Introduction
Воспалительная реакция с болезнью или травмой в центральной нервной системе (ЦНС) мало изучен, особенно в отношении взаимодействия между иммунной и резидентных клеток в ткани. Исследования этих клеточных взаимодействий в спинном мозге, представляют особый интерес в живом. Только легко доступны ЦНС белого вещества тракта в спинной столбцов спинного мозга, что делает этот важный участок, на котором сосредоточить усилия на улучшении посильную экспериментальный подход. Эти исследования были ограничены из-за технических трудностей в получении доступа и стабилизации ЦНС для работы с изображениями. Живая съемка в спинном мозге была описана ранее 1-13, однако, несколько исследований, обратившихся сотовой движение в травме спинного мозга за несколько часов после первоначального оскорбление. Травматический спинного поражение шнур сложная среда, с нейронами, астроциты, фибробласты, клетки-предшественники NG2 и иммунных клеток вкнг микроглии, нейтрофилы, макрофаги, Т-лимфоциты, В-лимфоциты и дендритные клетки 14,15. Макрофаги являются подмножеством иммунных клеток, ответственных за фагоцитоза в поражении, проникают из кровотока. Роль этих фагоцитов был обсужден с сообщениями о том, что эти клетки могут принимать как повреждения и защитных ролей в поврежденной ткани. Эти роли варьируются от увеличения среднего аксонов отмирание после травмы и действуя в фагоцитарной образом 16-22, к принятию на заживления раны фенотип и снижение функциональных дефицитов в раненное животное 21,23,24.
Ранее попытки выделить макрофаги микроглии, полагались в основном на морфологии здоровой ткани. Однако, активированные микроглии и макрофаги выразить многие из тех же маркеров и отобразить неотличимый морфологию после травмы 25-29, что делает разделение различных действий этих клеток трудно изучить BASред на только 30 этих факторов. Эти клетки могут быть отделены с помощью дифференциальной экспрессии CD45 методом проточной цитометрии 33,34, хотя этот подход менее полезны при выделении этих типов клеток в живом организме. Используя дифференциальное выражение CCR2 и CX3CR1 в микроглии и макрофагов, также были исследованы, хотя динамические изменения в экспрессии этих маркеров как моноциты дифференцируются в макрофаги могут осложнить точный анализ 35,36. Микроглия являются иммунные клетки-резиденты в ЦНС и воскресни из желточного мешка предшественников в период внутриутробного развития, в то время как макрофаги являются производными от прародителей костного мозга и войти в поврежденную ЦНС после инсульта 31,32. Альтернативный подход к использованию морфологию различать эти два типа клеток заключается в замене костный мозг с клеток-предшественников из животного-донора выражения прослеживается маркер в макрофагах, полученных от донора клеток-предшественников, сохраняя при этом житель ЦНС, Recipнике, полученных микроглии. Эти костного мозга химерные модели, как правило, используются во многих других применений 37-40. Этот метод имеет уникальные оговорки, связанные с повреждением целостности гематоэнцефалического барьера, вызванного облучением или цитотоксических лекарственных средств, используемых для ликвидации предшественников костного мозга в организме хозяина, тем самым ограничивая его использование в некоторых приложениях. Недавно, функциональные различия между микроглии и макрофагов в ЦНС начинают различить с помощью проточной цитометрии, чип-ген анализ массива и методы химеризм 24,26,41-44, которые окажутся очень полезными в будущем. Хотя разделения этих двух типов клеток остается сложной, понять их уникальные функции играет важную роль в приводя к более целенаправленной лечения расстройств, включающих как микроглии и макрофагов в ЦНС.
Описание клеточных взаимодействий в спинном поражении мозга имеет, прежде всего, исходить от исследований с участием моделей клеточных культур. Это dвследствии проблем, связанных с изображениями как спинного поражения мозга и клеток иммунной системы вместе в живом. Современные модели грызунов травмы спинного мозга различной формы и тяжести включают в себя модели ушиб 45,46, укола травм 2, рваная рана 47, а спинной колонка раздавить травм, описанную здесь, 16,18,48. Воспаление в мозговые оболочки увеличивается с тяжестью травмы и создает уникальные проблемы для имплантации окон или операций для серийного изображений. Некоторые из этих проблем включают инфильтрацию фагоцитирующих клеток, а также генерацию фиброзной ткани над хирургического вмешательства. Некоторые из этих вопросов могут быть преодолены путем создания небольших повреждений и покрытие подвергается спинного мозга с неиммуногенной перевязочный между твердой мозговой оболочкой и paraspinous мышц позволит в дальнейшем повторное открытие хирургии, как это делается здесь, чтобы учиться спинной колонки размозжение , Возможность изображением, только спинной части спинааль шнура также ограничивает выбор травмы, так как модели ушиб главным привести к повреждению центральной мозга, часто избавляя наиболее дорсальной части колонн спинных, особенно на ранних временных точках после травмы 45,49. Таким образом, мы описываем простую модель повреждения, который дает чистый, воспроизводимое, прямоугольной формы повреждение, которое полезно как для наблюдения за движением клеток внутри поражения, а также для облегчения количественной оценки аксонов положении по отношению к поражения.
