Geautomatiseerde Meting van longemfyseem en Kleine luchtweg remodeling in sigarettenrook blootgesteld Muizen

Introduction

Het gebruik van diermodellen COPD studie is uitdaging omdat geen model perfect repliceren alle kenmerken van de menselijke ziekte ^(2). De meeste onderzoekers gebruiken muizen model COPD vanwege de overeenkomsten tussen muizen en mensen in de pulmonale fysiologie, pathologie, genetica en metabolieten. Ook muizen zijn relatief goedkoop om te studeren, en zowel longemfyseem en kleine luchtwegremodelling ontwikkelen binnen 6 maanden van CS blootstelling ^(5,7-9).

Sigarettenrook geïnduceerde COPD: Verschillende methoden kunnen COPD induceren in muizen. De meeste onderzoekers blootstellen muizen CS, die de voornaamste etiologische factor voor menselijke COPD. CS blootstelling gedurende 6 maanden leidt de ontwikkeling van emfyseem en kleine luchtwegremodellering (SAR) bij muizen, maar de ernst van de ziekte die wordt geïnduceerd afhankelijk van het muizen stam onderzocht. Bijvoorbeeld, NZWLacZ muizen zijn bestand tegen de ontwikkeling van CS-geïnduceerd emfyseem dat AKR / J muizen extremely gevoelige ^(10). De meeste onderzoekers bestuderen C57BL / 6 muizen muizen in de CS blootstellingsmodel zoveel van transgene muizen in deze stam. Na 6 maanden CS blootstelling, emfyseem en kleine luchtwegen fibrose ontwikkelen wildtype (WT) C57BL / 6 muizen, en beide laesies zijn relatief mild van aard ^(5,10). De onderzoekers maken gebruik van twee soorten CS blootstelling: neus-only en het hele lichaam blootstellingen. De belangrijkste nadelen van de neus alleen belichtingstechniek zijn dat: 1) het is een arbeidsintensieve methode; en 2) muizen worden tegengehouden in kleine cellen die een stressrespons en hyperthermie in de dieren ⁽¹¹⁾ kan induceren. Het grote nadeel van blootstelling gehele lichaam (hierin beschreven) dat de dieren kunnen innemen (evenals inademen) nicotine en teer producten wanneer ze schoon hun vacht. Muizen blootgesteld aan lichaamstrillingen CS hebben een lager carboxyhemoglobine niveaus en een vermindering van verlies van lichaamsgewicht in vergelijking met dieren blootgesteld aan neus slechts CS ^(12).

longfunctietest (PFT): Handelingen longflexibiliteit en elasticiteit zijn gewoonlijk soortgelijk in C57BL / 6 wild type (WT) muizen blootgesteld aan lucht of CS gedurende 6 maanden als gevolg van de relatief milde emfyseem dat wanneer deze zich ontwikkelt stam wordt blootgesteld aan CS ^(10). Echter, wanneer emfysemateus vernietiging ernstiger toename longflexibiliteit en links verschuivingen in de druk-volume (PV) stroom lussen worden gedetecteerd. De laatste kan worden waargenomen, bijvoorbeeld in muizenstammen die meer vatbaar voor de effecten van CS ^(10), CS-blootgestelde C57BL / 6 stam van transgene muizen die een meer ernstige vorm emfyseem dan C57BL / 6 muizen WT ^(13), of CS-blootgestelde muizen blootgesteld aan omgevingsveranderingen dat ze meer vatbaar voor de effecten van CS ⁽¹⁴⁾ maken. Dit protocol maakt gebruik van een klein dier ventilator tot een vermindering van de elastische terugslag van de long (verhogingen van de quasi-statische longcompliantie [Constante] en verminderingen in het weefsel te metenelastantie [H]), PV stroom loops, en veranderingen in de luchtwegen en weefsel weerstand in verdoofde muizen ^(15,16).

Maatregelen van longemfyseem: Analyse van emfyseem ontwikkeling in CS-blootgestelde C56BL / 6 stam muizen is uitdagend omdat de distributie is ruimtelijk heterogeen. Verschillende methoden kwantificeren luchtruim uitbreiding in muizen. De eerste methode was de gemiddelde lineaire intercept (L _m) ^(17). De L _m methode is een langzaam, handmatig proces die de heterogeniteit van de ziekte (tenzij alle delen van de long willekeurig bemonsterd) en het gebruik ervan kan derhalve voor de waarnemer voorspanning in de analyse kan vangen. De destructieve index [DI, ^(18)] kwantificeert ook het luchtruim uitbreiding met behulp van een transparant vel met 50 gelijk verdeeld punten geplaatst over een gedrukte gedigitaliseerde beeld van een hematoxyline en eosine gekleurd long sectie. De PI-methode scoort het gebied rondom elk punt acgens de mate waarin de alveolaire leidingen en alveolaire wanden binnen dit gebied worden vernietigd. Het belangrijkste nadeel van de DI methode is dat het tijdrovend en niet nauwkeuriger dan andere methoden ^(19,20).

