإنسان. وضع وسائل الإعلام PSC الإنسان الطازجة مع 2 ميكروغرام / مل بوروميسين لمدة 5 أيام، وتغيير وسائل الإعلام الطرافة اليوميةح وسائل الإعلام الجديدة والمضادات الحيوية.
- بعد 5 أيام، subclone المتبقية المستعمرات مع إبرة عيار 21 على 0.2٪ الآبار المغلفة الجيلاتين، في لوحة 12-جيدا قبل المغلفة مع MEFS المستمدة من CF1mice وتوسيع كما هو مفصل أعلاه.
ملاحظة: بعد التوسع كافيا للحصول على الأسهم المجمدة، مطلوب تحويلها إلى ظروف خالية من وحدة التغذية. نتوقع 95٪ على الأقل الموت مستعمرة الخلايا الجذعية حيث أن معظم خلايا لن transduced بنجاح وسوف تستسلم للمضادات الحيوية خلال فترة 5 أيام من الحضانة. على الرغم من أن الغدة-لجنة المساواة العرقية-PuroR يدمج في كفاءة ،001-1٪ في الكروموسومات مجموعة من الخلايا المصابة، reexposing عينة من المستعمرات خالية من عامل إلى بوروميسين لضمان موت الخلايا 100٪ سيؤكد لم يحدث أي دمج 13. - ذوبان الجليد من قنينة واحدة من قبل aliquoted مصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد، على مدى فترة من حوالي 2 ساعة (توصيات الشركة الصانعة) حتى المصفوفة هي السائلة وتمييع إلى تركيز النهائي 1:30 في وسائل الإعلام القاعدية البارد. شركةفي العدد المرغوب فيه من الآبار في لوحة ستة جيدا مع 1 مل لكل بئر. ترك الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- عبر الفتحة (باستخدام إبرة عيار 18 أو الزجاج أو البلاستيك "طرف") لا يقل عن 20 إلى 30 المستعمرات من بئر المغلفة سابقا مع MEFS. كن حذرا للحد من MEF رفع ونقل من لوحة.
- توليد الجهاز عبر الفقس من خلال عدد من الأساليب المختلفة، من التدفئة أكثر تعقيدا، وسحب، والانتهاء من ماصة باستير الزجاج على لهب مكشوف، إلى الاستخدام البسيط للمعقم طرف ماصة بلاستيكية أو، كما في حالتنا، 21- و / أو 18 عيار الإبر.
- نضح مصفوفة من المغلفة جيدا بعد الحضانة.
- إزالة قطعة من المستعمرات عن طريق كشط لطيف من لوحة قديمة مع pipettor 200 ميكرولتر ووضعها بعناية إلى 3 مل من وسائل الإعلام مجتمعة جديدة 1 في لوحة المغلفة المصفوفة. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 حاضنة مرطب. تغيير وسائل الإعلام 48 ساعة بعد الركض.
- استخراج الحمض النووي الجيني من hiPSCs تحويله بعد رفعه وخالية من وحدة التغذية، في أكثر من 80٪ confluency، وذلك باستخدام مجموعات استخراج الحمض النووي التجاري.
- تحليل لالختان السليم مع الاشعال محددة لالتكامل الخارجية من الفيروسة البطيئة STEMCCA: gDNA-hendo-MycS إلى الأمام، 5'-acgagcacaagctcacctct-3 '؛ gDNA-hWPRE للعكس، 5'-tcagcaaacacagtgcacacc-3 ". إعادة الاشعال مجفف بالتجميد بالماء PCR الصف إلى حل الأسهم 10 ميكرومتر.
- تشغيل PCR مع بروتوكول خمس خطوات التالية: تمسخ الأولي في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. 35 دورات من كل مما يلي: تمسخ في 98 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، والصلب التمهيدي في 62 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، والإرشاد عند 72 درجة مئوية لمدة 15 ثانية؛ تليها دورة التمديد النهائي واحد في 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
- جعل 3٪ هلام الاغاروز وزنها عن طريق 1.5 غرام من الاغاروز ووضعه في 50 مل 1X تريس، خلات-EDTA العازلة. يذوب الميكروويف حتى الاغاروز ومكان في هلام DNA وصمة عار في صروبر تخفيف المزيج، والاستغناء الحجم المناسب في هلام كاسيت لترسيخ لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- تحميل 12 ميكرولتر من الناتج PCR مختلطة مع 3 ميكرولتر من صبغ تحميل إلى 3٪ agarose هلام. تشغيل هلام لمدة 30 دقيقة في 80 V.