Protocol
Примечание: Все животные должны быть размещены и использованы в соответствии с уходу и использованию животных комитета (IACUC) в учреждении. Все процедуры, описанные здесь, утверждаются Case Western Reserve University IACUC.
1. трансгенных животных
- Используйте имеющиеся в продаже люминесцентные репортер мышей, чтобы маркировать аксоны (Thy-1 YFP H) 50 и микроглии / моноциты (CX3CR1 GFP / GFP 51 см перечень материалов). Эти мыши должны быть пересекаются и поддерживается в виде отдельных колоний размножения в соответствии с институциональной политики по уходу за животными.
2. костного мозга химеры
- Определение животных, которые, по меньшей мере 8-недельного возраста для использования в качестве животных-реципиентов.
- Поместите животных-хозяев в круглом облучения проведения клетке разработан, чтобы держать мышь в состоянии обеспечить даже, облучения всего тела.
- Установите таймер на цезия (Cs-137) Облучатель для администрирования излучения DOS всего телавозраст 800-1000 Rads к животным в соответствии с инструкциями изготовителя (примеры, приведенные здесь, являются 980 рад).
- Вернуться животных в их клетки, чтобы отдохнуть в течение как минимум 4 часа.
- Выбор животных-доноров на соответствующей генотипа (рис 2а) в качестве источника клеток-предшественников костного мозга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующие доноры животные, выражающие разные фамилии конкретных флуоресцентных журналистам от хозяина для идентификации различных популяций клеток, или один из того же генотипа в качестве контролей. - Наполните одну чашку Петри с 70% -ным спиртом, и второе блюдо с 10 мл Roswell Park Memorial Institute (RPMI) средства массовой информации и 40 мкм ячейки фильтра, смоченной в средствах массовой информации. Заполните 15 мл коническую трубку с RPMI СМИ. Держите посуду и трубки на льду.
- Жертвоприношение животных-доноров СО 2 удушья в соответствии с ведомственным руководящим принципам. Очистите кожу и мех, впитывая всю животное с 70% этанола, пока все мех мокрые.
- Удалить СКв с нижней половине животного за счет разрезания вокруг средней части и потянув кожу вниз по задними ногами, чтобы в полной мере раскрыть мышцы ног.
- Удалить большеберцовой кости с передней перенапряжением в коленном суставе вывихнуть косточку, затем с помощью стерильного пинцета и ножниц, очистить и нарезать мышцы от обоих концов большеберцовой кости. Поместите кость в чашку Петри с алкоголем до 30 сек трансфер в ячейки фильтра внутри чашки Петри, содержащей СМИ.
- Вывихнуть тазобедренный сустав и очистить от мышцы крепятся к бедренной, размещенных бедренной кости кратко в спирте, а затем поместить его в том же сито клеток внутри блюда.
- В капюшоне культуры ткани, используйте стерильные ножницы, чтобы отрезать оба конца костей и вставьте 21 иглы на шприц емкостью 1 мл в конце кости. Промойте мозга в 15 мл коническую со средствами массовой информации. Повторите процедуры для остальных костей.
- Использование задней части плунжера из 3 мл шприца, раздавить кости заканчивается в клеткеФильтр на чашку Петри, чтобы извлечь больше клеток.
- Поместите фильтр в верхней части 50 мл коническую пробирку и передачи среды с отсасывали клетки из 15 мл коническую трубку. Использование в задней части плунжера для подавления костного мозга с целью получения суспензии отдельных клеток. Вымойте 15 мл коническую трубку, фрагменты костей и клеток фильтр с 30 мл среды в 50 мл коническую трубку.
- Центрифуга клетки в течение 5 мин при 500 мкг для осаждения клеток.
- LYSE красные кровяные клетки с 2 мл аммония-хлорида калия (ACK) буфера для лизиса в течение 2 мин. Гасят лизирующего буфера с 10 мл среды, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки. Центрифуга на 500 мкг в течение 5-10 мин для осаждения.
- Промыть клетки один раз в 10 мл RPMI среде и два раза в физиологическом растворе, центрифугирования при 500 х г в течение 5-10 мин для осаждения для каждой промывки.
- Ресуспендируют клеток в конечной концентрации 3 × 10 6 клеток в 200 мкл физиологического раствора.
- Передача 3 х 10 6 клеток мозга через хвостовую вену инъекцией в IRRadiated мышей-реципиентов.
- Поместите подкисленной водой (рН 3,0) в получателя клетке и позволяют мыши, чтобы восстановиться.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши, которые не трансплантация умрет в течение 10-14 дней после процедуры. - После 8 недель, проверки воссоздания мозга путем анализа периферической крови иммунные клетки с помощью проточной цитометрии (фиг.2В-С).
3. Спинной колонки Давка травмы
ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите соответствующие химера животных или двойные трансгенных животных для хирургии на основе эксперимента желаемого. Животные либо с мечеными мозга клеток, полученных резидентами или кости были созданы в предыдущих шагах.
- Подготовка и автоклава хирургические инструменты, в том числе кусачек, Дюмон # 4 щипцы, ирис ножницы, щипцы для проведения тканей, водителей игл и раны клипов.
- Подготовка лекарства для введения мышам для контроля боли. Bupernex и Marcaine обычно используются для контроля боли. Используйте соответствующие лекарства по мере необходимостий утверждены уходу и использованию комитета за животными (IACUC) по.
- Анестезии с 4% изофлуран и поддерживать с 1-2% изофлуран для достижения частоты дыхания 60-100 дыханий в минуту. Применить глаз смазку глаза животного, чтобы предотвратить сухость под наркозом и подтвердить отсутствие ответа пешком крайнем случае. Поддерживайте температуру с помощью электрогрелки и контролировать температуру с помощью ректального зонда.
- Бритье спине мыши с электробритвы за целевым уровне спинного мозга, а затем тампоном площадь в три раза с повидон-йода с последующим два раза с 70% алкоголя. Место животное на стерильной салфетке, и охватывают животное с другой стерильной драпировки с отверстием вырезать в нужном месте, чтобы визуализировать хирургическое место. Поддерживать все инструменты на стерильными пеленками во всем хирургии.
- Порезать кожу вдоль средней линии в желаемом уровне спинного с радужной оболочки ножницами, чтобы подвергать мышцы на спине животного.
- Под диссecting микроскоп, вырезать мышцы спины, в том числе трапециевидной и связок широчайшей мышцы спины вдоль средней линии, где они придают задних спинальных процессов, и подвергать позвоночник.
- Снимите ротатор мышцы между спинной и поперечных отростков позвонка, чтобы выявить пластинку конкретного позвонка должен быть удален (T11 в данном случае). Определить T11 путем введения последней невсплывающим ребра на этот процесс.
- Вставьте кончики кусачек в выше и ниже процесса, который будет удален пространстве и слегка приподнимите, чтобы убедиться, что они надежно в месте вокруг позвоночного пластинки, но не слишком глубоко, чтобы травмировать позвоночник. Закрыть кусачек в одно движение, чтобы удалить пластину.
- Увеличить ламинектомию по мере необходимости с помощью кусачек для удаления мелких деталей из оставшихся позвонка.
- Измерьте 1 мм от кончиков A # 4 щипцов, удерживая их от правителя и маркировка с перманентным маркером. Измерьте 1 мм эшелонирования ставкиWEEN два зубья, держа щипцы против правителя и устанавливает максимальную ширину советы до 1 мм, сдвинув резиновые щипцы кольцо на место на вал пинцета.
- Создать небольшое отверстие, вставив 30 иглы через твердую мозговую оболочку в двух точках вставки зубцов щипцов для доступа к спинного мозга.
- Вставка щипцов зубцы под углом к твердой мозговой оболочки через отверстия на глубину 1 мм, отмеченных на сторонах щипцов 90 °, убедившись, что метка над твердой мозговой оболочки. Pinch закрыть щипцы и удерживайте в течение 10 секунд. Выпуск и повторите щипцы выжать еще два раза в общей сложности три трюма. Удалить щипцы от спинного мозга.
- Кусок впитывающийся желатина сжатый губки в физиологическом растворе и место над местом повреждения.
- Использование Бегущая строчка, шов мышцы в месте над ламинектомии и пропитанную желатиновой губки с # 4 синтетических нерассасывающихся нейлоновых швов.
- Клип кожи на месте с помощью 5 мм, свернутой CLIпс.
- Подайте 10 мкл Marcaine (1,0 мг / кг) в 490 мл физиологического раствора подкожно по всему разреза и 5 мкл Bupernex (0,1 мг / кг) внутримышечно в ягодичную мышцы.
- Разрешить животных для восстановления на теплую подушку и отслеживать любые трудности в движении или признаков паралича в задних конечностях. Не оставить животное без присмотра или в присутствии других животных, пока полностью не восстанавливается после анестезии. Не используйте никаких животных, которые отображают дефицит наблюдаемые двигателя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя это давка поражение может быть выполнена на любом уровне вдоль спинного мозга, практически, T10-L4 представляют меньше технических проблем для работы с изображениями в отношении дыхания и стабилизации движения тела с использованием зажимов. Размещение Зажим должен быть изменен вокруг грудной клетки, чтобы изображение на грудном уровнях.
4. Прижизненные изображений
- Подготовка и автоклава хирургические инструменты, в том числе Дюмон # 4 пинцетом, Ирис ножницы, щипцы для проведения ткани, иглы Dреки и раны клипы.
- Обезболить мышь, как и прежде изофлураном. Анестезии в 4-5% и поддерживать на уровне 1-2% по мере необходимости для поддержания частоты дыхания 60-100 дыханий в минуту и отсутствие реакции на ногу крайнем случае. Держите мышь с подогревом, мониторинг частоты дыхания, когда не томография и постоянно контролировать температуру животного с ректальный зонд.
- Очистите кожу вокруг раны клипов с Бетадин, а затем алкоголь и удалить раны клипы соответствии с инструкциями производителя. После того, как раны клипы будут удалены, удалить волосы с Наир, если необходимо, и убрать на сайт снова повидон-йода и 70% спирта.
- Снова откройте кожу с помощью ножниц. Удалите все оставшиеся швы из мышц и потяните мышцы, кроме щипцами, при необходимости резки с ножницами.
- Под микроскопом рассекает, создать карманы для спинного мозга зажимы, сокращая мышцы с ножницами в стороне поперечных отростков на позвонок одном уровне позвонка выше и ниже Ламиnectomy.
- Поместите зажимы вокруг каждого из этих позвонков и затяните. Отрегулируйте при необходимости, чтобы места для объектива микроскопа, чтобы достичь спинной мозг. Убедитесь, что спинной мозг параллельно платформе изображения и сохранять стабильность тканей для визуализации. Если дыхание артефакт видели, скорректировать зажимы, соответственно, минимизировать движение в поле изображения.
- Обложка зажимы с парафином.
- Извлеките поглощаемый желатина сжатого губку из спинного мозга с пинцетом, осторожно отбирает, как много частей, как это возможно, и удаление как можно больше рубцовой ткани от более оболочек, как это возможно. Крышка подвергается спинной мозг солевым раствором и новой губки, если это необходимо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если какой-либо кровотечения из окружающего мышцы, либо ярым с губкой или прижечь по мере необходимости. Тем не менее, старайтесь не прикасаться к спинного мозга с прижиганием. Накройте спинного мозга с обеих кусок влажной ткани или желатина сжатый губки, когда прижигание. - Создать WELл провести иммерсионной жидкости с первого уплотнения кожи и ткани с Vetbond, а затем с помощью зубной акрил для создания и между двумя зажимами спинного мозга и держателем бокам животного. Подождите, пока акриловые лечения.
- Заполните хорошо с искусственным спинномозговой жидкости (ACSF) и проверьте еще раз для любого кровотечение вокруг хирургии сайта.
- При желании в этот момент, вводят флуоресцентные красители сосудов внутривенно путем инъекции в хвостовую вену, чтобы выделить кровеносные сосуды во время съемки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентные декстран выше 70 кДа часто используется, хотя квантовые точки и флуоресцентно меченные лектины также служат в качестве полезных красители сосудов. 50 мкл 150000 WM TRITC-декстрана, как правило, вводят внутривенно. - Чтобы получить соответствующую физиологически подвижность иммунных клеток, температура мыши должна поддерживаться на уровне 37 ° С. Подведите указатель мыши к температурным контролем окружающей среды под микроскопом для визуализации и мониторинга животного для правильных AnesУровень thesia от частоты дыхания и обуви крайнем случае. Монитор животное часто во время съемки для определения глубины наркоза, с целью достижения частота дыхания 60 - 100 вдохов в минуту.
- Найдите сайт видения через окуляр микроскопа.
- Отрегулируйте 2-фотонной лазерного сканирующего микроскопа принять г-стека изображений каждые 30-60 секунд, чтобы получать динамические данные изображений.
- После того, как изображения завершения сеанса удалить животное от нагретой коробке.
- Ослабить позвоночника фиксаторы и снимите мышь от зажимов. Потяните акрил далеко от кожи, удаляя зажимы.
- Если мышь должна быть отображены снова, поместите солевой вымачивают желатин сжатый губки на спинном мозге. Закройте мышцы и кожу над хирургии сайта. Не оставляйте животное без присмотра или в присутствии других животных во время восстановления после анестезии. Если животное проявляет никаких признаков неврологического дефицита после восстановления, животное должно быть умерщвлено. В противном случае, усыпитьмышь в CO 2 камеры, прежде чем он выходит из наркоза в соответствии с IACUC-утвержденным протоколом об эвтаназии.
- Анализ люминесцентных изображений с помощью программного обеспечения для анализа изображений в соответствии с инструкциями изготовителя.
Representative Results
Упрощенна схема спинной колонки раздавливание поражение показано на фиг.1А. После поражения, животное получают и стабилизируют для прижизненной микроскопии с использованием спинного зажимы (фиг.1В). Изображение, полученное сразу после травмы спинной колонка раздавить показывает ясно видимую прямоугольную поражения пинцетом зубьев точек вставки, которые явно идентифицировать. Аксоны в месте повреждения разорваны на протяжении всей всей спинной колонки (рис 1в). Целостность кровеносных сосудов остается неизменным, и никаких доказательств утечки красителя судно не было обнаружено флуоресценции. Для выполнения последовательного изображений одного и того же поражения в течение нескольких недель, мышцы и кожа может быть зашивается над ламинектомии для последующего повторного заражения. Подобно поражения морфологии видно на более поздних временных точках (фиг 1D, R). 5 дней после травмы, сайты щипцы для вставки видны до сих пор, но поражение начал увеличиваться в размерах DUE вторичного повреждения, вызванные воспалением. Аксоны в каудальном конце поражения отходя от начального участка травмы с помощью процесса, называемого "аксонального отмирание". Аксоны в ростральной конце поражения выставлены Уоллеровской-как дегенерация (рис 1D, E). Между дней 5 и 22 после травмы, размер поражения стабилизировалась. Одновременно с этим, большой приток CX3CR1 + клеток можно увидеть проникновения в и вокруг раздавить поражения в течение этих временных точках, хотя идентичность этих клеток (микроглии против макрофагов), не могут быть выделены в подготовке, как показано на рисунке 1.
Для того чтобы отличить поведение микроглии и макрофагов в раздавливание поражения микросреды, модель излучение химера была использована (описано на фиг.2А). Во-первых, клетки-предшественники костного мозга CX3CR1 + / GFP мыши заменены без флуоресцентного доноров CELLs, таким образом, только GFP + CNS-резидент микроглии могут видеть флуоресцентной визуализации. Эффективность восстановления мозга может быть подтверждено путем проточной цитометрии рассмотрении периферической крови через 8 недель после пересадки костного мозга (фиг.2В, С). В фиг.2В, F4 / 80 и GFP позитивных макрофагов, выделенный синим, обнаруживаются в CX3CR1 + / GFP → C57BL / 6 химерного мышь, в которой некоторые GFP отрицательным, но F4 / 80 положительные моноциты, также присутствуют. На рисунке 2C, без двойных положительного F4 / 80 и GFP-позитивных клеток остаются после замены CX3CR1 + / GFP получатель костного мозга дикого типа костного мозга. Перед травмы, микроглии, равномерно распределены в пределах спинного мозга, показывая отдыха, разветвленная морфология (рис 2D). 8 дней после травмы, только несколько микроглии может быть обнаружен в и вокруг очага поражения. Эти микроглии отображать амебоидных морфологию (рис 2E). Во-вторых, костиклетки-предшественники костного мозга в нефлуоресцентном мыши заменены клетками мозга от CX3CR1 + / GFP мыши, поэтому оказание костного мозга происходит CX3CR1 + моноциты / макрофаги, видимых флуоресценции GFP (рис 2а). Перед травмы, только GFP + клетки, обнаруженные в основном периваскулярное, которые, как сообщалось, быть получены костного мозга и непрерывно передавать на постоянной основе 28 (фиг 2f). После травмы раздавить, CX3CR1 + / GFP клетки можно увидеть вдоль внутренней поверхности кровеносных сосудов, окружающих очаг поражения (рис 2Н-J), и поражение центр заполнен проникновения CX3CR1 + / GFP макрофаги (Рис 2G).
Временной интервал изображения из столбцов спинных может быть выполнена до 6 ч. На рисунке 3, мы показываем нехимерные CX3CR1 + / GFP мышь непосредственно после травмы, при котором клетки из кровотока может быть представлена,п перемещении из кровеносного сосуда в направлении сердцевины поражения и перемещение в месте повреждения (рис 3а, б, Справочная фильм 1). Анализ изображений с использованием интенсивности флуоресценции для выявления клеток могут отслеживать пути, принятые макрофагов (рис 3а, б; Справочная Фильм 1). Статистических данных, полученных из анализа изображений показывают средний подвижность макрофагов в поражении составляет 3,6 мкм / мин (рис 3D). Наконец, на 22 дней, после травмы, аксонов, микроглии и макрофагов может все еще быть обнаружены в поражении, демонстрирующего область визуализации является стабильным в течение длительных периодов времени (дополнительные Movie 2).
Рисунок 1: Создание и последовательный изображений травмы спинной колонка раздавить. () Спиннойтравмы колонка давка осуществляется путем удаления процесса спинной позвонок на уровне интересов. Щипцы вставлены в колонку спинного спинного мозга 1 мм друг от друга, а затем закрывается 3 раза, чтобы получить повреждение, показанное на фиолетовый. (Б) животных затем устанавливают с спинного мозга зажимы для получения стабильности для прижизненной визуализации. (С) Сразу после травмы, сайты щипцы для вставки (красный овал) и прямоугольный объем размозжение (серая коробка) могут быть четко определены. Аксоны в спинной корни можно увидеть (белые стрелки), а также поврежденные концы аксонов на хвостовой части поражения (заполненные стрел). (D), через 5 дней после травмы, сайты вставки щипцы (красный овал ), и степень поражения (серое поле) до сих пор можно легко визуализировать. С момента первоначального оскорбление поражения увеличилась в размерах. Аксоны, проходящие Уоллеровской-как вырождение можно увидеть ростральнее поражения (открытое стрел) в дополнительна аксонов в спинном корней (белые стрелки) и концы поврежденных аксонов (белые стрелки). (E) 22 дней после травмы, повреждение сайт по-прежнему отождествляется с аналогичными размерами до ранения после 5 дней. Обратите внимание на большое количество CX3CR1 + клеток и вокруг поврежденного участка. Особенности меченые такие же, как в (D). Все масштабные линейки = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Конструирование химерных мышей, чтобы отслеживать CX3CR1 + / GFP с выражением ЦНС-резидентов микроглии или костного мозга, полученных макрофагов в спинной колонки раздавливание поражения. () Схема химерных поколения мышей либо с CX3CR1 + / GFP выражения миcroglia или макрофаги. Во-первых, у мышей Thy-1 YFP H облучении и костного мозга восстанавливают с клетками костного мозга, выделенных из CX3CR1 + / GFP мыши, в результате чего химерного мышь которой макрофаги GFP +. Во-вторых, Thy-1 YFP Н / CX3CR1 + / GFP мышей облучали и костного мозга восстанавливают с клетками костного мозга, выделенных из не-флуоресцентного мыши, получения химерного мышь которой микроглии являются GFP +. (B) Пример проточной цитометрии данных с клетками F4 / 80 + и CX3CR1 GFP + в крови из химерного животного с CX3CR1 + / GFP донора костного мозга пересаженной в облученной C57BL / 6 получателя. Клетки, полученные из CX3CR1 положительных доноров, положительных и для GFP и F4 / 80 приведены в синий выделенной области. (С) Пример проточной цитометрии данных с F4 / 80 + и CX3CR1 GFP + клеток в химерного животного с C57BL6 донорский костный мозг пересаживают в ИКизлучаемая CX3CR1 получатель + / GFP. Обратите внимание на отсутствие двойного положительного CX3CR1 + / GFP и F4 / 80 клеток в синий выделенной области. (Г) прижизненный двухфотонной микроскопический снимок мыши из первой химерного схеме, показывая GFP + микроглии с разветвленной морфологии в дорзальной колонка (наконечник стрелы). Эти клетки перемежаются среди аксонов (желтый) в корне спинного и спинной колонки. Шкала бар = 100 мкм. (Е) прижизненной визуализации той же мыши в (В) через 8 дней после травмы колонки спинной показывает несколько CX3CR1 + микроглии с большими и амебоидных форму тела клеток, которые отсутствуют процессы (стрелка головой). Шкала бар = 100 мкм. (F) Снимок мыши из второй схемы химерного в (А), показывающий скудное GFP + макрофаги, в паренхиме ЦНС. Шкала бар = 100 мкм. (G), прижизненной визуализации той же мыши в (F) через 8 дней после травмы спинного колонке показывает AlАРГЕ приток макрофагов в и вокруг поражения. Шкала бар = 100 мкм. (Н) выше, увеличение картина крови CX3CR1 + клеток, полученных в контакте с судов в неповрежденной животного. Шкала бар = 30 мкм. (I), реконструкция CX3CR1 клеток в контакт с судна, если смотреть изнутри судна. Шкала бар = 30 мкм. (J) восстановление CX3CR1 клеток в контакт с судна, вид с внешней стороны сосуда. Масштабная линейка = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3 :. Представительства отслеживания данных клеток в нехимерные CX3CR1 + / GFP мыши сразу же после спинной колонки давкетравмы. () Снимок CX3CR1 + микроглии и макрофагов вокруг поврежденных аксонов (желтый) за счет дополнительных Movie 1 сразу после травмы спинной колонки раздавить. (B) пути (серые), принятое + клеток CX3CR1 в (А) в течение 110 мин прижизненный изображений заседание. (C) раз в кодированном виде следов в (B). Композиции окрашены в зависимости от их времени в течение всего 110 минут фильма, как показано на временной шкале. (D) Гистограмма общей моторики + клеток CX3CR1. Все масштабные линейки являются 30 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Дополнительная Фильм 1: представитель прижизненной фильм сразу же после травмы спинной колонки раздавить в двойном гетерозиготе Thy-1 YFP / +
Дополнительная Фильм 2:. Представитель прижизненный фильм на 22 дней после спинной колонки раздавить поражения в двойном гетерозиготе Thy-1 YFP / + / CX3CR1 GFP / + мыши Показанная здесь представитель клип, снятый в мыши 22 дней после первоначального спинной колонки давке травмы на спинном T11 уровня. ИнжURY расположен в правом верхнем углу рамки. Аксоны (желтый) Возрастание рострально показаны в правом нижнем углу. В дорсальной вены и кровеносные сосуды помечены TRITC-декстран (красный). CX3CR1 + клетки в поражении движении на более медленной скорости по сравнению с теми сразу после травмы. Масштабная линейка = 50 мкм. Общее время: 90 мин. Скорость воспроизведения: 600x.
Discussion
Визуализации взаимодействия различных типов клеток в их нативной ткани отсеков в течение последующего патологии в реальном времени вызвало большой интерес. В густой сетью ЦНС, межклеточных контактов и сигнализации с соседними клетками имеют важное значение для нормальной функции и для понимания патологии ЦНС. Здесь мы описали использование 2-фотонной лазерной сканирующей микроскопии для наблюдения сотовой движения в механической поражения в спинном мозге. В дополнение к качеству хирургии и тканевой подготовки, механическая стабильность ткани имеет первостепенное значение для успешного покадровой микроскопии, в частности, выделения спинного мозга от дыхания артефакт движения. Стабильность может быть оценена путем поиска движения спинного мозга при вскрытии микроскопом, что соответствует скорости сердечных сокращений или дыхания животного. Стабильность должна быть оценена как во время выполнения операции, а также непосредственно перед началом изображений. Если анимыл не является стабильным, корректировки должны быть сделаны к размещению и герметичности спинного зажимов мозга. Cell-модели Тип конкретные флуоресцентные репортер мыши в сочетании с костного мозга химеры подходов позволило идентифицировать моноцитов по сравнению с микроглии и аксонов. Предыдущие исследования показали, что в крови моноцитов и не микроглии отвечают за среднее повреждением аксонов после травмы, используя методику, описанную здесь 43. Декстран конъюгированных краситель судно позволяет идентифицировать судно как обеспечить ориентиры и определить нарушения в целостности сосудов. Выбор подходящего люминесцентной модели репортер мыши имеет решающее значение для обеспечения надлежащей идентификации желаемых типов клеток, которые будут отображены.
Разработка люминесцентных мышиных моделях, которые подходят для исследований, проводимых также имеет важное значение для успеха эксперимента. Различие между этими двумя фагоцитирующих населения CX3CR1 + / GFP 52. Здесь мы обнаружили, что число клеток, проникающих в ЦНС в стационарном состоянии в результате химера поколения незначительно в отличие от Numbэ клеток, входящих поражения. Другие альтернативные модели, которые следует рассмотреть лекарственно-индуцированных химеры 52 или парабиотического модели мыши 53.
Здесь мы представили конкретный, простой и воспроизводимый небольшой модели повреждения, что приводит к поражению в белом веществе спинного спинного мозга, который легко изображения, используя 2-фотонной микроскопии. Этот способ также обеспечивает количественной оценке поражения для анализа степень аксонального отмирание в столбцах спинных, что в литературе был в сочетании с дополнительной фиксированной ткани анализа 16,18,43,48,54. В этой модели, животные отображать только минимальные дефицит и не требуют особого ухода после травмы. Будущие исследования с использованием спинной методы травмы колонка давка и визуализации, описанные здесь, могут быть мощными инструментами скрининга для оценки эффективности лечения травм спинного мозга. Эти процедуры могут включать в себя низкомолекулярные ингибиторы, наркотики, мобильные продукты, ткани трансплантатов и комбинаторные лечениес. Взаимодействие между макрофагов, микроглии и нейронов также могут играть определенную роль в других моделей заболеваний спинного мозга, включая рассеянный склероз, опухоли, менингит и боковой амиотрофический склероз, и этот метод может быть полезен при исследовании этих заболеваний, а также ,
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CX3CR1 GFP mice | Jackson laboratories | 5582 | |
| Thy-1 YFP H mice | Jackson laboratories | 3782 | |
| Mouse pie cage | Braintree Scientific | MPC 2 set | |
| 60 mm2 Petri dish | Corning | 430166 | For bone marrow isolation |
| Falcon 40 μm cell filter | Fisher Scientific | 08-771-1 | For bone marrow isolation |
| 1 x 15 ml and 1 x 50 ml conical tube | Fisher Scientific | For bone marrow isolation | |
| 21 gauge needle | BD | 305177 | For bone marrow isolation |
| 1 ml syringe | BD | 309628 | For bone marrow isolation |
| ACK lysis buffer | Gibco | A10492-01 | For bone marrow isolation |
| HBSS | Corning Cellgro | 21-022-CV | For bone marrow isolation |
| RPMI media | Sigma | R8758 | For bone marrow isolation |
| F4/80 antibody | Ebioscience | 12-4801 PE | For FACS verification of chimeras |
| 30 gauge insulin syringe | BD | 328280 | For tail vein injection |
| Spinal Cord Clamps | Narshinge | STS-A | For imaging |
| Ortho-Jet Dental Acrylic powder | Lang Dental | REF1320 | For imaging |
| Ortho-Jet Dental Acrylic liquid | Lang Dental | REF1404 | For imaging |
| Gelfoam gelatin sponges | Pfizer | 9034201 | For imaging |
| 4-0 Ethilon sutures | Ethilon | 1667G | For surgery |
| Reflex Clips, 7 mm | Kent Scientific | INS750344 | For surgery. Sterilize before use |
| Iris Scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | For surgery |
| 45/5 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-35 | For surgery |
| Rongeurs | Fine Science Tools | 16021-14 | For surgery |
| 30 gauge needle | BD | 305106 | For making access holes in dura |
| Forceps Dumont #4 Biology tips | Dumont | 11242-40 | For surgery |
| Needle Drivers | Fine Science Tools | 12002-12 | For surgery |
| Michel Wound Clip Forceps | Kent Scientific | INS700753 | For surgery |
| Wound clip remover | Fine Science Tools | 12033-00 | For surgery |
| O-rings for Forceps | Fine Science Tools | 11200-00 | For surgery, Often provided with #4 forceps, can also be ordered separately |
| Cordless Rechargable Animal trimmer | Wahl | Series 8900 | for surgery |
| Vetbond | 3M | 1469SB | For surgery |
| Betadine Solution (10% Providine-Iodine Topical Solution) | Purdue Products L.P. | NDC 67618-150-08 | For surgery |
| Nair Hair remover lotion | Church & Dwight Co., Inc. | NRSL-22329-05 | For surgery |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-2 | Drugs – for surgery |
| Marcaine | Henry Schein | NDC 0409-1587-50 | Drugs – for surgery 1.0 mg/kg given subcutaneously |
| Bupernex | Henry Schein | 121-7793 | Drugs – for surgery buprenorphine 0.1 mg/kg |
| aCSF | Chemicals from Sigma | 119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM glucose |
For surgery From Cold Spring Harbor Protocols |
| TRITC-dextran 150,000 MW | Sigma | T1287 | For intravenous administration to label vasculature |
References
- Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M., Lichtman, E., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11 (5), 572-577 (2005).
- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Vis Exp. (59), 2760 (2012).
- Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169 (1), 1-7 (2008).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
- Figley, S. A., et al. A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model. PLoS One. 8 (3), 58081 (2013).
- Steffens, H., Nadrigny, F., Kirchhoff, F. In vivo two-photon imaging of neurons and glia in the mouse spinal cord. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (12), (2012).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nat Med. 18 (1), 166-171 (2012).
- Dibaj, P., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. PLoS One. 6 (3), (2011).
- Dibaj, P., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58 (9), 1133-1144 (2010).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Long- and short-term intravital imaging reveals differential spatiotemporal recruitment and function of myelomonocytic cells after spinal cord injury. J Physiol. 591 (19), 4895-4902 (2013).
- Fenrich, K. K., et al. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows). J Physiol. 590 (16), 3665-3675 (2012).
- Dray, C., Rougon, G., Debarbieux, F. Quantitative analysis by in vivo imaging of the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord). Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (23), 9459-9464 (2009).
- Popovich, P. G., Jones, T. B. Manipulating neuroinflammatory reactions in the injured spinal cord: back to basics. Trends Pharmacol Sci. 24 (1), 13-17 (2003).
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).
- Horn, K. P., Busch, S. A., Hawthorne, A. L., van Rooijen, N., Silver, J. Another barrier to regeneration in the CNS: activated macrophages induce extensive retraction of dystrophic axons through direct physical interactions. J Neurosci. 28 (38), 9330-9341 (2008).
- Fitch, M. T., Silver, J. CNS injury, glial scars, and inflammation: Inhibitory extracellular matrices and regeneration failure. Exp Neurol. 209, 294-301 (2008).
- Busch, S. A., Horn, K. P., Silver, D. J., Silver, J. Overcoming macrophage-mediated axonal dieback following CNS injury. J Neurosci. 29 (2), 9967-9976 (2009).
- Popovich, P. G., van Rooijen, N., Hickey, W. F., Preidis, G., McGaughy, V. Hematogenous macrophages express CD8 and distribute to regions of lesion cavitation after spinal cord injury. Exp Neurol. 182 (2), 275-287 (2003).
- Popovich, P. G., et al. Depletion of hematogenous macrophages promotes partial hindlimb recovery and neuroanatomical repair after experimental spinal cord injury. Exp Neurol. 158 (2), 351-365 (1999).
- Kigerl, K. A., et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. J Neurosci. 29 (43), 13435-13444 (2009).
- Gensel, J. C., et al. Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity. J Neurosci. 29 (12), 3956-3968 (2009).
- Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
- Shechter, R., et al. Infiltrating blood-derived macrophages are vital cells playing an anti-inflammatory role in recovery from spinal cord injury in mice. PLoS Med. 6 (7), 1000113 (2009).
- Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science. 327 (5966), 656-661 (2010).
- Popovich, P. G., Hickey, W. F. Bone marrow chimeric rats reveal the unique distribution of resident and recruited macrophages in the contused rat spinal cord. J Neuropathol Exp Neurol. 60 (7), 676-685 (2001).
- Ransohoff, R. M. Microglia and monocytes: 'tis plain the twain meet in the brain. Nat Neurosci. 14 (9), 1098-1100 (2011).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
- Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).
- Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A.
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nat Neurosci. 16 (3), 273-280 (2013).
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).
- Herber, D. L., et al. Diverse microglial responses after intrahippocampal administration of lipopolysaccharide. Glia. 53 (4), 382-391 (2006).
- Saederup, N., et al. Selective chemokine receptor usage by central nervous system myeloid cells in CCR2-red fluorescent protein knock-in mice. PLoS One. 5 (10), 13693 (2010).
- Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).
- Iwasaki, A. The use of bone marrow-chimeric mice in elucidating immune mechanisms. Methods Mol Med. 127, 281-292 (2006).
- Spangrude, G. J. Assessment of lymphocyte development in radiation bone marrow chimeras. Curr Protoc Immunol. 4 (4.6), (2008).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48 (1), 11-22 (2009).
- Koon, H. W., Ho, S., Cheng, M., Ichikawa, R., Pothoulakis, C. Differentiating functional roles of gene expression from immune and non-immune cells in mouse colitis by bone marrow transplantation. J Vis Exp. e4208. , 4208 (2012).
- London, A., Cohen, M., Schwartz, M. Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
- Jung, S., Schwartz, M. Non-identical twins - microglia and monocyte-derived macrophages in acute injury and autoimmune inflammation. Front Immunol. 3, 89 (2012).
- Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Exp Neurol. 254, 109-120 (2014).
- Butovsky, O., et al. Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia. Nat Neurosci. 17 (1), 131-143 (2014).
- Lee, J. H., et al. A contusive model of unilateral cervical spinal cord injury using the infinite horizon impactor. J Vis Exp. 65, 3313-3310 (2012).
- Krishna, V., et al. A contusion model of severe spinal cord injury in rats. J Vis Exp. (78), (2013).
- Zhang, Y. P., et al. Controlled cervical laceration injury in mice. J Vis Exp. 75, 50030 (2013).
- Shen, Y., et al. PTPsigma is a receptor for chondroitin sulfate proteoglycan, an inhibitor of neural regeneration. Science. 326 (5952), 592-596 (1126).
- Ek, C. J., et al. Spatio-temporal progression of grey and white matter damage following contusion injury in rat spinal cord. PLoS One. 5 (8), e12021 (2010).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).
- Kierdorf, K., Katzmarski, N., Haas, C. A., Bone Prinz, M. marrow cell recruitment to the brain in the absence of irradiation or parabiosis bias. PLoS One. 8 (3), e58544 (2013).
- Filous, A. R., Evans, T. A., Lang, B. T., Silver, J. Synaptic-like connections between dystrophic axons and NG2+ cells: Another reason for regeneration failure after spinal cord injury. Neuroscience 2013, Society for Neuroscience. , Abstracts. San Diego. (2013).