Dit protocol maatregelen betekenen alveolaire koordelengte en alveolaire gebied op paraffine ingebedde longcoupes gekleurd met Gill's vlek. Morfometrie software zet afbeeldingen longsecties voor binaire afbeeldingen (waarin weefsel wit en luchtruim zwart) en superponeert een uniform raster van horizontale en verticale lijnen (akkoorden) en de software kwantificeert dan de lengte van elk akkoord in gebieden die door software als het luchtruim. Met deze methode is het mogelijk om de grootte van de alveoli in alle delen van de long in een gestandaardiseerde en relatief geautomatiseerde wijze ⁽²¹⁾ te meten.

Kleine luchtwegremodelling (SAR): De toegenomen afzetting van ECM eiwitten (vooral interstitial collagenen) rond kleine luchtwegen optreedt in CS-blootgestelde dieren en draagt ​​obstructie luchtstroom. Onderzoekers niet bestuderen SAR in diermodellen van COPD zo vaak als emfyseem ontwikkeling ^(22). Om SAR kwantificeren CS-blootgestelde muizen gebruikt dit protocol beeldanalyse software om de dikte van de laag van ECM eiwitten die wordt afgezet rond de kleine luchtwegen (luchtwegen met een gemiddelde diameter tussen 300 en 899 m) in paraffine ingebedde longsecties meten gekleurd met Masson trichroomkleuring vlek.

Protocol

Het protocol neemt ~ 25 weken in beslag. Het protocol muizen blootgesteld aan lucht of rook voor 24 weken. Aan het einde van de rook posities, worden de protocol maatregelen longfunctie in de muizen, en de longen opgeblazen tot een vaste druk, gefixeerd en verwijderd op dezelfde dag. Meer tijd nodig is voor de onderzoeker te verankeren, te snijden, en vlekken op de longcoupes (2-3 dagen), en vast te leggen en het analyseren van beelden (2-4 dagen, afhankelijk van het aantal dieren bestudeerde). Dit protocol kan ook gebruikt worden om leeftijdsgerelateerde luchtruim uitbreiding bij muizen gemeten.

Alle procedures beschreven in dit protocol zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Brigham and Women's Hospital / Harvard Medical School.

1. Whole-Body blootstelling aan sigarettenrook

1. Expose muizen te roken in een hele lichaam blootstelling rook apparaat (zie figuur 1) in een zuurkast geplaatst.
   OPMERKING: Het apparaat laadt automatisch onderzoek sigaretten in het wiel, lECHTEN de sigaretten, en verzamelt side-stream rook in de side-stream rook opvangruimte, en werpt de sigaretten. De machine combineert zijstroom rook hoofdstroom rook uit het sigaret door een pomp om een ​​mengsel van gewoon en nevenstroom rook creëren. De ventilator in het mengen en verdunnen kamer mengt de rook met omgevingslucht en drijft de rook in blootstellingskamers.
2. Plaats kooien met de muizen zonder de kooi deksels (figuur 1) blootstellingskamer. Laat de muizen vrij bewegen in hun kooien en hebben toegang tot voedsel en water gedurende de duur van de blootstelling aan rook (~ 1,75 uur).
3. Plaats een emmer gevuld met water onder de sigaret kamer naar uitgeworpen sigaretten te doven. Run ethanol (100%) door de pomp en sluit deze aan op het apparaat. Schakel de microprocessor element van de inrichting, die automatisch laden van de sigaretten, puffen van de pomp en het verwarmen van de sigaret ligh initieertting draad.
4. Het apparaat laadt, lichten, en rookt 10 sigaretten per keer en dan werpt de gebruikte sigaretten en vervangt ze door een nieuwe partij van 10 sigaretten en herhaalt dit proces. Elke cyclus duurt 9 min.
5. Acclimatiseren muizen te roken door ze bloot aan de rook van sigaretten 20 op de eerste dag, 40 sigaretten op de tweede dag 60 sigaretten op de derde dag, 80 sigaretten op de vierde dag, en 100 sigaretten op de vijfde dag. Tijdens de acclimatiseringsperiode, observeert de muizen zorgvuldig op tekenen van nood.
6. Na 5 dagen geacclimatiseerd, bloot de muizen 100 sigaretten per dag, 5 of 6 dagen per week gedurende 6 maanden. Dit niveau van blootstelling aan rook is nodig om relatief bescheiden luchtruim uitbreiding in C57BL / 6 wild-type muizen (23,24) induceren. Expose de controle muizen lucht uit de ruimte voor 6 maanden. Weeg muizen voordat rook acclimatisatie en daarna wekelijks om het effect van blootstelling aan rook op het lichaamsgewicht te beoordelen.
7. Toezicht houden op de totale hoeveelheid zwevende deeltjesmaterie (TSPM) in de blootstellingskamers na de eerste 60 sigaretten gerookt zijn:
   1. Weeg filtreerpapier en plaats het in een in-line filter houder die een geprogrammeerde filter sampler en droog gas meter. Het tijdelijke filter sampler trekt lucht uit de blootstelling kamer door het filterpapier en de gasmeter meet de luchtstroom tijdens de bemonstering.
      OPMERKING: Het filter vangt fijnstof als 20 m ³ van de blootstelling kamer lucht door het filter (gemeten op het droge gasmeter).
   2. Bereken het aantal TPM als de verandering in gewicht filter vóór en na de bemonstering (in mg) per ^m3 lucht. Ideaal TPM tellingen tussen 150 en 200 mg / ^m3.
8. Nadat alle sigaretten hebben gerookt, verwijder de kooien van de blootstelling kamer en observeer de muizen op tekenen van nood voor 20 min.
9. Reinig de pomp 100% ethanol na elk gebruik, en reinig alle poorten en staven in de machine tweewekelijkse bevorderenluchtcirculatie en voorkomen ophoping van teer.

2. longfunctietest (PFTS) En Lung Inflatie

1. Aan het einde van de blootstelling, verdoven elke muis door het leveren van een cocktail van ketamine (100 mg / kg), xylazine (10 mg / kg) en acepromazine (3 mg / kg) via de intraperitoneale route in 200 pl zoutoplossing (USP graad) en het gebruik van veterinaire zalf op de ogen om te voorkomen dat ze uitdrogen. Wacht totdat het dier is in een chirurgische vlak van anesthesie, beoordeelt het gebruik van de teen-snuifje methode.
2. Scheer de huid juist voor de luchtpijp en desinfecteer de regio met een jodium-bevattende oplossing gevolgd door ethanol. Maak een middellijn incisie door de huid en het onderhuidse weefsel juist voor de luchtpijp met behulp van een autoclaaf een schaar, en scheid de sternothyroid spieren met een tang om de luchtpijp bloot.
3. Pass 2 cm lengte van zijden hechtdraad posterior naar de luchtpijp, maak een tracheotomie op het anteriore gedeelte van de trachea met geautoclaveerd tracheal schaar, plaatst u een tracheacanule (18 G) in de tracheotomie, en maak het vast met de hechtdraad.
4. Sluit de muis aan de Y-buis van de adapter van de mechanische ventilator via de tracheacanule, en initiëren van mechanische ventilatie met een tidal volume van 10 ml / kg en een ademhalingsfrequentie van 150 ademhalingen / min.
   OPMERKING: Het is belangrijk in deze fase ervoor te zorgen dat de muis op adequate wijze wordt verdoofd om nauwkeurige PFT metingen te verkrijgen. Re-dosis van de muis met anesthetica als het dier zich niet in een chirurgische vlak van anesthesie. De totale duur van alle PFT manoeuvres is ongeveer 7,5 minuten, zodat het meestal niet nodig om de muizen dien een volgende anesthetica eenmaal een chirurgische vlak van anesthesie is bereikt. De totale tijd van de inductie van de anesthesie tot euthanasie is ~ 20 minuten.
5. Opblazen van de longen totale longcapaciteit (TLC) 3 maal voor een volume geschiedenis de inspiratoire capaciteit (IC) meten en te verminderen atelectase van de longen. Vervolgens perforben de enkele frequentie gedwongen oscillatie manoeuvre (Snapshot-150 verstoring) en het beoordelen van de dynamische weerstand (R), elastantie (ERS) en compliance (CRS) van de luchtwegen, gevolgd door de breedband frequentie gedwongen oscillatie manoeuvre (Quick Prime-3 verstoring ) en meet centrale luchtwegweerstand _(Rn), weefsel weerstand (G), weefsel elasticiteit (H) en de verhouding G / N (). Tenslotte opnemen quasic-statische compliance (C _st) tijdens de volume-drukstroom manoeuvres.
6. Herhaal elk van deze manoeuvres vijf keer (of aanvullende maatregelen uit te voeren, totdat consistente metingen worden verkregen) en pomp aan TLC drie keer tussen elke herhaalde metingen worden bepaald. Noteer de gemiddelde waarde van iedere parameter voor elke muis.
7. Verwijder de muis uit de mechanische ventilator en euthanaseren het met CO ₂ narcose gevolgd door cervicale dislocatie [deze euthanasie methode wordt goedgekeurd door onze Institutional Animal Care en gebruik Committee]. Knip het membraan, open de thorax in de middellijn, en verwijder de voorste ribben naar de longen bloot. Ontleden van de huid en het onderhuidse weefsel rond de luchtpijp en slagen voor een tweede 2-inch lengte van de zijden hechtdraad posterior naar de luchtpijp.
8. Bereid de machines longinflatie (Figuur 2):
   1. Vul een 500 ml konische Erlenmeyerkolf ¾ met steriel PBS, verzegelen met een rubber stop, omkeren, en hang deze op een ring stand (zodat de meniscus van de fosfaat gebufferde zoutoplossing pH 7,4 (PBS) 25 cm boven het hart van de muis).
   2. Steek het ene uiteinde van een intraveneuze geven ingesteld in de PBS in de kolf door de rubberen stop. Plaats een 6 inch lengte van een plastic serologische pipet door de rubberen stop, zodat de opening ligt boven de meniscus van de PBS om de lucht te laten PBS vervangen verlaten van de kolf.
   3. Open de klep van het geven van set en voer PBS al is het systeem voor het spoelen van de lucht uit het geven van set.
9. Sluit de intravenous geven ingesteld op de tracheacanule, de klep te openen, en laat PBS te stromen in de longen door de zwaartekracht, totdat de longen volledig op te blazen. Sluit de klep, afhechten luchtpijp met behulp van de chirurgische hechtdraad distaal van de tracheacanule, en verwijder de canule.
10. Til de luchtpijp met een pincet, en snijd de luchtpijp proximale om de knoop, en ontleden het bindweefsel posterior naar de luchtpijp en de longen. Verwijder de longen (zonder knikken daarvan) en plaats de longen in een buisje met 10% zoutoplossing gebufferd formaline. Bevestig de longen O / N bij RT, en de volgende dag, was ze met PBS twee keer.
11. De longen in paraffine insluiten, snijd 5 micrometer dikke secties, en dan vlekken de secties met Gill's vlek zoals hieronder beschreven.

3. emfyseem

1. Gill's kleuring van paraffine ingebedde longsecties
   1. Plaats de objectglaasjes in een plastic rek en incubeer ze op 70 ° C gedurende 20-30 min in een oven.
   2. De-pariffinize de objectglaasjesdoor incuberen gedurende 2 min in elk van de vier veranderingen xyleen.
   3. Hydrateren de dia door incuberen gedurende 2-3 min in elk van twee wijzigingen 100% ethanol, gevolgd door 2-3 minuten in elk van twee veranderingen van 95% ethanol en daarna wassen van de glaasjes tweemaal in PBS gedurende 2-3 min Voor elke verandering van de oplossing.
   4. Incubeer de glaasjes gedurende 18-48 uur in een 1: 1 mengsel van Gill's hematoxyline en gemodificeerde Harris hematoxyline.
   5. Was de dia's voor 2 min in elk van de vijf veranderingen gedestilleerd water en dehydrateren de objectglaasjes volgens incuberen vervolgens gedurende 2-3 min in elk van twee veranderingen van 95% ethanol, gevolgd 2-3 min in elk van 2 veranderingen van 100% ethanol.
   6. Maak de dia door incuberen gedurende 2 min in elk van de vier veranderingen xyleen.
   7. Monteer de dia's met duidelijke montage media en voeg een dekglaasje zonder de invoering van bubbels, waarin vervolgens analyse zal belemmeren.
2. Gerandomiseerde beeldopname:
   1. Verwerven zwart-wit beelden als TIFF-bestands met behulp van een microscoop, een 20 X objectief, en een camera en software die kan verwerven digitale beelden van hoge kwaliteit.
   2. Capture ~ 20-30 beelden (X 200 vergroting) per muis in een gerandomiseerde wijze, met de waarnemer verblind voor de experimentele conditie, het vermijden van een te lage gebieden van de long.
   3. Tape een micro-slide veld-finder op de dia. Het veld vinder heeft een raster met een aantal velden die zijn aangeduid met een letter (in verticale richting) en een aantal (in horizontale richting) en elk vierkant een plusteken (+) in het midden en wordt aangeduid met een letter en nummer (bijvoorbeeld A1, A2, ...... Z25).
   4. Gebruik een Random Field Generator Excel-spreadsheet om willekeurig een plein voor het vastleggen van beelden. Om een ​​willekeurige letter maken, voert EFGHJKLMNPQRSTU in cel B1 in de spreadsheet (de onderzoeker kan deze brief bereik aan te passen om het bereik van de kwadraten geïdentificeerd door een brief die de longen heen liggen te dekken). Voeg vervolgens de formule [= MID ($ B $ 1,1 + INT(RAND () * LEN ($ B $ 1)] naar cel C1 om willekeurig een brief in C1. Kopiëren en plakken C1 naar C2, C3, C4 et cetera om een ​​kolom van willekeurige letters te genereren.
   5. Om een ​​willekeurig getal in de aangrenzende kolom maken, typt u de formule = ASELECTTUSSEN (5,25) in D1 (waar 5-25 is de typische reeks van weefsel op de dia). Eventueel bijstellen dit bereik het bereik van vierkanten geïdentificeerd door een nummer dat de longen te liggen dekken.
   6. Kopiëren en plakken D1 naar D2, D3, D4 et cetera om een ​​kolom van willekeurige getallen naast die met willekeurige letters te genereren. Dus elke rij bevat een paar willekeurig gegenereerde letters en cijfers overeenkomen met de etiketten op de pleinen in het veld zoeker (bijvoorbeeld E17, H24. ...).
   7. Plaats de dia op de microscoop. De 4X microscoopobjectief vinden de overeenkomstige plein in het veld zoeker schuif (bijvoorbeeld E17, H24 ...) en plaats dit vierkant in het midden van het veld microscoop.
   8. Lijn het midden van de microscopischeveld met de "+" in het midden van het doelveld. Verwijder het veld finder, richten zich op de longen met behulp van de 20X microscoop objectief en het verwerven van het beeld als een grijs-schaal TIF-bestand. Als longweefsel covers <50% van de microscopische veld, selecteert u de volgende willekeurig gegenereerde plein. Herhaal tot ~ 20-30 opnamemethode voor elk dier. Alle afbeeldingen opslaan voor elk dier in een enkele map met de tag nummer van het dier, zodat het Excel-rapport macro om de bestanden te herkennen.

4. Morphometry emfyseem Meet

Het protocol maakt gebruik van Scion Image en aangepaste macro's aan de uitbreiding van het luchtruim te analyseren. Scion Afbeelding is een Windows-compatibele versie van het oorspronkelijke NIH Image applicatie die onder het Macintosh-besturingssysteem draait. Scion Afbeelding draait onder Windows XP en is nog steeds online beschikbaar via Wikiversity.org, waar een zoektocht naar 'Scion Image' zal de gebruiker direct naar links naar dehandleiding en beta 4.0.2 release van Scion Image. Installatie en werking van de software wordt gedetailleerd beschreven in de online aanvulling handleiding en hieronder samengevat. De alveolaire akkoordlengte macro werd aangepast van de macro in NIH Image.

1. Bereid de TIFF-beeld van de Gill's gekleurd long sectie voor Scion beeldanalyse:
   1. Start Scion Beeld en laad de macro's, zoals aangegeven in de online-supplement. Selecteer de Open Helderveld Image [1] macro te selecteren en open het TIFF-bestand. Vervolgens gebruikt het beeld uitgeven hulpmiddelen om het beeld te bereiden voor analyse.
   2. Gebruik de paint-brush tool om delen van het beeld die niet op het luchtruim of alveolaire wanden worden behandeld als het luchtruim of weefsel te dwingen. Bijvoorbeeld, verf bronchi en vaten zwarte zodat ze geanalyseerd weefsel. Verf ontstekingscellen (of stof) bezetten ruimte in de longblaasjes wit tot dat ze worden geanalyseerd als het luchtruim.
   3. Selecteer het penseel kleur door te klikken op de muis op dewoorden zwart of wit onderaan het venster LUT. Klik vervolgens op de brush tool. Om de borstel grootte, dubbelklikt u op het penseel wijzigen en voer een geschikte borstel grootte. Klik en sleep de muis over de afbeelding om structuren te schilderen de geselecteerde kleur (zie # 1 hierboven).
2. Het meten van de gemiddelde koorde lengte van het luchtruim
   1. Selecteer de macro koordelengte Air [2] om het luchtruim akkoord lengtes meten.
   2. Drempel van het beeld door eerst te klikken met de muis in de buurt van het centrum van het beeld sleept u de muis omhoog of omlaag om de drempelwaarde (een getal tussen 0 en 255, die wordt weergegeven in het venster Info) aan te passen. Klik op de muis een tweede keer om de drempelwaarde te accepteren. Pas de drempel naar de alveolaire wanden dezelfde dikte te maken als in de originele beelden.
      LET OP: Het is cruciaal dat de onderzoeker niet onder-drempel en daardoor onderbrekingen in de alveolaire wanden die niet bestaan ​​in de oorspronkelijke afbeelding die zal produceren niet makenkunstmatig hoog koordelengte waarden.
   3. Het programma verwijdert automatisch enkele pixels (enkele zwarte pixels omgeven door 8 witte pixels).
   4. em> 4.2.4. Observeer een venster waarin de gebruiker opnieuw drempel het binaire beeld vraagt, blijven de macro, of de macro annuleren. Weer drempel, beantwoorden Y om de snelle en selecteer de knop OK.
   5. em> 4.2.5. Visualiseer een horizontale en verticale rooster raam met lijnen 5 pixels uit elkaar gecreëerd door macro's. Het programma meet de lengten van horizontale en verticale lijnen die luchtruim overlappen.
   6. Sla het bestand op in een map, maar niet de standaard naam niet veranderen anders wordt het Excel-rapport macro's zal het bestand niet vinden (het formaat is de naam van de opname waaraan "CLa.txt" voor het luchtruim koordelengte.
      OPMERKING: Als het programma niet metingen te maken, kan de drempelwaarde te laag zijn (moet> 1). Als dit gebeurt, de onderzoeker opnieuw drempels het beeld met een hogere waarde.
   7. em> 4.2.7. Voor alveolaire gebied metingen (in aanvulling op lengtes akkoord), lopen de extra [4] en [5] macro's ook.
   8. em> 4.2.8. Ga door totdat alle beelden zijn geanalyseerd.
3. Het analyseren van de resultaten met behulp van Excel-rapport Macro's
   1. Open Excel-rapport 20x.xls. Handmatig inschakelen van macro's, indien nodig, afhankelijk van de standaard beveiligingsinstellingen in Excel-versie wordt gebruikt.
   2. Observeer een lijst van macro's in de Macro-venster (zie tabel 1).
      OPMERKING: CL_Air_1 meldt akkoord lengte van het luchtruim voor een enkel dier (map). CL_Air_Multi meldt akkoord lengte van het luchtruim voor meerdere dieren (mappen). AP_No_Edge_1 meldt het gebied van de longblaasjes zonder rand contacten voor een enkel dier (map) .AP_No_Edge_Multi meldt gebied van de longblaasjes zonder rand contacten voor meerdere dieren (mappen). AP_With_Edge_1 meldt gebied van longblaasjes met rand contacten voor een enkel dier (map). AP_With_Edge_Multi meldt gebied van longblaasjes met rand contacten voor meerdere mappen.
   3. Kies de CL_Air_Multi macro om alveolaire koordelengte metingen voor meerdere mappen die overeenkomen met beelden van meerdere muizen te melden. Het programma meldt alle _CLa.txt bestanden in de geselecteerde mappen. Weglaten van een _CLa.txt bestand (indien nodig) door het verhuizen naar een submap van de huidige map of hernoemen van de _CLa gedeelte.
   4. Uit het bestand venster, selecteert u een map tegelijk door te wijzen op de map en het selecteren van OK (het programma niet ondersteunt meervoudige selectie in een keer). Zoals elke map is geselecteerd, observeren op het werkblad. Selecteer "Annuleren" of sluit het bestand venster om door te gaan.
      OPMERKING: Afhankelijk van de versie van Excel, kan de onderzoeker hebben om terug te navigeren één mapniveau na elke map is geselecteerd.
   5. Observeer een afzonderlijk werkblad voor elke map, het tonen van statistieken voor elk _CLa.txt bestand gevolgd door statistieken voor koordelengte gegevens gecombineerd uit alle _CLa.txt bestanden.
   6. Hernoemen en sla de spreadsheet. De standaard bestandsnaam is de naam van de bovenliggende map toegevoegd met _CLa.xls. Sluit het werkblad voordat u een andere macro.

5. Kleine luchtweg remodeling

1. Kleuring en beeldopname
   1. Vlek longcoupes met Masson trichroomkleuring vlek met behulp van een commerciële kit en volg de instructies van de fabrikant.
   2. Leg afbeeldingen van alle luchtwegen in beide longen die volledig kan worden ondergebracht (zoals de blauwe laag buiten de luchtweg die de laag van ECM eiwitten die worden afgezet) in een afbeeldingsgebied met de 20X objectief van de microscoop.
      Opmerking grotere luchtwegen niet geassocieerd met een verhoogde afzetting van ECM eiwitten in CS-blootgestelde muizen.
   3. Sla de afbeeldingen in kleur als jpeg-bestanden.
2. Beeldanalyse: Open het beeldbestandin de beeldanalyse software.
   1. Openen en de naam van het logbestand om de metingen te nemen.
   2. Selecteer een lijntekening tool. Trek 4 lijnen die het lumen van de luchtwegen (de inwendige diameter) om de grootte van de luchtweg meten en bevat uitsluitend luchtwegen met de gewenste grootte in de analyse. Vervolgens trek 12 op gelijke afstanden lijnen (op positie in de luchtwegen overeenstemmen met de nummers van een klok) die zich vanaf de rand van de adventitia laag aanligt de luchtweg naar de rand van de blauw gekleurde gebied omringden de luchtweg van de dikte meten van de laag van ECM eiwitten buiten de luchtweg afgezet (Figuur 5). Dat meting van gebieden waar de luchtweg wisselwerking met andere luchtwegen of schepen.
   3. Eerste record al van de interne lijnen diameter in het logbestand, en neem vervolgens de 12 lijnen die de dikte van de blauwe ECM laag rond de luchtwegen te meten.
   4. Sluit de afbeelding te openen dan de volgende afbeelding.
   <li> Herhaal deze stappen totdat alle beelden voor het dierenwelzijn zijn ingelogd in één map.
   5. Begint u bij stap 5.2 voor de volgende map waarin de beelden die zijn vastgelegd op longcoupes uit de volgende dierlijke bevat. Verlaat het programma na voltooiing van de analyse van alle luchtwegen in longsecties van alle dieren in het experiment.
   6. Voer de 4 interne metingen diameter en de 12 ECM eiwit laagdikte metingen opgenomen voor elk van de luchtwegen voor elke muis in de data log-bestanden in een Excel-spreadsheet. Middel de diameter en ECM eiwitten laagdikte metingen voor elk dier.
   7. Converteer de metingen van pixels micron.
   8. Groep de luchtwegen op basis van hun grootte van de interne diameter (bv., 300-399 um, 400-499 um etc.) en vergelijk ECM dikte eiwitlaag metingen rondom de luchtwegen met soortgelijke maten voor de lucht- versus-rook blootgestelde muizen (bijv., luchtwegen met een diameter van 300-899 urn;
   9. Indien nodig, immunostain longcoupes voor individuele eiwitten (waaronder interstitiële collageen en basaal membraan eiwit) en het uitvoeren van een soortgelijke analyse als afzetting van eiwitten van belang met deze methode te kwantificeren.

Representative Results

Dit protocol begint met hele lichaam blootstelling van muizen CS. Adequaat toezicht en het onderhoud van het apparaat en de monitoring van TBM telt zorgen voor een consistente rook blootstelling (figuur 1). Belangrijk is dat de onderzoeker oefent de longinflatie techniek met de opblaasinrichting

Dit protocol begint met hele lichaam blootstelling van muizen CS. Adequaat toezicht en het onderhoud van het apparaat en de monitoring van TBM telt zorgen voor een consistente rook blootstelling (figuur 1). Belangrijk is dat de onderzoeker de gedragingen longinflatie techniek met de inflatie-inrichting (figuur 2) en voorzichtig verwijdert de longen na het opblazen om goed opgeblazen longsecties krijgen voor accurate analyse van de uitbreiding luchtruim. Figuur 3A toont een goed opgeblazen long terwijl figuur 3B toont een slecht opgeblazen long. Figuur 3C toont een beeld van een opgeblazen long afdeling voorbereid op de drempelen sTEP (macrofagen in de alveolaire ruimten zijn wit geschilderd en vaten en bronchiën zijn zwarte genereren geverfd. De drempelwaarden stap wordt een binair beeld waarin alle pixels in de alveolaire ruimte zijn wit en alle pixels in gebieden van de longen die niet alveoli zwart (Figuur 3D). Figuur 3E en 3F tonen de verticale en horizontale alveolaire akkoord lengtes dat de macro's te genereren, respectievelijk.

Longfunctie tests tonen bescheiden (en niet statistisch significant) verliet verschuivingen in de druk volume (PV) lussen reflecterende bescheiden verlies van elastische terugslag van de long in overeenstemming met de milde emfyseem die zich ontwikkelt in C57BL / 6 WT muizen blootgesteld aan CS voor 6 maanden ( Figuur 4A). Significante links verschuivingen in de PV lussen alleen waargenomen in muizenstammen die zeer gevoelig voor de effecten van CS of CS-belichte van transgene muizen met een ernstig emfyseem fenotype dan CS-blootgestelde C57BL / 6 WT-muizen.

Vijgure 5 toont representatieve beelden Masson-trichroom gekleurde longsecties van C57BL / 6 WT-muizen blootgesteld aan lucht (figuur 5A) of CS (figuur 5B) gedurende 6 maanden illustreren verhogingen ECM eiwitten depositie rond kleine luchtwegen in de CS-blootgestelde dieren. Figuur 5C illustreert hoe een beeld analyse software kwantificeert ECM eiwit afzetting rond de luchtwegen met de gewenste binnendiameter. Figuur 5D toont de analyse van ECM eiwitten depositie rond luchtwegen met een diameter van 300-899 urn in CS-blootgestelde C57BL / 6 WT-muizen.

Figuur 1. Een cartoon van het hele lichaam blootstelling sigaret systeem. Wordt een blootstelling rook apparaat aangesloten op een blootstelling rookkamer. De rook wordt getrokken uit de kant-stream opvangruimte en rook wordt getrokken uitde sigaretten door de pomp, en beide rook monsters zijn gemengd en verdund met lucht in de menging en verdunning kamer (links), en dan de rook stroomt naar de blootstelling kamer. De onderzoeker plaatst muizen in hun kooien in de blootstellingskamer (rechts); muizen vrij kunnen bewegen in hun kooien, en hebben toegang tot voedsel en water gedurende de duur van de blootstelling aan rook.

Figuur 2. De inflatie van muizen longen. De onderzoeker vult een kolf met steriel PBS, verbindingen met een rubberstop en inverteert het en stelt het een afstand van 25 cm boven het hart van het dier met een ring stand. Een intraveneuze geven set levert alle PBS naar de longen via de tracheacanule. Een cut-down serologische pipet wordt ingebracht door de rubberen stop en dit laat lucht in de kolf met het volume van PBS riool te vervangen die in de luNGS van de muizen door zwaartekracht.

Figuur 3. Emfyseem analyse. (A) toont een representatief beeld van Gill's vlek opgeblazen longsecties van muizen blootgesteld aan lucht of CS 6 maanden, de zwarte pijlen geven een vat en alveolaire macrofagen. (B) toont een representatief beeld van een opgepompte long die niet geschikt is voor analyse. (A) toont de "voor" en (C) toont de "na" van een representatieve long sectie die de onderzoeker voorbereidt voor het genereren van een binair beeld. De zwarte pijlen in (A) en (C) duiden op een schip (waarvan de onderzoeker verf zwart in (C)) of alveolaire macrofagen (waarvan de onderzoeker verf wit (C)). (D) < / Strong> toont het binaire beeld na de onderzoeker voert de drempel stap. (E) en (F) tonen de horizontale en verticale lengtes alveolaire akkoord dat de onderzoeker genereert, respectievelijk. Vergroting van alle afbeeldingen is x 200. Schalingsbalk die 400 pm is weergegeven in (A).

Figuur 4. alveolaire koordelengte en drukvolumecurves. (A) toont een typische analyse van alveolaire akkoord lengten in C57BL / 6 WT-muizen blootgesteld aan lucht (n = 13) of CS (n = 24) gedurende 6 maanden. De asterisk geeft p <0.001. (B) toont typische PV lussen uitgevoerd met C57BL / 6 WT-muizen blootgesteld aan lucht (n = 13) of CS (n = 14) gedurende 6 maanden. De gegevens zijn uitgedrukt als gemiddelde + SEM.

highres.jpg "/>
Figuur 5. Kleine luchtwegremodelling (SAR) evaluatie. (A) en (B) tonen representatieve beelden van Masson-trichroom gekleurde longsecties van C57BL / 6 WT-muizen blootgesteld aan lucht (A) of CS (B) gedurende 6 maanden. (C) laat zien hoe beeldanalyse software analyseert SAR in CS-blootgestelde muizen. (D) toont typische metingen van de dikte van de extracellulaire matrix eiwit afgezet rond kleine luchtwegen met een diameter van 300-899 m in C57BL / 6 WT-muizen blootgesteld aan lucht (n = 11) of CS (n = 16) gedurende 6 maanden. De gegevens zijn uitgedrukt als gemiddelde + SEM en asterisk geeft p <0,05.

Schaalbalken worden getoond op de afbeeldingen van elke sectie long.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Whole-body smoke exposure device	Teague Enterprise	TE-10z	Chronic Smoke exposures to induce chronic lung disease in mice
Research Cigarette	University of Kentucky	3R4F reference cigarettes
Pallflex® Air Monitoring Filters, Emfab Filters TX40HI20WW, 25 mm	Pall Corporation	7219	For measurement of TPMs
25 mm filter holder	Pall Corporation
Filter sampler	Intermatic	Metal T100
Gas meter	AEM	Gas meters G1.6; G2.5; G4
Tracheal Cannula for mouse 18 gauge	Labinvention		Analysis of pulmonary function
Mechanical ventilator	Scireq	FlexiVent
Gill's hematoxylin solution	Sigma-Aldrich	GSH316	For Gill staining, work under a fume hood
Hematoxylin solution, Harris modified	Sigma-Aldrich	HHS16
Cytoseal-60	Thermo Scientific	8310-16
Micro-Slide-Field-Finder	Andwin Scientific INC	50-949-582	For analysis of emphysema
Scion Image Program	Scion Corporation
Mason's trichrome stain	Sigma-Aldrich	HT15	For analysis of small airway fibrosis
MetaMorp Offline version 7.0	Molecullar Devices LLC	31032