- تصور مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية لعدم وجود الفرقة تشير الختان الصحيح.
3. الكميات من الاختلافات التعبير الجيني باستخدام PCR الكمي من قبل وhiPSCs المشاركة رفعه-
- استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من hiPSCs تحويله بعد رفعه وخالية من وحدة التغذية باستخدام مجموعات استخراج الحمض النووي الريبي التجارية.
- عكس نسخ تصل إلى 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام مجموعات التجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استخدام الراسية-بنسبة ضئيلة (DT) 18 والاشعال مسدوس عشوائية.
ملاحظة: تأكد من أن بروتوكول PCR تم تصميم لنسخ الجينات في أكثر من أو أقل من 4 كيلو بايت. سوف تحتاج إلى أن تكون لأنني أيهما الجين STEMCCA متكاملة أصلا الاشعال محددةn ل. - إعادة تشكيل التمهيدي مجفف بالتجميد بالماء PCR الصف إلى حل الأسهم 20 ميكرومتر.
- استخدام 5 نانوغرام من عينة في 20 ميكرولتر من رد الفعل الذي يتكون من 10 ميكرومتر UPL التحقيق، 2X LightCycler 480 المسابر ماستر، و 20 ميكرومتر إلى الأمام وعكس الاشعال.
4. شروط التحويل إلى GMP الصف
- في اليوم الأول من الانتقال للhiPSCs بعد رفعه لأكثر من الشروط GMP الصف، وجعل مزيج من وسائل الاعلام التي تتكون من PSC الإنسان جنبا إلى جنب وسائل الإعلام 1 (وسائل الإعلام مجتمعة 1) والصف السريرية الممارسات التصنيعية الجيدة (GMP) وسائل الاعلام المتوافقة (وسائل الإعلام مجتمعة 2 ) في نسبة 80:20.
- نضح قبالة وسائل الإعلام مجتمعة القديمة (1) ووضع 3 مل من وسائل الإعلام مجتمعة الجديدة 1 و 2، قبل تحسنت، في نسبة 80:20. تغيير وسائل الإعلام يوميا لمدة 3 أيام مع هذه النسبة محددة. خلايا المكان مرة أخرى إلى 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة.
- في يوم 4، وجعل وسائل الإعلام مجتمعة 1 و 2 في نسبة 50:50. نضح قبالة المتوسطة من العمر وreplacالبريد مع وسائل الإعلام استعد مسبقا، مع وسائل الإعلام مجتمعة 1 و 2 في نسبة 50:50. تغيير وسائل الإعلام لمدة 3 أيام مع هذه النسبة محددة. خلايا المكان مرة أخرى إلى 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة.
- في يوم 7، وجعل وسائل الإعلام مجتمعة 1 و 2 في نسبة 20:80. نضح قبالة المتوسطة القديمة واستبدالها مع وسائل الاعلام قبل تحسنت، مع وسائل الإعلام مجتمعة 1 و 2 في نسبة 20:80. تغيير وسائل الإعلام لمدة 3 أيام مع هذه النسبة محددة. خلايا المكان مرة أخرى إلى 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة.
- في يوم 10، وجعل وسائل الإعلام مجتمعة 1 و 2 في 0: نسبة 100. نضح قبالة المتوسطة القديمة واستبدالها مع وسائل الإعلام استعد مسبقا، مع وسائل الإعلام مجتمعة 1 و 2 في 0: نسبة 100. تغيير وسائل الاعلام كل يوم في هذه النسبة محددة. الخلايا هي الآن في تعريف تماما خالية من كره وسائل الإعلام. خلايا المكان مرة أخرى إلى 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة.
