Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

בודה מצעים מורכבים תרבות באמצעות רובוטית microcontact הדפסה (R-μCP) והתמר נוקלאופילית סדרתית

Published: October 31, 2014 doi: 10.3791/52186
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin, Madison, 2Department of Mechanical Engineering, University of Wisconsin, Madison
* These authors contributed equally

Introduction

היכולת של משטחים מורכבים-PEG להציג הליגנדים ביוכימיים קוולנטית כרוכים בו-זמנית, תוך שמירה על מאפייני עכירות שאינן טבועים להפוך אותם בחירה אידיאלית עבור סביבות מיקרוסקופיות מותאמות אישית הנדסה על מצעי תרבות 1,2,3. אינטראקציות biospecific מתווכות על ידי מברשות PEG יגנד מצומדות מאפשרת ניתוח מצמצם של ההשפעות של יוכימיים רמזים שנמצאו בתוך מתחם במייקרו-סביבות רקמות vivo על פנוטיפים תא בודדים. יתר על כן, ניתן להשתמש chemistries "לחץ" ביו-מאונך כדי להקל על חוסר תנועה כיוונית של הליגנדים, כך שהם מוצגים בתצורות ילידי 4-6. כך, דפוסים מרחביים מיקרוסקופים של PEG מברשות הוא כלי תכליתי ליצירת מעצב בנישות מבחנה לחקור איתות תא הנגרמת על ידי רמזים ביוכימיים משותקים 6,7.

שיטה נפוצה ליצירת תבניות המרחביות של מ"ק ביוכימייםes כרוך מצעים מצופים זהב הדפסת microcontact (μCP) עם דפוסי alkanethiols מצומדות PEG. ואז, monolayers micropatterned העצמי התאספו (טילי הקרקע-האוויר) של alkanethiols ylated-PEG מגביל ספיחה פיזית של מולקולות ביוכימיות, למשל, חלבונים, רק לאזורים בדוגמת שאינה של המצע 8,9. עם זאת, טילי הקרקע-האוויר שנוצרו על ידי טכניקה זו הן רגישות לחמצון בתרבית תאי תקשורת לטווח ארוך. כך, μCP'd alkanethiol טילי הקרקע-האוויר לעתים קרובות מורכב עוד יותר עם ​​מברשות פולימר PEG באמצעות פילמור הרדיקלי העברת אטום ביוזמת פני השטח (SI-ATRP) כדי להגביר את היציבות שאינה מזהמת את האזור 10. באופן ספציפי, μCP של יוזם פילמור alkanethiol, bromoisobutyrate ω-meraptoundecyl, על משטחים מצופים זהב ואחריו SI-ATRP של פולי (אתילן גליקול) methacrylate אתר מתיל (PEGMEMA) מונומרים יוצר משטחים עם טווח ארוך micropatterned, יציב, ושאינה עכירות PEG מברשות. יתר על כן, אלה הם מסוגלים להיות שונה יותר להציג moieties הכימית מגוון 11.

ניצול של נכס זה, שא et. אל. פיתח שיטה להנדס מצעי תרבות עם מברשות PEGMEMA multicomponent הצגת chemistries "לחץ" מאונך. בשיטה זו, הם משתמשים בסדרה של צעדי μCP / SI-ATRP ביניהם אזיד הנתרן רציף, ethanolamine, וpropargylamine החלפות nucleophilic ליצור מצעי תרבות מציגים דפוסים מיקרוסקופים של הליגנדים משותקים מרובים 6. בעוד שהפוטנציאל של שימוש chemistries כזה בשיתוף עם μCP מדריך ללהנדס מצעי תרבות רומן הוא עצום, הוא מוגבל על ידי הדיוק ואת הדיוק שבה ניתן ליישר צעדי μCP מרובים על מצע אחד. רמה גבוהה של דיוק ודיוק היה נדרשת לייצור reproducibly מורכב בנישות מבחנה תוך שימוש בטכניקות מגוונות אלה.

e_content "> כדי לטפל במגבלה זו, מספר מערכות μCP אוטומטית וחצי אוטומטי שנוצרו. צ'אקרה et. al. פיתחו מערכת μCP בי בולים מותאמים אישית מונחים על מערכת רכבות והביאו במגע קונפורמי עם מגלשות מצופים זהב באמצעות מפעיל פנאומטי מבוקרת מחשב. עם זאת, שיטה זו דורשת ייצור המדויק של עיצובי בולים מותאמים אישית ומדווח 10 מיקרומטר דיוק ללא דו"ח של הדיוק שהושג בעת ביצוע μCP מרובה השלבים 12. לאחרונה, שיטת ניצול מערכת צימוד kinematic משולבת דיוק שדווח להלן 1 מיקרומטר באמצעות דפוס בודד, אבל לא הצליחו ליישר במדויק דפוסים מרובים בשל חוסר השליטה מדויקת של תכונות חותמת מעובש לעצב 13. בנוסף, בשתי השיטות הקודמות דורשים מצע ליישארו קבועים בין צעדי דפוסים , וכך להגביל את מגוון chemistries שינוי פני השטח שיכול להיות משמעותימנוצל. כאן, אנו מתארים מערכת R-μCP אוטומטית מסוגל יישור מדויק ומדויק של צעדי μCP מרובים תוך מתן גמישות מירבית בעיצוב בולים וייצור. יתר על כן, מצעים בדוגמת ניתן להסיר שוב ושוב מהמערכת בין stampings, ובכך לאפשר את שימוש בchemistries שינוי המצע מגוון, כוללים החלפות nucleophilic רציפות. מצעים שהונדסו בשיטות chemistries כזה כבר נעשו שימוש בתרבית תאים בעבר על ידי שנינו 6,14 ואחרים 7. כך, יש לנו התמזגו R-μCP ותגובות התמר נוקלאופילית רציפות לפתח שיטה לייצור להרחבה של מצעי תרבות עם רמזים ביוכימיים מורכבים וmicropatterned.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בולים יצירת אלסטומרי

