Introduction
Evnen til PEG-podet overflater for å vise kovalent bundne biokjemiske ligander og samtidig beholde iboende ikke-begroing egenskaper gjør dem til et ideelt valg for ingeniør tilpassede mikroskala miljøer på kultur underlag 1,2,3. De biospesi interaksjoner mediert av ligand konjugert PEG børster gjør det mulig reductionistic analyse av virkningene av biokjemiske signaler innenfor komplekset in vivo microenvironments vev på enkeltcelle-fenotyper. Videre kan bio-ortogonale "klikk" kjemi brukes til å lette retnings immobilisering av ligander, slik at de blir presentert i native conformations 4-6. Dermed mikro romlige fordelingen av PEG børster er et allsidig verktøy for å lage designer in vitro nisjer å undersøke cellesignalisering indusert av immobilisert biokjemiske signaler 6,7.
En vanlig fremgangsmåte for å generere romlige mønstre av biokjemisk cues innebærer mikro utskrift (μCP) gullbelagt underlag med mønstre av PEG konjugerte alkanethiols. Så, de micropatterned selv montert monolayers (SAMS) av PEG-ylated alkanethiols begrenser fysisk adsorpsjon av biokjemiske molekyler, f.eks, proteiner, bare for ikke-mønstrede regioner av underlaget 8,9. Imidlertid Sams som genereres ved denne teknikk er følsomme for oksydasjon i langtidscellekulturmedier. Dermed μCP'd alkantiol Sams er ofte videre podet med PEG polymer børster ved hjelp av overflate initiert atom transfer radikalpolymerisering (SI-ATRP) for å øke regionens ikke-begroing stabilitet 10. Konkret μCP av alkantiol polymeriseringsinitiator, ω-meraptoundecyl bromisobutyrat, på gullbelagt flater etterfulgt av SI-ATRP av poly (etylenglykol) metyl eter metakrylat (PEGMEMA) monomerer genererer overflater med micropatterned langsiktig, stabil og ikke- begroing PEG børster. Dessuten, disse er istand til å bli ytterligere modifisert for å presentere forskjellige kjemiske grupper 11.
Å dra nytte av denne egenskapen, Sha et. al. utviklet en metode for å konstruere kultur substrater med multikomponent PEGMEMA børster presentere ortogonale "klikk" kjemi. I denne metoden, bruker de en rekke μCP / SI-ATRP skritt ispedd sekvensiell natriumazid, etanolamin, og propargylamin nucleofile erstatninger for å skape kultur underlag presentere mikroskala mønstre av flere immobilisert ligander 6. Mens potensialet i å bruke slike kjemikalier i forbindelse med manuell μCP til ingeniør nye kultur underlag er enorm, er det begrenset av presisjon og nøyaktighet som flere μCP trinn kan justeres på et enkelt substrat. Et høyt nivå av presisjon og nøyaktighet ville være nødvendig for å fremstille reproduserbart kompleks in vitro nisjer ved hjelp av disse teknikker anvendelige.
e_content "> For å møte denne begrensningen, har flere automatiserte og semi-automatisert μCP systemer blitt generert. Chakra et. utviklet en μCP system der definerte stempler er plassert på et skinnesystem og brakt inn konformal kontakt med gull-belagt lysbilder ved hjelp al. en datastyrt pneumatisk aktuator. Men denne metoden krever presis fabrikasjon av tilpassede stempler og rapporterer en 10 mikrometer presisjon med ingen rapport om nøyaktigheten oppnås når du utfører flere μCP trinn 12. Mer nylig en metode å benytte en integrert kinematisk koblingssystem rapporterte presisjon under 1 um ved å bruke et enkelt mønster, men var ikke i stand til å nøyaktig innrette flere mønstre på grunn av en mangel på nøyaktig styring av stempel funksjoner fra støpeformen for å forme 13. I tillegg har begge de tidligere metoder krever substratet til å ligge fast mellom mønstringstrinn , dermed vesentlig begrenser mangfoldet av overflatemodifikasjons kjemi som kan væreutnyttet. Her beskriver vi en automatisert R-μCP system i stand til nøyaktig og presis justering av flere μCP trinn samtidig som maksimal fleksibilitet i stempel design og fabrikasjon. Videre kan de mønstrede underlag være gjentatte ganger fjernet fra systemet mellom stampings, for derved å tillate bruk av forskjellige substrat modifikasjonskjemi, inkludert sekvensielle nukleofile substitusjoner. Substrater konstruert ved anvendelse av slike kjemikalier har vært benyttet for cellekultur tidligere av oss både 6,14 og andre syv. Derfor har vi slått sammen R-μCP og sekvensielle nukleofil substitusjon reaksjoner å utvikle en metode for skalerbar produksjon av kultur underlag med komplekse og micropatterned biokjemiske signaler.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generering Elastomeriske Frimerker
- For å generere PDMS stempel silisium mestere, designe fotomaske inneholder alle funksjonene mønstre ved hjelp av dataassistert design software.