ملاحظة: أثناء هذه العملية تحويل بأكملها، وهناك حاجة الركض روتيني مع إبرة عيار 18 للحفاظ على حجم مستعمرة السليم والكثافة. الخطة على صassaging خلايا كل 4 إلى 5 أيام على أساس حجم مستعمرة، confluency، والتمايز. - طبقة واحدة بشكل جيد في لوحة ستة جيدا مع خالية من كره الركيزة محددة على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة.
- مرور ميكانيكيا ومتموجة بشكل جيد، وتحويلها بالفعل إلى خالية من كره الظروف وسائل الإعلام، من لوحة ستة جيدا مع إبرة عيار 18. الأهم من ذلك، وضع وسائل الإعلام الجديدة (وسائل الإعلام مجتمعة 2) على الخلايا مع 1X ROCK المانع لمدة 1 ساعة، قبل الركض إلى ما قبل حالة وسائل الإعلام.
- نضح الركيزة حل الاصطناعية قبالة لوحة جديدة أن الخلايا يتم نقله إلى. إزالة كافة وسائل الإعلام التي تحتوي على كتل الخلايا الجذعية من لوحة قديمة ونقلها إلى لوحة جديدة.
- خلايا المكان مرة أخرى إلى 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 حاضنة لأيام 2 مع الحد الأدنى من اضطراب البدني (مثالي لوحات، ومرة واحدة داخل الحاضنة، لا يتم لمسها بشكل مباشر في أي وسيلة) للسماح أقصى المرفق.
ملاحظة: سوف الخلايا تتطلب تغييرات وسائل الإعلام اليومية. passagin المستمرغرام كل 4 أيام ستكون مهمة. باستخدام إبرة عيار 21، والمرور فقط أجزاء من المستعمرات مع الأمثل ESC مثل التشكل (نسبة نووي هيولي عالية). وهذا يضمن اختيار المستعمرات hiPSC المناسبة التي سوف تنمو بشكل جيد وتسفر في نهاية المطاف المستعمرات متجانسة. الوقت الكلي لاشتقاق ESC مثل المستعمرات ما بين 15-20 يوما بعد التغيير سائل الإعلام الموحد الأولي. - تجميد أسفل-رفعه آخر hiPSCs GMP من الدرجة الأولى من قبل عبر فتحة كل من المستعمرات باستخدام إبرة عيار 18. رفع جميع القطع قبالة باستخدام 200 ميكرولتر pipettor ونقل جميع وسائل الإعلام التي تحتوي على الخلايا إلى 15 مل قارورة المخروطية والطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- في حين أن الخلايا الطرد المركزي، وجعل وسائل الإعلام تجميد تتكون من أحجام متساوية من وسائل الإعلام مجتمعة الباردة 2 وتجميد المتوسطة مع تركيز DMSO النهائية من 7.5٪.
- بعد أن يتم مكعبات الخلايا، ونضح قبالة المتوسطة من العمر وإسقاط الحكيم إعادة تعليق بيليه مع وسائل الإعلام التجميد. TR فوراansfer إلى قارورة تجميد وضعت في الفريزر -80 درجة مئوية.
5. hiPSCs تميز GMP الصف مشاركة ورفعه-
- لضمان التعبير السليم للعلامات تعدد القدرات بعد التحويل، استخدم QPCR لقياس التعبير عن علامات تعدد القدرات الرئيسية (SOX2، OCT4، وNANOG) باستخدام الاشعال المدرجة في الجدول 1 مع نفس الخطوات المذكورة في الخطوة 3. منهجيات QPCR اتبع نفس الخطوات كما هو موضح في الخطوة 3.
- استخدام تدفق الخلوي للكشف عن حمض غير البشرية اللعابي Neu5Gc (N حمض -glycolylneuraminic) وفقا للشروط القياسية المدرجة في المجموعة كما نشرت سابقا 10.
- غسل بلطف لوحات ثقافة الخلية مع الخلايا باستخدام 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
- فصل المستعمرات باستخدام 1X التفكك كاشف لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- خلال فترة حضانة 5 دقائق من الخطوة 5.4، وإعداد عرقلة الحل (المنصوص عليها فيطقم) بجعل 0.5٪ حجب الوكيل في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة.
- تسمية المجموعة التالية من الأنابيب لتحليل التدفق الخلوي: غير ملوثين. 4 "، 6-Diamidino-2-phenylindole (دابي) دابي. السيطرة الضد 1: 200. الأجسام المضادة الأولية 1: 200. الأجسام المضادة الثانوية 1: 200 حمار مكافحة الدجاج مفتش (H + L)؛ عينة MEFS. الخلايا بعد رفعه عينة على مصفوفة. وعينة الخلايا على الركيزة الاصطناعية آخر رفعه.
- طرد بلطف المجاميع خلية من الخطوة 5.4 بإضافة 2 مل من حجب محتويات حل، ونقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل. الطرد المركزي في 80 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- غسل الخلايا مرتين مع عرقلة الحل وأجهزة الطرد المركزي كما جاء في الخطوة 5.7.
- بلطف اعادة تعليق حوالي 1 × 10 6 الخلايا في 100 ميكرولتر من عرقلة الحل مع حجم التخفيف المقابلة من كل الأجسام المضادة. احتضان مع هزاز لطيف في 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
- كرر يغسل ثلاث مرات كما في الخطوة 5.8.
- اعادة تعليق بيليه خلية في 400 ميكرولتر من مخفف بوffer (من مجموعة) مع 1: 100 من دابي لأنابيب 2 و 6 و 7 و 8 على النحو الوارد ضمن الخطوة 5.6.
- خلايا سلالة من خلال مصفاة 40 ميكرومتر وتعمل من خلال تدفق عداد الكريات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نقدم بروتوكول لاشتقاق السريري الصف خالية من عامل hiPSCs باستخدام نهج إعادة برمجة تستند lentiviral-STEMCCA. ويبين الشكل 1A صورة تمثيلية من ثلاثة خطوط رفعه قبل مختلف hiPSC، بعد إعادة برمجة مع اقتراب STEMCCA على طبقة من MEFS. والميزة الرئيسية لهذا النهج إعادة برمجة STEMCCA تكمن في نجاح إعادة برمجة يتفق علماء متعددة تحقيقه، في مجموعات بحثية مختلفة ومواقع. 1B الشكل يعرض بعد الختان للعكس النسخ-PCR هلام، والتي تبين subclone معين واحد (2.3) وهو خال تماما من الفيروسة البطيئة STEMCCA، كما يدل على ذلك عدم وجود الفرقة amplicon محدد لتسلسل معين الذاتية لSTEMCCA. 2A الشكل يظهر hiPSCs تحويلها قبل على كره تحتوي على مصفوفة ورفعه بعد انتهاء خالية من كره hiPSCs GMP الصف على مصفوفة الاصطناعية . الكميات من العوامل المرتبطة تعدد القدرات القياسية (SOX2، OCT4، وNANOG) باستخدام QPCR هو موضح في الشكل 2B. تم اختبار hiPSCs قبل، وقد تم تحويله وبعد تحويلها إلى الظروف GMP الصف من خلال التدفق الخلوي لالحامض اللعابي حمض N-glycolylneuraminic، يدل على مستضدات غير البشرية، كما هو مبين في الشكل 2C.
الشكل 1: التمثيلية البشرية المحفزة كاسيت الخلايا الجذعية (hSTEMCCA) -derived البشرية الناجمة عن الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSC) خطوط. (A) وقد تم تحليل جميع الخطوط الثلاثة المستمدة مع التكنولوجيا nrLAM-PCR وعثر فقط على خط عرض C8 أن يكون التكامل واحد في الجين PRPF39. فقط هذا الخط، بسبب آمن التكامل STEMCCA intronic تم اختيار، للخضوع لاختيار الغدة-لجنة المساواة العرقية-PuroR عن الختان لجنة المساواة العرقية بوساطة. (ب) الغدة-لجنة المساواة العرقية بوساطة STEMCCA الختان خارج خط C8. Pوجدت rimers ضد تسلسل النوكليوتيدات فريدة من نوعها وجدت في STEMCCA-إندو. Myc على-S و A-WPRE- أن subclone واحد فقط (2.3 آخر رفعه-iPSCs) تم رفعه وخالية من عوامل النسخ المعدلة وراثيا من طليعة الفيروس متكاملة بشكل صحيح. الحانات = 100 ميكرون. لقد تم تعديل هذا الرقم من الرهبة وآخرون. 10.