  1. כדי ליצור אדוני סיליקון של חותמת PDMS, לעצב דפוסי התכונה של photomask באמצעות תוכנת תכנון בעזרת מחשב.
    1. לעצב את הדפוס הראשון כ20 x 20 מערך של annuli עם 300 מיקרומטר קוטר פנימי (ID) וOD מיקרומטר 600 עם 1,200 מיקרומטר מרווח מרכז למרכז.
    2. לעצב את הדפוס השני כ20 x 20 מערך של annuli עם 600 מזהה מיקרומטר וOD מיקרומטר 900 עם 1,200 מיקרומטר מרווח מרכז למרכז.
    3. בנוסף, מקום 1 x 1 מ"מ 2 סימני התייחסות רבועים בכל ארבע הפינות של כל עיצוב מערך המרווחים 1,200 מיקרומטר מרכז למרכז מדפוס הפינה בזווית של 45 מעלות.
    4. לפברק את אדוני סיליקון לשימוש בניסוי זה עם 1: 1 יחס רוחב-גובה, המקשר לעומק תכונה 300 מיקרומטר תוך שימוש בטכניקות ליתוגרפיה סטנדרטית מפורטות במקום אחר 15 או בשיתוף פעולה עם בית יציקה microfluidic.
      הערה: תכונת עומקים נמוכים מ -100 מיקרומטר יכולים להוביל לעיוות חריגה של בולים לפני מגע עם משטחי מצע.
      הערה: פרוטוקול זה מתחיל שביש אדוני סיליקון כבר הושגו עם הדפוסים שתוארו של photoresist, אשר דורשים ציוד מיוחד וחדרים נקיים ליצור. עדיף להתייעץ עם מתקן מפברק או ליבה ליצור מאסטרים בדוגמת אלה.
  2. אדוני סיליקון Silanize O / N על ידי דגירה עם אדים (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydroocty) trichlorosilane.
    הערה: אדי Silane הוא רעילים ביותר ויש לטפל רק במנדף הכימי.
  3. ליצור העתקים הפוכות של אדוני סיליקון על ידי ריפוי 10: 1 של PDMS מראש פולימר וPDMS סוכן ריפוי על גבי אדוני סיליקון silanized בO צלחת פטרי / N ב 60 ° C.
  4. הסר את בולי PDMS מן המאסטרים סיליקון, ואג"ח הבולים לאקריל ניטריל acrylonitrile רפידות (ABS) או כל חומר קשיח אחרs באמצעות דבק.
    הערה: החומר של בחירה לא צריך להיות שקוף או ביולוגית. עם זאת, הוא חייב לספק משטח שטוח לממשק עם נוסע רובוטית וקשיחות גבוהה יותר מPDMS.

2. Coverslides הכנה

  1. coverslides לשטוף מיקרוסקופ (24 מ"מ x 50 # 1 מ"מ) בטולואן, מתנול וsonicate באצטון 1 דקות לפני השטיפה עם אתנול וייבוש תחת זרם חנקן עדין.
    הערה: ידית טולואן ואצטון רק במנדף הכימי.
  2. coverslides מעיל עם ~ 3.5 טיטניום ננומטר (TI) ואחריו 18.0 זהב ננומטר (Au) באמצעות מאייד אלומת אלקטרונים ממוקד.
    הערה: הליך זה תואם עם מגוון רחב של מצעים מצופים זהב כוללים סיליקון וקלקר. למרות שניתן ליצור אלה באתר, מצעים מצופים זהב זמינים גם באמצעות ספקים מסחריים.
    הערה: שכבות Ti צריכה להיות לפחות 3 ננומטר עבה, בעוד ששכבות Au על מצעים צריכה להיותt לפחות 5 ננומטר עבה ויכולים לנוע כל הדרך עד 1 מ"מ בעובי בהתאם לתכונות אופטיות האידיאלית של המצע הסופי 16,17. מצעים אינם נדרשים להיות ברור אופטי לייצור; עם זאת, הוא מאפשר בדיקה מיקרוסקופית של מצעים מפוברקים.
  3. יש לשטוף coverslides מצופה זהב עם אתנול ויבש תחת חנקן עדין מייד לפני השימוש.

3. R-μCP של annulus החיצוני

  1. לפני R-μCP עם המערכת באופן סלקטיבי תואמת זרוע רובוט ניסחה (SCARA), לכייל את effectors רובוטית הכלי ומערכות מצלמה כפולה נלוות באמצעות התוכנה של המערכת.
    הערה: מכשירים אלה הם בתמונה באיור 1.

איור 1
מערכת באיור 1. R-μCP ורובוטיק נוסע זרוע. (ב) נוסע זרוע רובוטית המתאר (ו) כלי תחריט שקצהו יהלום וכלי יניקת פנאומטי מחזיק חותמת PDMS (ח) מגובי ABS (ז).

