Abstract
Menneskeskapte pluripotente stamceller (hiPSCs) kan genereres med lentivirale baserte omprogrammering metoder. Imidlertid kan spor av potensielt onkogene gener som er igjen i aktivt transkriberte regioner av genomet, begrenser deres potensial for bruk i human terapeutiske anvendelser 1. I tillegg har ikke-humane antigener avledet fra stamcelle omprogrammering eller differensiering til terapeutisk relevante derivater utelukker disse hiPSCs fra å bli brukt i en human klinisk sammenheng 2. I denne videoen presenterer vi en prosedyre for omprogrammering og analysere faktorfrie hiPSCs gratis av eksogene transgener. Disse hiPSCs deretter kan analyseres for genuttrykk unormalt i den spesifikke intronet inneholder lentivirus. Denne analysen kan bli utført ved bruk av sensitive kvantitativ polymerasekjedereaksjon (PCR), som har en fordel i forhold til mindre følsomme teknikker som tidligere er brukt til å detektere genekspresjon forskjeller 3. Full konvertering tilklinisk kvalitet Good Manufacturing Practice (GMP) betingelser, gjør human klinisk relevans. Vår protokoll tilbyr en annen metodikk-forutsatt at dagens trygg-havn kriterier vil utvide og inkluderer faktorfrie karakteriserte hiPSC-baserte derivater for humane terapeutiske anvendelser-for utledning GMP-grade hiPSCs, som skal eliminere eventuelle immunogenisitet risiko på grunn av ikke-menneskelige antigener. Denne protokollen er bredt anvendelig på lentivirale omprogrammeres celler av enhver type og gir en reproduserbar metode for å konvertere omprogrammeres celler til GMP-grade forhold.
Protocol
MERK: Denne metoden ble brukt i forskning rapportert i Awe et al 10..
1. Omprogrammering voksent menneske Dermal Fibroblaster med STEMCCA
- Tine voksen dermal humane fibroblaster (HUFs), passasje 4 eller lavere, i en 37 ° C vannbad i 2 min, tar seg ikke å senke toppen av hetteglasset med vann.
- Plasser en-ml slurry av humane fibroblaster inn i en 15-ml konisk hetteglass og sakte plassere 4 ml standard HUF media, forvarmet til 37 ° C, i en drop-klok måte, for å fortynne ut dimethylsulfoxyd (DMSO) og re-suspen celler.
- Sentrifuger ampullen ved 200 xg i 10 min ved romtemperatur. Aspirere supernatanten og re-suspendere celler i et tilstrekkelig volum av mediet for å lage en suspensjon av 100 000 celler / ml og deretter legge til 2 ml i en brønn av en seks-brønns plate, forhåndsbelagt i 20 minutter med 0,2% gelatin.
MERK: En søster godt med et likt antall celler per linje og tilstand må sådd for celletelling / multiplisitet av infeksjon (MOI) beregning. - Rocke plate side til side og frem og tilbake for å fordele cellene. Inkuber over natten ved 37 ° C, 5% CO2 i en fuktig inkubator.
- På dagen for transduksjon, få celletall (e) fra søster godt (er) ca 24 timer etter første HUF plating.
- Tine opp 2 x 10 8 TU, eller tilsvarende, lentiviral konsentrat (STEMCCA) og fortynn til 1 x 10 8 TU / ml i HUF media.
- Transduce celler ved en MOI 10-forholdet i HUF media supplementert med 8 ug / ml transfeksjon middel. Bland transduserte brønner jevnt og inkuberes over natten ved 37 ° C, 5% CO2 i en fuktig inkubator.
- Omtrent 24 timer etter lentiviral transduksjon, slå HUF media til standard menneskelige pluripotent stamcelle (PSC) medium.
- På dager 2 til 6, endre media daglig med menneskelig PSC medium.
- På dag 6, plate to 0.2% gelatinbelagte 10 cm plater av1,5 til 1,75 x 10 6 MEFs avledet fra CF1 mus i HUF media 12.
- På dag 7, være forsiktig med å sentrifugere mer enn 100 xg, bruk romtemperatur trypsin å løfte av dag 7 omprogrammeres fibroblaster fra én brønn av de seks-brønns plate og passasje på en 1:16 ratio, ved plating alle celler jevnt mellom to 10 cm plater, med frisk menneske PSC media, som ble belagt med MEFs dagen før. Distribuere celle tilslag i klokkens spiralbevegelse og plasser i en 37 ° C, 5% CO 2 fuktet inkubator over natten.