الشكل 2: تحويل hiPSCs من الصف GMP الظروف خالية من كره السريرية وتوصيف التي تحتوي على كره. (A) خط hiPSC الممثل التي تم تحويلها من التي تحتوي على كره (البحوث الصف مصفوفة) لخالية من كره (الركيزة الاصطناعية) الظروف الممارسة الحالية جيدة التصنيع (GMP) الظروف. (B) الكمي بوليميريز سلسلة من ردود الفعل لفحص لتعدد القدرات المناسبة يرتبط التعبير الجيني بعد التحويل إلى الظروف الصف GMP. (C) في الخاأيون للاختبارات العقم القياسية لضمان التوافق GMP، وتدفق اختبار الفحص الخلوي استنادا لمستضد غير البشرية، N حمض -glycolylneuraminic، ويستخدم لإظهار أن hiPSCs بعد تحويلها القضاء على جميع كشف الحامض اللعابي (1٪ مع ما بعد خلايا رفعه على مصفوفة مقارنة مع 0٪ مع الخلايا بعد رفعه على ركيزة الاصطناعية). الخلايا الليفية الماوس الجنينية وخط hiPSC المشتقة في ظل ظروف GMP بمثابة الضوابط الإيجابية والسلبية، على التوالي، في هذه التجربة. الحانات = 100 ميكرون. HESC، الخلايا الجذعية الجنينية البشرية؛ PESS، بعد رفعه الركيزة الاصطناعية. بيم، بعد رفعه المصفوفة. لقد تم تعديل هذا الرقم من الرهبة وآخرون. 10.
| اسم الجين | إلى الأمام التمهيدي 5'-3 " | عكس التمهيدي 5'-3 " | التحقيق # |
| QRT-hPOU5F1 | gaagttaggtgggcagcttg | tgtggccccaaggaatagt | 13 |
| QRT-hSOX2 | gggggaatggaccttgtatag | gcaaagctcctaccgtacca | 65 |
| QRT-hNANOG | cagtctggacactggctgaa | cacgtggtttccaaacaaga | 55 |
الجدول 1: الاشعال تستخدم لتحليل PCR الكمي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن تصف منهجية مستمدة hiPSCs خالية من عامل وجعلها ذات الصلة سريريا عن طريق تحويل هذه الخلايا إلى الظروف GMP الصف لتمايز الخلايا المصب في العلاجات البشرية في المستقبل. وعلى الرغم من هذا البروتوكول هو الواجب التطبيق على نطاق واسع لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، اخترنا لإعادة برمجة الخلايا الليفية الجلدية الإنسان، وذلك بسبب سهولة استخراج من المريض وانطباقها على العلاجات البشرية شخصية. مرة واحدة يتم علاجها القيود بقدر التمايز كامل في المشتقات خلية ذات الصلة سريريا قلق 14، سيتم تحويل قدمت إلى الظروف GMP الصف أصبحت أكثر أهمية لمجموعة متنوعة من أنواع مختلفة من الخلايا.
الجزء الأول من هذه الدراسة ينطوي على إعادة برمجة الخلايا الليفية الإنسان مع الفيروسة البطيئة STEMCCA. وقد تم اختيار هذا الأسلوب في جزء كبير منه بسبب استنساخ لها، وكفاءة إعادة برمجة عالية نسبيا (0.02٪)، والقدرة القوية لإعادة برمجة عبر رجلص 10 أنواع مختلفة من الخلايا. هذه التقنية متفوقة على منهجيات إعادة برمجة أخرى مثل فيروس سينداي، البلازميدات episomal، والاصطناعية مرنا إعادة برمجة مقرها التي تعاني من انخفاض كفاءة إعادة برمجة واستنساخ 10. على الرغم من أن هناك علاقة بين ناقلات القائم على الإصابة بالفيروس الاندماج في زيادة النقاط الساخنة النشاط الجيني 15، ليس هناك ما يضمن أنها لن الاندماج في الجينات، وأقل من ذلك بكثير في منطقة أكثر أمنا من الجين، وإنترون. وبالتالي هذه العقبة تمثل قيدا ملحوظا على هذا النهج. بالإضافة إلى ذلك، هذا التفضيل الموقع الاندماج في موقع الجيني أكثر أمانا يتناقص مع المزيد من التكامل في جميع أنحاء الجينوم. ولذلك، فمن الضروري أن lentiviral السليم طليعة الفيروس الموقع التكامل والاندماج عدد استجوابهم بشكل صحيح من خلال تقنيات حساسة مثل تكنولوجيا nrLAM-PCR. إعادة برمجة المستقبلية باستخدام الزنك التكنولوجيا إصبع نوكلياز، تستهدف TALEN، أو كريسبر / الجين مقرها Cas9 (عبر homologouالصورة إعادة التركيب) قد يزيد من توجيه هذا المجال في مواضع محددة لإعادة برمجة 16.
وحالما يتم إعادة برمجة الخلايا الليفية الإنسان بشكل صحيح ولقد استمدت المستعمرات، جانبا مهما آخر من هذا البروتوكول هو التعبير الغدة-لجنة المساواة العرقية-PuroR لاختيار hiPSCs بعد رفعه. من المهم النظر في إعادة تعريض-المستعمرات إلى بوروميسين بعد بضعة أسابيع من زراعة الخلايا، من أجل التأكد من أن جميع اتش تم تخفيفه من خلال تكرار الخلية ولم تدمج بشكل متقطع في الجينوم. ان التكامل غير لائق في الجينوم من اتش تمثل مصدر قلق السلامة للالعلاجات الخلوية شخصية.
التحويل إلى الظروف GMP الصف هو خطوة هامة في إدخال تطبيق السريرية لهذه hiPSCs خالية من عامل. من المهم تغيير شرط واحد فقط في كل مرة عند تحويل هذه الخلايا لأكثر من الشروط خالية من كره. تبدأ من خلال تحويل الخلايا في xeno-وسائل الإعلام الحرة من خلال منهجية تحويل بطيئة. وhiPSCs لا يمكن أن يتسامح مع تغيير وسائل الاعلام وتغيير الركيزة في نفس الوقت. وبمجرد أن الخلايا الركض بانتظام مع التشكل الطبيعي في الظروف وسائل الإعلام الجديدة، وتبدأ عملية الانتقال على الركيزة خالية من كره. إذا أنواع معينة من الخلايا هي وجود مشكلة في تحويل أكثر من على الركيزة الموصى بها، من المجدي النظر في محاولة أخرى ركائز خالية من كره في السوق.
في الختام، يجب أن انطباق قوي واسعة من هذه التقنية برمجة جنبا إلى جنب مع تحويل GMP الصف تسمح السهل استنساخ وبمثابة الأساس للثقافة الخلية مشتقة hiPSC-المستقبل لالعلاجات البشرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and reagents | |||
| DMEM/F12 (basal media) | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11330057 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | |
| Minimum essential medium (MEM) non-essential amino acids (NEAA), 100x | Invitrogen | 11140050 | |
| Glutamax, 100x | Invitrogen | 35050-061 | |
| PenStrep, penicillin-streptomycin, 100x | Invitrogen | 15140-122 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828028 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C |
| Trypsin/EDTA, 0.5% | Invitrogen | 15400-054 | Dilute stock out to 0.05% in 1x PBS |
| Basic fibroblast growth factor | GlobalStem (Rockville, MD, USA) | GSR-2001 | Reconstitute to 10 µg/ml stock in 0.1% bovine serum albumin dissolved in 1x PBS and store at −80 °C |
| β-mercaptoethanol | Millipore (Billerica, MA, USA) | ES-007-E | |
| Matrigel (basement membrane matrix) | BD Biosciences (San Jose, CA, USA) | 356231 | Dilute stock Matrigel vial with 10 ml of DMEM/F12 while on ice for a 1:2 dilution. Aliquot and store at −20 °C. |
| CELLstart (Synthetic Substrate) | Invitrogen | A1014201 | |
| Stemmolecule Y27632 | Stemgent (Cambridge, MA, USA) | 04-0012-02 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche (Basel, Switzerland) | 4707494001 | |
| ProFreeze-CDM Medium/freezing medium | Lonza (Basel, Switzerland) | 12-769E | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | D8418 | |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | |
| 100 BP DNA Ladder | Invitrogen | 15628019 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain 10,000x | Invitrogen | S33102 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA) | 161-3101 | |
| Gelatin, from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | Make stock at 0.2% in PBS, autoclave and store at room temperature. |
| mTeSR1 | StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada) | 5850 | Combine Supplement 5x with the basic medium, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks. |
| Stemedia NutriStem XF/FF Culture Medium | Stemgent | 05-100-1A | Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks. |
| Primocin | InvivoGen (San Diego, CA, USA) | ant-pm-1 | |
| Accutase (Dissociation Reagent) | Invitrogen | A1110501 | |
| Donkey anti-Chicken IgG AlexaFluor 488 | Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA) | 703-546-155 | |
| Polybrene/transfection agent | Millipore | TR-1003-G | |
| Plasticware | |||
| 12-well plates | VWR (West Chester, PA, USA) | 29442-038 | |
| 6-well plates | VWR | 29442-042 | |
| 10-cm plates | Sigma-Aldrich | Z688819 | |
| 18-gauge needle | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | 148265D | |
| 21-gauge needle | Fisher Scientific | 14-829-10D | |
| Equipment | |||
| BD LSRII Flow Cytometer | KSystem by Nikon (Tokyo, Japan) | ||
| BD FACSDiva Version 6.1.3 Software | BD Biosciences | ||
| Kits | |||
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182000 | |
| KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA) | KK2601 | |
| High Pure RNA Isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack Kit | Sialix (Newton, MA, USA) | Basic Pack | |
| Media | |||
| Combined media 1 | StemCell Technologies and Stemgent | Consists of equal parts mTeSR1 and Nutristem | |
| Combined media 2 | StemCell Technologies and Stemgent | Consists of equal parts TeSR2 and Nutristem | |
| HUF Media | Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12 [DMEM/F12] supplemented with 10% fetal bovine serum, 1x non-essential amino acids, 1x Glutamax, and 1x Primocin | ||
| Human Pluripotent Stem Cell Media | DMEM/F12 supplemented with 20% knockout serum replacement, 1x Glutamax, 1x non-essential amino acids, 1x Primocin, 1x β-mercaptoethanol, and 10 ng/ml basic fibroblast growth factor. | ||
| DMEM/F12, Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12; PBS, phosphate-buffered saline. | |||
References
- Sommer, C. A., Mostoslavsky, G. The evolving field of induced pluripotency: Recent progress and future challenges. J Cell Physiol. 228, 267-275 (2013).
- Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35, 2816-2826 (2014).
- Karumbayaram, S., et al. From skin biopsy to neurons through a pluripotent intermediate under Good Manufacturing Practice protocols. Stem Cells Transl Med. 1, 36-43 (2012).
- Mostoslavsky, G. Concise review: the magic act of generating induced pluripotent stem cells: many rabbits in the hat. Stem Cells. 30, 28-32 (2012).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 27, 543-549 (2009).
- Somers, A., et al. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).
- Sommer, C. A., et al. Excision of reprogramming transgenes improves the differentiation potential of iPS cells generated with a single excisable vector. Stem Cells. 28, 64-74 (2010).
- Papapetrou, E. P., et al. Genomic safe harbors permit high beta-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, 73-78 (2011).
- Awe, J. P., et al. Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade status. Stem Cell Res Ther. 4, (2013).
- Receives FDA Clearance to Begin World's First Human Clinical Trial of Embryonic Stem Cell-Based Therapy. Geron Corporation Press Release. , Geron. (2009).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. 64, 3810-383791 (2012).
- Mitani, K., Kubo, S. Adenovirus as an integrating vector. Curr Gene Ther. 2, 135-144 (2002).
- Patterson, M., et al. Defining the nature of human pluripotent stem cell progeny. Cell Res. 22, 178-193 (2012).
- Schroder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).