  1. באופן ידני לשים בול PDMS עם 600 מזהה מיקרומטר ו -900 OD מיקרומטר בולט annuli עם הפנים כלפי מטה במתקן קינון חותמת. באופן ידני למקם coverslide מצופה זהב נוקה לאחרונה על גבי צ'אק הוואקום, מוצג באיור 1 א, ולשתק אותו באמצעות ואקום המעבדה המחובר.
  2. שימוש בפקדי הרובוט, ליישר את המצלמה כלפי מטה למול נקודת coverslide מצופה זהב המרכז, כמו באיור 2 א.
    הערה: נקודה זו התחלה יכולה להיות מוגדרת על ידי בדיקה ויזואלית ואינה דורשת דיוק רב, כמו חותמת PDMS היא הרבה largאה מ השקופית מצופה זהב.
  3. הדרך את הזרוע הרובוטית כדי לחרוט ארבע התייחסות "X" סימנים בקודקודים של ריבוע עם ממדים 3.8 מ"מ של 3.8 מ"מ במרכז בcoverslide מצופה הזהב באמצעות כלי תחריט שקצהו היהלום הצמוד לזרוע רובוטית. (מתואר באיור 2; תהליך אוטומטי)
    הערה: זו מבטיחה שכל ארבעת סימני ההתייחסות נמצאים במסגרת חזותית אחד של המצלמה פונה כלפי מטה.
  4. השימוש ברובוטים נוסע יניקת פנאומטי, איסוף ולהחזיק PDMS להחתים 1 מ"מ מעל מתקן קינון חותמת כמו באיור 2 ג. (תהליך אוטומטי)
  5. שימוש במצלמה כלפי מעלה מול וטבעת תאורת LED בתמונה באיור 2 ד ו E, לדמיין סימני ההתייחסות מרובעת של הבולים ולזהות אותם עם תוכנת המצלמה 10 פעמים על מנת לקבוע X הממוצע של הבול, Y, וזוויתי לקזז מהמרכז ציר נוסע רובוט. (תהליך אוטומטי)
  6. כמו ב הערה: חישוב פנימי מבוצע על ידי התוכנה של מערכת רובוטית כדי ליישר בדיוק של הבולים וX של coverslip, מקומות מרכז Y וקיזוזים זוויתי בצעדי R-μCP עתיד.
  7. 3.8) מניחים את החותמת באמבט של alkanethiol יוזם ATRP, bromoisobutyrate ω-mercaptoundecyl (2 מ"מ באתנול) כמתואר באיור 2F. (תהליך אוטומטי)
  8. הסר את החותמת מפתרון alkanethiol ומניח מעל זרם חנקן הדחוס כדי 0.48 בר (5 psi) להתאדות אתנול כמו באיור 2G. לאחר 1 דקות להגביר את הלחץ של זרם החנקן הוא 1.03 בר (15 psi) כדי להבטיח יובש אחיד. (תהליך אוטומטי)
    הערה: הייבוש חלקי יגרום לאובדן מוחלט או חלקי של נאמנות דפוס.
  9. לאחר ייבוש, להעביר את החותמת על עמדת המרכז המחושבת של השקופית מצופה זהב ומוריד אותה ב 100 מיקרומטר במרווחים תוך מעקב כוח מנוע ציר Z-כמתואר באיור 2H.
    הערה: זה מועבר כמומנט שחווה את מנוע ציר Z-ומוצג בתוכנת הדרכת רובוט. (תהליך אוטומטי)
  10. להפסיק הורדת החותמת פעם הלחץ הקבוע מראש של 79.2 kPa הושג, ולשמור על קשר עם השקופיות מצופים זהב במשך 15 שניות. (תהליך אוטומטי)
    הערה: ערכי הלחץ כאן מותאמים לגובה עיצוב בול והתכונה הנוכחי. אם עיצוב הבול משתנה, במיוחד עבור בולי יחס רוחב-גובה גבוה, מנגינה בהתאם אלה בתהליך של ניסוי והטעייה.
  11. לאט לאט להסיר את החותמת מהשקופית מצופה זהב ולמקם את החותמת בחזרה במתקן קינון חותמת. (תהליך אוטומטי)
    12. 4. SI-ATRP של PEGMEMA על Coverslides micropatterned

    1. לשחרר לחץ ואקום מחזיק coverslide micropatterned, ולהעביר אותו לבקבוק Schlenk 50 מיליליטר. חותם ודגת Schlenk בקבוקון באמצעות משאבת ואקום.
    2. להוסיף 5.5 מיליליטר של תערובת תגובת ATRP מכילה macromonomer PEGMEMA (208.75 mmol), מים (34.4 מיליליטר), מתנול (43.8 מיליליטר), נחושת (II) ברומיד (mmol 1), ו- 2 ', 2-bipyridine (3 mmol) ל בקבוק Schlenk.
    3. הוסף 0.5 מיליליטר של ascorbate L-נתרן (454.3 מ"מ) במים כדי ליזום את התגובה, ותאפשר לה להמשיך במשך 16 שעות ב RT תחת גז אינרטי.
      הערה: בעקבות תוספת של ascorbate L-נתרן, צבע תגובה תעבור מהצבע הירוק בהיר עד חום כהה, כפי שמוצגת באיור 3 א-B.
      הערה: התגובה יכולה להמשיך מעבר 16 שעות, אבל זה לא יהיה להגדיל את האורך של מברשות PEG באופן משמעותי.

    איור 3. ייזום של SI-ATRP. () ייזום של תגובה ושינוי צבע שלאחר מכן (ב ') לאחר תוספת של ascorbate L-נתרן. תמונה (C) מיקרוסקופים של משטח coverslide micropatterned ביצוע הליך SI-ATRP. סרגל קנה מידה של 1 מ"מ.

    1. הסר את coverslide micropatterned מהבקבוק שנק ולשטוף עם אתנול, מים, ואתנול ויבש תחת זרם חנקן עדין.
      הערה: בעקבות SI-ATRP, שינויי משטח צריכה להיות גלויות לעין וניתן הדמיה ונותחו תחת מיקרוסקופ כמו באיור 3 ג.
      הערה: זוהי השיטה הפשוטה ביותר כדי לבדוק את הדיוק של המשפט כפי שהוא מייתר את הצורך לimmunostain מצעים.