- Omtrent 48 timer etter seeding de omprogrammeres celler på MEFs og hver dag etterpå, bytte ut tilbrakt menneskelige PSC medier med ferske media.
- Etter 3 til 4 uker, plukke individuelle kolonier med typiske ESC lignende morfologi med en 21-gauge nål og subklone ut i en 24-brønners plate ved å anbringe omtrent 8 til 10 individuelle stykker av spesifikke kolonier i individuelle brønner i en 0,2% gelatin-belagte 24-brønns plate før frøed med MEFs avledet fra CF1 mus i menneskelig PSC medium.
MERK: Etter ekspansjon av kolonier plukket, koloniene må karakteriseres som pluripotent ved embryoid kropps dannelse og ekspresjon analyse av pluripotency markører på proteinnivå.
2. Vector Integrasjon Nettstedet Analyse og STEMCCA Eksisjon
- Analyser STEMCCA integrering stedet av ikke-restriktive lineær forsterkning PCR som beskrevet 10.
- Etter analysering for å sikre en integrering i et ønsket område i genomet, avgifts STEMCCA ved å suge av den gamle human ESC medium. Deretter kombinere 45 ul konsentrert Adeno-Cre-PuroR virus med 8 ug / ml transfeksjon middel i 3 ml standard PSC medier i 24 timer.
- Etter 24-timers inkuberingsperioden ble suge ut den blandede viral supernatant og vaske cellene to ganger med humane PSC medier. Plassere friske menneskelige PSC media sammen med to mikrogram / ml puromycin for en periode på fem dager, endre media daglig viddh ferske media og antibiotika.
- Etter 5 dager, subklon værende kolonier med en 21-gauge nål på 0,2% gelatin-belagte brønner i en 12-brønns plate forhåndsbelagt med MEFs avledet fra CF1mice og ekspandere som beskrevet ovenfor.
MERK: Etter tilstrekkelig utvidelse for å få en frossen lager, er konvertering til mater frie forhold som kreves. Forvente minst 95% stamcelle koloni død som de fleste celler ikke vil være vellykket transdusert og vil gi etter for antibiotika i løpet av 5 dagers inkuberingsperiode. Selv Adeno-Cre-PuroR integreres på en 0,001-1% effektivitet i verts kromosomer av infiserte celler, nytt å eksponere en prøve av faktorfrie kolonier å Puromycin å sikre 100% celledød vil bekrefte ingen integrasjon har skjedd 13. - Tine opp en ampulle med pre-alikvotert basalmembran matrise på is, i løpet av en periode på ca. 2 timer (produsentens anbefalinger) til matriksen er en væske og fortynnet til en sluttkonsentrasjon på 1:30 i kaldt basalmedier. Copå ønsket antall brønner i en seks-brønns plate med 1 ml pr brønn. La stå ved romtemperatur i 1 time.
- Kryssrastrering (ved hjelp av en 18-gauge nål, eller et glass eller plast "tips") på minst 20 til 30 kolonier fra en brønn tidligere belagt med MEFs. Vær forsiktig med å redusere MEF oppløftende og overføre fra plate.
- Generere skravering enhet gjennom en rekke ulike tilnærminger, fra mer komplisert oppvarming, dra, og etterbehandling av et glass Pasteur pipette på en åpen flamme, til den enkle bruken av en steril plast pipette eller, som i vårt tilfelle, 21- og / eller 18 gauge nåler.
- Aspirere matrisen fra den belagte brønnen etter inkubering.
- Fjerne deler av koloniene ved forsiktig skraping fra den gamle plate med en 200-mL pipette og plasser forsiktig inn i 3 ml av friske kombinerte media en i matrisen belagt plate. Inkuber over natten i en 37 ° C, 5% CO2 fuktet inkubator. Endre media 48 timer etter passaging.
- Utdrag genomisk DNA fra etter skåret ut og mater fritt konverterte hiPSCs, på mer enn 80% confluency, ved hjelp av kommersielle DNA-ekstraksjon kits.
- Analyser for riktig eksisjon med primere spesifikke for eksogene integrasjonene til STEMCCA lentivirus: gDNA-Hendo-MycS fremover, 5'-acgagcacaagctcacctct-3 '; gDNA-hWPRE-revers, 5'-tcagcaaacacagtgcacacc-3 '. Rekonstituer lyofiliserte primere med PCR-grade vann til 10 uM lagerløsning.
- Kjøre en PCR med følgende fem-trinns protokoll: innledende denaturering ved 95 ° C i 3 minutter; 35 sykluser av hver av følgende: denaturering ved 98 ° C i 20 sek, primer-hybridisering ved 62 ° C i 15 sek, og forlengelse ved 72 ° C i 15 sekunder; etterfulgt av en enkelt syklus endelig forlengelse ved 72 ° C i 3 minutter.
- Foreta en 3% agarosegel ved å veie ut 1,5 g agarose og plassere den i 50 ml 1 x Tris-acetat-EDTA-buffer. Mikrobølgeovnen til agarose er oppløst og sted i DNA gel stain på pRoper fortynning, mikse og dispensere riktig volum inn gel kassett å stivne i 1 time ved romtemperatur.
- Lasten 12 ul av PCR-produkt blandet med 3 ul av laste fargestoff i en 3% agarosegel. Kjør gelen i 30 minutter ved 80 V.
- Visualisere med ultrafiolett lys for fraværet av et band som indikerer riktig excision.
3. Kvantifisering av genekspresjon Forskjeller ved hjelp av kvantitativ PCR fra pre- og post skåret hiPSCs
- Utdrag total RNA fra etter skåret ut og mater fritt konverterte hiPSCs ved hjelp av kommersielle RNA ekstraksjon kits.
- Reverse-transkribere opp til 1 mikrogram total RNA ved hjelp av kommersielle kits i samsvar med instruksene fra produsenten. Bruk forankret-oligo (dT) 18 og tilfeldige heksamerprimere.
MERK: Kontroller at PCR-protokollen er skreddersydd for gentranskriptene på mer enn eller mindre enn 4 kb. Spesifikke primere må gjøres for hvilken genet STEMCCA opprinnelig integrert into. - Rekonstituere den lyofiliserte primer med PCR-grade vann til en 20 mM stamløsning.
- Bruk 5 ng prøve per 20 ul av reaksjon som består av 10 mikrometer UPL sonde, 2x LightCycler 480 prober Master, og 20 mikrometer fremover og revers primere.
4. Omgjøring til GMP-grade betingelser
- På den første dagen av overgangen til post-skåret hiPSCs over til GMP-grade forhold, lage en blanding av media som består av menneskelig PSC kombinert medie 1 (kombinert media 1) og klinisk klasse Good Manufacturing Practice (GMP) kompatibel medie (kombinerte media 2 ) ved et forhold på 80:20.
- Aspirer av de gamle kombinerte media en og plassere 3 ml ved de nye kombinasjons media 1 og 2, forvarmet, på 80:20 ratio. Endre media daglig i 3 dager med denne spesifikke forhold. Plasser cellene tilbake i en 37 ° C, 5% CO 2 inkubator.
- På dag 4, må den kombinerte medier 1 og 2 på et 50:50 forhold. Aspirer av gamle medium og fortrengte med forhånds varmet media, med den kombinerte media 1 og 2 på 50:50 ratio. Endre media for 3 dager med denne spesifikke forhold. Plasser cellene tilbake i en 37 ° C, 5% CO 2 inkubator.
- På dag 7, gjør den kombinerte medier 1 og 2 på et 20:80 forhold. Aspirer av gamle medium og erstatte med forvarmes media, med de kombinerte media 1 og 2 på 20:80 ratio. Endre media for 3 dager med denne spesifikke forhold. Plasser cellene tilbake i en 37 ° C, 5% CO 2 inkubator.
- På dag 10, gjør de kombinerte medier 1 og 2 ved et 0: 100 forhold. Aspirer av gamle medium og erstatte med forhånds varmet media, med den kombinerte media 1 og 2 på 0: 100-forhold. Endre media hver dag på denne spesifikke forhold. Celler er nå i fullstendig definert xeno-frie medier. Plasser cellene tilbake i en 37 ° C, 5% CO 2 inkubator.
MERK: Under hele denne konverteringsprosessen, er rutine aging med en 18-gauge nål som trengs for å opprettholde riktig koloni størrelse og tetthet. Plan på passaging celler hver 4 til 5 dager på basis av kolonistørrelse, konfluens, og differensiering. - Belegge en brønn i en seks-brønns plate med en definert xeno-fri substrat som anbefalt av produsenten.
- Mekanisk passasje en konfluent godt, allerede konvertert til Xeno-free medie forhold, fra en seks-brønns plate med en 18-gauge nål. Viktigere, plasserer nye medier (kombinerte medie 2) på cellene med 1x ROCK inhibitor for 1 time, før passering til pre-tilstand media.
- Aspirer syntetisk substrat løsning av den nye plate som cellene blir overført til. Fjern alle medier som inneholder stamcelle klumper fra den gamle plate og overføre til ny plate.
- Plasser cellene tilbake i en 37 ° C, 5% CO 2 inkubator for to dager med minimal fysisk forstyrrelse (ideelt plater, en gang inne kuvøse, ikke er direkte berørt på noen måte) for å tillate maksimal vedlegg.
MERK: Cells vil kreve daglige medie endringer. Kontinuerlig passaging hver 4 dager vil være viktig. Ved hjelp av en 21-gauge nål, passage bare de delene av kolonier med optimal ESC-lignende morfologi (høy nucleocytoplasmic ratio). Dette vil sikre valget for riktig hiPSC kolonier som vil vokse godt og til slutt vike homogene kolonier. Samlet tid til avledning av ESC som kolonier er mellom 15-20 dager etter den første kombinerte media endring. - Fryse ned GMP-klasse etter utskåret hiPSCs ved først kryssrastrering alle koloniene ved hjelp av en 18-gauge nål. Løft alle bitene av ved hjelp av en 200 mL pipette og overføre alle medier som inneholder cellene til en 15 ml konisk hetteglass og sentrifuger ved 200 xg i 5 min ved 4 ° C.
- Mens cellene er sentrifugering, må en frysemedier som består av like volumer av kald kombinerte medier 2 og frysemedium med en slutt-DMSO-konsentrasjon på 7,5%.
- Etter celler er pelletert, aspirer av gammelt medium og drop-messig re-suspendere pellet med frysemediet. Umiddelbart transfer å fryse ampuller og satt i en -80 ° C fryser.
5. karakteriserer GMP-grade Post-skåret hiPSCs
- For å sikre riktig uttrykk for pluripotency markører post-konvertering, bruker QPCR å kvantifisere uttrykk for viktige pluripotency markører (SOX2, OCT4, og Nanog) ved å bruke primere som er oppført i tabell 1 med de samme trinnene som nevnt i trinn 3. qPCR metoder følger samme trinnene som er oppført i trinn 3.
- Bruk strømningscytometri for å påvise ikke-humane sialinsyre Neu5Gc (N -glycolylneuraminic syre) i henhold til standardbetingelser som er oppført i settet som tidligere publisert 10.
- Vask forsiktig cellekulturplater med cellene ved hjelp av 1x fosfat-bufret saltvann (PBS).
- Dissosiere kolonier ved hjelp 1x dissosiasjon reagens i 5 min ved romtemperatur.
- I løpet av fem minutters inkubasjonstid i trinn 5.4, fremstille den blokkerende løsning (tilgjengelig ikit) ved å lage en 0,5%-blokkerende middel i iskald PBS.
- Merke følgende sett med rør for flowcytometri analyse: Ufarget; 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) DAPI; Kontroll-antistoff 1: 200; Primære antistoff 1: 200; Sekundært antistoff 1: 200 Donkey Anti-Chicken IgG (H + L); Eksempel MEFs; Sample etter utskåret celler på matrise; og Sample post-utskåret celler på syntetisk underlag.
- Forsiktig løsne celleaggregater fra trinn 5.4 ved å tilsette 2 ml blokkeringsløsning og overføre innholdet til en 15 ml konisk rør. Sentrifuger ved 80 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Vask cellene to ganger med blokkeringsløsning og sentrifugering som beskrevet i trinn 5.7.
- Forsiktig resuspendere ca. 1 x 10 6 celler i 100 ul blokkeringsløsning med det tilsvarende volum av hver fortynning antistoff. Inkuber med forsiktig gynging ved 4 ° C i 1 time.
- Gjenta vasker tre ganger som i trinn 5.8.
- Re-suspendere cellepelleten i 400 mL av fortynningsmiddel Buffer (fra kit) med 1: 100 av DAPI for rørene 2, 6, 7 og 8 som er oppført under trinn 5.6.
- Strain celler gjennom en 40 mikrometer sil og kjøre gjennom strømningscytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi presenterer en protokoll for utledning av klinisk kvalitet faktorfritt hiPSCs ved hjelp av STEMCCA lentiviral baserte omprogrammering tilnærming. Figur 1A viser et representativt bilde av tre forskjellige forhånds skåret hiPSC linjer, etter at omprogrammering med STEMCCA tilnærming på et lag av MEFs. Den primære fordelen med den STEMCCA reprogrammerings tilnærming ligger i overensstemmelse omprogrammering suksess oppnådd ved flere forskere, i forskjellige forskningsgrupper og steder. Figur 1B viser den post-excision revers transkripsjon-PCR-gel, som viser en spesiell subklon (2.3), som er helt fri fra STEMCCA lentivirus, som dokumentert av mangel på en amplicon bandet spesifikk for en bestemt sekvens endogen til STEMCCA. Figur 2A viser pre-konvertert hiPSCs på en xeno inneholder matrise og etter skåret Xeno-free GMP-grade hiPSCs på syntetisk matrise . Kvantifisering av standard pluripotency-assosiert faktorer (SOX2, OCT4, og Nanog) ved hjelp QPCR er illustrert i figur 2B. Pre-konvertert og post-konvertert hiPSCs til GMP-grade betingelser ble testet ved strømningscytometri for sialinsyre N-glykolylneuraminsyre, en indikasjon på ikke-humane antigener, slik som vist i figur 2C.
Figur 1: Representative human pluripotent stamcelle kassett (hSTEMCCA) avledede menneskeskapte pluripotent stamcelle (hiPSC) linjer. (A) Alle tre stammer linjer ble analysert med nrLAM-PCR-teknologi og bare den presenterte C8 linjen ble funnet å ha en integrering i PRPF39 genet. Bare denne linje, på grunn av den sikre intronic STEMCCA integrasjon, ble valgt ut til å gjennomgå Adeno-Cre-PuroR utvalg for Cre-formidlet eksisjon. (B) Adeno-Cre-formidlet STEMCCA eksisjon ut av C8 linje. Primers mot unike nukleotidsekvenser funnet i STEMCCA-endo-Myc-s og A-WPRE- funnet at bare én subklon (2.3 etter utskåret iPSCs) ble skikkelig tatt ut og fri for transgene transkripsjonsfaktorer fra den integrerte provirus. Barer = 100 mikrometer. Dette tallet har blitt forandret fra Awe et al. 10.
Figur 2: Konvertering av hiPSCs fra xeno holdig til kliniske grade GMP Xeno-frie forhold og karakterisering. (A) Representant hiPSC linje som har blitt konvertert fra xeno-holdig (forskning klasse matrise) til Xeno-free (syntetisk substrat) vilkårene etter gjeldende Good Manufacturing Practice (GMP) forhold. (B) Kvantitativ polymerase kjedereaksjon til analyse for riktig pluripotency assosiert genekspresjon etter konvertering til GMP klasse forhold. (C) I addition i standardtester for å sikre sterilitet GMP kompatibilitet, en flowcytometri-basert assay testing for det ikke-humane antigen, N -glycolylneuraminic syre, blir brukt til å vise at etter omdannet hiPSCs eliminere alle sialinsyre deteksjon (1% med post- skåret ut cellene på matrisen i forhold til 0% med etter skåret celler på et syntetisk substrat). Mus embryonale fibroblaster og en hiPSC linje avledet under GMP forhold tjente som positive og negative kontroller, henholdsvis i dette eksperimentet. Barer = 100 mikrometer. hESC, humane embryonale stamceller; Dess, post-utskåret syntetisk underlag; PEM, post-utskåret matrise. Dette tallet har blitt forandret fra Awe et al. 10.
| Gene Name | Forward Primer 5'-3 ' | Revers primer 5'-3 ' | Probe # |
| QRT-hPOU5F1 | gaagttaggtgggcagcttg | tgtggccccaaggaatagt | 13 |
| QRT-hSOX2 | gggggaatggaccttgtatag | gcaaagctcctaccgtacca | 65 |
| QRT-hNANOG | cagtctggacactggctgaa | cacgtggtttccaaacaaga | 55 |
Tabell 1: Primere anvendt for kvantitativ PCR-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en metode for å utlede faktor frie hiPSCs og gjør dem klinisk relevant ved å konvertere disse cellene til GMP-grade forhold for nedstrømscelledifferensiering i fremtidige menneskelige therapeutics. Selv om denne protokollen er bredt anvendelig på en rekke celletyper, valgte vi å omprogrammere menneskelige dermale fibroblaster, på grunn av den enkle utvinning fra pasienten og deres anvendbarhet til personlige menneskelige behandlingsformer. Når begrensningene er avhjulpet så langt som hele differensiering til klinisk relevante celle derivater er opptatt 14, den presenterte omdannelse til GMP-grade forhold vil bli enda mer relevant for en rekke forskjellige celletyper.
Den første delen av denne studien innebærer omprogrammering humane fibroblaster med STEMCCA lentivirus. Denne teknikken ble valgt for en stor del på grunn av dens reproduserbarhet, relativt høy omprogrammering effektivitet (0,02%), og robust evne til å omprogrammere tvers menneskety forskjellige celletyper 10. Denne teknikk er bedre enn andre reprogrammerings-metoder slik som Sendai-virus, episomale plasmider, og syntetisk mRNA basert omprogrammering som lider av lavere reprogrammerings effektivitet og reproduserbarhet 10. Selv om det er en sammenheng mellom HIV-baserte vektorer som integreres i økte genaktivitet punkter 15, er det ingen garanti for at de skal integreres i et gen, mye mindre i en tryggere område av et gen, intronet. Derfor er denne hindringen representerer en betydelig begrensning for denne tilnærmingen. I tillegg inneholder denne integrasjonen nettstedet preferanse til et tryggere genomisk plassering avtar med flere integrasjoner i hele genomet. Derfor er det viktig at riktig lentiviral provirus integreringssete og integrering nummer være riktig avlest ved følsomme teknikker som nrLAM-PCR-teknologi. Future omprogrammering utnytte sink finger nuclease teknologi, TALEN, eller CRISPR / Cas9-baserte genet targeting (via homologous rekombinasjon) kan videre lede dette feltet til konkrete loci for omprogrammering 16.
Når de humane fibroblaster er riktig omprogrammeres og kolonier er avledet, er et annet viktig aspekt av denne protokollen Adeno-Cre-PuroR uttrykk for valg av etter eksisert hiPSCs. Det er viktig å vurdere re-eksponering av koloniene til puromycin etter et par uker med cellekultur, for å sikre at all adenovirus er fortynnet ut gjennom cellereplikasjon og har ikke sporadisk integrert i genomet. Feilaktig integrering i genomet av adenovirus ville representere en sikkerhetsrisiko for personlig cellulære terapeutika.
Konvertering til GMP-grade forhold er et viktig skritt i å innføre klinisk anvendbarhet til disse faktorfrie hiPSCs. Det er viktig å forandre kun en tilstand på et tidspunkt da konvertere disse cellene over til Xeno frie betingelser; starte med å omdanne celler til xeno-frie medier gjennom treg konvertering metodikk. De hiPSCs kan ikke tolerere en media endring og et substrat endring samtidig. Når cellene er passering regelmessig med normal morfologi i de nye medie forhold, begynne overgangen på xeno fritt underlag. Hvis spesifikke celletyper har problemer overføring over på den anbefalte substrat, er det mulig å vurdere prøver andre Xeno fritt underlag på markedet.
I konklusjonen, bør robust og bred anvendelse av denne omprogrammering teknikken sammen med GMP-grade konvertering tillate enkel reproduserbarhet og fungerer som et fundament for fremtidig hiPSC baserte derivat cellekultur for menneskebehandlingsformer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and reagents | |||
| DMEM/F12 (basal media) | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11330057 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | |
| Minimum essential medium (MEM) non-essential amino acids (NEAA), 100x | Invitrogen | 11140050 | |
| Glutamax, 100x | Invitrogen | 35050-061 | |
| PenStrep, penicillin-streptomycin, 100x | Invitrogen | 15140-122 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828028 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C |
| Trypsin/EDTA, 0.5% | Invitrogen | 15400-054 | Dilute stock out to 0.05% in 1x PBS |
| Basic fibroblast growth factor | GlobalStem (Rockville, MD, USA) | GSR-2001 | Reconstitute to 10 µg/ml stock in 0.1% bovine serum albumin dissolved in 1x PBS and store at −80 °C |
| β-mercaptoethanol | Millipore (Billerica, MA, USA) | ES-007-E | |
| Matrigel (basement membrane matrix) | BD Biosciences (San Jose, CA, USA) | 356231 | Dilute stock Matrigel vial with 10 ml of DMEM/F12 while on ice for a 1:2 dilution. Aliquot and store at −20 °C. |
| CELLstart (Synthetic Substrate) | Invitrogen | A1014201 | |
| Stemmolecule Y27632 | Stemgent (Cambridge, MA, USA) | 04-0012-02 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche (Basel, Switzerland) | 4707494001 | |
| ProFreeze-CDM Medium/freezing medium | Lonza (Basel, Switzerland) | 12-769E | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | D8418 | |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | |
| 100 BP DNA Ladder | Invitrogen | 15628019 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain 10,000x | Invitrogen | S33102 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA) | 161-3101 | |
| Gelatin, from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | Make stock at 0.2% in PBS, autoclave and store at room temperature. |
| mTeSR1 | StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada) | 5850 | Combine Supplement 5x with the basic medium, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks. |
| Stemedia NutriStem XF/FF Culture Medium | Stemgent | 05-100-1A | Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks. |
| Primocin | InvivoGen (San Diego, CA, USA) | ant-pm-1 | |
| Accutase (Dissociation Reagent) | Invitrogen | A1110501 | |
| Donkey anti-Chicken IgG AlexaFluor 488 | Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA) | 703-546-155 | |
| Polybrene/transfection agent | Millipore | TR-1003-G | |
| Plasticware | |||
| 12-well plates | VWR (West Chester, PA, USA) | 29442-038 | |
| 6-well plates | VWR | 29442-042 | |
| 10-cm plates | Sigma-Aldrich | Z688819 | |
| 18-gauge needle | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | 148265D | |
| 21-gauge needle | Fisher Scientific | 14-829-10D | |
| Equipment | |||
| BD LSRII Flow Cytometer | KSystem by Nikon (Tokyo, Japan) | ||
| BD FACSDiva Version 6.1.3 Software | BD Biosciences | ||
| Kits | |||
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182000 | |
| KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA) | KK2601 | |
| High Pure RNA Isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack Kit | Sialix (Newton, MA, USA) | Basic Pack | |
| Media | |||
| Combined media 1 | StemCell Technologies and Stemgent | Consists of equal parts mTeSR1 and Nutristem | |
| Combined media 2 | StemCell Technologies and Stemgent | Consists of equal parts TeSR2 and Nutristem | |
| HUF Media | Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12 [DMEM/F12] supplemented with 10% fetal bovine serum, 1x non-essential amino acids, 1x Glutamax, and 1x Primocin | ||
| Human Pluripotent Stem Cell Media | DMEM/F12 supplemented with 20% knockout serum replacement, 1x Glutamax, 1x non-essential amino acids, 1x Primocin, 1x β-mercaptoethanol, and 10 ng/ml basic fibroblast growth factor. | ||
| DMEM/F12, Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12; PBS, phosphate-buffered saline. | |||
References
- Sommer, C. A., Mostoslavsky, G. The evolving field of induced pluripotency: Recent progress and future challenges. J Cell Physiol. 228, 267-275 (2013).
- Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35, 2816-2826 (2014).
- Karumbayaram, S., et al. From skin biopsy to neurons through a pluripotent intermediate under Good Manufacturing Practice protocols. Stem Cells Transl Med. 1, 36-43 (2012).
- Mostoslavsky, G. Concise review: the magic act of generating induced pluripotent stem cells: many rabbits in the hat. Stem Cells. 30, 28-32 (2012).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 27, 543-549 (2009).
- Somers, A., et al. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).
- Sommer, C. A., et al. Excision of reprogramming transgenes improves the differentiation potential of iPS cells generated with a single excisable vector. Stem Cells. 28, 64-74 (2010).
- Papapetrou, E. P., et al. Genomic safe harbors permit high beta-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, 73-78 (2011).
- Awe, J. P., et al. Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade status. Stem Cell Res Ther. 4, (2013).
- Receives FDA Clearance to Begin World's First Human Clinical Trial of Embryonic Stem Cell-Based Therapy. Geron Corporation Press Release. , Geron. (2009).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. 64, 3810-383791 (2012).
- Mitani, K., Kubo, S. Adenovirus as an integrating vector. Curr Gene Ther. 2, 135-144 (2002).
- Patterson, M., et al. Defining the nature of human pluripotent stem cell progeny. Cell Res. 22, 178-193 (2012).
- Schroder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).