- Utforme det første mønsteret som en 20 x 20 matrise av ringrom med 300 um indre diameter (ID) og 600 um med utvendig diameter 1,200 um sentrum-til-senteravstanden.
- Designe den andre mønsteret som en 20 x 20 matrise av ringrommene med 600 mikrometer ID og 900 mikrometer OD med 1200 mikrometer senter-til-senter avstand.
- I tillegg plasserer 1 x 1 mm 2 kvadrat fastmerker i alle fire hjørner av hver matrise utforming fordelt 1200 mikrometer senter-til-senter fra hjørnet mønster i 45 ° vinkel.
- Dikte silisium mestere for bruk i dette eksperimentet med 1: 1 størrelsesforhold, korrelere til en 300 mikrometer funksjon dybde ved hjelp av standard litografi teknikker beskrevet andre steder 15 eller i samarbeid med en mikrofluid støperi.
MERK: Feature Snødybder lavere enn 100 mikrometer kan føre til unormal deformasjon av frimerker før kontakt med substratoverflatene.
MERK: Denne protokollen begynner med har allerede innhentet silisium mestere med de beskrevne mønstre av fotoresist, som krever spesialutstyr og rene rom for å skape. Det er best å ta kontakt med en produsent eller kjernefasiliteten for å lage disse mønstrede mestere.
- Silanize silisium mestere O / N ved inkubasjon med (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydroocty) triklorsilan damp.
MERK: Silane damp er svært giftig og bør bare håndteres i avtrekksskap. - Lag invers replikaer av silisium masters ved herding av et 10: 1 forhold av PDMS pre-PDMS polymer og herdemiddel på toppen av de silaniserte silisium masters i en petriskål O / N ved 60 ° C.
- Fjern PDMS frimerker fra silisium mestere, og binde frimerker til akrylnitril-butadien-styren (ABS) bakside eller annet stivt materiales bruk av lim.
MERK: materialvalget trenger ikke være gjennomsiktig eller biokompatible. Det må imidlertid gi en flat overflate for grensesnitt med robot verktøy og høyere stivhet enn PDMS.
2. Å Dekk
- Skyll mikroskop Dekk (24 mm x 50 mm # 1) i toluen, metanol og sonicate i aceton i 1 min før skylling med etanol og tørking under en svak nitrogenstrøm.
MERK: Handle toluen og aceton bare i et avtrekksskap. - Frakk Dekk med ~ 3,5 nm titan (Ti) fulgt av 18,0 nm gull (Au) med en fokusert elektronstråle fordamperen.
MERK: Denne prosedyren er kompatibel med en rekke gullbelagt underlag, inkludert silisium og polystyren. Mens det er mulig å generere disse på stedet, gullbelagt underlag er også tilgjengelige via kommersielle leverandører.
MERK: Ti sjikt bør være minst 3 nm tykt, mens Au lag på substrater bør være ent minst 5 nm tykt, og kan strekke seg hele veien til 1 mm i tykkelse avhengig av de ideelle optiske egenskapene til det endelige substratet 16,17. Underlag er ikke nødvendig å være optisk klart for fabrikasjon; Men, det forenkler mikroskopisk analyse av fabrikkert underlag. - Skyll gullbelagt Dekk med etanol og tørr under forsiktig nitrogen umiddelbart før bruk.
3. R-μCP of Outer Ringrom
- Før R-μCP med selektivt elastisk artikulert robotarm (SCARA) system, kalibrere robotverktøyeffektbokser og tilhørende dual kamera systemer som bruker systemets programvare.
MERK: Disse redskapene er avbildet i figur 1.
Figur 1. R- μCP System og Robotic Arm Tooling. (A) Storskala visning av R-μCP system med alle verktøy og inventar, (a) vakuum chuck, (b) reagent bad, (c) nedover mot kamera, (d) stempel hekkende ligaen, (e) robot verktøyet. (B) Robotic arm verktøy som viser (f) diamond-tipped etsning verktøy og (g) pneumatisk suge verktøyet holder en (h) ABS-støttet PDMS stempel.
- Manuelt plassere en PDMS stempel med 600 mikrometer ID og 900 mikrometer OD utstå annuli ansiktet ned i stempel hekkende ligaen. Manuelt plassere en fersk rengjort gull-belagt coverslide på toppen av vakuum chuck, vist i figur 1A og immobilisere den ved hjelp av tilkoblet lab vakuum.
- Ved hjelp av roboten kontroller, justerer du nedover mot kamera over midtpunktet av gull-belagt coverslide, som i figur 2A.
MERK: Dette punktet kan i utgangspunktet bli definert ved visuell inspeksjon og ikke krever stor nøyaktighet, som PDMS stempel er mye largEr enn gull-belagt lysbilde. - Instruere robotarmen til å etse fire referanse "X" merker på hjørnene i et kvadrat med dimensjoner 3,8 mm med 3,8 mm sentrert på gull-belagt coverslide hjelp av diamant tippet etsning verktøy festet til robotarmen. (Avbildet i figur 2B, automatisert prosess)
MERK: Dette sikrer at alle fire referanse merkene ligger innenfor en visuell ramme for den nedadvendt kamera. - Ved hjelp av roboter pneumatisk suge tooling, pick-up og hold PDMS stemple en mm over stempel hekkende ligaen som i figur 2C. (Automatisert prosess)
- Bruke oppover mot kamera og LED-belysning ring avbildet i figur 2D og E, visualisere stempel Plassen fastmerker og identifisere dem med kameraprogramvaren 10 ganger for å bestemme stempel gjennomsnittlige X, Y og vinkelavvik fra midten av robot tooling aksen. (Automatisert prosess)
- Som i
- 3.8) Plasser stempel i et bad av alkantiol ATRP initiator, ω mercaptoundecyl-bromisobutyrat (2 mM i etanol) som vist i figur 2F. (Automatisert prosess)
- Fjern stempel fra alkantiol løsning og legg den over nitrogenstrøm trykksatt til 0,48 bar (5 psi) for å fordampe etanol som i figur 2G. Etter 1 min øke nitrogenstrømmen til trykket er 1,03 bar (15 psi) for å sikre ensartet tørrhet. (Automatisert prosess)
MERK: Ufullstendig tørking vil resultere i totalt eller delvis tap av mønster gjengivelse. - Etter tørking, bevege stempel over den beregnede midtstilling av gull-belagte lysbilde og senke den ved trinn 100 um mens overvåking Z-akse motorkraften som vist i figur 2H.
MERK: Dette er kommunisert som dreiemoment oppleves av Z-aksen motor og vises i robotstyring programvare. (Automatisert prosess) - Slutt å senke stempelet når det forutbestemte trykk på 79,2 kPa har blitt oppnådd, og opprettholde kontakt med gull-belagte lysbilde for 15 sek. (Automatisert prosess)
MERK: trykkverdiene her er optimalisert for gjeldende stempel design og funksjon høyde. Hvis stempel design er endret, spesielt for høye størrelsesforhold frimerker, tune disse tilsvarende ved en prøving og feiling prosess. - Sakte fjerne stempel fra gull-belagt lysbilde og sette inn stempelet tilbake i stempel hekkende ligaen. (Automatisert prosess) 4. SI-ATRP av PEGMEMA på Micropatterned Dekk
- Slipp vakuumtrykket som holder micropatterned coverslide, og overføre den til en 50 ml Schlenk kolbe. Seal og avgasse Schlenk flaske ved hjelp av en vakuumpumpe.
- Legg 5,5 ml ATRP reaksjonsblanding inneholdende den makromonomeren PEGMEMA (208,75 mmol), vann (34,4 ml), metanol (43,8 ml), kobber (II) bromid (1 mmol) og 2 ', 2-bipyridin (3 mmol) i den Schlenk-kolbe.
- Tilsett 0,5 ml av L-natriumaskorbat (454,3 mM) i vann for å initiere reaksjonen, og tillate det å fortsette i 16 timer ved RT under en inert gass.
MERK: Etter tilsetning av L-natriumaskorbat, vil reaksjons farge skifter fra grønt lys til mørk brun, som vist i figur 3A-B.
MERK: Reaksjonen kan fortsette utover 16 timer, men det vil ikke i betydelig grad øke lengden av PEG børster. - Fjern det micropatterned coverslide fra Schenk-kolbe og skyll med etanol, vann og etanol og tørr under en svak nitrogenstrøm.
MERK: Etter SI-ATRP, bør overflatemodifiseringer være synlig for øyet og kan avbildes og analysert under et mikroskop som i figur 3C.
MERK: Dette er den enkleste metoden for å teste presisjonen i rettssaken som det fjerner behovet for immunfarging av de underlag. - Plasser micropatterned coverslide i en 20 ml glassreaksjonsglasset.
- Tilsett 6 ml N, N-dimetylformamid (DMF) inneholdende 100 mM natriumazid til reaksjonsglasset. Oppretthold denne reaksjon ved 37 ° C i 24 timer.
MERK: Handle DMF bare i et avtrekksskap. Vær forsiktig når du veier ut natriumazid. - Ved fullføring, fjerner micropatterned coverslide fra reaksjonsglasset, og skyll med etanol og deretter vann og tørk under en nitrogenstrøm.
- Plasser micropatterned coverslide i 20 ml glass reaksjonshetteglass.
- Tilsett 6 ml dimetylsulfoksyd (DMSO) inneholdende 100 mM etanolamin og 300 mM trietylamin til reaksjonsglasset. Hold denne reaksjon ved 40 ° C i 24 timer.