    5. Functionalization יזיד של שרשרות micropatterned PEGMEMA

    1. הנח את coverslide micropatterned בבקבוקון זכוכית תגובת 20 מיליליטר.
    2. הוסף 6 מיליליטר של N, N -dimethylformamide (DMF) מכיל 100 אזיד הנתרן מ"מ לבקבוקון התגובה. לשמור על תגובה זו על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
      הערה: ידית DMF רק במנדף הכימי. נהג במשנה זהירות כאשר משקל את אזיד הנתרן.
    3. בסיום, להסיר את coverslide micropatterned מבקבוקון התגובה ולשטוף עם אתנול ואז מים ויבשים תחת זרם חנקן.

    6. פסיבציה של שרשרות ברום פונקציונליות PEGMEMA

    1. הנח coverslide micropatterned בבקבוקוני זכוכית תגובת 20 מיליליטר.
    2. הוסף 6 מיליליטר של sulfoxide דימתיל (DMSO) המכיל 100 ethanolamine מ"מ ו -300 מ"מ triethylamine לבקבוקון התגובה. החזק את התגובה הזאת ב 40 ° C למשך 24 שעות.
      הערה: ידית DMSO, ethanolamine, וtriethylamine רק במנדף הכימי.
    3. עם ההשלמה להסיר את coversl micropatternedIDE מבקבוקון התגובה, לשטוף עם אתנול ואז מים ויבשים תחת זרם חנקן.

    7. R-μCP של annulus הפנימי וSI-ATRP של PEGMEMA

    1. לבצע צעדי R-μCP כפי שתואר לעיל בצעדים 3.2 ו3.6-3.12, החלפת חותמת PDMS עם 300 annuli OD הבולט מיקרומטר מזהה ו 600 מיקרומטר, כך שannuli עם תכונות קטנות ממוקמים בתוך annuli micropatterned בעבר.
      הערה: סף הלחץ בבול זה הוא 132.0 kPa. כפי שהוזכר קודם לכן, הגדרות לחץ אלה הינן אופטימליות לתכונות חותמות בשימוש בניסוי זה.
    2. לבצע צעדי SI-ATRP כפי שתואר לעיל בצעדים 4.1-4.4.

    8. אצטילן Functionalization של שרשרות micropatterned PEGMEMA

    1. הנח coverslide micropatterned בבקבוקון זכוכית תגובת 20 מיליליטר.
    2. הוסף 6 מיליליטר של DMSO המכיל 100 מ"מpropargylamine לבקבוקון התגובה. לשמור על תגובה זו ב RT למשך 24 שעות.
      הערה: ידית DMSO וpropargylamine רק במנדף הכימי.
    3. עם ההשלמה להסיר את coverslide micropatterned מבקבוקון התגובה ולשטוף עם אתנול ואז מים ויבשים תחת זרם חנקן.

    9.-catalyzed נחושת "לחץ" biotinylation של אצטילן הסתיים בשרשרות PEGMEMA

    1. הנח coverslide micropatterned בבקבוקון זכוכית תגובת 20 מיליליטר.
    2. להוסיף 6 מיליליטר של נחושת גופרתית (15 מ"מ) / טריס [(1-בנזיל-1 H -1,2,3-triazol-4 י.ל.-) מתיל] אמין (TBTA, 30 מ"מ) (1: 1 v / במים • / DMF) מכיל 562 מיקרומטר המצומד אזיד-PEG 4 -Biotin לבקבוקון התגובה. להוסיף 1.2 מיליליטר של חומצת L-אסקורבית (0.15 מ"מ) במים לתערובת כדי לאתחל את התגובה.
    3. חנקן בועה באמצעות פתרון התגובה עבור 10 שניות, לאטום את הבקבוקון עם Parafilm, ולהגיב למשך 24 שעות ב RT.
    4. על completion להסיר coverslide micropatterned מבקבוקון התגובה, לשטוף עם מים ומניחים אותו בצלחת קלקר 12 גם.

    10. Immunofluorescent איתור של קבוצות אצטילן Biotinylated

    1. לחסום coverslide micropatterned בDPBS (3% חמורים בדם) במשך שעה 1 ב RT. כתם לקבוצות אצטילן biotinylated עם המצומד streptavidin-546 (2 מיקרוגרם / מיליליטר) בDBPS (3% חמורים בדם בPBS) לשעה 2 ב RT.
    2. יש לשטוף coverslide micropatterned 5 פעמים עם DPBS במשך 10 דקות עם תסיסה עדינה.
      הערה: איור 4 מתארים תמונה של השקופית לאחר שלב זה הושלם.

    11. נחושת חופשית "לחץ" biotinylation של יזיד הסתיים בשרשרות PEGMEMA

    הערה: אם תרצו, ניתן לבצע צעד שינוי המצע הזה באתר בתרבית תאים.

    1. השאר coverslide micropatterned ב12 גם pDBPS הבא המנה olystyrene שטיפות.
    2. הוסף 2 מיליליטר של DBPS (או תרבית תאי תקשורת) המכיל 20 מיקרומטר 4 DBCO-PEG -Biotin, ולאפשר תגובה זו להימשך 24 שעות על RT (או על 37 מעלות צלזיוס בחממה).
    3. בסיום, לשטוף coverslide micropatterned 5 פעמים עם DPBS (או פשוט לבצע שינוי תקשורת).

