Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Konsekvensanalyse af gentagen eksponering af organotypisk 3D bronchiale og Nasal vævskultur Modeller til Whole Cigarette Smoke

Published: February 12, 2015 doi: 10.3791/52325
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Biological Systems Research, Philip Morris International R&D, Philip Morris Products S.A.

Protocol

1. Kultur i organotypisk Tissue bronkial Culture Model

Bemærk: Rekonstituerede vævsmodeller blev købt som indstik, der er klar til brug. Alternativt kan kulturen udvikles fra primære celler som beskrevet for eksempel ved Karp og kolleger 16. Efter modtagelse af væv i steril emballage, altid håndtere de humane organotypiske væv under sterile betingelser.

  1. Tilføj 0,7 ml forvarmet (37 ° C) assaymedium til hver brønd af en ny steril 24-brønds plade under hætten.
  2. Fjern emballering af væv under kølerhjelmen, og overføre de vævskultursystemer indsætter den nye forberedt plade med 24 brønde (beskrevet i trin 1.1. Ovenfor).
  3. Vedligehold og kultur vævene i en inkubator ved 37 ° C (5% CO 2, 90% fugtighed).
  4. Udskift mediet hver 2 dage.
  5. Under en medium forandring, undersøge væv under et lysmikroskop for at sikre, at de er de contaminatipå frit, og at der ikke er nogen lækage af medium.

2. Cigarette Smoke (CS) Eksponering ved hjælp af en in vitro-eksponering System

  1. Tre dage før eksponering eksperimenter vaskes apikale side af vævskultur med 200 pi kulturmedium.
  2. På dagen for eksponering, hvis målingen af ​​ciliære bankende er planlagt før eksponering, håndtere væv til ciliaere bankende måling som beskrevet i afsnit 3.
  3. Pre-opvarme klimakammer af in vitro eksponering, og dyrkning basismodul til 37 ° C. Fyld dyrkning base modul med 17,5 ml medium per række.
  4. Fjern væv fra inkubatoren og placere dem under kølerhjelmen til at overføre de vævskultursystemer skær fra dyrkningspladen til dyrkning base modul af in vitro eksponering system. Derudover dækker dyrkning base modul med et glaslåg.
  5. Overfør væv i klimakammer af in vitro eksponering system for udsættelse for mainstream CS.
  6. Hvis in vitro-eksponering er udstyret med en mikrovægt, opsætte kvartskrystalmikrovægt før kører eksponeringen at måle real-time partikelaflejring af røg på en kvartskrystal ved hjælp af mikrovægt software.
    1. Udskift krystallerne i mikrovægten moduler forbundet til hver række af fortyndingsluft / distributionssystem.
    2. Slut mikrovægt modulet til mikrovægt software. Indstil omfanget af målingen til nul i softwaren.
  7. Udsætte væv ifølge den eksperimentelle procedure (f.eks. Som i figur 1)
    Bemærk: Forudgående eksponering, reference- cigaretter (3R4F) er betinget mellem 7 og 21 dage under kontrollerede forhold ved 22 ± 1 ° C og relativ fugtighed på 60 ± 3% i henhold til ISO standard 3402 17.
    1. Generere cigaretrøg (f.eks. Fra 3R4F cigaretter) anvendelse af en 30-port karrusel rygning Machine ifølge Health Canada Intense regime: ryge cigaretterne til en standard butt længde, dvs. ca. 35 mm ved 55 ml pust over 2 sek, to gange et minut og 8 sek pumpe udstødning tid.
      Bemærk: Hvis det er nødvendigt, fortyndes mainstream CS, så dosis ikke er for giftigt. I resultater rapporteret her, blev røg fortyndet til 16% (vol / vol).
    2. Brug 60% befugtet luft til kontrolprøverne (air-eksponerede).
    3. Expose væv for 6-7 min (dvs.., 1 cigaret eller luft-eksponerede) i in vitro eksponeringssystemet
    4. Sæt væv tilbage i inkubatoren ved 37 ° C (5% CO 2, 90% fugtighed) i 1 time.
    5. Gentag trin 2.7.3 og 2.7.4 tre gange mere.
  8. Ved afslutningen af ​​eksponering eksperiment stoppe mikrovægt software. Softwaren vil generere en fil, der indeholder alle de målinger sammen med en grafisk repræsentation af partiklen deposition.
  9. Overfør væv tilbage fra dyrkning BASE modulet til dyrkningspladen. Placer væv tilbage i inkubatoren ved 37 ° C (5% CO2, 90% fugtighed), indtil målingerne for de forskellige endpoints ved de specifikke efter eksponering tidspunkter.

3. Måling af Ciliaere Beating

Bemærk: Som pr forsøgsplan (figur 1), optage ciliære slå før eksponering og direkte efter eksponeringen.

  1. Fjern vævskulturpladerne fra inkubatoren og efterlade dem under hætten ved stuetemperatur i 30 minutter for at stabilisere cilia slå.
  2. Placer væv under lysmikroskopet tilsluttet CiliaMetrix Software.
  3. Optage filmen og frekvens (i hertz) i ciliære slå. Mål frekvens hver 3 sek i 1 minut.
  4. Retur væv tilbage til inkubatoren ved 37 ° C (5% CO 2, 90% fugtighed).

4. transepithelial elektrisk modstand (TEER) Måling

Bemærk: Målingen af ​​TEER udføres 3 dage før og 48 timer efter eksponering under kølerhjelmen under sterile tilstand ved hjælp Chopstick elektrode (STX-2) er forbundet til en voltohmmeter.

  1. Tilsæt 200 pi dyrkningsmedier til den apikale overflade af de humane bronchiale væv.
  2. Tænd EVOMX maskine; vaske elektrode med en 70% ethanolopløsning.
  3. Vask elektrode med dyrkningsmediet.
  4. Mål modstanden (Ω) ved at indsætte elektroden i mediet på den apikale side af vævskultur uden at røre vævet.
  5. Gentag trin 4,4 fem gange for at opnå fem eksemplarer målinger.
  6. Efter målingerne, forsigtigt fjerne mediet fra den apikale side af vævskulturer under anvendelse af en emhætte.
  7. Retur vævskulturerne til inkubatoren ved ved 37 ° C (5% CO 2, 90% fugtighed) til dyrkning.

5. cytokrom P450 (CYP) 1A1 / 1B1 aktivity

  1. Før starten af ​​undersøgelsen forberede luciferin påvisningsreagens ved at overføre hele indholdet af flasken af ​​den relevante rekonstitutionsbuffer til ravfarvet flaske indeholdende luciferin påvisningsreagens (ifølge producentens anvisninger). Store portioner af 2 ml ved -20 ° C i højst 1 måned.
  2. For 48 timer efter eksponering tid, inkuberes væv i 48 timer efter CS eksponering ved 37 ° C.
  3. Varm Luciferin påvisningsreagens til RT.
  4. Inkuber væv skær i 3 timer eller O / N med Luciferin-CEE-substrat (fortyndet ved 1:50) i det basale dyrkningsmedium.
  5. Transfer 50 pi kulturmedium fra hvert væv indsætte til en 96-brønds uigennemsigtig hvid luminometer plade ved stuetemperatur.
  6. Der tilsættes 50 pi luciferin påvisningsreagens til hver brønd for at initiere en luminescerende reaktion.
  7. Inkubér pladen ved stuetemperatur i 20 min.
  8. Læs luminescens under anvendelse af et luminometer.
    Bemærk: Forluminometer, brug en integration på cirka 0,25-1 sek per samt en retningslinje.

6. RNA Extraction.

  1. Før opsamling 3D organotypiske væv skær, forberede 1) en boks med tøris, 2) tilstrækkelig mængde af blade (én pr 3D insert), 3) kold PBS uden calcium og magnesiumchlorid, 4) en 25 ml glas pipette og 5 ) sterile glas nåle til aspiration.
    1. Label rør fyldt med keramiske perler til homogenisering af faste celleprøver og tilsæt 700 pi Qiazol.
    2. Tænd aspiration maskine.
    3. Saml pladen af ​​3D organotypiske væv indsatser fra inkubatoren.
    4. Vask hver indsats på pladen 3 gange med kold PBS. Mellem vaske aspireres PBS med glasset nål. Efter den tredje vask, at aspirere med PBS og dækplade forhindre udtørring af indsatsen.
    5. For hver indsats fra pladen, skåret ud indsatsen membran (som 3D væv insert bosat), indtil MembrAne ligger fladt ned på klingen.
    6. Overfør væv (sammen med indsatsen membran) fra bladet til homogenisering røret passende mærket, og skru låget på røret, ryst den og vortex det.
    7. Frys prøven i tøris og opbevares ved -80 ° C eller fortsætte med at ekstraktet RNA.
      Bemærk: Før ekstraktion af RNA, mærke alle rør og kolonner ifølge randomisering design (hvis relevant). Forbered alle reagenser efter producentens anbefalinger og tegne prøver fra -80 ° C fryser og tø dem på is, indtil de er helt optøet.
  2. Homogenisering
    1. Grind prøver med homogenisering instrument på 6000 Hz for 45 sek. Gentag om prøverne ikke er behørigt homogeniseret og efterlade prøver i 5 minutter ved stuetemperatur.
    2. Tilføj 140 pi chloroform til prøven og vortex for 10-15 sek.
    3. Overfør supernatanten fra homogenisering røret til en faselåst rør og rystes på enthermoshaker i 2 minutter ved 1400 rpm og RT.
    4. Yderligere inkuber prøverne i 2 minutter ved stuetemperatur og centrifugeres prøver ved 12.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
  3. RNA nedbør, vask, suspension og oprensning i QIAcube.
    1. Den øvre vandige fase overføres i en ny 2 ml rør.
    2. Læg alle nødvendige reagenser i udvinding robot ifølge producenten protokolark, vælge den relevante protokol, indstille elueringsvolumenet (30 pi) og køre udvinding robot.
    3. Når kørslen er færdig, skal du fjerne rotoren adaptere og holde elueringsrørene straks ved 4 ° C til yderligere analyse eller ved -80 ° C til langtidsopbevaring.
  4. Kvalitetskontrol af det isolerede RNA
    1. Bestem mængden af ​​det isolerede RNA ved anvendelse af en UV-læser i henhold til producentens anvisninger.
    2. Kontroller kvalitet af RNA og RNA integritet ved hjælp mikrofluid-gel-baserede lab-on-a-chip og en UV-læser, according med producentens anvisninger.

7. Microarray Workflow

Bemærk: Den nedenfor beskrevne proces fokuserer på metoden for Affymetrix GeneChip High throughput 3'IVT Express Kit, som anvendes til target-syntese til hybridisering på Affymetrix 3 'genekspression patroner startende fra fremstillingen af ​​RNA til anvendelse af et kompleks væskehåndtering (f.eks., pipettering, fortynding, dispensering, eller integration).

  1. Forberedelse
    1. Tilfældig prøver at undgå batch virkninger. Antallet af prøver, der behandles af partier er fra 1 til 96 inklusive en positiv (Commercial human universal henvisning RNA) og en negativ (RNase frit vand) kontrol pr parti.
    2. Start target syntese under anvendelse af 100 ng af total RNA i 3 pi RNAse-frit vand. For 100 ng af total RNA, bruge en 16 h inkubationstid.
  2. RNA Amplification
    1. Forbered Poly-A RNA spike-i kontrol opløsning ved en seriel fortynding af Poly-A RNA Stock med Poly-A Kontrol fortyndingsbuffer:
      1. For fortynding 1, forberede 2 pi polyA kontrol lager i 36 pi fortyndingsbuffer.
      2. For fortynding 2, forberede 2 pi fortynding 1 i 98 pi fortyndingsbuffer.
      3. For fortynding 3, forberede 4 pi fortynding 2 i 196 pi fortyndingsbuffer.
      4. For fortynding 4, forberede 20 pi fortynding 3 i 180 pi fortyndingsbuffer.
    2. Fortynd RNA i RNase-frit vand for at få en koncentration på 33,3 ng / pl.
    3. Tilsæt 2 pi af polyA kontrolopløsning til de 3 pi total RNA-prøve direkte i en 96 brønds plade. Dette trin udføres ved det flydende håndteringssystem.
    4. Forbered væskehåndteringssystem og mål syntese. Placer pladerne på robotten. Læg alle de nødvendige reagenser og laboratorieudstyr på dækket. Robotten starter proceduren ved at forberede appropriate mastermiks og inkuberes prøverne i den automatiserede fjernstyrede PCR blok.
    5. Første kvalitetskontrol: Styring af amplifikationsproces
      1. Hvis kvaliteten af ​​aRNA er acceptabel, udføre fragmentering trin ved tilsætning til hver prøve 8 pi fragmentering 5X puffer (Dette trin udføres af væskehåndteringssystem). Ellers udføre det foregående trin igen begyndende fra RNA. Brug fragmenteret aRNA straks eller opbevares ufortyndet og fragmenteret aRNA ved -20 ° C (eller -70 ° C i længere tids opbevaring).
      2. Udfør en anden kvalitetskontrol analyse ved optagning tilfældigt 12 prøver i pladen og overførsel 1 pi på mikrofluidik gel baseret system til at kontrollere effektiviteten af ​​fragmentering.
  3. Hybridisering procedure
    1. Scan chip stregkoder og registrere hver prøve i fabrikantens software i henhold til instruktionerne.
    2. Forbered hybridisering mix somfølger for en enkelt reaktion og føje den til 33 pi af den fragmenterede og mærket aRNA: 4,2 pi kontrol oligonukleotid B2 (3 nM), 12,5 pi 20x eukaryote hybridiseringsmetoder kontrol, 25 pi 100% DMSO, 125 pi 2x hybridiseringspuffer og 50 pi H2O til et slutvolumen på 216,7 pi
      Bemærk: hybridisere vaske og scanne positive og negative kontroller, inden behandling af prøverne.
    3. Pre-våd array med 200 pi præ-hybridiseringsblanding i hybridiseringen Vask og Stain kit.
    4. Placer chip i hybridiseringen ovn indstillet til 45 ° C og 60 rpm i 10 min.
    5. I mellemtiden denaturere pladen (indeholdende den endelige cocktail hybridiseringsblanding) i en PCR-blok ved 99 ° C i 5 minutter og 45 ° C i 5 minutter.
    6. Fjern pre-hybridiseringsblanding fra arrayet og erstatte det med 200 pi af hybridisering cocktail mål (en prøve pr chip).
    7. Placer array i hybridization ovn indstillet til 45 ° C i 16 timer (O / N) med en rotationshastighed på 60 rpm.
  4. Vask og farvning
    1. Kør "Fluidik" fra software-menulinjen. I dialogboksen Fluidik boksen, skal du vælge modulet af interesse (1 - 4), skal du vælge Prime_450 program til alle moduler derefter. Placer røret for Wash Buffer A i en flaske (400 ml) og vaskebuffer B i en flaske (200 ml), samt for milliQ vand i en flaske (500 ml).
    2. Efterfølgende skal du følge instruktionerne LCD-skærmen. Løft nåle og 600 pi pletten cocktail 1 (SAPE Solution Mix) og 600 pi pletten cocktail 2 (antistofopløsning Mix) indeholdende mikrocentrifugerør ved positionerne # 1 og # 2, og 900 pi array indeholdende bufferopløsning ved position # 3.
    3. Efter O / N inkubation i ovnen, opsug cocktail fra chippen og fyld mikroarrayet med 250 pi Wash Buffer A. Tildel den rigtige chip til hvert modul, skal du vælge FS450-001 protokol og køre hver moDule følge vejledningen på skærmen. Denne proces varer 90 min.
    4. Når LCD-skærmen viser "Skub Cartridge" besked, skal du fjerne chippen og inspicere, om der er bobler. Hvis der er luftbobler, fylde array helt med Array holder buffer. Påfør klistermærker på septa at undgå lækager i scanneren og rengør microarray vinduet før lastning i scanneren.
  5. Scanning.
    1. Varm op scanneren. Læg chippen ind i autoloader af scanneren og starte scanningen.
      Bemærk: Efter ~ 12 min per chip, er en .CEL fil pr chip genereret.
    2. Kontroller billedet, og tilpasse nettet (hvis nødvendigt) til stedet for at identificere probe celler.
      Bemærk: Datasættet er indsendt til Arrayexpress (Tiltrædelse kode = E-mtab-1721).

8. netværksbaserede Systembiologi Analyse for en konsekvensanalyse

  1. Microarray databehandling.
    Bemærk: Data behandlingen af ​​end scoring metoder blev gennemført ved hjælp af R statistisk miljø-version 2.14.
    1. Åbn en R18 session og indlæse AFFY 19, gcrma og affyPLM pakker installeret ved at køre kommandoerne: bibliotek (AFFY)> bibliotek (gcrma)> Bibliotek (affyPLM)
    2. Læs rå datafiler kører kommandoen: data.affybatch <-ReadAffy ("sti til den mappe, hvor gemmes de CEL filer")
    3. Trække fra baggrunden korrektion og fraktil normale at generere sonde sæt udtryk værdier ved hjælp af gcrma pakke, ved at køre kommandoen: eset.norm <-gcrma (data.affybatch)
  2. Kvalitetskontrol.
    1. Generer RNA nedbrydning plots med kommandoen: deg <-AffyRNAdeg (data.affybatch)
    2. Uddrag koefficienten af ​​RNA nedbrydning hældning køre kommandoen: hældningen = deg $ hældning
    3. Plot hældningskoefficienten og identificere mulige outliers.
    4. Generer nBrug og RLE plots at køre følgende kommandoer: Pset <-fitPLM (data.affybatch)> RLE (Pset)> nBrug (Pset).
    5. Identificer hvis nogle af boxplots genererede outliers: et array betragtes outlier hvis mindst 2 af de 3 QC målinger defineret nedenfor afviger fra de andre arrays:
      - Deg $ hældning er forskellig fra den gennemsnitlige deg $ hældning
      - NBrug plot: et array betragtes outlier, hvis øvre kvartil falder under 0,95 eller den laveste kvartil over 1,05, dvs hvis boxplot er helt over 1,05 eller helt under 0,95..
      - RLE plot: et array betragtes outlier hvis medianen af ​​RLE fordelingen er større end 0,1 eller mindre end -0.1.
    6. Hvis et array er identificeret som en outlier, så kassere, og start igen fra trin 8.1.2.
    7. Monter en overordnet lineær model til data for de specifikke kontraster af interesse (dvs.., Sammenligninger af "behandlet" og "kontrol" forhold) genererer rå P-værdier for hver probe indstillet på microarray, som kan være Furthendes justeres ved hjælp af Benjamini-Hochberg proceduren for Limma pakken. Vælg en probeset per gen for at holde som repræsentant for genet for yderligere analyser, som beskrevet i 20.
      Bemærk: Et blokerende faktor (eksponeringen plade) fra forsøget design tegnede i modellen for databehandling.
  3. Netværk-baseret analyse.
    Bemærk: Den metode, som gennemføres her er beskrevet i detaljer i Martin et al. (I revision i BMC bioinformatik).
    1. For hver parvise sammenligning af renter, starte fra den beregnede (log2-) fold ændringer (behandling vs. kontrol) for hver genet under netværket (fra trin 8.2).
    2. Beregn den underskrevne Laplace matrix L af netværket defineret af L (i, j) = - tegn (i ~ j) w (i, j) hvis der er en kant af vægt w (i, j) mellem knudepunkt i og j, L (i, j) = deg (I) er den vægtede grad af I og L (i, j) = 0 ellers. Vægten w (i, j) er lig med 1, hvis i og j er i rygraden og w (i, j) = 1 / n hvis jeg er en rygrad node og j er et af dets N neighbyderste periferi i udskrift lag.
    3. Beregn scoringer for rygraden ved f = L3-1L2Tx hvor L3 er sub-matrix af L til skelettet noder og L2 er sub-matrix af L hvis rækker svarer til de transkriptionelle lag noder og kolonne til skelettet knudepunkter
    4. Beregn den underskrevne Laplace, Q, i netværket defineret af backbone-netværk, hvor alle kant skilte tilbageføres.
    5. Beregn NPA score ved NPA = fTQf.
    6. Beregn konfidensintervallet, rygraden kant permutation p-værdi og udskrift lag permutation p-værdi.
      Note: (. Fx den biologiske variation mellem prøverne i en forsøgsgruppe) Ud over konfidensintervallerne af NPA scoringer, som tegner sig for den eksperimentelle fejl, følgesvend statistik blev udledt til at beskrive de særlige egenskaber i NPA score til biologi beskrevet i netværket. Fordi NPA er en kvadratisk form, af folden ændringer, kan dens varians beregnes på grundlag af fold-ændringen estimeret variances. Et konfidensinterval efterfølgende udledes ved hjælp af den centrale grænse teorem. To permutation tests blev gennemført 21, hvorved det første at vurderer, om resultaterne var specifikke for den underliggende dokumentation (dvs.., Gen fold-ændring) i modellen, hvilket fører til en permutation P-værdi (angivet med * O i tallene, da P -værdi <0,05). For det andet at vurdere, om "årsag og virkning" lag af netværket bidraget væsentligt til amplituden af ​​netværket forstyrrelse (angivet med K * i tallene, da P-værdi <0,05).
    7. Overvej netværket som påvirket af behandlingen, hvis konfidensintervallet ikke indeholder nul og de to permutation p-værdier <0,05.
    8. Beregn de førende knudepunkter der er defineret som de centrale knudepunkter i rygraden bidrager op til 80% af NPA score.

Representative Results

I resultaterne er beskrevet nedenfor, de organotypiske væv var primære humane epitelceller isoleret fra sunde, ikke-ryger, kaukasiske donorer og blev rekonstitueret hjælp fibroblaster 15.

3D bronchiale og nasale væv modeller
In vitro bronchiale og nasale organotypiske modeller ligne på celleniveau den humane luftveje epitel (figur 2).

CS eksponering
Organotypiske bronchiale og nasale væv modeller kan gentagne gange udsættes for mainstream CS ved luft-væske grænsefladen. Røgen eksponering eksperimentelle procedure, der anvendes for de resultater, der er illustreret her, er afbildet i figur 1.

Registrering af ciliær slå
Cilia slå indregning i værelser med eksponerede væv som vist i videoerne. CS eksponering var forbundet med en reduktion af den ciliære slagfrekvens: stærkere toppunktet omkring4 Hz i fingeret eksponerede og før eksponering observeres ikke længere efter CS eksponering (figur 3). Dette reducerede frekvens ville gøre cilier slå mindre effektive til at fjerne slim og smitstoffer 22.

Måling af TEER og CYP1A1 / 1B1 aktivitet
TEER blev målt 48 timer efter den sidste udsættelse at sikre vævet er stadig funktionel. CYP1A1 / 1B1-aktivitet blev også målt 48 timer efter afslutningen af eksponering som illustreret i figur 1. De TEER værdier i CS-eksponerede væv var ikke signifikant forskellig i forhold til luft-eksponerede væv bekræfter, at der ikke er nogen væsentlig cytotoksisk virkning af røg ved denne koncentration. Ved 48 h post-eksponering, var CYP1A1 / 1B1 aktivitet af væv steg lidt, hvilket indikerer en beskeden stigning af væv forsvarsmekanisme efter eksponering (figur 4).

Genekspressionsprofiler og netværk systemer biologi tilgang at undersøge virkningen af ​​CS eksponering på ændring af miljøfremmede metabolisme
Væv blev opsamlet ved 48 timer efter eksponering tidspunkter. Efterfølgende blev microarray analyse udført for at generere genekspressionsprofiler af CS- og air-eksponerede væv. Virkningerne af CS eksponering på xenobiotisk metabolisme blev undersøgt ved hjælp af en netværksbaseret systembiologi tilgang gearede fra gen-udtryk profiler og som rapporteret tidligere 15. Ved hjælp af en net-baserede systemer biologi fremgangsmåde viser, at CS virkninger eksponering på niveauet af backbone knudepunkter i de xenobiotiske Metabolisme netværksmodel pænt korreleret mellem in vitro og in vivo datasæt (figur 5). I modsætning hertil på niveauet for hver individuelle ændringer gen-ekspression, var fattige korrelationer observeret mellem in vitro (CS-eksponerede vs. værelser med eksponerede) og in vivo (rygere vs. ikke-rygere).


Figur 1. Skematisk procedure for gentagen eksponering af CS til de organotypiske bronkiale vævsmodeller Forkortelser:. CYP, cytochrom P450; CS, cigaretrøg; TEER, transepithelial elektrisk modstand.

Figur 2
Figur 2. organotypisk bronchiale og nasale epiteliale vævskulturplader modeller. Cartoon illustrerer bronchiale (A) og nasal (B) vævskultur insert ved luft-væske-grænsefladen. De in vitro-modeller indeholdt cilierede celler er vist i den apikale lag af hematoxylin & eosin farvede celler (C for bronchial, D for nasal) som rapporteret tidligere 15. Modellerne blev co-dyrket med fibroblaster, som er vigtige for vækst og differentiering af epitelceller (angivet ved pile). Farvning af luftvejs afstamning markører: P63 (E for bronkial, F for nasal) og Muc5AC (G for bronkial, H til nasal) er vist som rapporteret tidligere 15. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Cilia slagfrekvens. Cilia slagfrekvens (CBF) blev målt i luft-eksponeret og i kulturen før og efter eksponering. Nedsat CBF blev set efter CS eksponering (repræsentative resultater fra to insert er vist som gentagelse 1 (R1) og replikere 2 (R2)).

annonce / 52325 / 52325fig4.jpg "/>
Figur 4. Måling af CYP1A1 / CYP1B1 aktivitet og TEER. Venstre pannels angiver CYP1A1 / CYP1B1 aktivitet i de bronchiale (A) og nasal (B) væv modeller. Højre paneler angiver TEER måling i bronchiale (C) og nasal (D) væv modeller. Midler ± SD er vist. Forkortelser: CS, cigaretrøg; CYP cytochrom P450; TEER, transepithelial elektrisk modstand; RLU, relative luminescense enhed.

Figur 5
Figur 5. Netværk-baserede systemer biologi fremgangsmåde til vurdering af CS eksponering i forbindelse med xenobiotiske metabolisme virkning. Ændringerne af genekspressioner niveauer blev anvendt til at beregne aktivering af rygraden node de xenobiotiske Metabolisme netværksmodel (A) strong> som rapporteret i en tidligere publikation 15. Figuren til højre illustrerer begrebet kvantificering af backbone knudepunkter, også kendt som "forskellen netværk backbone værdi," ved hjælp af NPA tilgang. De blå ovaler repræsenterer aktiviteten af backbone knudepunkter (dvs.., Det funktionelle lag), og de ​​grønne kugler udgør ekspressionen af gener (dvs.., Den transkriptionelle lag). Virkninger af CS eksponering i organotypiske bronchiale væv (in vitro, CS-eksponerede vs. air-eksponerede) ved 48 timers post-blev sammenlignet med dem af rygning for human bronchieepithelceller opsamlet ved bronchoskopi og nasal epithelial ved burshing ringere turbinate (GSE16008 ) (in vivo, rygere vs. rygere) (B). Insets, korrelation af genekspression skifter mellem in vitro og in vivo datasæt. Forkortelser: CS, cigaretrøg; NPA, netværk forstyrrelse amplitude.ove.com/files/ftp_upload/52325/52325fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Discussion

Her har vi vist anvendeligheden af ​​menneskelig organotypisk bronchiale og nasale væv modeller til at vurdere virkningen af ​​gentagen eksponering CS. Som et alternativ til dyreforsøg, blev en række eksponeringssystemer udviklet til toksikologiske vurderinger af aerosol eksponering in vitro (f.eks., Vitrocell, Cultex, Alice, etc.). Disse eksponering moduler kan også anvendes til en toksikologisk vurdering af luftbårne forurenende stoffer, luftbårne partikler, nanopartikler, etc. I denne undersøgelse anvendte vi Vitrocell system, der kan rumme op til 48 forskellige prøver samtidigt, giver mulighed for større skala eksperimenter og lavere variabilitet mellem behandlinger. For hver aerosol eksponering in vitro, risikoen for forurening vævskultur fortsat en stor risiko, hvis afbødning kræver en omhyggelig håndtering af vævskulturer hele eksperimenterne.

Måling partikelaflejring i realtid på mikrovægten under eXposure eksperiment gør det muligt at overvåge, at CS doser genereret fra eksponeringssystemet er i overensstemmelse med forventningerne. For at sikre nøjagtigheden af den målte partikelaflejring, oprettelse online måling korrekt, før eksponeringen er critial fx opsætning af skalaen til 0. Derudover grund af forskellen mellem de områder af mikrovægt (cm 2) og vævskultur insert (0,33 cm2), vi justeret den endelige beregning til området af kulturen insertet: kun 33% af aflejringen på mikrovægten afspejler den faktiske aflejring i kultur indsatsen.

Måling af TEER at fastslå stram-junction barriere funktionalitet og at vurdere afbrydelse af epitellaget er en forholdsvis nem procedure at gennemføre, som vi rapporteret her. Fordi de bronchiale og nasale væv modeller indeholde slim-producerende indflettede slimceller, skal imidlertid apikal vask skal udføres før TEER measurement. Den apikale vask er kritisk, fordi tilstedeværelsen af ​​slim lag og variabiliteten af ​​dens tykkelse dåse partiskhed måling af TEER, interferring med virkningerne af CS eksponering. Dette begreb er i overensstemmelse med, hvad der blev rapporteret af Hilgendorf og kollegaer, hvor permeabiliteten af Caco-2-celler blev berørt af co-dyrkning med slim-producerende bæger cellelinje HT29 23. Den slim skal vaskes før TEER måling fordi apikal vask lige før eksponeringen kan forstyrre de vævsreaktioner på CS. Derfor er målingen foretaget tre dage før eksponering, og ikke lige før eksponeringen.

Vi viste, at der kan måles CYP1A1 / CYP1B1 aktivitet fra de organotypiske kultur modeller efter CS eksponering selvom aktiviteten blev kun let øget med CS. Dette svagt signal kan forstærkes af en længere inkubation af CYP1A1 / 1B1 substrat (dvs.., Luciferin-CEE), for eksempel til24 timer (data ikke vist). En af de begrænsninger af CYP aktivitet måling i det foreliggende arbejde er fraværet af normalisering til CYP proteinniveau eller celletallet, som kan tages i betragtning ved fremtidige undersøgelser for at sikre, at ændringen på enzymaktiviteten ikke påvirkes ved ændring af enten protein eller det celletallet.

Vi rapporterede, at CS eksponering hæmmede ciliære slå i både nasale og bronkiale vævsmodeller. Lignende observationer blev gjort i forskellige pattedyr og ikke-pattedyr modeller 12. For ciliær slå måling sikre, at væv håndteres og behandles på en lignende måde er kritisk, for eksempel hvis medium ændring iværksættes, bør det anvendes til alle prøver. Sutto og kolleger rapporterede, at pH påvirkede pattedyr ciliær slagfrekvens 24. Således når man sammenligner slå frekvenser mellem celler behandlet med forskellige compunds / blandinger, pHjustering bør overvejes at minimere variabilitet af ciliære slå måling. Desuden temperatur, ved hvilken målingen udføres, er også kritisk, da hyppigheden af ​​ciliære bankende falder med faldende temperatur. For at minimere variabilitet på grund af disse ændringer, en etape-top inkubator, udstyrede med temperaturen, CO 2 og fugtighed kontrol blev anvendt i denne undersøgelse. På trods af dette, vi observeret, at det ciliære slå frekvenser i de bronchiale væv efter CS eksponering var meget variabel (dvs.., Stige i et indlæg og falde i anden indsats), hvilket tyder på, at den ciliære bankende er meget forstyrret lige efter eksponering. I modsætning hertil observerede vi fraværet af målelige ciliær beating frekvenser i den nasale væv efter CS eksponering, hvilket tyder på, at reaktionen af ​​den nasale væv er mere følsom og konsekvent. Dette er i overensstemmelse med en tidligere publikation viser, at den nasale væv har en lavere kapacitet til at afgifte somsammenlignet med bronkie 25.

Endelig viste vi, at genekspression profilering fra organotypisk bronchiale og nasale væv modeller udsat for CS kunne påvise en effekt af CS på xenobiotisk stofskifte. Interessant, den observerede ændring i xenobiotisk metabolisme i organotypisk bronchiale og nasal in vitro-modeller udsat for CS ligne in vivo-situationen hos rygere som diskuteret mere detaljeret i en tidligere publikation 15. For genekspression analyser, ved hjælp af robot instrument laver en high-throughput analyse mulig. Desuden automatisk robot håndtering øger yderligere sammenhæng og nøjagtighed genekspression resultater. Ikke desto mindre, hurtig samling af vævsprøverne var kritisk for at undgå RNA-nedbrydning under RNA-ekstraktion. RNA forarbejdning og transkriptom fremgangsmåder beskrevet her kan også anvendes til in vivo vævsprøver.

Disclosures

Denne undersøgelse blev finansieret af Philip Morris International.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Maurice Smith og Marja Talikka for deres gennemgang af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MucilAir-human fibroblasts-bronchia Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland http://www.epithelix.com/content/view/122/19/lang,en/
MucilAir Culture Medium Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland http://www.epithelix.com/content/view/84/16/lang,en/
VITROCELL VITROCELL systems GmbH, Waldkirch, Germany http://www.vitrocell.com/index.php?Nav_Nummer=2&R=
3R4F reference cigarette University of Kentucky http://www2.ca.uky.edu/refcig/
30-port carousel smoking machine SM2000 Philip Morris, Int.
CiliaMetrix camera and software La Haute École de Gestion (HESGE), Geneva, Switzlerland
Leica DMIL microscope  Leica, Heerbrugg, Switzerland
LED light source Titan Tool Supplies, Buffalo, NY
Chopstick Electrode STX-2 World Precision Instruments http://www.wpiinc.com/products/physiology/stx2-chopstick-electrode-set-for-evom2/
EVOMXTM Epithelial Voltohmmeter  World Precision Instruments http://www.wpiinc.com/products/physiology/evom2-evom2-epithelial-voltohmmeter-for-teer/
Luciferin Detection Reagent 
MagNA Lyser Instrument  Roche http://www.roche.com/products/product-details.htm?region=us&type=product&id=66
chloroform  Sigma-Aldrich http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en&region=
QIAcube  Qiagen 9001882
NanoDrop Thermo Scientific http://www.nanodrop.com/
Agilent 2100 Bioanalyzer  Agilent http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106
Affymetrix GeneChip High throughput 3’IVT Express Kit Affymetrix http://www.affymetrix.com/catalog/prod370001/AFFY/High-Throughput-(HT)-Whole-Transcript-(WT)-Kit
Scanner 3000 7G  Affymetrix http://www.affymetrix.com/catalog/131503/AFFY/Scanner-3000-7G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pezzulo, A. A., et al. The air-liquid interface and use of primary cell cultures are important to recapitulate the transcriptional profile of in vivo airway epithelia. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiolog. 300, L25-L31 (2011).
  2. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature reviews Molecular cell biolog. 8, 839-845 (2007).
  3. Dvorak, A., Tilley, A. E., Shaykhiev, R., Wang, R., Crystal, R. G. Do airway epithelium air–liquid cultures represent the in vivo airway epithelium transcriptome. American journal of respiratory cell and molecular biolog. 44, 465 (2011).
  4. Wiszniewski, L., et al. Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biolog. 34, 39-48 (2006).
  5. Balharry, D., Sexton, K., BéruBé, K. A. An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane. Toxicolog. 244, 66-76 (2008).
  6. Mathis, C., et al. Human bronchial epithelial cells exposed in vitro to cigarette smoke at the air-liquid interface resemble bronchial epithelium from human smokers. Am J Physiol Lung Cell Mol Physio. 304, L489-L503 (2013).
  7. Cho, M. -H., et al. A bioluminescent cytotoxicity assay for assessment of membrane integrity using a proteolytic biomarker. Toxicology in Vitr. 22, 1099-1106 (2008).
  8. Stewart, C. E., Torr, E. E., Mohd Jamili, N. H., Bosquillon, C., Sayers, I. Evaluation of Differentiated Human Bronchial Epithelial Cell Culture Systems for Asthma Research. Journal of Allerg. 2012, 11 (2012).
  9. Blume, L. F., Denker, M., Gieseler, F., Kunze, T. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Pharmazi. , 19-24 (2010).
  10. Chhin, B., et al. Ciliary beating recovery in deficient human airway epithelial cells after lentivirus ex vivo gene therapy. PLoS genetic. 5, e1000422 (2009).
  11. Jiao, J., Meng, N., Wang, H., Zhang, L. Comparison of human nasal epithelial cells grown as explant outgrowth cultures or dissociated tissue cultures in vitro. Front Me. 7, 486-491 (2013).
  12. Talbot, P. In vitro assessment of reproductive toxicity of tobacco smoke and its constituents. Birth defects research. Part C, Embryo today : review. 84, 61-72 (2008).
  13. Port, J. L., et al. Tobacco smoke induces CYP1B1 in the aerodigestive tract. Carcinogenesi. 25, 2275-2281 (2004).
  14. Hoeng, J., et al. A network-based approach to quantifying the impact of biologically active substances. Drug Discov Toda. 17, 413-418 (2012).
  15. Iskandar, A. R., et al. Systems approaches evaluating the perturbation of xenobiotic metabolism in response to cigarette smoke exposure in nasal and bronchial tissues. Biomed Res In. 2013, 512086 (2013).
  16. Karp, P. H., et al. An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures. Methods in molecular biolog. 188, 115-137 (2002).
  17. ISO 3402: Tobacco and tobacco products -- Atmosphere for conditioning and testing. , International Organization for Standardization. (1999).
  18. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , The R Core Team. (2011).
  19. Gautier, L., Moller, M., Friis-Hansen, L., Knudsen, S. Alternative mapping of probes to genes for Affymetrix chips. BMC Bioinformatic. 5, 111 (2004).
  20. Hermida, L., et al. Confero: an integrated contrast data and gene set platform for computational analysis and biological interpretation of omics data. BMC genomic. 14, 514 (2013).
  21. Thomson, T. M., et al. Quantitative assessment of biological impact using transcriptomic data and mechanistic network models. Toxicology and applied pharmacolog. 272, 863-878 (2013).
  22. Teff, Z., Priel, Z., Gheber, L. A. The forces applied by cilia depend linearly on their frequency due to constant geometry of the effective stroke. Biophysical journa. 94, 298-305 (2008).
  23. Hilgendorf, C., et al. Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport. J Pharm Sc. 89, 63-75 (2000).
  24. Sutto, Z., Conner, G. E., Salathe, M. Regulation of human airway ciliary beat frequency by intracellular pH. The Journal of physiolog. 560, 519-532 (2004).
  25. Zhang, X., et al. Similarities and differences between smoking-related gene expression in nasal and bronchial epithelium. Physiological genomic. 41, 1-8 (2010).

Tags

Bioengineering humant organotypisk bronchieepithelceller 3D kultur, cigaretrøg cilier slå miljøfremmede metabolisme netværksmodeller systemer toksikologi
Konsekvensanalyse af gentagen eksponering af organotypisk 3D bronchiale og Nasal vævskultur Modeller til Whole Cigarette Smoke
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuehn, D., Majeed, S., Guedj, E.,… More

Kuehn, D., Majeed, S., Guedj, E., Dulize, R., Baumer, K., Iskandar, A., Boue, S., Martin, F., Kostadinova, R., Mathis, C., Ivanov, N. V., Frentzel, S., Hoeng, J., Peitsch, M. C. Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke. J. Vis. Exp. (96), e52325, doi:10.3791/52325 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter