Abstract
La eficacia de los protocolos de extracción de ADN puede ser altamente dependiente de tanto el tipo de muestra que se está investigado y los tipos de análisis realizados aguas abajo. Teniendo en cuenta que el uso de nuevas técnicas de análisis de la comunidad bacteriana (por ejemplo, microbiomics, metagenómica) es cada vez más frecuente en las ciencias agrícolas y medioambientales y muchas muestras ambientales dentro de estas disciplinas puede ser physiochemically y microbiológicamente único (por ejemplo, muestras fecales y basura / ropa de cama de el espectro de la producción de aves de corral), los métodos de extracción de ADN apropiadas y eficaces deben ser elegidos cuidadosamente. Por lo tanto, un método de extracción de ADN híbrido automatizado semi-novela fue desarrollado específicamente para su uso con muestras de producción de aves de corral del medio ambiente. Este método es una combinación de los dos tipos principales de extracción de ADN: mecánica y enzimática. Una intensa etapa de homogeneización mecánica de dos pasos (utilizando perlas paliza específicamente formulado para ambienmuestras TAL) se añadió al principio del método de extracción de ADN enzimática "patrón oro" para muestras fecales para mejorar la eliminación de bacterias y el ADN de la matriz de la muestra y mejorar la recuperación de miembros de la comunidad bacterianas Gram-positivos. Una vez que se inició la parte de extracción enzimática del método híbrido, el proceso de purificación restante se automatizó usando una estación de trabajo robótica para aumentar el rendimiento y disminuir el error de muestra procesamiento de la muestra. En comparación con los métodos de extracción de ADN mecánicos y enzimáticos estrictas, este método híbrido novela proporciona el mejor rendimiento general combinado al considerar cuantitativa (qPCR utilizando 16S rRNA) y cualitativa (utilizando microbiomics) las estimaciones de las comunidades de bacterias totales en el tratamiento de las heces de aves de corral y las muestras de cama .
Protocol
1. La homogeneización mecánica de Aves de Corral Ambiental muestras de producción
- Antes de la extracción, establezca un baño de agua a 95 ° C y permitir que el tiempo de baño de agua para llegar a esa temperatura.
- Pesar 0,33 g de suelo o material fecal en un tubo de 2 ml de lisado Matrix E.
- No exceda de 0,33 g de la muestra en el tubo, ya que esto hará que las siguientes soluciones para superar la capacidad del tubo.
- Descongele las muestras a temperatura ambiente antes de pesar.
- Con el fin de analizar un total de 1 g de suelo / heces, pésese 3 replicar 0,33 g de muestras para cada muestra ambiental individual.
- Almacene las muestras a -20 ° C dentro de los tubos cónicos de matriz antes de la extracción, si es necesario.
- Añadir 825 l de sodio tampón fosfato y 275 l de solución de PLS a un tubo de muestra. Mezclar utilizando un vórtex durante ~ 15 segundos y centrifugar las muestras a 14.000 xg durante 5 min.
- Decantar el supernatante y añadir 700 l de Buffer ASL. Mezclar utilizando un vórtex durante 5 seg.
- Asegúrese de que haya espacio de cabeza (~ 10% del volumen total) disponible en el tubo cónico en este punto. Si no hay espacio de cabeza, los tubos tendrán una tendencia a tener fugas durante la siguiente etapa de homogeneización que podría conducir a la contaminación cruzada y / o la pérdida de muestra.
- Colocar las muestras en un FastPrep 24 Instrumento, y homogeneizar las muestras a una velocidad de 6,0 m / s durante 40 s.
- Centrifugar la muestra homogeneizada a 14.000 xg durante 5 min. Transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de 2 ml estéril.
- Para maximizar la recuperación de ADN de la muestra, repita los pasos 1.4 a 1.6, combinando los sobrenadantes en el mismo tubo de microcentrífuga estéril, 2 ml.
2. Inhibición enzimática de los inhibidores de homogeneizados de ejemplo
NOTA: Este protocolo utiliza el kit QIAamp ADN en heces Mini.
- Incubar lasobrenadante en un 95 ° C baño de agua durante 5 min para maximizar la recuperación de ADN de las células restantes en el sobrenadante.
- Incubar a 70 ° C para muestras que contienen organismos sobre todo Gram-negativos. Sin embargo, si los organismos Gram-positivos están presentes (que es el caso de las muestras de heces de aves de corral), se incuba a 95 ° C.
- Utilice clips de plástico de bloqueo en los tubos de microcentrífuga para asegurar que los tubos no se "pop" abierta y potencialmente perder volumen de la muestra como la presión puede acumularse en estos tubos de microcentrífuga sellados.
- Abra cada tubo de microcentrífuga para liberar los, re-capitalización de los tubos de microcentrífuga de presión y mezcle utilizando un vortex durante 15 segundos.
- Centrifugar la muestra a 14.000 xg durante 1 minuto, retirar 1,2 ml del sobrenadante y colocarlo en un nuevo tubo de microcentrífuga de 2 ml estéril.
- Añadir 1 ficha Inhibitex a cada muestra y mezclar utilizando un vórtice hasta que la muestra se convierte en un / líquido blanquecino uniforme blanco.
- Evite touching la pestaña Inhibitex mientras se coloca en el tubo de microcentrífuga que contiene la muestra. Para lograr esto, coloque el paquete de ampolla que contiene la ficha directamente sobre el tubo de microcentrífuga abierta y empuje suavemente la lengüeta del blister y en el tubo de microcentrífuga.
- Incubar la muestra durante 1 min a TA (~ 25 ° C) y se centrifuga a 14.000 xg durante 5 min.
- Transferir todo el líquido a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril y se centrifuga a 14.000 xg durante 5 min.
- Evitar cualquier partículas restantes que pueden haber sedimentadas en el fondo del tubo de microcentrífuga al final de la etapa 2.5 cuando se transfiere el líquido.
3. Automated DNA Purification Uso de la estación de trabajo robótica QIAcube
NOTA: El número de consumibles de plástico, la disposición de los adaptadores de rotor de muestra dentro de la centrífuga, y los volúmenes requeridos de los tampones / soluciones dependen de la numero de muestras que están en ejecución.
- Añadir tubos de elución y tubos de filtro a las ranuras correspondientes dentro de los adaptadores de rotor. Para cada muestra, añadir 400 l de la ranura central del adaptador de rotor. Coloque los adaptadores del rotor de la centrífuga estación de trabajo en la disposición correcta de acuerdo con el número de muestras que se purificó.
- Asegúrese de que todas las tapas del tubo de microcentrífuga se fijan correctamente en el adaptador de rotor desde una de no hacerlo podría resultar en la esquila durante una de las etapas de centrifugación del protocolo de purificación.
- Añadir el número requerido de 1.000 ly 200 l de filtro consejos para la estación de trabajo, y rellenar las botellas de amortiguamiento suministrados con el volumen requerido de tampones.
NOTA: Los tampones necesarios para este protocolo de purificación (AL, AW1, AW2, y AE) están contenidos en el kit QIAamp DNA Mini heces. El usuario necesita para suministrar el 100% de etanol que se necesita para el bu AWfertas y como una solución utilizada en el proceso de purificación. - Añadir el volumen requerido de la solución de proteinasa K suministrado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril y colocarlo en la ranura A en la estación de trabajo. Además, añadir el número requerido (igual al número de muestras que se purificada) de 2 ml de seguridad de bloqueo de tubos de muestra de microcentrífuga de RB a la sección de agitador de la estación de trabajo.
- Asegúrese de que las tapas de los tubos de muestra se colocan de forma segura en las ranuras correspondientes en la estación de trabajo, ya que una no hacerlo resultará en un error cuando el equipo escanea inicialmente la estación de trabajo para asegurarse de que todos los plásticos y líquidos necesarios están disponibles para el pedido correr.
- El uso de la pantalla táctil en la estación de trabajo, seleccione el ADN de las heces - Taburete Humano - Protocolo de detección de patógenos, y leer a través de las pantallas siguientes para asegurarse de que la estación de trabajo se ha cargado correctamente. Una vez que todas las pantallas de verificación se pasan, seleccione Inicio para ejecutar este protocolo.
- Si la extracción de ADN de más de 12 muestras, iniciar el proceso de homogeneización (Paso 1) para el siguiente conjunto de muestras, ya que una racha de 12 muestras de toma ~ 72 min para completar en la estación de trabajo.
- Retire las muestras de los adaptadores de rotor, la tapa, y el lugar a -20 ° C hasta que sea necesario para los análisis posteriores posteriores.
- En este punto, combinar los 3 purificaciones repetidas para una muestra individual (un total analizado cantidad = 1 g) usando un sistema de centrifugación / basado en la evaporación. Combinar las repeticiones y re-eluyen a un volumen final de 100 l de tampón Tris-EDTA.
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Representative Results
Para este estudio, los excrementos fecales frescas y muestras de cama se recuperaron de una casa comercial de pollos de engorde (~ 25.000 aves) en el sureste de Estados Unidos. Los pollos (Gallus gallus) fueron Cobb-500 cruza, y eran 59 días de edad en el momento del muestreo. Muestras fecales y basura frescas se recuperaron de cuatro áreas distintas dentro de la casa (cerca de la almohadilla de refrigeración, cerca de las líneas de bebedero / alimentadoras, entre las líneas de bebedero / alimentadoras, y cerca de los extractores de aire), y las muestras de cada una de estas áreas contenían cinco agrupada muestras de dentro de esa área. Las muestras de las cuatro áreas de la casa fueron extraídos y cuantitativamente / cualitativamente analizaron por separado según el tipo de muestra (fecal o basura). Los datos que se presentan a continuación representan los valores medios para toda la casa para los dos tipos de muestras ambientales.
Total de abundancias 16S rDNA, una estimación de la comunidad bacteriana total contenida dentro de una muestra, se determinaron mediante un publicarlo previamenteed protocolo de qPCR 20, y los valores se normalizaron usando la cantidad de ADN recuperado de cada método de extracción (basan en el análisis fluorométrico descrito previamente 21. De los tres métodos de extracción, la Figura 1 muestra que el método mecánico proporcionado constantemente la mayor bacteriana normalizada abundancia total gen estimaciones para ambas muestras fecales y basura (5,85 ± 0,16 y 5,56 ± 0,08 log 10 copias 16S rDNA ng -1 ADN extraído, respectivamente), mientras que, el método enzimático proporciona constantemente las estimaciones fecales y basura más bajas (4,83 ± 0,54 y 4,61 ± 0,13 log 10 copias 16S rDNA ng -1 ADN extraído, respectivamente). El método de extracción híbrida novela produjo normalizados abundancias 16S rDNA que resultaron ser significativamente (p ≤ 0,05) más alto que el método enzimático, pero estadísticamente similar al método mecánico para tanto las muestras fecales y basura (5,50 ± 0,16 y5,23 ± 0,14 log 10 copias de 16S rDNA ng -1 ADN extraído, respectivamente). Por lo tanto, tanto los métodos de extracción mecánicos e híbridos proporcionan una estimación cualitativa mayor de las comunidades bacterianas totales dentro de estas muestras que el método enzimático.
A fin de evaluar cualitativamente las comunidades bacterianas total de cada tipo de muestra y método de extracción, el flujo de trabajo microbiomic como revisado en Navas-Molina et al. (2013) 22 se utilizó. En resumen, la región V4 del gen 16S rRNA se amplificó por PCR con cebadores que contienen adaptadores de secuenciación MiSeq y códigos de barras Golay y se secuenció en la plataforma Illumina MiSeq 23,24. A continuación, los datos de secuenciación prima se procesó en QIIME 1.7.0-dev 25,26,27 utilizando los parámetros por defecto. Secuencia de procesamiento de datos incluye: de filtrado de la calidad; OTU agrupación (referencia abierta al 97% del umbral) usando UCLUST 27; OTU nivel de filtrado abundancia de <0,005% 22, 31; asignación taxonomía utilizando la RDP clasificador contra la base de datos de referencia Greengenes 13_5 28; alineamiento de secuencias con PyNAST 29 contra el núcleo Greengenes establece 28; construcción del árbol filogenético utilizando FastTree 30. El guión core_diversity_analyses.py se utilizó para ejecutar todas las métricas de diversidad beta alfa y generar todas las parcelas, gráficos y estadísticas, a una profundidad de secuenciación de 7.865 secuencias por muestra.
El método de extracción de ADN elegido exhibió una clara influencia en las microbiomas fecales y de camada recuperados. Comenzando en el nivel phylum (Tabla 1), los datos globales (lo que representa para ambas muestras fecales y basura) reveló que los métodos que posea la paso muy perjudicial homogeneización (mecánica, híbrido) comunidades típicamente cedidos con mayores abundancias de filos Gram-positivos (98,0 y 97,49%, respectivamente) en relación con el método enzimático (81,74%). Por el contrario, phyla Gram-negativasrepresentado una parte mucho mayor de la comunidad bacteriana total recuperado del método enzimático (17,49%) en comparación con cualquiera de los (1,89%) o híbridos (2,38%) métodos mecánicos. Este efecto extracción diferencial sobre los perfiles microbiomic generales y la prevalencia de organismos Gram-positivas y Gram-negativas se demostró eficaz a nivel de género (Figura 2) .Los métodos mecánicos e híbridos producidos perfiles microbiomic relativamente similares, mientras que el método enzimático mostró microbioma una distribución diferente de la abundancia relativa de los taxones recuperado. Por ejemplo, Alistipes Gram-negativas spp.in las muestras de heces (el bloque de color rojo con el A; 7,71% de la comunidad total) extrajeron mediante el método enzimático se reduce drásticamente en las huellas dactilares de los otros dos métodos de extracción (flechas rojas; 0,47 -0,81%), pero el Gram-positivo Lactobacillus spp. (Bloque grande púrpura con la L) era mucho más frecuente se reduce cuando se utiliza el enzmétodo ymatic (42,71%) en comparación con los métodos mecánicos o híbridos (57,22% y 61,85%, respectivamente). No obstante, mientras que la abundancia relativa de los taxones exhiben algunas diferencias entre los tres métodos de extracción, el número total de taxones descubierto fueron similares para los tres métodos, tanto para la materia fecal (92 de 112 taxones) y hojarasca (96 de 112 taxones).
El método enzimático produjo consistentemente las comunidades bacterianas con la mayor riqueza, diversidad y equitatividad (utilizando el Chao1, filogenético diversidad y equitatividad métricas, respectivamente), tanto para las muestras fecales y basura, con el método mecánico que muestran consistentemente las estimaciones más bajas para estos ecológica parámetros (Tabla 2). El método híbrido demostró consistentemente métricas ecológicos intermediario para los otros dos métodos. Estadísticamente, las estimaciones ecológicos de todas las muestras, independientemente del método de extracción, se encontró que eran similares, aunque método enzimáticodio lugar a una (p = 0,045) microbioma significativamente más rica en comparación con el método mecánico cuando se analizan las muestras de cama. Si bien no se encontraron otras diferencias significativas entre los métodos de extracción, las mayores diferencias entre los parámetros ecológicos se encuentran típicamente entre el enzimática y métodos mecánicos, con el método híbrido realizar igualmente bien a los otros dos métodos; similar a la evaluación cuantitativa de estos métodos de extracción (Figura 1).
Figura 1. cualitativa comparación comunidad bacteriana basan en métodos de extracción de ADN. Las columnas representan la media log 10 -transformmed 16S rRNA copias de genes determinados por qPCR normalizada contra la cantidad de ADN recuperado de (barras sólidas) fecales o basura (barras punteadas) muestra ( basado en la determinación fluorométrica). Thmétodo de extracción de ADN e utilizado para obtener estos valores se indica en el eje x. Las barras de error representan la desviación estándar entre 4 muestras repetidas. Para cada tipo de muestra (heces o la litera), las cartas encima de las columnas representan significativamente diferentes medios sobre la base de un solo sentido el análisis de ANOVA utilizando la prueba de comparación múltiple de Tukey (p = 0.05).
Figura 2. a nivel de género comparación microbiomic de los métodos de extracción de ADN. Cada columna representa la comunidad promedio total bacteriana (basado en gen 16S rRNA datos Illumina MiSeq) de taxones recuperados para cada método de extracción de las heces (primeros tres columnas) y basura ( tres últimas columnas) muestras. Cada columna representa la media de cuatro muestras diferentes de áreas distintas dentro de la casa de pollos de engorde. La carta en la base de las columnas indica el extrmétodo de acción (M = Mecánica, E = enzimática, H = Híbrido). Los diferentes colores en cada columna representan la abundancia relativa de un género dentro de la comunidad general, y color para cada géneros es el mismo para todas las columnas.
Tabla 1.-nivel Filo comparación microbiomic de los métodos de extracción de ADN. Abundancias relativas (% total de secuencias recuperado) para cada método de extracción de ADN del 2 Gram-positivos (actinomicetos y Firmicutes) y 3 Gram-negativas (Bacteriodetes, Proteobacteria, Tenericutes) phyla recuperado a partir del análisis microbiomic de ambos tipos de muestras.
Tabla 2. Las comparaciones por pares de r ichness, Diversidad, equitatividad y estimaciones para los métodos de extracción de ADN de tres basados en la comunidad bacteriana microbiomic-nivel de género análisis utilizando QIIME. Para ambos tipos de muestras, se realizaron comparaciones por pares para las tres posibles combinaciones de métodos de extracción. El total de los parámetros de la comunidad bacteriana evaluados incluyen riqueza (α-diversidad basada en la estadística Chao1), la diversidad (β-diversidad basada en la estadística filogenético Diversidad), y la uniformidad (basado en la estadística de equidad). Los valores representan la media (desviación estándar) de 4 muestras área distinta dentro de la nave de pollos, y una α = 0,05 se utilizó para determinar la significación entre las comparaciones por pares. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.
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Discussion
El método de extracción de ADN utilizado efectuarse las estimaciones totales de la comunidad bacteriana cuantitativos y cualitativos, tanto para las muestras fecales y basura, el apoyo a la muestra analiza la naturaleza depende de los métodos de extracción de ADN visto previamente 1,3,6. Tanto para las muestras fecales y basura, el orden de actuación de los métodos de extracción de ADN fue diferente para la cuantitativa (mecánica> Híbrido> enzimática) y el cualitativo (Enzimática> Híbrido> Mecánica) estimaciones totales de la comunidad bacteriana. Mientras que el método híbrido no produjo las más altas estimaciones cuantitativas o cualitativas, en ambos casos el método híbrido produjo resultados que fueron estadísticamente similar al método de mayor rendimiento de extracción (Figura 1, Tabla 2), produciendo de esta manera la mejor combinación del total cualitativa y cuantitativa estimaciones de la comunidad bacteriana de los tres métodos de extracción de prueba. Cabe señalar que ne profil comunidad bacterianaES pueden ser fuertemente efectuarse por el método de extracción de ADN, como se ve en los resultados de este estudio (Figura 2, Tabla 1) y otros estudios anteriores utilizando muestras ambientales 4,5,8,9,11,12, y estos efectos diferenciales de mayo fuertemente influir en el análisis e interpretación de los datos del estudio. Sabiendo esto, los investigadores deben considerar seriamente el método de extracción adecuado para sus tipos de muestras y objetivos experimentales sobre una base de estudio por estudio.
Un paso clave para la eficacia del nuevo método híbrido es la etapa de homogeneización de gran alcance para ayudar en gran medida no sólo en la liberación de células bacterianas de las complejas matrices / suelo fecales, sino también para romper las paredes celulares más duras de miembros de la comunidad Gram-positivas . Las estimaciones cuantitativas mayores (Figura 1) y la mayor proporción de Gram-positivo Actinobacteria y Firmicutes dentro de los microbiomas para ambos métodos de extracción que utilizan este paso de homogeneización (
Este método, que se describe, contiene algunos requisitos específicos de los cuales los usuarios deben ser conscientes. En primer lugar es el uso de un homogeneizador de alta potencia, así como algunos componentes de un kit de extracción comercialmente disponibles. Estudios anteriores demostraron que otros pasos mecánica talón de latir o homogeneizadores de alto poder mejorar la eficiencia de la extracción de ADN y producen 4,5,9; por lo tanto, un tipo diferente de etapa de homogeneización mecánica podría integrarse en el método de extracción híbrido (aunque puede ser necesario el uso de equipo especializado diferente). El método híbrido descrito aquí también utiliza los tubos de talón-golpear que están diseñados específicamente para el homogeneizador y específico para muestras ambientales debido al éxito de esta matriz lisis en los estudios comunitarios anteriores a partir de muestras de aves de corral 15, 31-33. Finalmente, se requiere que el "patrón oro" método de extracción de ADN enzimática (heces Mini Kit QIAamp DNA) para la purificación enzimática de la muestra de ADN en el protocolo híbrido, ya que se ha demostrado que el método de extracción enzimática más eficaz cuando se utiliza muestras fecales 3,18,19. Si bien no se requiere el uso de la estación de trabajo robótica (instrucciones con el kit se pueden realizar a mano), el uso de la estación de trabajo robótica aumenta en gran medida el rendimiento, minimiza el error de procesamiento, y los resultados en el ADN de mayor calidad para su posterior análisis aguas abajo 7. La automatización de este tipo, utilizando los kits mecánicos existentes no está disponible actualmente, lo que representa otra ventaja del método híbrido.
Actualmente, la estación de trabajo robótica se describe en este protocolo se limita a procesar un máximo de 12 muestras en 72 min, pero el trabajo preliminar ha demostrado que este método funciona igual de bien en el puesto de t mayor rendimientoen que puede procesar 96 muestras dentro de 40 min (datos no mostrados). La prueba adicional de esta opción rendimiento mucho más alto mejorará en gran medida la eficacia del método híbrido desde más muestras podrían ser procesados de una manera semi-automatizado dentro de un día típico. Además, los datos preliminares utilizando este método de extracción de ADN novela ha demostrado que es eficaz para otras muestras relacionadas de aves de corral (por ejemplo, enjuagues piel / plumas, enjuagues de carcasa, homogeneizados de contenido cecal), así como otros tipos de muestras ambientales (por ejemplo, los suelos agrícolas , heces porcinas, heces de caballos, heces de cabra, heces bovinas). Por lo tanto, necesitarán futuros estudios para determinar la eficacia de este método híbrido para la extracción de ADN de muchas muestras agrícolas y ambientales. Además validación de este método por futuros estudios sería potencialmente permitir una adopción más amplia de este método para la evaluación de las comunidades bacterianas totales de una variedad de entornos agrícolas y ambientales.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysing Matrix E tube | MPBio | 6914-050 | Different sizes available and the last 3 numbers of the cat. No. indicate size (-050 = 50 tubes, -200 = 200 tubes, -1000 = 1,000 tubes) |
| Sodium Phosphate Solution | MPBio | 6570-205 | Can be purchased individually, or also contained within the FastDNA Spin Kit for feces (Cat. No. 116570200) |
| PLS Buffer | MPBio | 6570-201 | |
| Buffer ASL (560 ml) | Qiagen | 19082 | |
| FastPrep 24 homogenizer | MPBio | 116004500 | 48 x 2 ml HiPrep adapter (Cat. No. 116002527) available to double throughput of mechanical homogenization step |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | Qiagen | 51504 | |
| QIAcube24 (110V) | Qiagen | 9001292 | Preliminary results show that QIAcube HT (Cat. No. 9001793) can be used to improve throughput, but different consumables are required of this machine and more comparative work needs to be done. |
| Filter-Tips, 1,000 ml (1024) | Qiagen | 990352 | |
| Filter-Tips, 200 ml (1024) | Qiagen | 990332 | |
| QIAcube Rotor Adapters (10 x 24) | Qiagen | 990394 | For 1.5 ml microcentrifuge tubes included with in the rotor adapter kit there is an alternative. It is Sarstedt Micro tube 1.5 ml Safety Cap, Cat. No. 72.690 |
| Sample Tubes RB (2 ml) | Qiagen | 990381 | Alternative: Eppendorf Safe-Lok micro test tube, Cat. No. 022363352 |
References
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