    12. Immunofluorescent איתור של קבוצות יזידו Biotinylated

    1. כתם לקבוצות אזיד biotinylated עם המצומד streptavidin-488 (2 מיקרוגרם / מיליליטר) ב 2 DPBS מיליליטר (3% חמורים בדם) לשעה 2 ב RT.
    2. יש לשטוף coverslide micropatterned 5 פעמים בDPBS במשך 10 דקות עם תסיסה עדינה.
    3. תמונת micropatterned coverslide באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal. איור 4 א-C מתארת ​​תמונות של השקופית לאחר שלב זה הושלם.
      הערה: בעת שימוש מצעים למבחני תרבית רקמה, לדלג סעיפים 10 ו -12 של פרוטוקול זה. לאחר degre הרצוידואר של functionalization, לעקר את coverslide המהונדס על ידי שטיפת שני הצדדים עם 100% אתנול וייבוש תחת זרם חנקן. העבר את השקופית לארון בטיחות ביולוגית סטרילי ולשטוף את השקופיות עם PBS חמש פעמים לפני שתמשיך עם זריעת תאים ותרבות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השימוש בטכניקות μCP היישור ידניים להנדס מצעי תרבות עם מערכים של מברשות שהושתלו PEG פונקציונליות עם מאונך "לחץ" chemistries הוכח בעבודות קודמות 6. עם זאת, זה מציע שליטה מינימאלית של התמצאות דפוס ולעתים קרובות תוצאות חפיפה של התחומים פונקציונליות. כאן, מערכת R-μCP רומן משמשת כדי להתגבר על מגבלה זו, ואת יכולתו בצורה מדויקת תבנית מערך של annuli מברשת PEG עם 300 מיקרומטר מזהה ו -600 OD מיקרומטר הצגת קבוצות alkyne מסוף בתוך מערך נפרד של annuli מברשת PEG עם 600 מיקרומטר OD ID ו -900 מיקרומטר הצגת קבוצות אזיד מסוף הפגין 14. בעקבות התגובה של alkyne הצגת PEG מברשות עם תזיד-PEG 3 -Biotin והתגובה של אזיד הצגת PEG מברשות עם DBCO-PEG 4 -Biotin, מצע immunostained עם בדיקות ניאון וצלם באמצעות מיקרוסקופ confocal (Figure 4). ניתוח של תמונות אלה באמצעות תכנית MATLAB מותאמת אישית חשבה ומצאה כי שני מערכי מברשת PEG היו מיושרים עם דיוק תת-10 מיקרומטר, כלומר, X ~ 6.4 מיקרומטר, Y ~ 1.7 מיקרומטר, וθ ~ 0.02 מעלות, שהוא ביצרן של ציטט גבול במודל שלנו SCARA (כלומר, ~ 10 מיקרומטר) ומעיד על הביצועים הקודמים של מערכת R-μCP 14. כך, אנו מאמינים כי השימוש בSCARAs גבוה יותר בסוף במערכת זו יספק רזולוציה נמוכה עוד יותר, תת-מיקרון. תוצאות אלו מראות יכולות הנדסי מצע רב-תכליתיות מופעלות על ידי השימוש בשילוב של מערכת R-μCP ותגובות התמר נוקלאופילית רציפות. תגובתיות הצולבת המינימלית שמעידה תיוג ניאון של הכימיקלים במשטח מאונך ממחישה את הפוטנציאל של מערכת זו לקיבוע מדויק של רמזים ביוכימיים לייצר מצעי תרבות מורכבים עבור יישומי הנדסת רקמות. </ P>

איור 2
איור 2. סכמטי של תהליך R-μCP. (א) כלפי מטה מול המצלמה חזותית שקופיות מצופים זהב משותק, סימני התייחסות (ב) תחריט על coverslide מצופה זהב, (ג) הסרת חותמת PDMS ממתקן קינון חותמת, (D - E) חזותי סימני התייחסות חותמת PDMS עם מצלמה כלפי מעלה מול , (ו) הצבת חותמת PDMS בalkanethiol אמבטיה יוזם, ייבוש (G) alkanethiol יוזם ממס על זרמי חנקן, והטבעת חותמת (H) alkanethiol מצופה PDMS על coverslide מצופה זהב.

איור 4
תמונות איור 4. immunostained של שקופיות micropatterned. ו- (ב) קבוצות alkyne, biotinylated באמצעות כימיה לחיצת נחושת חופשית ותיווך נחושת, וזוהה עם streptavidin-488 ו-546 בהתאמה. (C) כיסוי של שני ערוצי הניאון. כל קנה המידה אוסרת 500 מיקרומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מצעים אידיאליים עבור הנדסת רקמות יהיו bioinspired ובכך לשחזר את ההתפלגות המרחבית של ביו הליגנדים קריטיים נמצאים בתוך הרקמות המקומיות. הם גם היו בעלי תכונות דינמיות המאפשרות התאמות זמניות של הליגנדים ודפוסי המרחב שבו הם מוצגים כדי לאפשר המורפוגנזה רקמה ביימה ומרחבית מוגבלת אינדוקציה של גורל תא. ייצור של מצעים כזה דורש הקיבוע של רמזים ביוכימיים רבים בכיוונים מורכבים והורה מאוד על מצעים. בעוד מדמים את כל הגורמים במשק של הנישה של תאים במבחנה אינו סביר, מערכת R-μCP המתוארת כאן מאפשרת קיבוע של אזורים המרובים של chemistries ביו מאונך עם שליטה מיקרוסקופית של התמצאות במרחב.

השירות של עליות אלה מצעים נוספים כאשר בהתחשב בכך שבעוד שמערכי מברשת PEG כרוכים בהליגנדים משותקיםיכול לעורר אינטראקציות biospecific, מברשות PEG מאוגד יישארו עמידות בפני ספיחת חלבון ובכך יכולות לשמש כדי לשלוט בהדבקת תא והגירה. למרות ספיחה פסיבית, micropatterned של מטריצת חוץ-תאית חלבונים (ECM) או הטיות פולימר-PEG היא שיטה פשוטה לשליטה הידבקות תא והגירה, טכניקה אלה מספק רק שליטה חולפת מאז ספיחה היא תהליך הפיך 11. כמו כן, מולקולות לספוג למשטחים באורינטציות בלתי צפויות ובריכוזים אקראיים וכך להגביל את הנאמנות ושליטה של ​​אינטראקציות biospecific. יתר על כן, תרכובות משמש בדרך כלל כדי ליצור אזורים שאינן עכירות, כגון אלבומין בסרום שור או pluronic F127, אין לי אתרים תגובתי המיועדים לfunctionalization נוספת הגבלה לאחר ספיחה בשינויים באתר. טילי קרקע-אוויר של alkanethiols יכולים להיות שנוצרו עם קבוצות תגובתי כזה לשינוי פני השטח נוסף, אבל גם יש להם עמידות מוגבלת בקונדיט תרבית רקמהיונים בשל חוסר מיגון חמצוני המוענק על ידי PEG מורכב מברשות 10,11. לעומת זאת, המיזוג של פלטפורמות R-μCP עם השתלת PEG-מברשת ותגובות התמר נוקלאופילית רציפות מספק את היכולת להנדס מצעים עם אזורים עמידים, microscale cytophobic כי ניתן לשנות מראש או באתר עם ​​פונקציות ביו-מאונך. זה יאפשר שליטה רבה יותר של אינטראקציות biospecific שיכול לווסת במורפולוגיה רקמת מבחנה וצמיחה.

כוח עיקרי של R-μCP בהשוואה למערכות אחרות ליישור הדפסות microcontact רציפים הוא היכולת להסיר את המצע מהמערכת בין stampings חוזר ונשנה, תוך שמירה על הדיוק גבוה יישור 12,13. זה מאפשר גיוון רב יותר בסוגי chemistries משטח שניתן ליישם, ואת משך הזמן של תגובות שינוי פני השטח יכול להיות מגוון כדי לכוון את הצפיפות של לאחר מכן imהליגנדים גייסו 6. כך, R-μCP יכול לשמש להקמה הדרגתיים ריכוז מוקדי ברמזים ביוכימיים אשר מתווכים אינטראקציות biospecific 14. עם היכולת לשלוט במדויק הן את המיקום ומידת אינטראקציות biospecific, מערכת R-μCP מציעה שיטה ייחודית לחקר תפקידיו של הליגנדים ביו בהמורפוגנזה רקמות וקובעת מערכת איתנה ליצירת מצעי תרבות המדמים את הצגת ברמזים ביולוגיים ב הנישה in vivo.

היבט קריטי של נישות סלולריות, במיוחד בפיתוח, הוא אפנון חלל ובזמן של איתות גורמי 18. למרות שניתן להוסיף רמזים ביוכימיים מסיסים לתקשורת והתרבות באופן מוגדר במסגרת זמן, יש מוגבל שליטה במרחב שעליו תאים נתקלים רמזים אלה. עם מערכת R-μCP המתוארת כאן, ניתן לבנות מצעי תרבות micropatterned עם functionaliz סופניעורך PEG מברשות הצגת קבוצות פונקציונליות אזיד שאין להם השפעה על גורל תא בתרבות. בעוד קבוצות אזיד הן מסוגלים לעבור תגובות-catalyzed נחושת "לחץ" עם מולקולות הצגת alkyne, זה לא יכול להתבצע בנוכחות של תאים בתרבות נתונה הרעילות של נחושת. עם זאת, מולקולות גבוהה, מתח כמו dibenzocyclooctyne (DBCO) עוברות תגובה סלקטיבית וביולוגית מאוד ללא נחושת אזיד-alkyne cycloaddition 19,20. דרך נטיה של linkers המכיל DBCO, ניתן לשנות מצעי תרבות micropatterned באתרו עם הליגנדים ביולוגיים חדשים 21. עם היכולת לעבד אזורי cytophobic cytophilic או להוסיף רמזים ביוכימיים שונים לשימוש בהליכי איתות רב-שלבים, שיש לי מצעי תרבות שנוצרו בשיטה זו יכולות הסתגלות רומן ובכך לספק מערכת יציבה יותר עבור מורה המורפוגנזה רקמות במבחנה.

למרות הסיר העצוםential ושירות של פלטפורמת R-μCP, זה יש חסרונות מסוימים. השימוש בצעדי SI-ATRP רבים כדי ליצור מצעים מורכבים-PEG מאריך מאוד את זמן הייצור בהשוואה לשיטות מעורבות דיו להדפסה או בתצהיר microdroplet של חלבוני ECM. בעוד הדיוק של טכניקות הדפסת דיו יריביו של מערכת R-μCP הנוכחית, הספיחה של חלבוני ECM היא הפיכה ובכך לספק פחות שליטה על אינטראקציות תא-חלבון. כמו כן, מצעים שנוצרו באמצעות טכניקות הדפסת דיו לא ניתן להסיר במהלך ייצור, ובכך מונעים את שימוש בchemistries מגוון שינוי מצע המאפשרים, למשל, מוגבל במרחב בשינויי מצע אתר 22. בשל מגבלות אלה טכניקות הזרקת דיו מתאימות יותר לייצור מהיר של מצעי תרבות עוסקים בעיקר בזמן קצר ובהסדרים סטטי של מולקולות ביולוגיות ותאים מסוגים 23 ואילו מערכת R-μCP הרבה בטיr מתאים ליצירת מצעים רבי פנים נועדו להציג לטווח ארוך, שליטה דינמית על שני אינטראקציות הסלולר המרחב ובזמן ב2D עם הליגנדים ביולוגיים מגוונים.

הדפסת microcontact מאפשרת בתצהיר מהיר של ננו-to-מיקרוסקופי "דיו" תכונות מעל שטח פנים גדול, אבל תמיד היה הטרוגניות משמעותית בריכוז חומרים "דיו" שהופקדו. זו גם מגבלה נוכחית של פלטפורמת R-μCP כפי שניתן לראות באיור 4. אנו משערים כי ההטרוגניות בשינוי הניאון של PEG מברשות היא כתוצאה מיישומו של הרובוט של כוח נורמלי לא אחיד על פני חותמת PDMS כל, ש גם סביר להניח שלא שטוח לחלוטין. התוצאה במגע לחץ לא אחיד בין כל האזורים של הבול והמצע ובכך גורמת לתצהיר אחיד של יוזם alkanethiol ועובי הבא של מברשת PEG המורכבים. בכדי לייצר מצעים מורכבים-PEG עם אף תצהיר של alkanethiols ובכך פונקציונלי משטח, עיצוב כלי החתמה יצטרך להיות מותאם ליישום כוח נורמלי שחולק ואחיד על פני חותמת PDMS כל. זה יאפשר את מגע אחיד עם השקופיות מצופים זהב על פני כל עצמאי הממשק של פגמי חותמת. כמו כן, באיור 4, ניתן לראות זיהום צולב קל של קבוצות אצטילן על מברשת PEG אזיד הופסק. בעוד צפיפות הליגנדים משותקים בשל זיהום צולב פני השטח בהשוואה מינימאלית לזה בPEG-המברשת המיועדת, זה יכול להיות מצטמצם כמעט לאפס על ידי הגדלת משך הזמן של תגובת פסיבציה ethanolamine (ראה סעיף 6), כפי שהודגם בעבר 6.

היישום העיקרי של מערכת R-μCP המתוארת כאן הוא לייצור מצעי תרבית רקמה מורכבים שיכול לשמש להפעלת o שליטה במרחב ובזמןגורל תא f. עם זאת, רמת הדיוק הגבוה והדיוק של פלטפורמת R-μCP עושה את זה בשיטה אטרקטיבית עבור יישומים אחרים, כמו גם. יכולת דפוס אזורי cytophilic עם chemistries יגנד ההפרש ואחריו בשינוי באתרו של אזורי אינרטי בעבר, cytophobic מאפשרת לתרבות המשותפת של שורות תאים מרובות עם פיקוח הדוק על ההתמצאות במרחב שלהם. זה בשילוב עם טבע תפוקה גבוהה הגלום בmicropatterning להוות אלטרנטיבה לשיטות קיימים להקרנת תפוקה גבוהה של שני תאים בודדים ושילובים רב-תא 24. בעוד מערכת R-μCP יש פוטנציאל גדול בתחום הביולוגיה, זה יכול להיות מיושם גם בתחום מערכות מייקרו (MEMS). בייצור MEMS, רצוי להעביר רכיבי MEMS עם דיוק גבוה ודיוק לייצור המוני. עם טכניקות הטבעה הקינטית רומן, מערכת R-μCP המתוארת כאן יכולה להיות מותאמת להדפסת compone ביעילותNTS של סיליקון או גליום ניטריד על פרוסות סיליקון לשימוש ביצירת MEMS 25. כך, פלטפורמת R-μCP יכולה לשמש למגוון רחב של יישומים פוטנציאליים.

לסיכום, שימוש במערכת R-μCP ליצור PEG-מורכב מצעי תרבות orthogonally פונקציונליות באמצעות תגובות התמר נוקלאופילית רציפות מציג פלטפורמה לא רק אידיאלית לפוטנציאל השליטה מורפולוגיה רקמה וצמיחה במבחנה, אבל מערכת מצוינת לחקירת התפקידים מרובים הליגנדים ביו על גורל תא. היכולת לרמזים ביוכימיים רבים דפוס בדפוסים ברורים והורה מאוד קובעת את היסודות לבניית מצעי תרבות מסוגלים מורה להיווצרות של מבני רקמות עם סוגי תאים מרובים מאורגנים בקנה מידת מיקרון. זה, בשילוב עם היכולת לשנות מצעי micropatterned באתר, עלול לאפשר לשליטה חסרה תקדים של המורפוגנזה וcel רקמהגורל l בתרבות. טכניקות הדפוסים המתוארות כאן לספק מערכת רב-תכליתית לייצור מצעי תרבות שתוכל יום אחד לאפשר ייצור רציונלים ושחזור של מבני רקמות organotypic במבחנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SCARA  Epson LS3-401ST Higher end models with increased precision are available if desired. 
(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane Gelest SIT8174.0 CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Ellsworth Adhesive Co NC9020938 Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable.
24 mm x 50 mm #1 Cover Glass Slides Fisher Scientific 48393106 These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need.
CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator Telemark SEC-600-RAP Requries specialized training.
EPSON LS3 SCARA EPSON LS3-401ST
ω-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate Prochimia FT 015-m11-0.2 Store at -20 °C. Other ATRP initiators may be used as this R-μCP platform is applicable to all micropatterning modalities. 
Schlenk Tube Flask 50 ml Synthware 60003-078 Requires rubber stoppers with diaphram.
Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate Sigma Aldrich 447943 Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors.
Methanol (Certified ACS) Fisher Scientific A412-4 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Copper(II) Bromide Sigma Aldrich 437867 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
2,2'-Bipyridine Sigma Aldrich D216305 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
Sodium L-Ascorbate Sigma Aldrich A4034
20 ml Borosilicate Glass Scintillation Vials Fisher Scientific 03-340-4E
Sodium Azide Sigma Aldrich S2002 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
N,N-dimethyformamide Sigma Aldrich 227056 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Ethanolamine Sigma Aldrich 398136 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Triethylamine Sigma Aldrich T0886 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Dimethylsulfoxide Sigma Aldrich 276855 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Propargylamine Sigma Aldrich P50900 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
200 Proof Ethanol University of Wisconsin Material Distribution Services 2292 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Azide-PEG3-Biotin ClickChemistryTools AZ104-100 Solubilized in DMF
Copper(II) Sulfate Sigma Aldrich C1297 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) Sigma Aldrich 678937
L-Ascorbic Acid Sigma Aldrich A7506
Phosphate Buffer Saline Invitrogen 14190144
Donkey Serum Sigma Aldrich D9663 Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose.
12-Well Polystyrene Plate Thermo Scientifit - NUNC 07-200-81 Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions.
DBCO-PEG4-Biotin Clickchemistytools A105P4-10 Solubilized in DMF
Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate Life Technologies S-11223 Solubilized in PBS
Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate Life Technologies S-11225 Solubilized in PBS
Nikon A1-R Confocal Microscope Nikon Nikon Eclipse Ti, A1R An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Senaratne, W., Andruzzi, L., Ober, C. K. Self-Assembled Monolayers and Polymer Brushes in Biotechnology: Current Applications and Future Perspectives. Biomacromolecules. 6 (5), 2427-2448 (2005).
  2. Hucknall, A., Kim, D. -H., Rangarajan, S., Hill, R. T., Reichert, W. M., Chilkoti, A. Simple Fabrication of Antibody Microarrays on Nonfouling Polymer Brushes with Femtomolar Sensitivity for Protein Analytes in Serum and Blood. Advanced Materials. 21 (19), 1968-1971 (2009).
  3. Hucknall, A., Rangarajan, S., Chilkoti, A. In Pursuit of Zero: Polymer Brushes that Resist the Adsorption of Proteins. Advanced Materials. 21 (23), 2441-2446 (2009).
  4. Rozkiewicz, D. I., Jańczewski, D., Verboom, W., Ravoo, B. J., Reinhoudt, D. N. Click” Chemistry by Microcontact Printing. Angewandte Chemie International Edition. 45 (32), 5292-5296 (2006).
  5. Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology. Chemical Society Reviews. 39 (4), 1272-1279 (2010).
  6. Sha, J., Lippmann, E. S., McNulty, J., Ma, Y., Ashton, R. S. Sequential Nucleophilic Substitutions Permit Orthogonal Click Functionalization of Multicomponent PEG Brushes. Biomacromolecules. 14 (9), 3294-3303 (2013).
  7. Tugulu, S., Silacci, P., Stergiopulos, N., Klok, H. -A. RGD—Functionalized polymer brushes as substrates for the integrin specific adhesion of human umbilical vein endothelial cells. Biomaterials. 28 (16), 2536-2546 (2007).
  8. Ashton, R. S., et al. High-Throughput Screening of Gene Function in Stem Cells Using Clonal Microarrays. Stem Cells. 25 (11), 2928-2935 (2007).
  9. Koepsel, J. T., Murphy, W. L. Patterned Self-Assembled Monolayers: Efficient, Chemically Defined Tools for Cell Biology. ChemBioChem. 13 (12), 1717-1724 (2012).
  10. Mrksich, M., Dike, L. E., Tien, J., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver. Experimental cell research. 235 (2), 305-313 (1997).
  11. Ma, H., Hyun, J., Stiller, P., Chilkoti, A. Non-Fouling” Oligo(ethylene glycol)- Functionalized Polymer Brushes Synthesized by Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization. Advanced Materials. 16 (4), 338-341 (2004).
  12. Bou Chakra, E., Hannes, B., Dilosquer, G., Mansfield, D. C., Cabrera, M. A new instrument for automated microcontact printing with stamp load adjustment. Review of Scientific Instruments. 79 (6), (2008).
  13. Trinkle, C. A., Lee, L. P. High-precision microcontact printing of interchangeable stamps using an integrated kinematic coupling. Lab on a Chip. 11 (3), 455 (2011).
  14. McNulty, J., et al. High-precision robotic microcontact printing (R-μCP) utilizing a vision guided selectively compliant articulated robotic arm. Lab on a Chip. , (2014).
  15. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscalepatterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
  16. Nam, Y., Chang, J. C., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Gold-Coated Microelectrode Array With Thiol Linked Self-Assembled Monolayers for Engineering Neuronal Cultures. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (1), 158-165 (2004).
  17. Ma, H., Wells, M., Beebe, T. P., Chilkoti, A. Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization of Oligo(ethylene glycol) Methyl Methacrylate from a Mixed Self-Assembled Monolayer on Gold. Advanced Functional Materials. 16 (5), 640-648 (2006).
  18. Scadden, D. T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 441 (7097), (2006).
  19. Codelli, J. A., Baskin, J. M., Agard, N. J., Bertozzi, C. R. Second-Generation Difluorinated Cyclooctynes for Copper-Free Click Chemistry. Journal of the American Chemical Society. 130 (34), 11486-11493 (2008).
  20. Debets, M. F., van Berkel, S. S., Schoffelen, S., Rutjes, F. P. J. T., van Hest, J. C. M., van Delft, F. L. Aza-dibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3+2) cycloaddition. Chemical Communications. 46 (1), 97 (2010).
  21. DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
  22. Roth, E. A., Xu, T., Das, M., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. Inkjet printing for high-throughput cell patterning. Biomaterials. 25 (17), 3707-3715 (2004).
  23. Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. Biomaterials. Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).
  24. Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).
  25. Meitl, M. A., et al. Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp. Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 92 הדפסת microcontact רובוטית R-μCP לחץ כימיה כימיה של פני השטח הנדסת רקמות micropattern ייצור מתקדם
בודה מצעים מורכבים תרבות באמצעות רובוטית microcontact הדפסה (R-μCP) והתמר נוקלאופילית סדרתית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Knight, G. T., Klann, T., McNulty,… More

Knight, G. T., Klann, T., McNulty, J. D., Ashton, R. S. Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-µCP) and Sequential Nucleophilic Substitution. J. Vis. Exp. (92), e52186, doi:10.3791/52186 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter