Abstract
רגולציה של סינתזת חלבון מהווה נקודת שליטה מרכזית בתגובה תאית ללחץ. בפרט, יחידות בקרת RNA דיסקרטי הוצגו כדי לאפשר לתרגום סלקטיבי של mRNAs הספציפי, אשר בדרך כלל קשורים לחלבונים הנדרשים לתגובת לחץ מסוימת. זיהוי של mRNAs אלה, כמו גם האפיון של מנגנוני פיקוח אחראים לתרגום סלקטיבי היה בחוד החנית של ביולוגיה מולקולרית לכמה זמן. פרופיל Polysome הוא שיטת אבן פינה במחקרים אלה. המטרה של פרופיל polysome היא ללכוד תרגום mRNA על ידי משתק ריבוזומים פעיל תרגום בתמלילים שונים ונפרדת polyribosomes וכתוצאה מכך על ידי ultracentrifugation על שיפוע סוכרוז, ובכך מאפשר להבחנה בין תמלילים מתורגמים ביותר ואלה תורגמו בצורה גרועה. אז יכולות להיות מאופיינות אלה נוספות על ידי שיטות ביולוגיה מולקולריות ביוכימי ומסורתית. חשוב לציין, עמ 'שילובolysome פרופיל עם גישות הגנומי תפוקה גבוהה מאפשר ניתוח בקנה מידה גדול של הרגולציה translational.
Introduction
רגולציה של סינתזת חלבון (תרגום) היא תהליך תאי חשוב שקשורה קשר הדוק להישרדות סלולרית. בהתחשב בעובדה שהתרגום צורך יותר מ -50% מהאנרגיה של התא, אין זה מפתיע שהתרגום מוסדר בחוזקה ושההפרעות בתרגום אינן נסבלות היטב. לעומת זאת, רבים תהליכים תאיים חריגים דורשים כי מכונות תרגום ופלט תרגום (כלומר proteome) צריכים להיות שונה. זה קורה לעתים קרובות במדינות תגובת לחץ ומחלות שונות, והוא כנראה הכי טוב שהודגם בסרטן. יתרון מפתח של שליטת translational הוא היכולת של תאים לתכנת מחדש במהירות את תפוקת החלבון בתגובה לטריגרים חיצוניים ופנימיים שונים, מנגנון כוונון ובכך בסדר שעצות האיזון בין הישרדות תא ומות 1.
שני היבטים של שליטת translational מעניינים במיוחד; הבנה של הטבע של MEC הרגולציהאלמנטי hanism (ים) ובקרה המאפשרים לתרגום ספציפי, וזיהוי של mRNAs הספציפי ומוצרי החלבון שלהם, המשתתפים בתגובה התאית להדק המסוים שעורר תרגום סלקטיבי במקום הראשון. פרופיל Polysome הוא טכניקה המאפשרת לימוד אפקטיבי של שני התהליכים.
המטרה הכללית של טכניקת פרופיל polysome היא ללמוד ולכמת את מצב התרגום של mRNAs המסוים בתנאים סלולריים שונים. העיקרון של השיטה הוא ללכוד תרגום mRNA על ידי '' הקפאה '' ריבוזומים פעילים תרגום בתמלילים שונים ונפרדים polyribosomes וכתוצאה מכך על ידי ultracentrifugation על שיפוע סוכרוז, ובכך מאפשרים להבחנה בין תמלילים מתורגמים ביותר (מחויבת כמה ריבוזומים) ו גרוע מתורגם אלה (כפופים לריבוזומים אחד או שניים). בפרוטוקול ספציפי זה, cycloheximide האנטיביוטי שנקשר ל60S מקטע ריבוזומלי וחוסם את שחרורו של tRNA deacetylated מאתר E הריבוזום 2, משמש כדי לעכב טרנסלוקציה הריבוזום ולעכב ריבוזומים על mRNAs תרגום. עם זאת, סוכני חסימה אחרים כגון emetine שתרגום גם חוסם התארכות 3, ניתן להשתמש.
בניגוד למערבי סופג ו -35 S-מתיונין טכניקות תיוג המודדות את התוצר הסופי של תהליך התרגום, polysome יש פרופיל את היתרון של מדידת עמותת ריבוזומים עם mRNAs באופן פעיל-המתורגם, ובכך מאפשר למחקר מפורט יותר של מנגנוני תרגום בתנאים שונים. לפיכך, הטכניקה ניתן להתאים בקלות ללמוד במיוחד מצבים שונים של תרגום 4-6, גורמי חלבונים מעורבים בויסות תרגום 7-9, תנאי לחץ משפיעים על סינתזת חלבון 1,10,11 או את ההשפעות של מבני mRNA כגון IRES או במעלה הזרם מסגרות קריאה פתוחות בסינטיסייזר החלבוןesis 12-14. כיום, polysome יישומי פרופיל הם אפילו רחבים יותר בשימוש במערכים DNA 15 או רצף של הדור הבא 16,17 לנתח mRNAs הקשורים polysomes.
Protocol
הערה: הערה על עבודה עם RNA: היזהר בתקן להגנה מפני השפלה RNA על ידי RNases. השתמש בכפפות, טיפים פיפטה המחסום, plasticware RNase ללא וכימיקלים בכל השלבים של הפרוטוקול. השתמש ultrapure או מים שטופל DEPC לכל הפתרונות. לטהר כל משטחים חשודים עם פתרון איון RNase בעקבות הפרוטוקול של היצרן.
1. הכנה של פתרונות.
- להכין 500 מיליליטר של יסוד הפתרון (0.3 M NaCl;. 15 מ"מ MgCl 2 6 שעות 2 O; 15 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4). מערבבים בעזרת סרגל ומערבבים עד הפתרון הוא ברור ועובר דרך מסנן 0.45 מיקרומטר. אחסן בטמפרטורת חדר.
- הכן 10 ו 50% פתרונות סוכרוז ו 60% פתרון צ'ייס כדלקמן:
- 10% סוכרוז פתרון (w / v), בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר להוסיף 5 סוכרוז g ולמלא 50 מיליליטר עם יסוד פתרון. עבור 50% סוכרוז פתרון (w / v), במודעת צינור צנטריפוגה 50 מיליליטרד 25 סוכרוז g ולמלא 50 מיליליטר עם יסוד פתרון.
- עבור 60% (w / v) צ'ייס פתרון, בצינור צנטריפוגות 50 מיליליטר להוסיף 30 סוכרוז g ולמלא 50 מיליליטר עם יסוד פתרון. הוספה של פתרון הכחול bromophenol רווי 100 μl (להוסיף bromophenol הכחול למים עד שלא יותר יתמוסס; צנטריפוגות כדי גלולה האבקה שלא נמסה) לפתרון מרדף 60%. מערבבים בעזרת מערבולת ולאמת פירוק מוחלט.
- פתרונות חנות ב 4 ° C עד צורך.
- הכן RNA תמוגה חיץ. הכן חיץ זה טרי ביום של הניסוי. הכן 500 μl של חיץ תמוגה RNA עבור כל דגימה. ל 1 מיליליטר של יסוד פתרון להוסיף 10 μl טריטון X-100 (1% [v / v] סופי), μl 1 של 100 מ"ג / מיליליטר cycloheximide בDMSO (CHX, 0.1 מ"ג / מיליליטר סופי) ו -3.5 RNasin μl (140 U / Ml). מערבבים בעזרת מערבולת. שמור על קרח.
הערה: cycloheximide הוא רעיל ביותר ועלולה לגרום למוטציות. הימנע ממגע עם עור ושאיפה. כדי להימנע מטיפול בצורת האבקה לעתים קרובות מדי, הכנההם כמות גדולה יותר של 100 מ"ג / מיליליטר מניות בDMSO, aliquot ולשמור ב -80 ° C עבור אחסון לטווח ארוך. להמשיך לעבוד המניה ב -20 מעלות צלזיוס. - היום של הניסוי, להכין פתרונות סוכרוז + CHX על ידי הוספת CHX (ריכוז סופי של 0.1 מ"ג / מיליליטר) להיקף הרצוי של 10% ו -50% תמיסת סוכרוז (~ 7 מיליליטר של כל פתרון לשיפוע).
2. הכנת סוכרוז Gradient שימוש להכנת אוטומטית של צבע
- הפעל יצרנית השיפוע '' על '' ואת רמת הצלחת שתחזיק הדרגתיים (criticalstep!) לחץ על '' הסיום '' כאשר צלחת מפולסת.
- בחר בתפריט תכנית השיפוע שיופעל:
- לחץ על תפריט '' גראד '' ובחר '' רשימה ''.
- בחר באפשרות "SW41".
- גלול ברשימה ובחר את תכנית "על ידי עיתונות" '10 - 11 צעדים - השיפוע של 50% "ing על הכפתור '' תרוץ ''.
- הנח צינור חרוטי ultracentrifuge (SW-41 צינור, 14 x 89 מ"מ) לבלוק מרקר ולהשתמש בסמן צינור הקנס קבוע לאתר את חותמו על הצינור לאורך המדרגה העליונה של בלוק דה מרקר. מניחים צינורות במעמד הולם על משטח יציב.
הערה: סימון זה יהיה מדריך המילוי לשכבות פתרונות סוכרוז 10 ו -50%. - צרף את צינורית שני הניתנת לשני מזרקים 10 מיליליטר ולשטוף על ידי pipetting למעלה ולמטה עם מים חמים מזוקקים המכילים פתרון איון RNase. הקפד להסיר את כל העקבות של מים לאחר מכן.
- מלא את אחד מהמזרקים עם 10% CHX + סוכרוז והכנס את הצינורית בחלק התחתון של צינור ultracentrifuge. בעדינות לוותר פתרון 10% סוכרוז עד שהולך רק בעבר הסימן שנעשה על הצינור.
הערה: הימנע עושה בועות. אם בועות טופס, לטפוח בעדינות צינורית כדי לעקור אותם. - מלא את המזרק האחר עם סוכרוז 50% + CHX, לנגב נוזלי נוספת מעם צינורית לנגב בעדינות להכניס בחלק התחתון של צינור ultracentrifuge. בעדינות לוותר תמיסת סוכרוז 50% עד שהוא מגיע בדיוק הסימן. במהירות ובצורה חלקה להסיר את הצינורית.
הערה: סוכרוז 10% צריך לעלות בצינור ויוצר מיניסקוס בשטח. אם לא, להוסיף עוד תמיסת סוכרוז 10% על פני השטח. - הכנס את הכובע הניתן על ידי הטיית צינור ultracentrifuge מעט ועקירת כל בועות האוויר. הסר נוזל עודף במאגר של הכובע עם micropipet.
- נגב נוזל עודף לאורך קיר הצינור ומניחים על צלחת יצרנית השיפוע.
- לחץ על הכפתור '' תרוץ ''.
הערה: הצלחת להטות בזווית שצוינה, לעצור לשנייה 5 והסיבובים כדי ליצור השיפוע יתחיל. - כאשר היווצרות שיפוע היא מלאה (כ 2 דקות, המכשיר ישמיע צפצוף), להסיר בעדינות את ultracentrifuge (ים), מקום על מדף ובמהירות להסיר את הכובע בתנועה כלפי מעלה כדי להימנע מלהפריע gradie NT.
- שמור שיפוע (ים) על קרח. נא לא להפריע! לחלופין, שיפועים לשמור לילה בשעה 4 מעלות צלזיוס.
- לחלופין, להשתמש באמצעים לשיפוע שני קאמריים לעשות הדרגתיים כדלקמן:
- צינורות יש לשטוף ויצרנית שיפוע עם פתרון איון RNase ומים RNase חינם.
- הוסף 5 מיליליטר של סוכרוז 50% + CHX לתא הפרוקסימלי של יצרנית שיפוע ולהבטיח כי כל אוויר שבין שני התאים יוסר.
- הוסף 5 מיליליטר של סוכרוז 10% + CHX לתא הדיסטלי של יצרנית שיפוע.
- הוסף 0.5 מיליליטר של סוכרוז 50% + CHX לחלק תחתון של צינור צנטריפוגה חרוטי (צינור SW-41, 14 x 89 מ"מ) ומקום בבעל צינור.
- הפעל בוחש ממוקם בתא הפרוקסימלי, תחנה-זין פתוח והפקדת שיפוע במהירות מוגדרת "3" (כ 1 מ"ל / דק ').
- שיפוע מקום (ים) על קרח. נָא לֹא להַפרִיעַ.
יכול להיות כל הזמן Gradients הלילה ב 4 מעלות צלזיוס: הערה.
3. תא תמוגה וultracentrifugation.
- "Margin-left: 40px;">
- הנח SW-41 הרוטור ודליים על 4 מעלות צלזיוס ו צנטריפוגות להגדיר עד 4 מעלות צלזיוס.
הערה: הליך תמוגה התא מותאם במיוחד עבור שתי subconfluent 150 מ"מ (~ 70-80% ומחוברות) צלחות של תאי HEK293 לשיפוע והכרכים המשמשים ייתכן שיצטרכו להיות מותאמים לשורות תאים שונות. - פלייט תאים בצפיפות התאים המתאים בתקשורת הצמיחה לפחות 24 שעות לפני תמוגה.
- הכן aliquot (20 מיליליטר לכל 150 צלחת מ"מ) של תקשורת צמיחה המכילה CHX / מיליליטר 0.1 מ"ג.
- דגירה תאי CHX + תקשורת (20 מיליליטר לכל צלחת 150 מ"מ) במשך 3 דקות על 37 מעלות צלזיוס / 5 CO% 2 למעצר וללייצב polysomes.
- עבודה במהירות, תקשורת לשאוב מצלחות, צלחות מניחים על קרח ולשטוף תאי פעם עם פוספט הקר 10 מיליליטר קרח סליין (PBS: 137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na 2 4 HPO, 1.8 מ"מ KH 2 PO 4) בתוספת עם CHX (ריכוז סופי של 0.1 מ"ג / מיליליטר) להיות זהיר, כדי פיפטה באיטיות במורד סידדואר של קיר הצלחת כדי למזער הסרת monolayer התא.
- לשאוב PBS ולהוסיף עוד 10 מיליליטר PBS + CHX לכל צלחת, לגרד תאים עם מרים תא ולהעביר את הנפח הכולל של שני הצלחות לצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר על קרח. שמור 1 מיליליטר של השעיה תא צינור microfuge על קרח לניתוח חלבונים במורד הזרם.
- צנטריפוגה שפופרת 50 מיליליטר של תאים ב 300 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- הסר את כל גלולה PBS וגלול ב500 μl של חיץ תמוגה RNA הקר כקרח.
- העבר את ההשעיה תא צינור microcentrifuge 2 מיליליטר.
- פיפטה מעלה ומטה לתאי lyse ולדגור על קרח במשך 10 דקות, כאשר מדי פעם vortexing.
- צנטריפוגה XG ב 2000 על 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות עד גלולה גרעינים.
- העברת supernatant לצינור microcentrifuge 2 מיליליטר חדש.
- צנטריפוגה ב17,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי גלולה פסולת תא.
- העברת supernatant לצינור 2 מיליליטר microcentrifuge חדש ולהשתמש 2 μl למדודצפיפות אופטית ב 260 ננומטר (מאגר תמוגה השימוש ריק).
- הסר 50 μl (10% בסך הכל) מכל מדגם לניתוח של רנ"א הכל. הערה ניתן לאחסן lysate ב -80 ° C עד צורך.
- בעדינות לטעון יחידות A260 שווים על כל הדרגות סוכרוז (דקות 10 OD, אופטימליות 25 OD, בנפח מרבי של 500 μl;. לדלל lysate המרוכז עם חיץ תמוגה נוסף במידת צורך).
- מילויים להבטיח נמצאים 0.1 גרם של כל אחד לפני ultracentrifugation האחר.
- מילויים צנטריפוגה בסל"ד 39,000 (260,343 XG) עבור 1.5 שעות על 4 מעלות צלזיוס.
- במהלך spindown לשמור בלם הרוטור ובלכבות אותו במהלך האטה כאשר הוא מגיע 1,000 סל"ד.
הערה: שלב זה ממזער הפרעה כלשהי של הדרגתיים הנגרם על ידי שינויים פתאומיים בתאוצה כראשי מברשת הקשר עם הרוטור במהלך בלימה.
4. מערכת פלזמת Gradient Instrument Set-up.
- הגדרת המכשיר וריק שלpectrophotometer במים באופן הבא:
- הפעל את הרכיבים ולאפשר את המנורה כדי להתחמם-לפחות 15 דקות.
- אספן שבריר להבטיח מוגדר שיטת 'polysome' (סמל תיקייה לחץ לחיצה כפולה; תמורת חץ פעמיים כדי לחזור למסך בית).
- להבטיח את השסתום על אספן החלק מוגדר לבזבז (חץ מצביע לסמל פח אשפה). הנח 250 מיליליטר ארלנמייר המכיל מים מזוקקים מתחת לצינור האיסוף פסולת.
- בחר את הגדרות ברשמקול התרשים הבאות: Set רגישות לחייג ל'LAMP SET ואופטיקה '; להגדיר מתג מסנן רעש ל'1.5 '; להגדיר חיוג מפריד שיא ל'כבוי '; להגדיר חיוג מהיר תרשים ל'30 סנטימטר / שעה '(5 סנטימטרים / 10 דקות); להגדיר Baseline התאם חיוג (בחלק העליון של יחידת ספקטרופוטומטר) ל'MAX פתוח '.
הערה: אופציונאלי: תוכנת רשמקול דיגיטלית יכולה לשמש במקום מקליט התרשים. במחשב, לחץ על "התחל". חלון רכישה יפתח: תחת התפריט דואר אפשרויות, גרפיקה השהה לבטל את סימון. תחת 'קנה מידה, להציב גבולות של הגרף ל-10 ו -100 (ניתן לשינוי על--לטוס במהלך ריצה). לחץ על הכפתור שמור כדי ליצור קובץ חדש ולהקליט את הריצה. - יש להכניס את המזרק והחבית במשאבה והדק למקומו (ברגי שימוש סיפק ומפתח אלן).
הערה: אל תהדק. - מלא את המזרק עם צ'ייס פתרון על ידי שימוש ב''REV' 'הפקודה בקצב מהיר. הנח את המשאבה במצב זקוף ולרדוף אוויר דרך צינורות באמצעות 'קדימה' הפקודה ''. השתמש אך ורק מהירים לתפקוד ושוטף זה.
- להתקין צינור ultracentrifuge מלא במי RNase ללא.
- פירס צינור ultracentrifuge עם הצינורית עד שני הסימנים שחורים גלוי (החור מחלק ממוקם בין שני הסימנים האלה) ולהתחיל משאבת מזרק על '' ידני '' ב6.0 מיליליטר / דקה.
- כמים עוברים דרך תא הזרימה (כאשר גפתרון hase ממלא 1/3 של הצינור), מהירות מעבר למשתנה ומוגדר 1.0 מיליליטר / דקה.
- בקצב זרימה של 1.0 מיליליטר / דקה, להתאים את Baseline התאם חיוג על ספקטרופוטומטר, עד שהמתח בתרשים נמצא באפס (+/- 0.5 יחידות).
הערה: שים לב יציאת מים מצינור השפכים לארלנמייר. - הגדרת הרגישות הרצויה ל'0.5 'או' 1.0 'AU.
הערה: 1.0 AU עובד הכי טוב בשביל 10 OD יחידות בשיפוע 10 מיליליטר. אם OD נמוך מ -10, רגישות '0.5' יכולה לשמש כדי לשפר את האות. - לחץ על כפתור Auto Baseline ולהתאים את בסיס הגדרת סימן 10% ברשמקול התרשים ידי סיבוב חוגת מקליט הקיזוז (האופציונלית, אם באמצעות מקליט דיגיטלי).
- ברגע שבסיס יציב מושגת, סובב את מתג המשאבה ל'כבוי 'והחיוג המהיר תרשים 60 סנטימטר / hr אם באמצעות מקליט תרשים אנלוגי או' כבוי 'אם באמצעות מקליט דיגיטלי.
- לשחזר את צ'ייס הפתרון על ידי מעבר משאבה ל'ריעמדת V (במידת הצורך ניתן להגדיל את קצב זרימה חזרה ל6.0 מיליליטר / דקה ... אל תשתמשו RAPID) עד שהוא מגיע הסימן הראשון על צינורית הפירסינג.
- הסר צינור צנטריפוגות ולרדוף אחרי כל בועות אוויר בתוך הצינורית על ידי הפעלה קצת צ'ייס הפתרון דרכו. נגב את נקי שלב פירסינג.
הערה: חלק שאריות המים עלולים לדלוף מתא הזרימה.
5. צבע פלזמה ואיסוף הדגימות.
- התקנה ולנקב את צינור צנטריפוגות מכיל שיפוע סוכרוז.
- הנח עשרה 2 מיליליטר צינורות microcentrifuge בעמדות מגש אספן שבריר 1-11 כך שהכובעים לא יבלטו כלפי מעלה. החלף את '' צינור # 1 '' לעת עתה עם '' צינור פסולת '' כדי לאסוף את נוזלים שנותרו בצינורות האספן.
- הגדר את חוגת שליטת משאבה ל'ידני 'וקצב זרימה במשאבת המזרק ל'6.0 מיליליטר / דקה " לחץ על הסמל 'הפעל' באספן החלק. ברגע שהזרוע מגיעה לצינור הראשון, לחץ על כפתור '' ההפסקה '' (זה יהיה בעמדת הזרוע ולפתוח את השסתום מחלק-חלק).
- התחל המשאבה באמצעות הפקודה '' קדימה '' ולפקח עט מקליט תרשים. כאשר הוא מתחיל להסיט כלפי מעלה (מצביע על המדגם שעובר דרך תא הזרימה של ספקטרופוטומטר), להחליף במהירות '' צינור פסולת '' עם '' צינור # 1 ''.
- כאשר הירידה הראשונה נאסף, לעבור במהירות פקודות ל'Start / Stop מרחוק ',' '(1.0 מיליליטר / דקה) משתנה' 'ולחץ על' 'הפנאי' 'סמל.
הערה: המשאבה נשלטת היום על ידי ממשק אספן חלק ו 1 מיליליטר שברים ייאספו כל דקות. - מנקודה זו ואילך, קריאות A260 יופיעו בממשק הדיגיטלי מקליט (או Recorde התרשים האנלוגיr). ודא '' שיא '' כפתור בתוכנה נלחץ!
- לאחר מרדף הפתרון הכחול נכנס לצינור האיסוף או הצינור שעבר (בדרך כלל צינור 11), לחץ על סמל "עצור".
הערה: השסתום מחלק צריך לעבור את שסתום הפסולת. - שמור ברים על קרח עד שכל ההדרגות היו לפרק. בסופו של השברים היום יכול להיות מאוחסן ב -80 מעלות לפני חלבון או RNA בידוד. אם נדרש ניתוח חלבון ו- RNA, לפצל כל חלק בחצי (500 μl עבור כל חלבון וניתוח RNA).
6. לשטוף
הערה: (זה צעד אופציונאלי לביצוע רק אם הדרגתיים מרובה הם שייגבה).
- להטביע את צינור השפכים לארלנמייר המכיל ~ 50 מיליליטר של מים ultrapure ולהפוך את המשאבה באמצעות קצב זרימה 6 מיליליטר / דקה.
- להפסיק את המשאבה כאשר צ'ייס הפתרון מגיע o הסימן הראשונהn צינורית הפירסינג.
- הסר את צינור צנטריפוגות, לרדוף אחרי כל אוויר מהצינורית ולנקות את שלב הפירסינג.
הערה: חלק שאריות המים עלולים לדלוף מתא הזרימה. - חזור על התהליך החלוק מתחיל בשלב 5.1.
7. סופי על ניקוי.
- נתק את צינור המשאבה מהתחתית מַדקֵר ולשאוב את צ'ייס הפתרון לתוך צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר באמצעות זרימת ההגדרה המהירה. אחסן את צ'ייס הפתרון על 4 מעלות צלזיוס כפי שניתן לעשות שימוש חוזר אותו.
- חבר צינור משאבה למערכת צינורות 3 דרך ולסגור את הברז שמוביל למזרק. חבר צינור אחד למזרק 50 מיליליטר מלא במים מזוקקים וצינור האחר לבסיס מַדקֵר.
- התקן את צינור ultracentrifuge משמש לצעד לריווח ולהעביר לפחות 50 מיליליטר של מים מזוקקים באמצעות ספקטרופוטומטר וצינור איסוף (המתג לתפריט אוסף בממשק באמצעות לחיצה על 'הכוכבים't / השהה '' סמל).
- הסר צינור, מזרק (מפתח האלן שימוש כדי להסיר ברגים) ואת כל רכיבים נשלפים האחרים ולשטוף ביסודיות במים ברז חמים ולאחר מכן לשטוף עם מים ultrapure.
הערה: קח טיפול מיוחד בעת שטיפת הבוכנה, חבית, צינורות ופירסינג צינורית.
הערה: ידית חבית מזרק הזכוכית בזהירות! אחסן את כל הרכיבים מאבק. - נגב תחתון של תא זרימה עם רקמות רכות טבולה במים מזוקקים. נגב את מגש אספן שבריר, וכל התחום אחר שבו סוכרוז ייתכן שנשפך.
8. בידוד של RNA מברי סוכרוז.
- הכן 50 μl של פתרון proteinase K לכל 1 מיליליטר של שבריר סוכרוז (37.5 μl 10% SDS, 0.5m 7.5 μl EDTA, μl Glycoblue 1, 4 μl של 20 מ"ג / מיליליטר proteinase K).
- ב 2 מיליליטר צינור תחתון שטוח, דגירה 1 מיליליטר שבריר סוכרוז עם 50 μl של פתרון proteinase K ב 55 מעלות צלזיוסעבור שעה 1 (אם באמצעות 500 שברים μl להתאים את עוצמת הקול של פתרון proteinase K בהתאם).
- הוסף נפח שווה של פנול: כלורופורם: אלכוהול Isoamyl (125: 24: 1, רצוי חומצי (pH 4.5) כדי למזער את זיהום DNA) לשברי סוכרוז.
הערה: הוספת 200 μl נוסף של כלורופורם לשברים 7-10 בגלל שהם כבדים יותר ושלבים יכולים לקבל הפוכים.
הערה: פנול / כלורופורם עלול לגרום לכוויות במגע ושאיפה. ללבוש חלוק מעבדה, משקפי בטיחות, ולהשתמש fumehood. - מערבולת ~ 30 שניות ו צנטריפוגות במהירות המרבית למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
- הסר ~ 80-90% משלב המימי (לא לגעת הביניים שיכולים להכיל הדנ"א הגנומי) ומקום בצינור חדש.
- הוסף נפח שווה של כלורופורם צעד וחזור על 8.4.
- הסר שלב המימי להיות זהיר, כדי למנוע הביניים.
- להוסיף 01:10 נפח של 3 M נתרן אצטט, pH 5.2 (לחלופין 5 אצטט M אמוניום יכול לשמש).
- להוסיף 1.5 כרכים של מצונן, absoluאתנול te ומערבולת במשך 15 שניות.
- לזרז לילה ב -20 ° C. (או שעה 1 ב -80 מעלות צלזיוס, אם בעומס).
הערה: ניתן להשאיר את הדגימות ב -20 ° C למשך זמן ארוך יותר במידת צורך. - צנטריפוגה במהירות המרבית למשך 30 דקות ב 4 ° C.
- שטוף את הכדור עם 1 מיליליטר של אתנול 70% RNase ללא מצונן.
- אוויר יבש גלולה וגלול ב-20 μl מים RNase חינם.
- לכמת RNA הכולל על ידי spectrophotometry כדי להבטיח תשואה וטוהר (המבוסס על A260 / 280 יחס) הולמות ולהמשיך לניתוח RT-qPCR הסטנדרטי 14 באמצעות כמויות שווה של כל חלק ופריימרים ספציפיים PCR לmRNA (ים) של עניין.
9. בידוד של חלבונים מברי סוכרוז.
- בנוסף ל- RNA, יכולים להיות מבודדים חלבונים וזיהו גם בשברי polysome בודדים. השתמש באחד פרוטוקולים רבים מעולים זמינים לבידוד חלבון, למשל 18.
Representative Results
יש לנו לאחרונה תיארתי תפקיד חדש למדכא גידול PDCD4 כמעכב תרגום סלקטיבי של IRES-מחסה mRNAs קידוד מעכבים אפופטוטיים XIAP וBcl-XL 12. פרופיל Polysome היה טכניקת מפתח כדי להדגים את המעורבות הספציפית של PDCD4 בתרגום תיווך IRES. HEK293 תאים היו transfected זמני לרוקן רמות אנדוגני של PDCD4 (איור 1 א), ואז העביר לpolysome ניתוח פרופיל. הבחנו כי רמות הפחתה של PDCD4 לא לפגוע בתרגום סלולארי הגלובלי, כמו להישפט על ידי חוסר השינויים בפרופיל polysome כאשר משווים siCTRL וsiPDCD4 תאים שטופלו (איור 1). באופן דומה, polysome הפצה של גרסה הלא-IRES של XIAP 19 הייתה ללא שינוי בין תאים שטופלו ולא טופלו (איור 1 ג '). בניגוד לכך, polysome הפצה של mRNAs שני IRES-מחסה, XIAP וBcl-XL, הייתה שונה באופן משמעותי. בהעדר PDCD4 ההפצה של שני mRNAs אלה מוסטת לribopolysomes הכבד (1D איור, E). מכיוון שזו אינה מלווה בשינויים ברמות מצב היציב של XIAP וBcl-XL mRNA (איור 1F) תוצאות אלו מראות משופרים תרגום של XIAP וBcl-XL בתאים עם רמות PDCD4 מופחתות, אשר אושר גם על ידי מערבי (איור סופג 1G).
איור 1:. פרופיל Polysome מזהה PDCD4 כמעכב סלקטיבי של תרגום XIAP וBcl-XL () טופלו HEK293 תאים עם PDCD4 siRNA או שליטה (CTRL), ללא מיקוד siRNA, lysed ונתון ניתוח כתם מערבי עם אנטי PDCD4 ונוגדנים נגד Nucleolin כדי לוודא את מידת PDCD4 לדפוק למטה. (ב) PDCD4 ופל כמו ב() וlysates התא היו נתונים לpolysome פרופיל. פרופיל polysome נציג מוצג בפנל העליון; חלוקת הלא IRES XIAP (C), Bcl-XL (ד '), וXIAP IRES (E) mRNAs ביחס לזה של GAPDH מוצג כאחוז מה- mRNA הכולל (% mRNA) בכל חלק. (F) יציב רמות ה- mRNA -state נמדדו על ידי RT-qPCR בPDCD4 siRNA או שליטה (CTRL) siRNA תאים שטופלו. (G) lysates מ (A) גם היו נתונים לניתוח כתם מערבי עם אנטי XIAP, אנטי-Bcl-XL, ו נוגדנים נגד Nucleolin. (NB. הנתונים המוצגים באיור 1 פורסם במקור ב -12) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
פרופיל Polysomal הוא טכניקה רבת עוצמה שמאפשרת כימות של מדינת תרגום של תמלילים מסוימים בתנאי טיפול שונים. זוהי טכניקה פשוטה מאוד באופן עקרוני ובכל זאת דורשת מספר שלבים של ביצוע, שחלקם הם קריטיים לייצור פרופילי polysome טובים. שלבים העיקריים אלה הם: 1) שימוש בכימיקלים וplasticware RNase חינם, 2) הכנה הדרגתיים סוכרוז טוב (הדרגתיים סוכרוז 10-50% בניסיון שלנו עובדים הכי טוב עבור יעילות פתרון 40 / 60S יחידות משנה וmRNAs עם ריבוזומים קשורים), ו- 3 ) תוך שימוש בתאים שגדלים באופן אקספוננציאלי ולא מחובר יותר מ -80% על מנת ללכוד את השיעור הגבוה ביותר של תרגום. צעד אחרון זה צריך להילקח בחשבון כאשר עושים טיפולי תא ארוכים, כגון מציאה גן או ביטוי יתר, כך שהסכום של תאים לצלחת יהיה פונקציה של כמה התאים יהיו מחוברים בנקודת הסיום.
בתוצאות presenטד כאן, polysome ניתוח הפרופיל היה כלי חשוב להערכת תפקיד PDCD4 בויסות התרגום של mRNAs XIAP וBcl-XL 12-מחסה IRES. העובדה שאנו לא צופים כל שינוי בפרופילי polysome הכלליים על PDCD4 לדפוק למטה (איור 1) אפשרה לנו להגיע למסקנה כי PDCD4 לא לפגוע בתרגום סלולארי הגלובלי בתנאים של הניסוי. אנחנו הבאים עשינו שימוש בניתוח RT-qPCR כדי לקבוע את חלוקת XIAP וBcl-XL mRNAs בתאים שטופלו עם PDCD4 או siRNAs שליטה. qPCR הוא שיטת בחירה של ניתוח פרופילי polysome, בניגוד לסטנדרטי RT-PCR או סופג צפון, משום שהוא מאפשר ללא כמו ניתוח חצי כמותית של הפצת mRNA ולגילוי שינויים דקים בtranslational יעילות בין טיפולים. השימוש בטכניקה זו, הצלחנו להראות כי ההפצה של mRNAs Bcl-XL XIAP ו( כאחוז מכלל mRNA היעד על פני גרadient) היה עבר בצורה משמעותית לpolyribosomes הכבד (mRNAs עם מספר גדול של ריבוזומים הקשורים בם) לאחר PDCD4 לדפוק למטה (1D איור, E), וכך מצביעה על עלייה בתרגום של mRNAs אלה. זה אושר גם על ידי עלייה ברמות חלבון XIAP וBcl-XL אבל לא ברמות RNA המצב היציב שלהם (איור 1F, G). חשוב לציין, הפצת polysome של הגרסה הלא-IRES של XIAP הייתה ללא שינוי בין תאים שטופלו ולא טופלו (איור 1 ג '). לחלופין, יעילות translational יכולה להיות מוצגת כיחס בין תוכן mRNA בpolysomes (בדרך כלל שברי 5 עד 10) לעומת monosomes (בדרך כלל שברים 2 עד 4) 14.
השימוש בבקרות בכל הפרוטוקול חשוב באימות כל polysome פרופיל תוצאה, כפי שניתן לא בכוחות עצמם לייחס פסגות שנצפו מקריאות ספיגה ב 254 ננומטר ל- RNA ריבוזומלי (חומר ניקוישל, כגון טריטון X-100 מאוד לספוג באזור זה של הספקטרום ועלול לטשטש 40 / 60S פסגות בחלק העליון של השיפוע). מילויים ריקים ללא lysate ו / או עם חיץ lysate צריכים להפעיל כדי לקבוע את תרומתו היחסית של המאגרים לספיגה ב 254 ננומטר. Artefactual מבנים מסדר גבוהים יותר גם יכולים להוביל לפרשנות מוטעה של polysomes שבו יש באף עובדה (לדוגמא "פסאודו-polysomes" 20). Sequestering מגנזיום (המשמש בכל ההליך כדי לייצב 80S ריבוזומים) עם EDTA chelator קטיון דו הערכי הוסיף לlysates ולמאגר שהשיפוע (20 מ"מ במשך 15 דקות) יגרום הפרדה של הריבוזום לקטן (40S) המרכיב אותה וגדול (60S תת-יחידות). לכן, אם פסגות ספיגה נרשמו ב 260 ננומטר הן אכן polysomes, טיפול EDTA יקרוס הפרופיל כזה שמקסימום יחיד יהיה שנצפה בחלק העליון של שיפוע המתאים לשחרור ה- mRNA ויחידות ריבוזומלי (מידע לא מוצג). ביחדעם קריסה מושרה EDTA של הפרופיל, כל המטרות הספציפיות נותחו על ידי qPCR צריך להימצא כעת בחלק העליון של השיפוע.
מספר ריבוזומים הקשורים mRNA הוא לא תמיד אינדיקציה למידת היעילות שmRNA מסוים מתורגם. ואכן, יש הקשרים ספציפיים שבו תרגום פעיל בpolysomes הופך תקוע 21,22 שהקורא צריך להיות מודע. קביעה אם או לא תמלילים עוסקים באופן פעיל עם מכונות התרגום יכולים להיעשות על ידי) טיפול במדגם עם puromycin, שלא כמו EDTA, גורם ל'ניגר 'של ריבוזומים שבאופן פעיל translocating פני mRNA, או ב) טיפול במדגם עם homoharringtonine אשר מעכב טרנסלוקציה של הריבוזום הראשון רק בקודון ההתחלה, שוב גורם ל'ניגר 'של כל ריבוזומים translocating במורד הזרם.
השימוש בתמלילי שליטה לניתוח qPCR הוא גם קריטי. אין התמיכה בבחירהtion של תמלילים שאינם מושפעים מהתנאים טיפול שונים, כגון גנים מסוימים במשק בית (GAPDH, אקטין, טובולין, Nucleolin), mRNAs ריבוזומלי (18S, RPL13A) או במקרה זה גרסה הלא-IRES של IRES XIAP, הוא חשוב ב האימות אם ההשפעה של הטיפול על תרגום היא ספציפית או כללי. תמלילי שליטה אלה יכולים לשמש כדי לנרמל את ההפצה של mRNAs ניתח כפי שנעשה כאן (mRNAs XIAP וBcl-XL היה מנורמל GAPDH mRNA ומבוטא באחוזים מכלל תוכן mRNA המיוצגים בסכום של תוכן mRNA בכל שבריר ) או לחלופין, יכול לבוא לידי ביטוי mRNAs היעד והשליטה כערכים מוחלטים ומוצג בנפרד. ניתוח qPCR של lysates הקלט (בדרך כלל 10% מנפח כולל) הוא צעד נוסף שישלוט על חלוקת mRNAs הספציפי. באופן אידיאלי, תוכן mRNA של תמליל ספציפי בlysate הקלט צריך להיות דומה לסכום של תוכן mRNA בכל 10 הברים ניתחו. לבסוף, צעד אופציונאלי לשליטה לפנול: שלב חילוץ כלורופורם הוא ספייק כל חלק polysome עם במבחנה mRNA כתב עיבד (כגון CAT, אצטיל כלורמפניקול transferase) שניתן לכמת בהמשך על ידי qPCR ויכול גם לשמש כדי לנרמל 14 נתונים.
כמו בכל טכניקה, פרופיל polysome מציג כמה מגבלות. העובדה שבדרך כלל מינימום של 10 שברים (משמרות עדינות יותר ביעילות תרגום עשויה לדרוש יותר או 20) צריכה להיות שנאספו על מנת לקבל הפצות polysome נחמדה עושה את הצעד הזה הגבלה, במובן זה שרק למקסימום של 4 דגימות יכול להיות ניתח בכל פעם כדי שתוכל לטפל בנוחות מיצוי RNA וניתוח qPCR של 40 דגימות ובקרת 4 קלט בבת אחת. גודל המדגם יכול בקלות להוסיף עם כמה תמלילים להיות מנותחים וכמה qPCR משכפל לעשות, וזה יכול להיות יקר. מגבלה נוספת של פרופיל polysomal מבוסס qPCRnalysis הוא שזה יכול להיעשות רק על גישה מבוססת מועמד (שבו התמלילים להיות מנותחות ידועים מראש) ולא יכולים להיות מיושמים לניתוח הגנום של תרגום. עם זאת, בתחילת המאה ה -21, חוקרים החלו לחקור RNA polysomal שלהם ברמה גנומית באמצעות DNA microarrays 15 ולאחרונה עם רצף של הדור הבא 16,17. בגישה זו עוצמה, פרופיל polysomal מתבצע כפי שתואר בפרוטוקול זה אלא שבמקום לבצע ניתוח qPCR של שברים בודדים, monosomes שברים (בדרך כלל חלק 2-4) וpolysomes שברים (בדרך כלל שברים) הם אספו יחד ושינויים בתרגום העולמי נתח על ידי מערך DNA או RNA רצף הגנום. מכאן עם גישה זו, ניתן להעריך את כל mRNAs הפצה שמשמרות מpolysomes לmonosomes (ירידה בתרגום) או להיפך (עלייה בתרגום) על טיפול ספציפיment. אימות וכימות הפצת polysomes mRNA ספציפית אז יכולים להיעשות על ידי qPCR. שימוש אפילו יותר חזק של עיקרון פרופיל polysomal הוא פרופיל הריבוזום. הארכת תפוקה גבוהה נוספת של טכניקה זו דווחה לאחרונה, המאפשרת ניטור בו-זמני של מאות polysome שברים 23. זה מספק יתרון ברור כאשר חיטוט יעילות translational של אוספי מוטציה או במסכי RNAi בקנה מידה גדולה. פרופיל הריבוזום הוא טכניקה שמנצלת רצף של הדור הבא למפה שברי RNA מוגנים על ידי ריבוזומים (עקבות הריבוזום) העוסקים בסינתזה של חלבוני 24,25. בטכניקה זו, טרנסלוקציה הריבוזום יכולה להיות מעוכבת עם cycloheximide (הפיך) או emetine (בלתי הפיך) ואחריו תמוגה תא ועיכול RNase להניב אוכלוסייה של עקבות הריבוזום. הריבוזומים מועשרים, RNA הכולל מבודד, וריבוזומלי זיהום וRNA ריבוזומלי המיטוכונדריה מוסר.עקבות RNA של כ 26-28 נוקלאוטידים מבודדות, הפוך עיבד, הפך לספריית cDNA והרצף 26. בניגוד לפרופיל polysome סטנדרטי, גישה זו לא רק מזהה mRNAs הספציפי שמוסדרים translationally אלא גם מניבה מידע mRNA הספציפי ברזולוציה קודון כגון כיבוש המדויק וצפיפות של ריבוזומים לאורך תמליל ספציפי. זה מעניין בעיקר לmRNAs עם מצבים ספציפיים של תרגום כגון mRNAs IRES-מחסה, כפי שהוא יכול לתת מידע נוסף על מיקום בהריבוזומים לגיוס התמליל מתרחש.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gradient Master 108 automated gradient maker | BIOCOMP | 107-201M | |
| Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker | LABCONCO | 4517000 | |
| Beckman Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Model # L-100-XP | |
| Density gradient fractionator | TELEDYNE ISCO | 69-3873-246 | Composed of: tube piercing system, peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280 nm filters and Foxy R1 Fraction Collector |
| WinDaq data acquisition software | DATAQ INSTRUMENTS | WINDAQ/LITE | http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm |
| Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 331372 | |
| Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose) | DiaMed | PRE1900-N | |
| Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom) | SafeSeal | 12000 | |
| Sucrose (nucleases-free) | Calbiochem | 573113 | MW = 342.3 g/mol |
| Cycloheximide | SIGMA | C7698 | MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing. |
| Sodium chloride (nucleases-free) | OmniPur | 7710 | MW = 58.44 g/mol |
| MgCl2.6H2O (nucleases-free) | OmniPur | 5980 | MW = 203.3 g/mol |
| Tris Base (nucleases-free) | J.T. Baker | 4109-01 | MW = 121.14 g/mol |
| Triton X-100 | OmniPur | 9400 | Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation |
| Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2515 | |
| RNaseZap Rnase inactivation solution | Ambion, Life Technologies | AM9780 | |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml) | Invitrogen, Life Technologies | AM9516 | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Ambion, Life Technologies | AM9722 | Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
- Tscherne, J. S., Pestka, S. Inhibition of protein synthesis in intact HeLa cells. Antimicrob Agents Chemother. 8 (4), 479-487 (1975).
- Damgaard, C. K., Lykke-Andersen, J. Translational coregulation of 5'TOP mRNAs by TIA-1 and TIAR. Genes Dev. 25 (19), 2057-2068 (2011).
- Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
- McKinney, C., et al. Global reprogramming of the cellular translational landscape facilitates cytomegalovirus replication. Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2014).
- Jivotovskaya, A. V., Valasek, L., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. Eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) and eIF2 can promote mRNA binding to 40S subunits independently of eIF4G in yeast. Mol Cell Biol. 26 (4), 1355-1372 (2006).
- Gross, J. D., et al. Ribosome Loading onto the mRNA Cap Is Driven by Conformational Coupling between eIF4G and eIF4E. Cell. 115 (6), 739-750 (2003).
- Graber, T. E., Baird, S. D., Kao, P. N., Mathews, M. B., Holcik, M. NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response. Cell Death Differ. 17 (4), 719-729 (2010).
- Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. E. Re-programming of translation following cell stress allows IRES-mediated translation to predominate. Biol Cell. 100 (1), 27-38 (2008).
- Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).
- Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
- Occhi, G., et al. A novel mutation in the upstream open reading frame of the CDKN1B gene causes a MEN4 phenotype. PLoS Genet. 9 (3), (2013).
- Faye, M. D., et al. Nucleotide composition of cellular internal ribosome entry sites defines dependence on NF45 and predicts a posttranscriptional mitotic regulon. Mol Cell Biol. 33 (2), 307-318 (2013).
- Zong, Q., Schummer, M., Hood, L., Messenger Morris, D. R. RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (19), 10632-10636 (1999).
- Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biol. 14 (11), (2013).
- Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9818-9823 (2013).
- Corbin, F., et al. The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes. Hum Mol Genet. 6 (9), 1465-1472 (1997).
- Riley, A., Jordan, L. E., Holcik, M. Distinct 5' UTRs regulate XIAP expression under normal growth conditions and during cellular stress. Nucleic Acids Res. 38 (14), 4665-4674 (2010).
- Thermann, R., Hentze, M. W. Drosophila miR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation. Nature. 447 (7146), 875-878 (2007).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Graber, T. E., et al. Reactivation of stalled polyribosomes in synaptic plasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16205-16210 (2013).
- Wang, Y., Ringquist, S., Cho, A. H., Rondeau, G., Welsh, J.
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
