Introduction
El sulfato de dextrano (DS) y quitosano (CS) son polisacáridos con múltiples grupos sulfato cargados negativamente sustituidos (en DS), o grupos amino cargados positivamente (desacetilado CS). Cuando se mezcla en una solución acuosa, los dos polisacáridos forman complejos de polielectrolitos a través de interacciones electrostáticas. Los complejos resultantes pueden formar grandes agregados que se separación de fases de la solución acuosa (precipitados), o pequeñas partículas que son dispersables en agua (coloides). Las condiciones específicas que contribuyen a estos resultados han sido ampliamente estudiados, y se han resumido y se ilustra en detalle en una reciente revisión 1. Entre estas condiciones, dos requisitos básicos para la producción de partículas dispersables en agua son los polímeros de carga opuesta deben 1) tienen significativamente diferente masa molar; y 2) ser mezclado en una relación no estequiométrica. Estas condiciones permitirán que los segmentos poliméricos acomplejados carga neutra generados por la carganeutralización para segregar y forman el núcleo de la partícula, y el exceso de polímero para formar la cubierta exterior 1. Las partículas de glicanos descritos en este protocolo se pretende para la administración pulmonar, y están diseñados para ser neta de carga negativa, y de dimensiones nanométricas. La carga superficial negativa reduce la probabilidad de la captación celular de las partículas de 2,3. Las partículas de dimensión nanométrica facilitan el paso a través de las vías respiratorias distales. Para lograr este objetivo, la cantidad de DS utilizado en esta preparación es en exceso de CS (relación en peso 3: 1); y de alto peso molecular-DS (promedio en peso MW 500.000) y de bajo peso molecular CS (rango MW 50-190 kDa, 75-85% desacetilado) se utilizan.
SDF-1α es un factor homing de células madre, que ejerce la función de toma de referencia a través de su actividad quimiotáctica. SDF-1α juega un papel importante en homing y mantenimiento de las células madre hematopoyéticas en la médula ósea, y en el reclutamiento de progecélulas NITOR a los tejidos periféricos a 4,5 reparación de lesiones. SDF-1α tiene un sitio de unión a heparina en su secuencia de la proteína, que permite que la proteína se une a la heparina / heparán sulfato, formar dímeros, ser protegido de la proteasa (CD26 / DPPIV) inactivación, e interactuar con las células diana a través de los receptores de la superficie celular 6-8. DS tiene propiedades estructurales similares a la heparina / heparán sulfato; Por lo tanto, la unión de SDF-1α a DS sería similar a la de sus ligandos poliméricos naturales.
En el siguiente protocolo, se describe la preparación de nanopartículas SDF-1α-DS-CS. Los procedimientos representan una de las formulaciones que se han estudiado previamente 9. El protocolo está adaptado originalmente de una investigación de nanopartículas de VEGF-DS-CS 10. Una preparación a pequeña escala se describe, que se puede escalar fácilmente con las mismas soluciones madre y condiciones de preparación. Después de la preparación, las partículas se caracterizan by el examen de su tamaño, el potencial zeta, grado de incorporación SDF-1α, in vitro tiempo de liberación, y la actividad de la SDF-1α incorporado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparación de SDF-1α Glycan Nanopartículas
Debido a los efectos de la administración in vivo, esterilizar todos los recipientes, pipetas y puntas utilizadas en la preparación.
- Preparar las siguientes soluciones madre en agua ultrapura: sulfato de dextrano al 1%; 1 M NaOH (esterilizada por filtración con una membrana de PES); 0,1% de quitosano en 0,2% de ácido acético glacial (filtro a través del 0,8 y 0,22 micras filtros consecutivos y ajustar el pH a 5,5 con NaOH después); 0,1 M ZnSO 4; 15% de manitol; y 0,92 mg / ml SDF-1α (almacenado en alícuotas a 80 ° C, y se mantiene a 4 ° C una vez descongelados).
- Esterilizar soluciones madre a través de 0,22 micras membranas de filtro. Evaluar los niveles de endotoxina en la solución preparada con el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) coágulo de gel. Asegúrese de que los niveles son <0,06 UE / ml.
- Añadir 0,18 ml de agua ultrapura a un vial de vidrio de 1,5 ml que contenía una barra de agitación magnética. Ajuste la velocidad de agitación a 800 rpm. Añadir 0,1 ml 1%sulfato de dextrano y se agita durante 2 min. Añadir 0,08 mg SDF-1α (0,087 ml de 0,92 mg / ml SDF-1α solución) y se agita durante 20 min.
- Añadir 0,33 ml 0,1% gota a gota quitosano y se agita durante 5 min. Cambiar la velocidad de agitación al máximo y añadir 0,1 ml 0,1 M ZnSO4 lentamente con una jeringa 0,1 ml (más de 1 min).
- Volver velocidad de agitación a 800 rpm y agitar durante 30 min. Añadir 0,4 ml 15% de manitol y se agita durante 5 min. Transferir la mezcla de reacción a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar a 16.000 xg a 4 ° C durante 10 min.
Nota: La presencia de manitol facilita la resuspensión de las partículas después de la centrifugación. Dependiendo de la compacidad de la pastilla, la concentración de manitol puede variar de 0% a 5%. La resuspensión completa de las partículas después de cada centrifugación es crítico para evitar los agregados en la suspensión final. - Aspirar el sobrenadante y utilizar una pipeta para extraer la última gota de líquido lentamente. Añadir 0,2 ml 5% de manitol. Suspender el pellet con 0,5 ml, 29 G neejeringa dle. Añadir 1 ml de manitol al 5%. Centrifugar a 16000 xg durante 15 min.
- Repita el paso 1.6.
- Aspirar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 0,2 ml 5% de manitol. Guarde la suspensión de partículas a 4 ° C.
Nota: La suspensión de partículas también puede ser almacenado congelado a -80 ° C o liofilizado. Incluyendo manitol 5% en la suspensión es esencial para evitar la agregación de las partículas después de la congelación y descongelación o después de la liofilización y la rehidratación. El manitol se puede eliminar por centrifugación de la suspensión después de que el almacenamiento.
2. Medición de tamaño de partícula y Potencial Zeta
El tamaño de partícula y el potencial zeta se analizan mediante dispersión de luz dinámica y dispersión de luz electroforética, respectivamente, con un analizador de partículas se indica en la Lista de Materiales.
- Ajuste los siguientes parámetros para la medición del tamaño de partícula: tiempos de acumulación: 70; Repetir las veces: 4; Temperatura: 25 ° C;Diluyente: agua; Ajuste de intensidad: auto.
- Diluir la muestra SDF-1α-DS-CS con agua (dilución de 10 veces). Carga de 100 l de la muestra a una cubeta UV desechable tal como una cubeta de Eppendorf. Inserte la cubeta en el soporte de la celda. Espere a que el ajuste de la intensidad de alcanzar "óptimo" (~ 10.000 cps). Iniciar la adquisición de datos.
- Después de que se ha completado la medición, registrar los resultados de cumulantes diámetro (nm) y el índice de polidispersidad. Media de los resultados obtenidos a partir de cada uno de los 4 lecturas repetidas y calcular la desviación estándar.
- Carga de 500 l de la muestra de partículas diluida 10 veces a una celda de flujo para la medición de potencial zeta. Ajuste los siguientes parámetros para la medición: los tiempos de acumulación: 10; Repetir las veces: 5; Temperatura: 25 ° C; Diluyente: agua; Ajuste de intensidad: auto. Registre los resultados del potencial zeta (mV). La media de los resultados obtenidos a partir de cada una de las 5 lecturas repetidas, y calcular el deviatio estándarn.
3. Cuantificación de SDF-1α en las Partículas
- Diluir de forma libre SDF-1α a concentraciones de 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, y 0,05 mg / ml en tampón de muestra Laemmli 1,3x. Diluir 6 mu l muestras SDF-1α-DS-CS con 40 l 1.3x tampón de muestra Laemmli. (4x Preparar tampón de Laemmli madre que contiene 0,25 M Tris-HCl, pH 7,5, 8% de SDS, 40% de glicerol, 0,05 mg / ml de azul de bromofenol, y 8% de 2-mercaptoetanol. Dividir la solución madre en pequeñas alícuotas y mantenerla en -20 ° C para uso individual.)
- Calentar las muestras a 100 ° C durante 10 min. Vortex las muestras dos veces (cada uno durante 10 segundos a velocidad máxima) durante el tiempo de calentamiento 10 min con el fin de disociar las partículas completamente. Enfriar las muestras a temperatura ambiente durante 2 min. Se centrifuga a 10.000 xg durante 0,5-1 min para reducir el agua de condensación. Vortex de nuevo para mezclar bien.
Nota: En este punto, la solución de la muestra debe ser clara sin visible precipitado presente. - Carga 10 y# 181; l muestra / pocillo de un gel SDS 4-20%. Ejecutar la electroforesis a 200 V durante 20 min. Teñir el gel con Coomassie proteína mancha azul.
- Examine la densidad de banda de proteína de SDF-1α usando un generador de imágenes y análisis de densitometría software molecular. Calcular la cantidad de SDF-1α en las partículas frente a una curva patrón construida con las normas SDF-1α libres.
4. In Vitro Ensayo de liberación
- Mezclar partículas de glicano SDF-1α con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin calcio y magnesio (D-PBS) a una proporción de 1: 1 (v / v).
- Divida la suspensión de partículas en 0,05 ml alícuotas en tubos de 1,5 ml. Cargar las muestras a la parte inferior de los tubos. Evitar la introducción de burbujas de aire o alterar la superficie del líquido. Selle la parte superior de los tubos con Parafilm.
NOTA: Al hacer esto, el líquido se mantendrá en la parte inferior durante la rotación de arriba a abajo posterior en el mezclador tubo. - Gire los tubos a 37 y# 176; C en un mezclador giratorio de Micro-Tube. Retire las alícuotas de a las horas designadas y centrifugar inmediatamente las muestras a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Separar los sobrenadantes y pellets, y reconstituir el pellet con 0,05 ml D-PBS. Almacenar las muestras a -20 ° C. Después se recogen todas las muestras, examinar los sobrenadantes y pellets en un gel de SDS como se describió anteriormente.
5. Ensayo de Migración
Este ensayo mide la actividad quimiotáctica de SDF-1α. Interacción de SDF-1α con su receptor (CXCR4) en la superficie celular provoca la migración de la célula hacia el gradiente de SDF-1α. En este ensayo, las células se cargan en un pozo superior (separados por una membrana semipermeable desde un pocillo inferior) solución y SDF-1α en un pocillo inferior.
- Diluir SDF-1α (libre o unido a partículas formulario) con tampón de migración (medio RPMI-1640 que contiene 0,5% de albúmina de suero bovino) en un 3-fodilución en serie ld a concentraciones finales de 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,41, 0,14, y 0,05 ng / ml.
- Añadir 0,6 ml de la solución de SDF-1α diluido o tampón de migración sólo (control negativo) a un pocillo de la placa de 24 pocillos. Añadir 0,57 ml de tampón de migración a un pozo (control celda de entrada). Incubar a 37 ° C durante 30 min. Coloque un inserto de cultivo celular permeable tales como Transwell (tamaño de poro 5 m, diámetro 6,5 mm) en la parte superior de la inferior también. Cargar 0,1 ml células Jurkat (5 × 10 5) en la Transwell insertan. Cargar 0,03 ml células directamente al control de celda de entrada también. Incubar la placa a 37 ° C durante 2 horas en una incubadora de CO2 al 5%.
- Quite los insertos Transwell. Transferencia de las células que han migrado a los pocillos inferiores a un tubo de poliestireno de 4 ml. Contar las células migraron con un citómetro de flujo.
- Calcular la migración como un porcentaje del número de células de entrada (el número de células en el control de células de entrada bien x 100/30) después de la sustracción de los números en negative controles (células migradas a los pocillos que contienen sólo tampón de migración).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El tamaño y el potencial zeta de las partículas de SDF-1α-DS-CS preparados se determinó con un analizador de partículas. La figura 1 muestra el análisis de la medida del tamaño. De los resultados obtenidos a partir de cumulantes cuatro mediciones repetidas, el diámetro hidrodinámico medio de las partículas SDF-1α-DS-CS es 661 ± 8,2 (nm) y la polidispersidad es de 0,23 ± 0,02. El resultado de la medición del potencial zeta se muestra en la Figura 2. De los cinco mediciones repetidas, el potencial zeta de las partículas de SDF-1α-DS-CS es -24,8 ± 0,5 mV. Como se mencionó anteriormente, la presencia de 5% de manitol en la suspensión de partículas SDF-1α-DS-CS es esencial para la prevención de la agregación de partículas durante un proceso de congelación y descongelación. La Figura 3 muestra la medida del tamaño de las partículas suspendidas en el agua y se congeló a -80 ° C. Un pico de agregación distinta es visible después de la descongelación.
El amount de SDF-1α en las partículas de SDF-1α-DS-CS se estima por electroforesis en gel de SDS. Figura 4A muestra un gel SDS teñido de azul de Coomassie con las normas-SDF 1α, DS-CS de nanopartículas (partículas de control sin incorporación SDF-1α , Ctrl NP) y SDF-1α-DS-CS de nanopartículas (SDF-1α NP) muestras cargadas. Una curva estándar se construye a partir del análisis de la densidad de las bandas estándar SDF-1α (Figura 4B). Cálculo de la curva estándar indica que la concentración de SDF-1α en la muestra SDF-1α NP es 0,03 mg / ml (media de duplicados). Desde la dilución de la muestra con el tampón de muestra es (6 + 40) / 6, la concentración de la muestra original es 0,23 mg / ml. Como el volumen final de la preparación de partículas es de 0,2 ml, SDF-1α total en la suspensión final es 0,046 mg. Teniendo en cuenta la masa de entrada del SDF-1α en la mezcla de reacción es 0,08 mg, la eficacia de captura de SDF-1α en las partículas DS-CS es 57%. ValeOsan se ha informado anteriormente para teñir con azul de Coomassie. La tinción, sin embargo, no es significativo en el gel se muestra en la Figura 4A. Es, tal vez, relacionada con la cantidad de quitosano (matriz de partículas) cargada en el gel. En cualquier caso, una disociación completa y la separación de SDF-1α de la matriz de partículas sea necesaria para valorar con precisión la cantidad de la proteína incorporada. Este gel también muestra que SDF-1α no se degrada de forma detectable por calentamiento a 100 ° C durante 10 min o por el proceso de vórtice, como no hay bandas se encuentran entre la banda de proteína SDF-1α y el frente de colorante.
La velocidad de liberación in vitro de SDF-1α de las nanopartículas se determina por incubación de las partículas en 50% de D-PBS a 37 ° C durante 7 días. A las 0 horas, 3 horas, 8 horas, 24 horas, 48 horas y 7 días, alícuotas de las muestras se retiran e inmediatamente se centrifuga. El SDF-1α liberado (en el sobrenadante) se separa de la SD unido a partículasF-1α (pellet). Las muestras se ejecutan en un gel de SDS, y la cantidad de SDF-1α en los sobrenadantes y los pellets se determinan por la tinción de Coomassie y análisis de densitometría. Un gel de SDS típica del análisis se muestra en la Figura 5. Como se ha demostrado, la partícula unida SDF-1α se libera mínimamente después de una incubación de 7 días.
La actividad de la SDF-1α unido a partículas se mide mediante un ensayo de migración (ensayo de quimiotaxis), y en comparación con la de libre SDF-1α. En este ensayo, SDF-1α en las nanopartículas DS-CS se diluye en serie con un tampón de migración, y se incubó con células Jurkat durante 2 horas. Las células migradas se cuentan con un citómetro de flujo. Los datos (con concentraciones de SDF-1α de 0,05 a 11 ng / ml) se representan con la regresión no lineal de ajuste, y la CE 50 se calcula. Como se muestra en la Figura 6, el SDF-1α unido a partículas inducida en la misma medida de la migración como la de libre de SDF-1 ^5; en todas las concentraciones medido. Los valores de EC50 de las formas libres y ligados a las partículas de SDF-1α son 0,55 y 0,45 ng / ml, respectivamente.
Figura 1. Pantalla de Análisis de tiro que muestra medición dinámica de dispersión de luz del tamaño de las partículas. Los dos paneles superiores muestran las gráficas de la función de autocorrelación, G2 (τ), y logaritmo de [G2 (τ) -1] a través del tiempo. Procesador de señal digital del instrumento (correlador) expresa la intensidad de la luz detectada como una función de tiempo de retardo (τ). El gráfico muestra que las partículas SDF-1α-DS-CS causaron un decaimiento exponencial de la intensidad entre 0,2 a 2 ms. Para obtener la constante de desintegración media <Γ>
Figura 2. Análisis pantalla disparo que muestra la dispersión de luz electroforéticamedición del potencial zeta de partículas. El panel superior muestra un G2 (τ) con el tiempo parcela. La función oscilante descomposición gradualmente se observa típicamente en partículas cargadas que se someten a electroforesis y dispersión de luz. La función refleja el desplazamiento de frecuencia (desplazamiento Doppler) causada por las partículas que se mueven en el campo eléctrico. Una transformación de Fourier de G2 (τ) da el espectro de potencia (intensidad vs. gráfico de frecuencia) que se muestra en el panel central. El centro del pico de desplazamiento de frecuencia define la movilidad de las partículas, de la que se calcula el potencial zeta. El potencial zeta calculado se muestra en la parte inferior de la pantalla.
Figura 3. Partículas medida del tamaño de SDF-1 partículas α-DS-CS después de la congelación y descongelación en agua. En ausencia de manitol, las partículas forman agagrega- después de la congelación y descongelación. Tenga en cuenta la formación de una intensidad de pico adicional / tamaño y el aumento de cumulantes diámetro y la polidispersidad en comparación con la de la Figura 1.
Figura 4. Cuantificación de la SDF-1 α incorporación en nanopartículas DS-CS. (A) Fotografía de teñido con Coomassie gel SDS cargado con las normas SDF-1α libres, DS-CS de nanopartículas (Ctrl NP), y SDF-1α-DS- CS nanopartícula (SDF-1α NP) muestras como se indica. Las bandas de proteína-1α y SDF funcionamiento el gel colorante frontal están marcados. Las muestras Ctrl NP no se tiñeron con azul de Coomassie y las bandas de quitosano (ancho) son vagamente visible. (B) Las bandas se analizaron con un densitómetro, a partir del cual la curva estándar se construye con las normas SDF-1α libres (promedio de Duplicate). La cantidad de SDF-1α en las nanopartículas se calcula en contra de la curva estándar, lo que da un valor medio de 0,3 mg / pocillo (10 l).
Figura 5. gel de SDS que muestra SDF-1 α in vitro curso de tiempo de liberación. Coomassie manchado de gel SDS muestra la cantidad liberada de SDF-1α (en sobrenadantes) y unido SDF-1α (en gránulos) después de la incubación de SDF-1α-DS nanopartículas -CS a 37 ° C durante diversos períodos de tiempo. Re-impreso con el permiso de 9.
Figura 6. Las curvas de dosis-respuesta de SDF-1 α (círculos) y de nanopartículas SDF-1α (NP) (cuadrados) en un ensayo de migración de células Jurkat. SDF-1α en tanto libre y de nanopartículas con destino aMS mostró la misma actividad con valores de EC50 de 0,55 y 0,45 ng / ml, respectivamente. Re-impreso con el permiso de 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Como se mencionó anteriormente, las nanopartículas DS-CS se forman a través de neutralización de la carga entre el polianión (DS) y policatión (CS) moléculas. Dado que la interacción de carga se produce fácilmente durante la colisión molecular, la concentración de las soluciones de polímero y la velocidad de agitación durante la mezcla es crítica para el tamaño de las partículas resultantes. Una tendencia general es que las soluciones de DS y CS 15 y mayor resultado velocidad de agitación en partículas más pequeñas más diluido.
La formulación de las nanopartículas de glicano SDF-1α se puede variar. Por ejemplo, las cantidades y proporciones de SDF-1α / DS / CS utilizados en este protocolo son 0,08 / 0,33 / 1 (mg / mg / mg), respectivamente. Dependiendo del uso previsto de las nanopartículas SDF-1α, estas relaciones pueden cambiar. Si la cantidad de SDF-1α añadió a la mezcla es de 0,04 mg (0,04 / 0,33 / 1, mg / mg / mg) en lugar de 0,08 mg, las partículas serán menores, ~ 650 nm, y la eficiencia de atrapamiento SDF-1α ligeramente greater, 70-80% 9. Sin embargo, cuando se entrega in vivo, una mayor cantidad de la matriz de glicano estará presente por SDF-1α. Si se desea un tamaño de partícula menor, la formulación de nanopartículas de glicano-1α SDF puede ser modificado adicionalmente. Una alternativa es utilizar un quitosano menor peso molecular, como se demuestra en Ref 15. Cabe señalar, sin embargo, que el quitosano tiene una alta afinidad por endotoxina (cargado negativamente lipopolisacáridos); por lo tanto, una prueba de nivel de endotoxina o potencialmente una purificación es necesaria para el uso de cualquier producto de quitosano antes de la entrega in vivo. La segunda alternativa es cargar SDF-1α en pre-formadas pequeñas nanopartículas DS-CS. Puesto que este último se puede manipular más fácilmente en tamaño de partícula y SDF-1α tiene una alta afinidad por DS, la carga de una pequeña cantidad de SDF-1α a la cubierta exterior de las partículas de DS-CS puede resultar en partículas más pequeñas.
En comparación con otros tipos denanopartículas (por ejemplo, PLGA 11, 12 polianhídrido, o gelatina nanopartículas 13), las nanopartículas DS-CS tienen ventajas y limitaciones particulares. Las principales ventajas de las nanopartículas DS-CS son: 1) la preparación de partículas no implica disolventes orgánicos o sonicación vigorosa. Es, por lo tanto, adecuado para el factor de proteína de la incorporación, como la preparación suave reduce la probabilidad de la inactivación de proteínas; 2) la matriz de las partículas tiene una propiedad estructural similar a la matriz extracelular, lo que hace que las partículas compatibles con el medio ambiente del tejido y es menos tóxico e inflamatorio; y 3) imita SDF-1α glicanos ligados a las partículas una relación de unión natural entre la proteína y la matriz extracelular, lo que explica la actividad quimiotáctica completa de SDF-1α después de haber sido incorporado en las partículas de glicanos. El SDF-1α completamente activo en forma de partículas unido le permite servir como un factor homing estacionaria en el tejido embiente. Las limitaciones de las nanopartículas DS-CS son: 1) los diámetros de las partículas son generalmente mayores que las partículas mencionadas anteriormente; y 2) colapsar fácilmente en soluciones salinas, que pueden no ser adecuados para la inyección directa en la circulación sanguínea.
El SDF-1α unido a partículas se encuentra para ser lanzado mínimamente de las nanopartículas después de una incubación de siete días. Este fenómeno está relacionado con la alta afinidad de SDF-1α para la heparina, que también contribuye a su función in vivo. Dado que las proteínas con dominios de unión a heparina generalmente tendrán diferentes afinidades para la heparina, sus velocidades de liberación probablemente diferirán. Por ejemplo, en un VEGF 165-DS-CS nanopartícula prepara en una formulación similar, el 44% de la VEGF incorporado 165 fue lanzado en la primera hora y el 29% fue lanzado en la próxima 47 horas durante la incubación a 37 ° C 14. Por lo tanto, el patrón de liberación in vitro para una prot específicaein necesita ser probado individualmente.
El propósito de la preparación de las nanopartículas SDF-1α-DS-CS es entregar SDF-1α en el pulmón y establecer una señal de homing de células madre en el tejido. Las partículas también pueden ser entregados a otros tejidos para el mismo propósito, aunque el formato de nanopartículas específica no es necesaria para la inyección de tejido sólido. El hecho de que SDF-1α se estabiliza por DS en la matriz de nanopartículas y se libera mínimamente de las partículas apoya madre principios de reclutamiento celular, y se espera que la partícula que es beneficioso para la regeneración de tejidos.
Dado que las nanopartículas de proteínas-glicano tienen una matriz similar a la de los glicosaminoglicanos de la superficie celular y la matriz extracelular, es posible que las proteínas incorporadas partículas se pueden intercambiar en estas matrices (Las moléculas de la matriz extracelular cargados negativamente pueden competir con la unión de la positivamente proteína cargada) en vivo caracterización in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por becas del NIH: HL671795, HL048743 y HL108630.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran sulfate | Fisher | BP1585-100 | |
| Chitosan, low molecular weight | Sigma | 448869 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | 204986 | |
| D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
| UltraPure water | Invitrogen | 10977-023 | |
| SDF-1α | Prepared according to reference 8. | ||
| Syringe filter, PES membrane 0.22 μm | Millipore | SLGP033RS | |
| Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm) | Fisher | 14-513-63 | |
| Glass vial Kit; SUN-SRi | Fisher | 14-823-182 | |
| Delsa Nano C Particle Analyzer | Backman Coulter | ||
| Eppendorf UVette Cuvets | Eppendorf | 952010069 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-Rad | 456-1096 | |
| GelCode Blue Safe Protein Stain | Fisher | PI-24592 | |
| Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System | BioRad | 170-8640 | |
| Corning Transwell Permeable Supports | Corning | 3421 | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | |
| Pyrogent plus kit | Fisher | NC9753738 |
References
- Delair, T. Colloidal polyelectrolyte complexes of chitosan and dextran sulfate towards versatile nanocarriers of bioactive molecules. Eur J Pharm Biopharm. 78 (1), 10-18 (2011).
- Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles. Pharmacol Rev. 64 (3), 505-519 (2012).
- Yue, Z. G., et al. Surface charge affects cellular uptake and intracellular trafficking of chitosan-based nanoparticles. Biomacromolecules. 12 (7), 2440-2446 (2011).
- Ghadge, S. K., Muhlstedt, S., Ozcelik, C., Bader, M. SDF-1alpha as a therapeutic stem cell homing factor in myocardial infarction. Pharmacol Ther. 129 (1), 97-108 (2011).
- Sharma, M., Afrin, F., Satija, N., Tripathi, R. P., Gangenahalli, G. U. Stromal-derived factor-1/CXCR4 signaling: indispensable role in homing and engraftment of hematopoietic stem cells in bone marrow. Stem Cells Dev. 20 (6), 933-946 (2011).
- Sadir, R., Baleux, F., Grosdidier, A., Imberty, A., Lortat-Jacob, H.
- Amara, A., et al. Stromal cell-derived factor-1alpha associates with heparan sulfates through the first beta-strand of the chemokine. J Biol Chem. 274 (34), 23916-23925 (1999).
- Sadir, R., Imberty, A., Baleux, F., Lortat-Jacob, H. Heparan sulfate/heparin oligosaccharides protect stromal cell-derived factor-1 (SDF-1)/CXCL12 against proteolysis induced by CD26/dipeptidyl peptidase IV. J Biol Chem. 279 (42), 43854-43860 (1074).
- Yin, T., et al. SDF-1alpha in glycan nanoparticles exhibits full activity and reduces pulmonary hypertension in rats. Biomacromolecules. 14 (11), 4009-4020 (2013).
- Huang, M., Vitharana, S. N., Peek, L. J., Coop, T., Berkland, C. Polyelectrolyte complexes stabilize and controllably release vascular endothelial growth factor. Biomacromolecules. 8 (5), 1607-1614 (2007).
- McCall, R. L., Sirianni, R. W. PLGA nanoparticles formed by single- or double-emulsion with vitamin E-TPGS. J Vis Exp. (82), 51015 (2013).
- Carrillo-Conde, B. R., Roychoudhury, R., Chavez-Santoscoy, A. V., Narasimhan, B., Pohl, N. L. High-throughput synthesis of carbohydrates and functionalization of polyanhydride nanoparticles. J Vis Exp. (65), 3967 (2012).
- Xu, J., Amiji, M. Therapeutic gene delivery and transfection in human pancreatic cancer cells using epidermal growth factor receptor-targeted gelatin nanoparticles. J Vis Exp. (59), e3612 (2012).
- Lauten, E. H., et al. Nanoglycan complex formulation extends VEGF retention time in the lung. Biomacromolecules. 11 (7), 1863-1872 (2010).
- Schatz, C., Domard, A., Viton, C., Pichot, C., Delair, T. Versatile and efficient formation of colloids of biopolymer-based polyelectrolyte complexes. Biomacromolecules. 5 (5), 1882-1892 (2004).
