Automatisierte Messung von Lungenemphysem und Klein Airway Remodeling im Zigarettenrauch ausgesetzten Mäuse

Introduction

Die Verwendung von Tiermodellen zu untersuchen COPD ist schwierig, weil kein Modell perfekt zu allen Funktionen des menschlichen Krankheit ⁽²⁾ zu replizieren. Die meisten Forscher verwenden Mäuse COPD aufgrund der Ähnlichkeiten zwischen Mäusen und Menschen in ihrem Lungen Physiologie, Pathologie, Genetik und Metaboliten zu modellieren. Auch sind Mäuse relativ kostengünstig zu studieren, und beide Emphysem und kleinen Umbau der Atemwege entwickeln sich innerhalb von 6 Monaten nach CS Exposition ^(5,7-9).

Zigarettenrauch induzierten COPD: Verschiedene Methoden können COPD in Mäusen zu induzieren. Die meisten Forscher entlarven Mäuse CS, die die Haupt ätiologischer Faktor für die menschliche COPD ist. CS Exposition für 6 Monate bewirkt, dass die Entwicklung von Emphysem und der kleinen Atem Remodellierung (SAR) in Mäusen, aber die Schwere der Krankheit, die induziert wird, variiert in Abhängigkeit von dem murinen Stamm untersucht. Zum Beispiel sind NZWLacZ Mäuse resistent gegen die Entwicklung von CS-induzierte Emphysem wohin AKR / J-Mäuse sind extremely empfindlich ^(10). Die meisten Forscher studieren C57BL / 6-Mäuse-Stamm in der CS-Expositionsmodell so viele Gen-Targeting-Mäuse sind in dieser Sorte zur Verfügung. Nach 6 Monaten der CS Exposition, Emphysem und der kleinen Atemwege Fibrose in Wildtyp zu entwickeln (WT) C57BL / 6 Mäusen, und beide Läsionen sind in der Schwere ^(5,10) relativ mild. Die Forscher nutzen zwei Arten von CS Exposition: Nase nur und Ganzkörperaufnahmen. Die Hauptnachteile der Nase nur Aufnahmetechnik sind, dass: 1) es ist ein arbeitsintensiver Verfahren ist; und 2) Mäuse müssen in kleine Kammern, die eine Stress-Reaktion und Hyperthermie in der Tiere ⁽¹¹⁾ veranlassen können zurückgehalten werden. Der größte Nachteil der Ganzkörperexposition (hier beschrieben) ist, dass die Tiere sich nehmen (wie auch inhalieren) Nikotin und Teer-Produkte, wenn sie ihr Fell zu reinigen. Mäuse von Ganzkörper-CS ausgesetzt haben auch eine geringere Carboxyhämoglobin und ein geringeres Körpergewichtsverlust, wenn sie mit Tier Nasen nur CS ⁽¹²⁾ ausgesetzt ist, verglichen.

Lungenfunktionsprüfung (PFT): Maßnahmen der Lungencompliance und Elastance sind in der Regel ähnlich in C57BL / 6-Wildtyp (WT) Mäusen aufgrund der relativ milden Emphysem, dass, wenn dieses entwickelt, um Luft oder CS für 6 Monate ausgesetzt Stamm auf CS ⁽¹⁰⁾ ausgesetzt ist. Wenn jedoch emphysematous Zerstörung schwerere, Erhöhung der Lungencompliance und Linksverschiebungen in der Druck-Volumen (PV) zu fließen, Schleifen detektiert werden kann. Letzteres kann beobachtet werden, beispielsweise in Mausstämme, die anfällig für die Auswirkungen von CS ⁽¹⁰⁾ sind, in CS-belichteten C57BL / 6-Stamm Gen-Targeting-Mäusen, die eine schwerere Emphysem Typ als C57BL / 6-Mäuse haben WT ⁽¹³⁾ oder in CS-exponierten Mäusen gegenüber Umweltveränderungen, die sie anfällig für die Auswirkungen von CS ⁽¹⁴⁾ zu machen unterzogen. Dieses Protokoll verwendet einen kleinen Tierbeatmungsgerät Rabatte der elastischen Rückstoß der Lunge (Anstieg der quasistatischen Lungencompliance [Cst] und Ermäßigungen in Gewebe zu messenElastanz [H]), PV Strömungsschleifen, und Veränderungen in den Atemwegen und Gewebefestigkeit bei anästhesierten Mäusen ^(15,16).

Maßnahmen von Lungenemphysem: Analyse von Emphysem Entwicklung CS-exponierten C56BL / 6-Mäuse-Stamm ist eine Herausforderung, da ihre Verteilung ist räumlich heterogen. Mehrere verschiedene Methoden zu quantifizieren Luftraumvergrößerung bei Mäusen. Das erste Verfahren verwendet wurde, war die mittlere Linearabschnitt (L _m) ^(17). Ist die L _m Verfahren jedoch eine langsame, manuelle Prozess, der die Heterogenität der Erkrankung (es sei denn, alle Abschnitte der Lunge zufällig abgetastet) und seine Verwendung kann daher Beobachter Bias einführen in die Analyse nicht erfassen können. Die Zerstörungsindex [DI, ^(18)] quantifiziert auch Luftraum Erweiterung mit einem transparenten Blatt mit 50 gleichmäßig verteilten Punkten über einer gedruckten digitalisierten Bild einer Hämatoxylin und Eosin-gefärbte Lungenabschnitt platziert. Die PI-Verfahren erzielt das Gebiet um jeden Punkt acCording in dem Maße, in dem die Alveolargänge und Alveolarwände in diesem Bereich werden zerstört. Der Hauptnachteil des DI-Methode ist, dass es zeitaufwendig und genauer als andere Verfahren ^(19,20).

Dieses Protokoll Maßnahmen bedeuten alveolären Sehnenlänge und Alveolarbereich auf Paraffin eingebettete Lungenschnitten mit Gills Fleck befleckt. Morphometrie Software wandelt Bilder von Lungenschnitten auf binäre Bilder (in dem Gewebe ist weiß und Luftraum ist schwarz), und dann überlagert ein einheitliches Raster aus horizontalen und vertikalen Linien (Akkorde) und die Software quantifiziert dann die Länge der einzelnen Saite in Gebieten identifiziert Software als Luftraum. Mit dieser Methode ist es möglich, die Größe der Alveolen in allen Teilen der Lunge in einer standardisierten und relativ automatisierte Weise ⁽²¹⁾ zu messen.

Kleine Umbau der Atemwege (SAR): Die erhöhte Ablagerung von ECM-Proteinen (insbesondere interstitial Kollagene) um kleinen Atemwege erfolgt im CS-exponierten Tieren und trägt zu einer Behinderung des Luftstroms. Forscher nicht SAR im Tiermodell der COPD so oft wie Emphysem Entwicklung ⁽²²⁾ zu studieren. SAR in CS-exponierten Mäusen quantifizieren, verwendet dieses Protokoll, Bildanalyse-Software, um die Dicke der Schicht aus ECM-Proteinen, die in der Umgebung der kleinen Atemwege (Atemwege mit einem mittleren Durchmesser zwischen 300 und 899 m) in Paraffin eingebetteten Lungenschnitten aufgebracht wird gemessen mit Masson-Trichrom-Färbung gefärbt.

Protocol

Das Protokoll nimmt ca. 25 Wochen. Das Protokoll exponierten Mäusen Luft oder Rauch für 24 Wochen. Am Ende der Rauch Belichtungen werden die Protokollmaßnahmen Lungenfunktion bei den Mäusen, und die Lungen auf einen festgelegten Druck aufgepumpt ist, befestigt ist und am gleichen Tag entnommen. Zusätzliche Zeit für die Forscher, einbetten, schneiden und färben die Lungenschnitte (2-3 Tage), und zu erfassen und die Bilder analysieren, benötigt (2-4 Tage, abhängig von der Zahl der Tiere untersucht). Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um altersbedingte Luftraumvergrößerung bei Mäusen zu messen.

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss am Brigham and Womens Hospital / Harvard Medical School zugelassen.

1. Ganzkörper-Zigarettenrauch Exposition

1. Expose Mäusen zu rauchen in einen Ganzkörper-Rauchexposition Gerät (siehe Abbildung 1) in einer Abzugshaube installiert.
   HINWEIS: Das Gerät lädt automatisch Forschungs Zigaretten in das Rad, lECHTE die Zigaretten, und sammelt Nebenstromrauch in der Nebenstromrauch Sammelkammer, und wirft die Zigaretten. Die Maschine verbindet Nebenstromrauch mit Hauptstromrauch aus der Zigarette durch eine Pumpe entnommen, um eine Mischung aus Mainstream und Nebenstromrauch erzeugen. Das Gebläse in der Misch- und Verdünnungskammer mischt den Rauch mit Umgebungsluft und treibt den Rauch in Expositionskammern.
2. Platz Käfige mit den Mäusen ohne den Käfigdeckel entfernt (Abbildung 1) in der Belichtungskammer. Lassen Sie die Maus frei um in ihren Käfigen bewegen und haben Zugang zu Nahrung und Wasser für die Dauer der Rauchexposition (~ 1.75 h).
3. Legen Sie einen mit Wasser gefüllten Eimer unter dem Zigarettenkammer ausgeworfen Zigaretten auszulöschen. Führen Ethanol (100%) durch die Pumpe und schließen Sie es an das Gerät. Schalter an den Mikroprozessor Element der Vorrichtung, die automatische Beladung der Zigaretten, Puffen der Pumpe und das Erhitzen der Zigarette ligh initiiertting Draht.
4. Das Gerät lädt, Lichter, und raucht 10 Zigaretten in einer Zeit, und wirft dann die Zigaretten verwendet und ersetzt sie durch eine neue Charge von 10 Zigaretten und wiederholt diesen Vorgang. Jeder Zyklus dauert 9 min.
5. Akklimatisieren Mäusen, indem sie sie den Rauch von 20 Zigaretten am ersten Tag, 40 Zigaretten am zweiten Tag, 60 Zigaretten am dritten Tag, 80 Zigaretten am vierten Tag und 100 Zigaretten am fünften Tag rauchen. Während der Eingewöhnungszeit, beachten Sie die Maus sorgfältig auf Anzeichen von Leiden.
6. Nach 5 Tagen Akklimatisierung aussetzen die Mäuse 100 Zigaretten pro Tag, 5 oder 6 Tage pro Woche für 6 Monate. Dieses Niveau der Rauchexposition ist notwendig, um relativ bescheidene Luftraumvergrößerung in C57BL / 6-Wildtyp-Mäusen (23,24) zu induzieren. Setzen Sie das Kontrollmäusen auf Umgebungsraumluft für 6 Monate. Wiegen Mäuse vor Rauch Akklimatisierung und danach in wöchentlichen Abständen um die Wirkung der Rauchexposition auf das Körpergewicht zu bewerten.
7. Überwachen Sie die Gesamt SchwebstaubMaterie (TSPM) in den Expositionskammern nach den ersten 60 Zigaretten wurden geraucht:
   1. Wiege eine Filterpapier und legen Sie es in einem Inline-Filterhalter, die auf einer zeitgesteuerten Filter Sampler und Trockengaszähler angeschlossen ist. Das Zeitfilter Sampler zieht Luft aus der Belichtungskammer durch das Filterpapier und den Gaszähler misst den Luftstrom während der Probenahme.
      HINWEIS: Der Filter fängt Feststoffteilchen als 20 m ³ der Belichtungskammer Luft strömt durch den Filter (gemessen am Trockengaszähler).
   2. Berechnen Sie die TPM-Zählung als die Änderung der Filter Gewicht vor und nach der Probenahme (in mg) pro m ³ Luft. Ideal TPM Zahlen zwischen 150 und 200 mg / m ^3.
8. Denn der Zigaretten wurden geraucht, entfernen Sie die Käfige von der Belichtungskammer und beachten Sie die Maus für Anzeichen von Leiden für 20 min.
9. Reinigen Sie die Pumpe mit 100% Ethanol nach jedem Gebrauch, und reinigen Sie alle Häfen und Stäbe in der Maschine zweimal wöchentlich zu fördernLuftzirkulation und verhindern Ansammlung von Teer.

2. Lungenfunktionstest (PFTS) und Lung Inflation

1. Am Ende der Belichtungen, betäuben jede Maus durch die Bereitstellung eines Ketamin-Cocktail (100 mg / kg), Xylazin (10 mg / kg) und Acepromazin (3 mg / kg) auf intraperitonealem Weg in 200 ul Kochsalzlösung (USP Klasse) und verwenden Veterinär Salbe auf die Augen, um sie vor dem Austrocknen zu schützen. Warten, bis sich das Tier in einem chirurgischen Ebene Anästhesie, bewertet mit der Zehe-Pinch-Verfahren.
2. Rasur die Haut ventral der Trachea und desinfizieren die Region mit einer Jod enthaltenden Lösung, dann mit Ethanol. Machen Sie eine Mittellinienschnitt durch die Haut und Unterhautgewebe anterior der Luftröhre mit autoklaviert Schere, und trennen Sie die M. sternothyroideus Muskeln mit der Pinzette, um die Luftröhre aus.
3. Übergeben Sie einen 2-Zoll-Länge von Seidenfaden hinter der Luftröhre, einen Luftröhrenschnitt an der Vorderseite der Luftröhre mit autoklaviertem tracheal Schere, legen Sie eine Trachealkanüle (18 G) in den Luftröhrenschnitt, und befestigen Sie sie mit der Naht.
4. Verbinden der Maus, um die Y-Rohrleitung der Adapter des mechanischen Ventilator über die Luftröhrenkanüle und initiieren Lüftung mit einem Tidalvolumen von 10 ml / kg und einer Atemfrequenz von 150 Atemzügen / min.
   HINWEIS: Es ist wichtig, an dieser Stelle, um sicherzustellen, dass die Maus ausreichend betäubt, um genaue Messungen zu erhalten PFT. Re-Dosis die Maus mit Anästhetika, wenn sich das Tier nicht in einer Operationsebene der Anästhesie. Die Gesamtdauer aller PFT Manöver etwa 7,5 min, so ist es in der Regel nicht notwendig, den Mäusen mit Anästhetika redose einmal chirurgische Ebene der Anästhesie wurde erreicht. Die Gesamtzeit aus der Einleitung der Narkose zu Euthanasie ~ 20 Minuten.
5. Pumpen Sie die Lungen, um totale Lungenkapazität (TLC) 3-mal für ein Volumen Geschichte um den inspiratorischen Kapazität (IC) zu messen und zu reduzieren Atelektase der Lunge. Als nächstes Leisbin der einzige Frequenz erzwungenen Schwingung Manöver (SnapShot-150 Störungs) und Beurteilung der dynamischen Widerstand (R), Elastance (ERS) und Compliance (CRS) der Atemwege, gefolgt von der breitbandigen Frequenz erzwungenen Schwingung Manöver (Quick Prime-3 Störungs ) und messen zentralen Atemwegswiderstand (R _n), Gewebewiderstand (G), Gewebe Elastanz (H), und das Verhältnis G / N (). Schließlich Rekord quasic statische Compliance (C _st) während der Volumen-Druck-Flow Manöver.
6. Wiederholen Sie jede dieser Manöver fünfmal (oder zusätzliche Maßnahmen bis stabile Messwerte erhalten werden) und pumpen bis TLC dreimal zwischen den wiederholten Reihe von Messungen. Notieren Sie den Mittelwert für jeden Parameter für jede Maus.
7. Entfernen Sie die Maus vom Beatmungsgerät und einschläfern es mit CO ₂ Narkose durch Genickbruch folgte [diese Euthanasie Methode wird von unserem Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt]. Schneiden Sie die Blende, open den Brustkorb in der Mittellinie, und entfernen Sie die vorderen Rippen in die Lunge aus. Präparieren Sie die Haut und Unterhaut um die Luftröhre und übergeben Sie einen zweiten 2-Zoll-Länge von Seidenfaden hinter der Luftröhre.
8. Bereiten Sie die Geräte für Lungeninflation (Abbildung 2):
   1. Füllen eines 500 ml Erlenmeyerkolben konische ¾ voll mit sterilem PBS, versiegeln mit einem Gummistopfen, invertieren und suspendieren sie auf einem Ringständer (so dass der Meniskus der phosphatgepufferte Kochsalzlösung pH 7,4 (PBS) 25 cm oberhalb das Herz der Maus).
   2. Stecken Sie ein Ende eines intravenösen geben in den Kolben durch den Gummistopfen in das PBS eingestellt. Legen Sie eine 6 inch Länge eines Plastik serologischen Pipette durch den Gummistopfen, so daß ihre Öffnung oberhalb des Meniskus der PBS, damit die Luft zu ersetzen PBS Verlassen des Kolbens.
   3. Öffnen Sie das Ventil der Reihe geben, und führen PBS wenn das System aus der Reihe geben spülen, Luft.
9. Schließen Sie das intravenous geben Set auf die Trachealkanüle, das Ventil zu öffnen, und lassen PBS in die Lungen durch die Schwerkraft fließt, bis die Lungen vollständig aufzublasen. Schließen Sie das Ventil, binden Sie die Luftröhre mit dem chirurgischen Naht distal der Trachealkanüle, und entfernen Sie die Kanüle.
10. Heben Sie die Luftröhre mit einer Pinzette und schneiden Sie die Luftröhre proximal der Knoten, und zerlegen das Bindegewebe hinter der Luftröhre und der Lunge. Die Lunge (ohne nicking ihnen) Entfernen Sie vorsichtig, und setzen Sie die Lunge in ein Röhrchen mit 10% Kochsalzlösung Formalin. Befestigen Sie die Lunge O / N bei RT, und am nächsten Tag, waschen Sie sie zweimal mit PBS.
11. Betten Sie die Lunge in Paraffin, geschnitten 5 um dicke Abschnitte und dann färben die Abschnitte mit Gill-Färbung, wie unten beschrieben.

3. Emphysem

1. Gill-Färbung von in Paraffin eingebetteten Lungenschnitte
   1. Objektträger in einem Kunststoffgestell und inkubieren sie bei 70 ° C für 20-30 min in einem Ofen.
   2. De-pariffinize die Foliendurch Inkubation für 2 min in jeder der vier Veränderungen Xylol.
   3. Rehydrieren die Folien durch Inkubation für 2-3 min in jeder von zwei Veränderungen von 100% Ethanol, gefolgt von 2-3 min in jeder von zwei Veränderungen von 95% Ethanol und dann Waschen der Objektträger zweimal in PBS für 2-3 min Für jede Änderung der Lösung.
   4. Die Die Objektträger 18 bis 48 h in einer 1: 1 Mischung von Gill Hämatoxylin und modifizierten Harris Hämatoxylin.
   5. Für 2 min in jedem von fünf Austausch von destilliertem Wasser waschen, die Folien und entwässern die Schieber durch Inkubieren dann für 2-3 min in jeder von zwei Veränderungen von 95% Ethanol, gefolgt von 2-3 min in jeweils 2 Änderungen von 100% Ethanol.
   6. Klar die Folien durch Inkubation für 2 min in jeder der vier Veränderungen Xylol.
   7. Montieren Sie die Folien mit klaren Eindeckmittel und fügen Sie ein Deckglas, ohne dabei Blasen, die anschließende Analyse behindern.
2. Randomisierte Bildaufnahme:
   1. Erwerben Sie Schwarzweißbilder als TIFF-Dateis mit einem Mikroskop, eine 20 X Ziel, und eine Kamera und Software, die qualitativ hochwertige digitale Bilder erwerben können.
   2. Capture ~ 20-30 Bilder (X 200-fache Vergrößerung) pro Maus in randomisierter Weise mit dem Betrachter auf der experimentellen Bedingung geblendet vermeidet unter aufgeblasenen Bereichen der Lunge.
   3. Kleben Sie ein Mikro-Schiebefeld-Finder auf die Folie. Die Feldsucher hat ein Gitter, das eine Reihe von Quadraten, die mit einem Buchstaben (in der vertikalen Richtung) gekennzeichnet sind und eine Reihe (in horizontaler Richtung), und jedes Feld mit einem Kreuz (+) in der Mitte und wird durch einen Buchstaben identifiziert und die Anzahl (beispielsweise A1, A2, ...... Z25).
   4. Verwenden Sie ein Zufallsfeldgenerator Excel-Tabelle, um zufällig einen Platz für die Bilderfassung. Um eine zufällige Buchstaben zu erstellen, geben EFGHJKLMNPQRSTU in Zelle B1 in der Tabelle (der Forscher können diesen Brief Bereich einzustellen, um den Bereich der Quadrate von einem Buchstaben, die die Lungen überlagern identifiziert decken). Als Nächstes fügen Sie die Formel [= MID ($ B $ 1,1 + INT(RAND () * LEN ($ B $ 1)] C1 Zelle nach dem Zufallsprinzip wählen Sie einen Buchstaben in C1. Kopieren und Einfügen von C1 in C2, C3, C4 und so weiter, um eine Spalte von zufälligen Buchstaben zu generieren.
   5. Um eine Zufallszahl in der benachbarten Spalte zu erstellen, geben Sie die Formel = ZUFALLSBEREICH (5,25) in D1 (wo 5-25 ist der typische Bereich von Gewebe auf dem Objektträger). Optional passen Sie diesen Bereich, um den Bereich der Quadrate von einer Reihe, die die Lungen überlagern identifiziert zu decken.
   6. Kopieren und Einfügen von D1 zu D2, D3, D4 und so weiter, um eine Spalte von Zufallszahlen neben dass mit zufälligen Buchstaben zu generieren. Somit enthält jede Zeile ein Paar zufällig generierte Buchstaben und Zahlen, die den Etiketten auf den Plätzen im Bereich Sucher (zB E17, H24 ....).
   7. Legen Sie die Folie auf dem Mikroskop. Mit dem 4X Mikroskopobjektiv finden Sie das entsprechende Kästchen auf dem Gebiet Finder Dia (zB E17, H24 ...) und stellen Sie diesen Platz im Zentrum des Mikroskops ein.
   8. Richten Sie die Mitte des mikroskopischenFeld mit dem "+" in der Mitte des gewählten Platz. Entfernen Sie das Feld Finder, konzentrieren sich auf die Lunge mit dem 20X Mikroskopobjektiv und erwerben Sie das Bild als Graustufen-TIF-Datei. Wenn Lungengewebe Abdeckungen <50% der mikroskopischen Feld, wählen Sie die nächste zufällig generierte Platz. Wiederholen, bis ~ 20-30 Bilder werden für jedes Tier festgehalten. Speichern Sie alle Bilder für jedes Tier in einem Ordner mit dem Tag-Nummer des Tieres, damit das Excel Report Makro, um die Dateien zu erkennen gekennzeichnet.

4. Morphometrie Um Emphysem Messen

Das Protokoll verwendet Scion Bild und kundenspezifische Makros für Luftraumvergrößerung analysieren. Scion Bild ist eine Windows-kompatible Version des ursprünglichen NIH Bild-Anwendung, die unter dem Macintosh-Betriebssystem läuft. Scion Bild läuft unter Windows XP und ist immer noch online über Wikiversity.org, wo eine Suche nach 'Scion Bild "wird es dem Benutzer, die Links zu lenkenHandbuch und Beta 4.0.2 Freisetzung von Scion Bild. Installation und Bedienung der Software wird in der Online-Ergänzung Handbuch beschriebenen und im Folgenden zusammengefasst. Die alveoläre Sehnenlänge Makro wurde von der in NIH Bild Makro angepasst.

1. Bereiten Sie das TIFF-Bild der Gills befleckt Lungenbereich für Scion Bildanalyse:
   1. Starten Scion Bild und laden Sie die Makros in der Online-Ergänzung angegeben. Wählen Sie das Öffnen Hell Bild [1] Makro Wählen und öffnen Sie die TIFF-Datei. Sie dann in den Bildbearbeitungswerkzeuge, um das Bild für die Analyse vorzubereiten.
   2. Verwenden Sie den Pinsel-Werkzeug, um Bereiche des Bildes, die nicht Luftraum oder Alveolarwände entweder als Luftraum oder als Gewebe behandelt werden, zu erzwingen. Beispielsweise malen Bronchien und Behälter schwarz, so daß sie als Gewebe analysiert. Malen Entzündungszellen (oder Staub) besetzen Raum in der Alveolen weiß, dass sie als Luftraum analysiert.
   3. Wählen Sie den Pinsel Farbe, indem Sie mit der Maus über dieWörter Schwarz oder Weiß an der Unterseite des LUT-Fenster. Klicken Sie dann auf dem Pinsel-Werkzeug. Um die Größe des Pinsels, doppelklicken Sie auf das Pinsel-Werkzeug ändern, und geben Sie eine geeignete Pinselgröße. Klicken und ziehen Sie mit der Maus über das Bild, um Strukturen zu malen die gewählte Farbe (siehe # 1 oben).
2. Mess mittlere Sehnenlänge des Luftraums
   1. Wählen Sie das Makro Sehnenlänge Air [2], um die Luftraumsehnenlängen zu messen.
   2. Threshold das Bild, indem Sie zuerst, Klicken mit der Maus in der Nähe der Mitte des Bildes und ziehen Sie die Maus nach oben oder unten, um den Schwellenwert (eine Zahl zwischen 0 und 255, die im Info-Fenster angezeigt wird) anzupassen. Klicken Sie auf die Maus ein zweites Mal, um den Schwellenwert zu akzeptieren. Stellen Sie die Schwelle, um die Alveolarwände die gleiche Dicke wie in der Originalbilder zu machen.
      HINWEIS: Es ist entscheidend, dass der Forscher nicht unter der Schwelle und damit Brüche in den Alveolarwände, die nicht im Originalbild, die produzieren wird nicht existieren erstellenkünstlich hoch Sehnenlänge Werte.
   3. Das Programm entfernt automatisch einzelne Pixel (Einzel schwarze Pixel durch 8 weißen Pixeln umgeben).
   4. em> 4.2.4. Beachten Sie ein Fenster, das den Benutzer zur erneuten Schwelle der binären Bild auffordert, weiterhin das Makro oder das Makro abzubrechen. Um Schwelle wieder beantworten Y auf die Eingabeaufforderung, und wählen Sie die Schaltfläche OK.
   5. em> 4.2.5. Visualisieren Sie einen horizontalen und vertikalen Gitterfenster mit Linien 5 Pixel Abstand von Makros erstellt. Das Programm misst die Länge der horizontalen und vertikalen Linien, die Lufträume überschneiden.
   6. Speichern Sie die Datei in einem beliebigen Ordner, aber nicht den Standardnamen ändern, da sonst die Excel Report-Makros wird nicht die Datei zu finden (das Format ist der Name des mit "CLa.txt" für die Luftraumsehnenlänge angehängten Bild.
      HINWEIS: Wenn das Programm keine Messungen durchzuführen, kann der Schwellenwert zu niedrig sein (muss> 1). Wenn dies die Forscher Wiederschwellen das Bild mit einem höheren Wert auf.
   7. em> 4.2.7. Für Alveolarbereich Messungen (zusätzlich zu den Längen Akkord), führen Sie die zusätzlichen [4] und [5] Makros auch.
   8. em> 4.2.8. Weiter, bis alle Bilder wurden analysiert.
3. Analyse der Ergebnisse mit Hilfe von Excel-Makros Bericht
   1. Öffnen Sie Excel Report 20x.xls. Manuell aktivieren Makros gegebenenfalls in Abhängigkeit von der Standardsicherheitseinstellung in Excel-Version verwendet wird.
   2. Beachten Sie eine Liste von Makros in der Makro-Fenster (siehe Tabelle 1).
      HINWEIS: CL_Air_1 berichtet Sehnenlänge der Lufträume für ein einzelnes Tier (Ordner). CL_Air_Multi berichtet Sehnenlänge der Lufträume für mehrere Tiere (Ordner). AP_No_Edge_1 meldet den Bereich der Alveolen ohne Kantenkontakten für ein einzelnes Tier (Ordner) .AP_No_Edge_Multi berichtet Bereich der Alveolen ohne Kantenkontakten für mehrere Tiere (Ordner). AP_With_Edge_1 berichtet Bereich Alveolen mit Randkontakten für ein einzelnes Tier (Ordner). AP_With_Edge_Multi berichtet Bereich Alveolen mit Kanten contakte für mehrere Ordner.
   3. Wählen Sie das CL_Air_Multi Makro alveolären Sehnenlängenmessungen für mehrere Ordner entsprechend der Bilder mehrerer Mäuse zu melden. Es wird angezeigt, alle _CLa.txt Dateien in den ausgewählten Ordnern. Lassen Sie eine _CLa.txt Datei (bei Bedarf), indem Sie sie in einen Unterordner des aktuellen Ordners oder Umbenennen der _CLa Teil.
   4. Aus dem Dateifenster, wählen Sie einen Ordner auf einmal, indem Sie den Ordner wählen Sie dann OK (das Programm nicht eine Mehrfachauswahl zu einer Zeit unterstützt). Da jeder Ordner ausgewählt ist, beobachten sie auf dem Arbeitsblatt. Wählen Sie "Abbrechen", oder schließen Sie die Datei Fenster, um fortzufahren.
      HINWEIS: Abhängig von der Version von Excel kann der Forscher müssen eine Ordnerebene zurück wechseln nach jedem Ordner ausgewählt ist.
   5. Beachten Sie ein separates Arbeitsblatt für jeden Ordner und zeigt Statistiken für jeden _CLa.txt Datei gefolgt von Statistiken für die Sehnenlänge von Daten aus allen _CLa.txt Dateien zusammengefasst.
   6. Benennen und speichern Sie die Tabelle. Der Standarddateiname ist der Name des übergeordneten Ordners mit _CLa.xls hängt. Schließen Sie das Arbeitsblatt, bevor Sie ein anderes Makro.

5. Kleine Airway Remodeling

1. Die Färbung und Bildaufnahme
   1. Fleck Lungenschnitten mit Masson-Trichrom-Färbung mit einem kommerziellen Kit, und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
   2. Zum Aufzeichnen von Bildern aller Luftwege in beiden Lungen, die vollständig untergebracht werden kann (einschließlich der blauen Schicht außerhalb des Luftwegs, die die Schicht aus ECM-Proteinen, die abgeschieden werden, ist) in einem Bildbereich mit der 20x-Objektiv am Mikroskop.
      HINWEIS: Größere Luftwege sind nicht mit einer erhöhten Ablagerung von ECM-Proteinen in CS-exponierten Mäusen verbunden.
   3. Speichern Sie die Farbbilder als JPEG-Dateien.
2. Bildanalyse: Öffnen Sie die Bilddateibei der Bildanalyse-Software-Programm.
   1. Öffnen Sie und benennen Sie die Protokolldatei, um die Messungen zu erfassen.
   2. Wählen Sie eine Zeile Zeichenwerkzeug. Draw 4 kreuzenden Linien, die das Lumen des Atemwegs (der Innendurchmesser), um die Größe des Luftwegs zu messen, und nur jene Atemwege mit der gewünschten Größe in der Analyse. Als nächstes ziehen 12 gleich beabstandeten Linien (bei der Position in dem Luftweg entsprechend den Nummern einer Uhr), die sich von der Kante der Adventitia anstoß den Luftweg zum Rand des blaugefärbten Bereich umgeben den Atemweg, um die Dicke zu messen der Schicht aus dem ECM-Proteinen außerhalb der Atemwege abgelagert (Abbildung 5). Vermeiden Sie Bereiche, in denen die Messung der Atemwege interagiert mit anderen Atemwege oder Gefäße.
   3. Erster Datensatz alle inneren Durchmesserlinien in der Log-Datei, und nehmen Sie dann die 12 Linien, die die Dicke der blauen ECM Schicht um die Atemwege zu messen.
   4. Schließen Sie das Bild öffnen Sie dann das nächste Bild.
   <li> Wiederholen Sie diese Schritte, bis alle Bilder für das Tier sind in einem Ordner geloggt worden.
   5. Beginnen Sie mit Schritt 5.2 auf den nächsten Ordner, der die auf die Lungenschnitte aus dem nächsten Tier aufgenommenen Bilder enthält. Verlassen des Programms nach Beendigung der Analyse aller der Atemwege in Lungenschnitten von allen Tiere im Experiment.
   6. Geben Sie die 4 Innendurchmesser-Messungen und die 12 ECM-Protein Schichtdickenmessungen für jede Fluglinie für jede Maus in die Datenprotokolldateien in einer Excel-Tabelle aufgezeichnet. Der Mittelwert der Schichtdickenmessungen Durchmesser und ECM-Protein für jedes Tier.
   7. Konvertieren Sie die Messwerte von Pixeln, um Mikrometer.
   8. Gruppe der Atemwege nach ihrem Innendurchmesser Größe (z. B. 300 bis 399 & mgr; m, 400-499 & mgr; m etc.) und vergleichen Sie ECM-Protein Schichtdickenmessungen rund um die Atemwege mit ähnlichen Größen für die Luft- gegen Rauch-exponierten Mäusen (z. B. Atemwege mit einem Durchmesser von 300 bis 899 um;
   9. Falls benötigt, Immunfärbung Lungenschnitten für die einzelnen Proteine ​​(einschließlich interstitielle Kollagene und Basalmembranprotein) und führen eine ähnliche Analyse der Ablagerung von Proteinen von Interesse unter Verwendung dieses Verfahrens zu quantifizieren.

Representative Results

Dieses Protokoll beginnt mit Ganzkörper-Exposition von Mäusen für CS. Angemessene Aufsicht und Wartung des Gerätes und die Überwachung der TPM zählt eine konsistente Rauch Exposition (Abbildung 1). Es ist wichtig, dass der Forscher übt die Lunge Inflation Technik unter Verwendung der Aufblasvorrichtung

Dieses Protokoll beginnt mit Ganzkörper-Exposition von Mäusen für CS. Angemessene Aufsicht und Wartung des Gerätes und die Überwachung der TPM zählt eine konsistente Rauch Exposition (Abbildung 1). Es ist wichtig, dass die Forscher Methoden der Lunge Inflation Technik unter Verwendung der Aufblasvorrichtung (Abbildung 2) und vorsichtig entfernt die Lunge nach Inflation um gut aufgeblasenen Lungenschnitten für die genaue Analyse des Luftraums Erweiterung erhalten. 3A zeigt eine gut aufgeblasen Lunge während 3B zeigt eine schlecht aufgepumpt Lunge. 3C zeigt ein Bild eines aufgeblasenen Lungenabschnitt für die Schwellwertbildung s hergestelltTEP (Makrophagen in den Alveolen sind weiß gestrichen und Gefäße und die Bronchien werden schwarz gemalt erzeugen. Der Schwellenwertschritt erzeugt ein binäres Bild, in dem alle Pixel in dem Alveolarraum weiß sind und alle Pixel in Bereichen der Lunge, die nicht Alveolen schwarz sind (3D). 3E und 3F zeigen die vertikalen und horizontalen alveolären Sehnenlängen die Makros zu erzeugen sind.

Lungenfunktionstests zeigen, bescheiden (und statistisch nicht signifikant) Linksverschiebungen in der Druck-Volumen (PV) Schleifen reflektieren bescheidenen Verlust der elastischen Rückstoß der Lunge im Einklang mit der milden Emphysem, die in C57BL / 6 WT-Mäusen zu CS für 6 Monate ausgesetzt entwickelt ( 4A). Signifikante Linksverschiebungen in den PV-Schleifen nur in Mäusestämme, die sehr empfindlich gegenüber den Auswirkungen von CS oder CS-belichteten Gen-Targeting-Mäuse mit einem schweren Emphysem Phänotyp als CS-belichteten C57BL / 6 WT-Mäuse beobachtet.

Feigeure 5 zeigt repräsentative Bilder Masson Trichrom-gefärbten Lungenschnitten von C57BL / 6-WT-Mäusen um Luft (5A) und CS (5B) für 6 Monate darstellt Steigerungen ECM Proteinablagerung um die kleinen Luftwege in der CS-exponierten Tieren ausgesetzt. Fig 5C veranschaulicht, wie ein Bild-Analyse-Software quantifiziert ECM Proteinablagerung um die Atemwege mit dem gewünschten Innendurchmesser. 5D zeigt die Analyse der Proteinablagerung ECM rund Atemwege mit einem Durchmesser von 300 bis 899 & mgr; m in CS-belichteten C57BL / 6 WT-Mäusen.

Abbildung 1. Eine Karikatur des Ganzkörper-Zigarette Belichtungssystem. Eine Rauchexposition Gerät mit einem Rauchexposition Kammer verbunden ist. Rauch wird aus dem Nebenstrom Sammelkammer gezogen und Rauch wird aus gezogendie Zigaretten von der Pumpe, wobei beide Rauch Proben werden gemischt und mit der Umgebungsluft in die Misch- und Verdünnungskammer (links) verdünnt, und dann wird der Rauch in die Bestrahlungskammer fließt. Der Forscher legt Mäuse in ihren Käfigen in der Belichtungskammer (rechts); Mäuse sind in der Lage, sich frei in ihren Käfigen bewegen, und haben Zugang zu Nahrung und Wasser für die Dauer der Rauchexposition.

Abbildung 2. Die Inflation der murine Lunge. Der Forscher füllt eine Flasche mit sterilem PBS, Dichtungen es mit einem Gummistopfen und invertiert und sichert sie in einem Abstand von 25 cm über dem Herzen des Tieres mit einem Ringständer. Eine intravenöse Geben Set bietet die PBS in die Lunge über die Trachealkanüle. Ein cut-down serologischen Pipette wird durch den Gummistopfen eingeführt und dies ermöglicht, dass Luft in den Kolben, um das Volumen von PBS, dass fließt in die lu ersetzenngs der Mäuse durch die Schwerkraft.

Abbildung 3. Emphysem Analyse. (A) zeigt ein repräsentatives Bild von Gill's Fleck aufgeblasen Lungenschnitten von Mäusen, an Luft oder CS für 6 Monate ausgesetzt wird, die schwarzen Pfeile zeigen einen Behälter und Alveolarmakrophagen. (B) zeigt ein repräsentatives Bild eines im aufgeblasenen Lunge, die nicht geeignet für die Analyse ist. (A) zeigt die "vor" und (C) zeigt die "Nachher" Bild eines repräsentativen Lungenabschnitt, der Forscher bereitet sich auf die Erzeugung eines binären Bildes. Die schwarzen Pfeile in (A) und (C) weisen entweder ein Gefäß (die der Forscher erstellt schwarze in (C)) oder Alveolarmakrophagen (die der Forscher Farben weiß in (C)). (D) < / Strong>, zeigt das Binärbild nach der Forscher führt die Schwelle Schritt. (E) und (F) zeigen die horizontale und vertikale alveolare Sehnenlängen, dass der Forscher erzeugt sind. Vergrößerung aller Bilder ist x 200. Maßstabsbalken, die 400 & mgr; m ist in (A) gezeigt.

Abbildung 4. Alveolar Sehnenlänge und Druck-Volumen-Kurven. (A) zeigt eine typische Analyse eines Alveolar Sehnenlängen in C57BL / 6 Mäusen WT Luft (n = 13) und CS (n = 24) 6 Monate lang ausgesetzt. Das Sternchen bedeutet, p <0,001. (B) zeigt typische PV Schlaufen an C57BL / 6-WT-Mäusen durchgeführt, um Luft (n = 13) und CS (n = 14) 6 Monate lang ausgesetzt. Daten sind als Mittelwert + SEM ausgedrückt.

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Abbildung 5. Kleine Umbau der Atemwege (SAR) Beurteilung. (A) und (B) zeigen repräsentative Bilder von Massons Trichrom-gefärbten Lungenschnitten von C57BL / 6 WT-Mäusen in die Luft (A) oder CS (B) für 6 Monate ausgesetzt. (C) zeigt, wie die Bildanalyse-Software analysiert SAR in CS-exponierten Mäusen. (D) zeigt typische Messungen der Dicke der extrazellulären Matrixproteinschicht um kleinen Atemwege aufgebracht, die einen Durchmesser von 300 bis 899 m in C57BL / 6 Mäusen WT Luft ausgesetzt (n = 11) und CS (n = 16) 6 Monate. Daten sind als Mittelwert + SEM ausgedrückt und Sternchen zeigt p <0,05.

Maßstabsbalken auf die Bilder der einzelnen Lungenschnitt gezeigt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Whole-body smoke exposure device	Teague Enterprise	TE-10z	Chronic Smoke exposures to induce chronic lung disease in mice
Research Cigarette	University of Kentucky	3R4F reference cigarettes
Pallflex® Air Monitoring Filters, Emfab Filters TX40HI20WW, 25 mm	Pall Corporation	7219	For measurement of TPMs
25 mm filter holder	Pall Corporation
Filter sampler	Intermatic	Metal T100
Gas meter	AEM	Gas meters G1.6; G2.5; G4
Tracheal Cannula for mouse 18 gauge	Labinvention		Analysis of pulmonary function
Mechanical ventilator	Scireq	FlexiVent
Gill's hematoxylin solution	Sigma-Aldrich	GSH316	For Gill staining, work under a fume hood
Hematoxylin solution, Harris modified	Sigma-Aldrich	HHS16
Cytoseal-60	Thermo Scientific	8310-16
Micro-Slide-Field-Finder	Andwin Scientific INC	50-949-582	For analysis of emphysema
Scion Image Program	Scion Corporation
Mason's trichrome stain	Sigma-Aldrich	HT15	For analysis of small airway fibrosis
MetaMorp Offline version 7.0	Molecullar Devices LLC	31032