MERK: Handle DMSO, etanolamin, og triethylamin bare i et avtrekksskap. - Ved ferdigstillelse fjerne micropatterned coverslIDE fra reaksjonsglasset, skyll med etanol og deretter vann og tørk under en nitrogenstrøm.
- Gjennomføre R-μCP trinn som tidligere beskrevet i trinn 3.2 og 3.6 til 3.12, erstatte en PDMS stempel med 300 mikrometer ID og 600 mikrometer OD utstå annuli, slik at ringrommene med mindre funksjoner er plassert inne i tidligere micropatterned annuli.
MERK: Trykket terskelen for dette stempelet er 132,0 kPa. Som tidligere nevnt, er disse trykkinnstillinger optimalisert for stempel funksjoner som blir brukt i dette eksperiment. - Gjennomføre SI-ATRP trinn som tidligere beskrevet i trinn 4.1 til 4.4.
- Plasser micropatterned coverslide i en 20 ml glassreaksjonsglasset.
- Tilsett 6 ml DMSO inneholdende 100 mMpropargylamin til reaksjonsglasset. Oppretthold denne reaksjonen ved RT i 24 timer.
MERK: Håndter DMSO og propargylamin bare i et avtrekksskap. - Ved fullføring fjerne micropatterned coverslide fra reaksjonsglasset, og skyll med etanol og deretter vann og tørk under en nitrogenstrøm.
- Plasser micropatterned coverslide i en 20 ml glassreaksjonsglasset.
- Tilsett 6 ml av kobbersulfat (15 mM) / Tris [(1-benzyl-1 H-1,2,3-triazol-4-yl) metyl] amin (TBTA, 30 mM) (1: 1 v / v vann / DMF) inneholdende 562 uM azid-PEG-4-biotin-konjugat til reaksjonsglasset. Tilsett 1,2 ml av L-askorbinsyre (0,15 mM) i vann til blandingen for å initialisere reaksjonen.
- Boble nitrogen gjennom reaksjonsoppløsningen i 10 sek, forsegle ampullen med Parafilm, og reagere i 24 timer ved RT.
- Ved completion fjerne micropatterned coverslide fra reaksjonshetteglasset, skyll med vann og legg den i en 12-brønns polystyren parabolen.
- Blokker micropatterned coverslide i DPBS (3% Esel serum) i 1 time ved RT. Beis for biotinylerte acetylengrupper med streptavidin-konjugat 546 (2 ug / ml) i DBPS (3% Esel serum i PBS) i 2 timer ved RT.
- Skyll micropatterned coverslide fem ganger med DPBS i 10 minutter med forsiktig omrøring.
MERK: Figur 4B viser et bilde av sleiden etter dette trinnet er fullført. - La micropatterned coverslide i 12-brønnen polystyrene fatet etter DBPS skyller.
- Tilsett 2 ml DBPS (eller cellekulturmedium) inneholdende 20 uM DBCO PEG-4-biotin, og tillate denne reaksjonen å fortsette i 24 timer ved RT (eller ved 37 ° C i en inkubator).
- Ved ferdigstillelse, skyll micropatterned coverslide fem ganger med DPBS (eller bare utføre en medie endring).
- Beis for biotinylerte azid-grupper med streptavidin-konjugat 488 (2 ug / ml) i 2 ml DPBS (3% Esel serum) i 2 timer ved RT.
- Skyll micropatterned coverslide fem ganger i DPBS i 10 minutter med forsiktig omrøring.
- Bilde micropatterned coverslide hjelp confocal fluorescens mikroskop. 4A-C viser bilder av raset etter dette trinnet er fullført.
MERK: Når du bruker underlag for vevskulturstudier analyser, hopp §§ 10 og 12 i denne protokollen. Etter at den ønskede ° vinkele av funksjonalisering, sterilisere coverslide konstruert ved å skylle begge sider med 100% etanol og tørking under en nitrogenstrøm. Overfør lysbildet til en steril biologisk sikkerhetskabinett og skyll lysbildet med PBS fem ganger før du fortsetter med celle seeding og kultur.
5. Azid funksjon av Micropatterned PEGMEMA Chains
6. passivisering av Brom funksjon PEGMEMA Chains
7. R-μCP av innerringen og SI-ATRP av PEGMEMA
8. Acetylen funksjonalisering av Micropatterned PEGMEMA Chains
9. Kobber-katalysert "Klikk" Biotinylation av Acetylen Avsluttet PEGMEMA Chains
10. Immunofluorescent Påvisning av Biotinylated Acetylen Grupper
11. Kobber-free "Klikk" Biotinylation av Azid Avsluttet PEGMEMA Chains
MERK: Hvis ønskelig, kan dette substratet modifikasjonstrinnet bli utført in situ i løpet av cellekulturen.
12. Immunofluorescent Påvisning av Biotinylated Azide Grupper
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruken av manuelle justerings μCP teknikker for å konstruere kultur substrater med matriser av PEG-podet børster functionalized med ortogonal "klikk" kjemi har blitt vist i tidligere arbeid 6. Imidlertid tilbyr denne minimal kontroll av mønster orientering og ofte resulterer i overlapping av funksjon områder. Her blir en ny r-μCP system som brukes for å overvinne denne begrensning, og dens evne til å nøyaktig mønster en matrise av PEG børste ringrom med 300 um ID 600 um og OD presentere terminal alkyn-grupper innenfor et separat matrise av PEG børste ringrom med 600 um ID og 900 mikrometer OD presentere terminal azid grupper er vist 14. Etter omsetning av alkynet presentere PEG børster med azid-3-PEG-biotin og reaksjonen av azid presentere PEG børster med DBCO PEG-4-biotin, ble substratet immunostained med fluorescerende prober og avbildes ved hjelp av et konfokalt mikroskop (Figur 4). Analyse av disse bildene ved hjelp av en tilpasset MATLAB program beregnet at de to PEG børste arrays ble justert med sub-10 mikrometer nøyaktighet, dvs. X ~ 6,4 mikrometer, Y ~ 1,7 mikrometer, og θ ~ 0,02 °, som er på produsentens sitert grense av vår SCARA-modellen (dvs. ~ 10 um) og en indikasjon til R-μCP systemets ytelse før 14. Følgelig tror vi at bruken av høyere-end SCARAs i dette systemet ville gi enda lavere, sub-mikron-oppløsning. Disse resultatene viser de allsidige substratet ingeniørkrefter som aktiveres av den kombinerte bruken av R-μCP system og sekvensielle nukleofil substitusjon reaksjoner. Den minimale kryssreaktivitet dokumentert av fluorescerende merking av de ortogonale overflatekjemi tjener til å illustrere potensialet i dette systemet for presis immobilisering av biokjemiske signaler for å generere komplekse kultur substrater for tissue engineering applikasjoner. </ P>
Figur 2. Skjematisk av R- μCP Process. (A) nedover mot kamera visualisere immobilisert gull-belagt slide, (B) etsning referansemerkene på gull-belagt coverslide, (C) fjerne PDMS stempel fra stempel hekkende ligaen, (D - E) visualisering PDMS stempel fastmerker med oppover mot kamera (F) plassere PDMS stempel i alkantiol initiativtaker bad, alkantiol (G) tørking initiator løsemiddel løpet nitrogen bekker, og (H) stempling alkantiol belagt PDMS stempel på gull-belagt coverslide.
Figur 4. immunostained Bilder av MicroPatterned Slide. (A) azidet og (B) alkyn grupper, biotinylert bruker kobber-fri og kobber-mediert klikk kjemi, og oppdaget med henholdsvis streptavidin-488 og -546. (C) Overlegg av både fluorescerende kanaler. All skala barer 500 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ideelle substrater for vevsteknologi ville bli bioinspired og derved rekapitulere den romlige fordelingen av bioaktive ligander kritiske innenfor de native vev. De ville også ha dynamiske egenskaper som gjør at tidsmessige justeringer av ligandene og de romlige mønster i hvilket de er presentert for å tillate rettet vev morfogenese og romlig begrenset induksjon av celle skjebne. Fabrikasjon av slike underlag krever immobilisering av flere biokjemiske signaler i komplekse og høyt bestilt orienteringer på underlag. Mens simulere alle endogene faktorer i en celle nisje in vitro er urimelig, R-μCP systemet beskrevet her åpner for immobilisering av flere regioner av ortogonale bioaktive kjemi med mikro kontroll av romlig orientering.
Nytten av slike underlag øker ytterligere når de vurderer at mens PEG børste arrays bundet med immobilisert liganderkan lokke fram biospesi interaksjoner, ubundne PEG børster forbli motstandsdyktig mot protein adsorpsjon og dermed kan tjene til å kontrollere celle adhesjon og migrasjon. Selv om passive, micropatterned adsorpsjon av ekstracellulær matriks (ECM) proteiner eller polymere er-PEG-konjugater er en enklere fremgangsmåte for å kontrollere celle adhesjon og migrering, disse teknikk bare tilveiebringe forbigående kontroll siden adsorpsjon er en reversibel prosess 11. Også molekyler adsorberes til overflatene i uforutsigbare retninger og ved tilfeldige konsentrasjoner derved begrenser nøyaktigheten og kontroll av biospesi interaksjoner. Videre har forbindelser som vanligvis brukes til å lage ikke-begroings regioner, slik som bovint serumalbumin eller Pluronic F127, ikke besitter angitte reaktive seter for ytterligere funksjonalisering begrensende post-adsorpsjon in situ modifikasjoner. Sams av alkanethiols kan genereres med slike reaktive grupper for ekstra overflatemodifisering, men også de har begrenset holdbarhet i vevskultur Conditioner på grunn av mangel på oksidativt skjerming gis av podet PEG børster 10,11. Omvendt fusjonen av våre R-μCP plattformer med PEG-børste pode og sekvensielle nukleofiliske substitusjonsreaksjoner gir mulighet til ingeniør underlag med holdbare, mikroskala cytophobic regioner som kan modifiseres a priori eller in situ med bio-ortogonale funksjoner. Dette vil tillate større kontroll over biospesi interaksjoner som kan regulere in vitro vev morfologi og vekst.
Et nøkkelstyrke for R-μCP sammenlignet med andre systemer for å innrette sekvensielle mikro opptrykk er evnen til å fjerne substratet fra systemet mellom gjentatte stampings samtidig opprettholde høy justeringsnøyaktighet 12,13. Dette gjør at større mangfold i typer overflatekjemi som kan brukes, og varigheten av overflatemodifikasjonsreaksjoner kan varieres for å tune tettheten av senere immobilisert ligander 6. Dermed kan R-μCP brukes til å etablere knutepunkter konsentrasjonsgradienter i de biokjemiske signaler som formidler biospesi interaksjoner 14. Med kapasitet til nøyaktig kontroll både plasseringen og graden av biospesi interaksjoner, tilbyr R-μCP systemet en unik metode for å undersøke rollene til bioaktive ligander i vev morphogenesis og etablerer et robust system for å generere kultur underlag simulere presentasjonen av biologiske signaler i in vivo nisje.
En kritisk del av mobilnettet nisjer, spesielt innen utvikling, er spatiotemporal modulering av signalfaktorer 18. Selv om oppløselige biokjemiske signaler kan tilsettes til kulturmedier i en tidsmessig definert måte, hvor det er begrenset romlig kontroll over hvilke celler støter på disse signaler. Med R-μCP system som beskrives her, er det mulig å konstruere micropatterned kultur substrater med terminalt functionalized PEG børster presentere azid funksjonelle grupper som ikke har noen effekt på celle skjebne i kultur. Mens azid-grupper er i stand til å undergå kobber-katalysert "klikk" reaksjoner med molekyler som presenterer alkyn, kan dette ikke utføres i nærvær av celler i kultur gitt giftigheten av kobber. Men høy belastning molekyler som dibenzocyclooctyne (DBCO) gjennomgå en svært selektiv og biokompatible kobberfritt azid-alkyn cykloaddisjon reaksjon 19,20. Gjennom konjugering av DBCO holdige linkerne, kan micropatterned kultur underlag endres in situ med nye biologiske ligander 21. Med muligheten til å gjengi cytophobic regioner cytophilic eller legge til ulike biokjemiske signaler for bruk i flere trinn signal prosedyrer, kultur underlag generert med denne metoden har romanen adaptive evner og dermed gi en mer robust system for å instruere vev morphogenesis in vitro.
Til tross for den enorme pottenential og nytten av R-μCP plattform, det har visse ulemper. Bruk av mange SI-ATRP skritt for å generere PEG-podet underlag i stor grad øker fabrikasjon tid i forhold til metoder som involverer blekkutskrifter eller mikro deponering av ECM proteiner. Mens presisjonen av blekkstråletrykkteknikk kan konkurrere med dagens R-μCP system, er adsorpsjon av ECM-proteiner reversibel derved å tilveiebringe mindre kontroll av celle-protein interaksjoner. Dessuten kan substrater som genereres via blekkstråletrykketeknikker ikke fjernes under fabrikasjon, og dermed hindrer bruk av ulike substrat modifikasjons kjemi som muliggjør, for eksempel, romlig begrensede in situ substrat 22 modifikasjoner. På grunn av disse begrensningene inkjet teknikker er bedre egnet for rask generasjon av kultur underlag først og fremst opptatt med kort varighet, statiske arrangementer av biomolekyler og celletyper 23 mens R-μCP systemet er mye better egnet mot å generere mangefasetterte underlag er utformet for å vise langsiktig, dynamisk kontroll over både romlige og tidsmessige cellulære interaksjoner i 2D med ulike biologiske ligander.
Mikro utskrift muliggjør rask deponering av nano-til-mikroskala "ink" inneholder over store flater, men det har alltid vært stor heterogenitet i konsentrasjonen av deponert 'blekk' stoffer. Dette er også en strømbegrensning til R-μCP plattform som kan observeres i figur 4. Vi hypotese at heterogeniteten i fluorescerende modifiseringen av PEG børster er på grunn av robotens anvendelse av en ujevn normalkraft over hele PDMS stempel, hvilke er også sannsynlig ikke helt flat. Dette resulterer i ikke-ensartet kontakttrykket mellom alle regioner av stempel og substratet og derved forårsake ujevn avsetning av alkantiol initiator og påfølgende tykkelsen av podet PEG børste. IFor å fremstille PEG-podete substrater med jevn avsetning av alkanethiols og derved overflatefunksjonalitet, vil stanseverktøyet designen trenger å bli optimalisert for å påføre et jevnt fordelt og normalkraft over hele PDMS stempel. Dette vil lette jevn kontakt med de gullbelagt lysbilder i hele grensesnittet uavhengig av stempel ufullkommenhet. Også i figur 4B, kan man observere svak kryss-kontaminering av acetylengruppene på azid terminert PEG børste. Mens overflatetetthet av immobiliserte ligander på grunn av kryss-forurensning er minimal i forhold til at på den tiltenkte PEG-børste, kan denne reduseres til nær null ved å øke varigheten av etanolamin passiveringsreaksjon (se punkt 6) som demonstrert tidligere seks.
Den primære anvendelsen av R-μCP systemet som er beskrevet her er for fremstilling av komplekse vev kultur substrater som kan brukes for å utøve romlig og tidsstyre of celle skjebne. Men den høye presisjonen og nøyaktigheten av R-μCP plattformen gjør det til en attraktiv metode for andre programmer også. Evnen til mønsteret cytophilic områder med differensial ligand chemistries fulgt av in situ endring av tidligere inerte, cytophobic regioner åpner for co-kultur av flere cellelinjer med stram kontroll over sin romlig orientering. Dette kombinert med den iboende høy gjennomstrømming natur micropatterning presentere et alternativ til dagens metoder for høy gjennomstrømming screening av både enkeltceller og multi-celle kombinasjoner 24. Mens R-μCP system har et stort potensial i riket av biologi, kan det også brukes til feltet av mikroelektromekaniske systemer (MEMS). I MEMS fabrikasjon, er det ønskelig å overføre MEMS komponenter med høy presisjon og nøyaktighet for masseproduksjon. Med nye kinetiske stempling teknikker, kunne R-μCP systemet beskrevet her være tilpasset effektivt skrive ut components av silisium eller galliumnitrid på silisiumskiver til bruk i generere MEMS 25. Således kan R-μCP plattformen skal brukes til en lang rekke potensielle anvendelser.
I konklusjonen, til bruk av R-μCP systemet generere PEG-podet kultur underlag orthogonally funksjon bruker sekvensielle nukleofil substitusjon reaksjoner presenterer ikke bare en ideell plattform for potensielt kontrollerende vev morfologi og vekst in vitro, men et utmerket system for å undersøke rollene til flere bioaktive ligander på celle skjebne. Evnen til mønster flere biokjemiske signaler i distinkte og høyt bestilt mønstre etablerer grunnlaget for å bygge kultur underlag som kan instruere dannelsen av vev strukturer med flere celletyper organisert i micron skala. Dette, kombinert med muligheten til å endre micropatterned substrater i situ, kan tillate for uovertruffen kontroll av vev morphogenesis og cell skjebne i kultur. Mønstringen teknikker beskrevet her gir et allsidig system for produksjon av kultur underlag som kan en dag letter rasjonell og reproduserbar produksjon av organotypic vevsstrukturer in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SCARA | Epson | LS3-401ST | Higher end models with increased precision are available if desired. |
| (Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane | Gelest | SIT8174.0 | CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated. |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Ellsworth Adhesive Co | NC9020938 | Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable. |
| 24 mm x 50 mm #1 Cover Glass Slides | Fisher Scientific | 48393106 | These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need. |
| CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator | Telemark | SEC-600-RAP | Requries specialized training. |
| EPSON LS3 SCARA | EPSON | LS3-401ST | |
| ω-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate | Prochimia | FT 015-m11-0.2 | Store at -20 °C. Other ATRP initiators may be used as this R-μCP platform is applicable to all micropatterning modalities. |
| Schlenk Tube Flask 50 ml | Synthware | 60003-078 | Requires rubber stoppers with diaphram. |
| Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate | Sigma Aldrich | 447943 | Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors. |
| Methanol (Certified ACS) | Fisher Scientific | A412-4 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Copper(II) Bromide | Sigma Aldrich | 437867 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| 2,2'-Bipyridine | Sigma Aldrich | D216305 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | A4034 | |
| 20 ml Borosilicate Glass Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-340-4E | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| N,N-dimethyformamide | Sigma Aldrich | 227056 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | 398136 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Propargylamine | Sigma Aldrich | P50900 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| 200 Proof Ethanol | University of Wisconsin Material Distribution Services | 2292 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Azide-PEG3-Biotin | ClickChemistryTools | AZ104-100 | Solubilized in DMF |
| Copper(II) Sulfate | Sigma Aldrich | C1297 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Sigma Aldrich | 678937 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A7506 | |
| Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 14190144 | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose. |
| 12-Well Polystyrene Plate | Thermo Scientifit - NUNC | 07-200-81 | Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions. |
| DBCO-PEG4-Biotin | Clickchemistytools | A105P4-10 | Solubilized in DMF |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Life Technologies | S-11223 | Solubilized in PBS |
| Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | S-11225 | Solubilized in PBS |
| Nikon A1-R Confocal Microscope | Nikon | Nikon Eclipse Ti, A1R | An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates. |
References
- Senaratne, W., Andruzzi, L., Ober, C. K. Self-Assembled Monolayers and Polymer Brushes in Biotechnology: Current Applications and Future Perspectives. Biomacromolecules. 6 (5), 2427-2448 (2005).
- Hucknall, A., Kim, D. -H., Rangarajan, S., Hill, R. T., Reichert, W. M., Chilkoti, A. Simple Fabrication of Antibody Microarrays on Nonfouling Polymer Brushes with Femtomolar Sensitivity for Protein Analytes in Serum and Blood. Advanced Materials. 21 (19), 1968-1971 (2009).
- Hucknall, A., Rangarajan, S., Chilkoti, A. In Pursuit of Zero: Polymer Brushes that Resist the Adsorption of Proteins. Advanced Materials. 21 (23), 2441-2446 (2009).
- Rozkiewicz, D. I., Jańczewski, D., Verboom, W., Ravoo, B. J., Reinhoudt, D. N. Click” Chemistry by Microcontact Printing. Angewandte Chemie International Edition. 45 (32), 5292-5296 (2006).
- Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology. Chemical Society Reviews. 39 (4), 1272-1279 (2010).
- Sha, J., Lippmann, E. S., McNulty, J., Ma, Y., Ashton, R. S. Sequential Nucleophilic Substitutions Permit Orthogonal Click Functionalization of Multicomponent PEG Brushes. Biomacromolecules. 14 (9), 3294-3303 (2013).
- Tugulu, S., Silacci, P., Stergiopulos, N., Klok, H. -A. RGD—Functionalized polymer brushes as substrates for the integrin specific adhesion of human umbilical vein endothelial cells. Biomaterials. 28 (16), 2536-2546 (2007).
- Ashton, R. S., et al. High-Throughput Screening of Gene Function in Stem Cells Using Clonal Microarrays. Stem Cells. 25 (11), 2928-2935 (2007).
- Koepsel, J. T., Murphy, W. L. Patterned Self-Assembled Monolayers: Efficient, Chemically Defined Tools for Cell Biology. ChemBioChem. 13 (12), 1717-1724 (2012).
- Mrksich, M., Dike, L. E., Tien, J., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver. Experimental cell research. 235 (2), 305-313 (1997).
- Ma, H., Hyun, J., Stiller, P., Chilkoti, A. Non-Fouling” Oligo(ethylene glycol)- Functionalized Polymer Brushes Synthesized by Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization. Advanced Materials. 16 (4), 338-341 (2004).
- Bou Chakra, E., Hannes, B., Dilosquer, G., Mansfield, D. C., Cabrera, M. A new instrument for automated microcontact printing with stamp load adjustment. Review of Scientific Instruments. 79 (6), (2008).
- Trinkle, C. A., Lee, L. P. High-precision microcontact printing of interchangeable stamps using an integrated kinematic coupling. Lab on a Chip. 11 (3), 455 (2011).
- McNulty, J., et al. High-precision robotic microcontact printing (R-μCP) utilizing a vision guided selectively compliant articulated robotic arm. Lab on a Chip. , (2014).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscalepatterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
- Nam, Y., Chang, J. C., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Gold-Coated Microelectrode Array With Thiol Linked Self-Assembled Monolayers for Engineering Neuronal Cultures. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (1), 158-165 (2004).
- Ma, H., Wells, M., Beebe, T. P., Chilkoti, A. Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization of Oligo(ethylene glycol) Methyl Methacrylate from a Mixed Self-Assembled Monolayer on Gold. Advanced Functional Materials. 16 (5), 640-648 (2006).
- Scadden, D. T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 441 (7097), (2006).
- Codelli, J. A., Baskin, J. M., Agard, N. J., Bertozzi, C. R. Second-Generation Difluorinated Cyclooctynes for Copper-Free Click Chemistry. Journal of the American Chemical Society. 130 (34), 11486-11493 (2008).
- Debets, M. F., van Berkel, S. S., Schoffelen, S., Rutjes, F. P. J. T., van Hest, J. C. M., van Delft, F. L. Aza-dibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3+2) cycloaddition. Chemical Communications. 46 (1), 97 (2010).
- DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
- Roth, E. A., Xu, T., Das, M., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. Inkjet printing for high-throughput cell patterning. Biomaterials. 25 (17), 3707-3715 (2004).
- Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A.
- Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).
- Meitl, M. A., et al. Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp. Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).
