Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Экологические модуляций Количество мозга допамина нейронов у взрослых мышей

Published: January 20, 2015 doi: 10.3791/52329
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Florey Institute of Neuroscience and Mental Health, The University of Melbourne

Abstract

Продолжительно изменения в мозге или "пластичности мозга" лежат в основе адаптивного поведения и ремонт головного мозга следующую заболевания или травмы. Кроме того, взаимодействие с окружающей средой может вызывать пластичность мозга. Все больше исследований пытается определить, какие сред стимулировать пластичность мозга полезен при лечении мозг и поведенческих расстройств. Два экологические манипуляции описаны либо увеличить, либо уменьшить количество тирозингидроксилазы иммунопозитивных (TH +, то фермент, ограничивающий скорость дофамина (ДА) синтеза) нейроны в мозге взрослых мышей. Первый включает в себя сопряжения мужского и женского мышей вместе непрерывно в течение 1 недели, которая увеличивает мозга TH + нейроны приблизительно на 12% у мужчин, но снижает мозга TH + нейроны приблизительно на 12% у женщин. Второй включает в себя жилье мышей непрерывно в течение 2 недель в "обогащенных средах" (EE), содержащих ходовые колеса, игрушки, веревки, Верстка материал и т.д., которые яncreases мозга TH + нейроны примерно 14% у мужчин. Кроме того, протокол описан в одновременно придавая лекарств непосредственно в мозге в течение этих экологических манипуляций, чтобы помочь идентифицировать механизмы, лежащие в основе экологически индуцированной пластичность мозга. Например, EE-индукция более среднего мозга TH + нейронов отменены одновременным блокады синаптической вход на среднего мозга нейронов. Вместе, эти данные свидетельствуют о том, что информация об окружающей среде передается через синаптическую вход для среднего мозга нейронов включить или выключить экспрессии генов "Да". Таким образом, соответствующая экологическая стимуляция, или доставка лекарственных препаратов из основных механизмов, могут быть полезны для лечения головного мозга и поведенческих расстройств, связанных с дисбалансом в среднем мозге DA (например, болезнь Паркинсона, синдром дефицита внимания и гиперактивности, шизофрения, наркомания).

Introduction

Сигнализация DArgic нейронов в вентральной области покрышки (VTA) и черной субстанции Парс компактов (SNC) среднего мозга считается важным для вознаграждения почве познавательных, эмоциональных и моторных поведения. Однако, слишком много или слишком мало среднем мозге сигнализации DA вызывает много инвалидности симптомы в различных неврологических расстройств (например, болезнь Паркинсона, синдром дефицита внимания и гиперактивности расстройство, шизофрения, наркомания). Препараты, повышающие или снижающие DA сигнализации облегчить эти симптомы, однако они также производят побочные эффекты, относимые к дизрегуляции сигнализации и мимо цели эффекты. Эффективность лекарственного также снижается с течением времени из-за компенсаторных реакций головного мозга. Поэтому задача состоит в том, чтобы восстановить нормальную мозга сигнализации DA более целенаправленно и физиологическим путем, и выступает подход, увеличивая или уменьшая количество среднего мозга нейронов DA.

Данные накапливались в течение SEVEral десятилетия, что экспрессия генов и белков, участвующих в метаболизирующий и торговли DA и других катехоламинов в зрелых клеток взрослого может изменяться (обзор в 1). В среднем мозге, количество тирозин гидроксилазы иммунопозитивные (Th +, ограничивающим скорость ферментом в синтезе DA) нейронов уменьшается, то увеличивается следующих нейротоксина введение 2,3, в то время как количество TH immunonegative (Th-) нейронов показывает противоположный образец (то есть увеличивается затем уменьшается 3). Это согласуется с потерей затем получить из "DA" фенотипа некоторыми клетками. Количество нейронов Th + и th- SNC Также было показано, чтобы изменить в равных, но противоположных направлениях следующие различные процедуры, которые изменяют электрическую активность этих клеток 4,5. Например, настой из малого проводимости, кальций-активируемых калия (SK) канал антагонист апамин в мозге в течение 2 недель уменьшается количество TH + и возрастает (на ту же сумму) нюmber из Th- SNc нейронов 4,5. В отличие от этого, вливание агониста SK канал 1-EBIO увеличивает количество TH + и уменьшается (на ту же величину) числа нейронов th- SNC 4,5. Аналогичные изменения были замечены после различных обработок, направленных на активность нейронов SNC, в том числе и такие, которые направлены афферентные входы 4. Это кажущееся регулирование числа SNC DArgic нейронов нейронной активности и ввода афферентной повышает вероятность того, окружающей среды или поведение может влиять на численность SNC нейронов. Действительно взрослых мышей воздействию различных сред имеют более или менее мозга (SNC и VTA) Th + нейроны, и по крайней мере некоторые из этих изменений окружающей среды, вызванных отменены одновременным блокады синаптической вход в мозге 6. Цели этой связи являются: (1) представить дополнительную информацию о том, как реализовать наши экологические манипуляции и настои лекарственных средств; и (2) предоставить дополнительные данные, подтверждающие наше утверждение, что еnvironment регулирует количество среднего мозга нейронов Д.А., через вход афферентной.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все экспериментальные процедуры на животных были одобрены Florey института Комитета Neuroscience и психического этики здоровья животных и соответствовать национального здравоохранения Австралии и Совета по медицинским исследованиям опубликовал свод правил по уходу и использованию животных для научных целей (7-е издание, 2004).

1. Экологические Манипуляции

  1. Пол Сопряжение
    1. Используйте половозрелых (> 8 недель), подобранных по возрасту мужчин и женщин мышей.
      Примечание: Обычно мы используем мышей C57BL / 6, но имели те же результаты с использованием швейцарской мыши в данном протоколе. Обычно мы используем N = 8 мужчин и N = 8 самок для каждого эксперимента, делится на N = 2 мужского пола, пар (п = 4 мужчины), п = 2 женщины-женщины пары (N = 4 женщины), и N = 4 между мужчиной и женщиной пары (N = 4 мужчины и N = 4 женщины).
    2. По прибытии в животное изолятор, группы доме мышей по полу в течение> 3 дней для акклиматизации. Здесь и через вмия Пол спаривания, держать посторонние стимулы окружающей среды (например, температура окружающей среды, свет: темно цикл, пища, вода, обработка и уборка) постоянная или распространять в равной степени для всех мышей.
    3. Случайно назначить каждой мыши мужского пола, мужской паре, женщины-женщины пары или пары мужчин и женщин. Поместите каждую пару в чистую клетку в отдельности (2 мышей / клетку) с вволю доступ к пище и воде, а просто разместить их таким образом непрерывно в течение 7 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Регулярное животноводства в порядке в течение этого периода, но должны быть распределены одинаково ко всем мышей. Будьте осторожны, чтобы избежать спаривания самцов и самок помета.
  2. Экологическая Обогащение
    1. Используйте половозрелых (> 8 недель), подобранных по возрасту мужских или женских мышей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно мы используем N = 18 мышей для каждого эксперимента, разделенных на группы N = 6 / лечения.
    2. По прибытии в животное изолятор держать их группу расположен в аналогичный стандарт размещены (SH) (например, (например, температура окружающей среды, свет: темно цикл, пища, вода, обработка и уборка) постоянная или распространять в равной степени для всех мышей.
    3. Для начала экологической обогащение, случайно назначить каждой мыши к одному из 3 групп: SH; ходовое колесо (RW), или окружающей среды, обогащенный (EE) и поместить каждую группу мышей вместе в одинаковой чистой клетке с свободном доступе к пище и воде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь большие крысы-холдинг клетки для всех групп, измерительные 27 см в ширину, долго 42 см, и 16 см глубиной были использованы.
      1. Кроме того, предоставляем следующие условия окружающей среды для каждой группы: SH, содержащей только мусор (бумага гранулы или опилки) на этаже; RW, содержащий SH плюс 2 ходовые колеса; EE, содержащий RW плюс игрушки (тросы, лестницы, тоннели, и такие объекты, как пустые рулоны бумажных полотенец и предметов папиросной бумаги), с которыми эксPlore, игры, подъем, скрывать, и гнездо.
      2. Их размещения, таким образом, непрерывно в течение 14 дней.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Регулярное животноводства в порядке в течение этого периода, но должны быть распределены одинаково ко всем мышей.
    4. Тема EE мыши на дополнительную «супер-обогащения» (ГП), поместив их вместе в большую клетку, содержащую новые игрушки для 1час / день (тот же час каждый день), 5days / неделю.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь был использован более широкий 46 см, длиной 69 см, а 40 см в глубину пластиковой тубе.
      1. Поддержание новинку, представляя другой набор игрушек каждой сессии. Чистые игрушки, которые должны быть повторно представлена ​​на мышах с мыльной водой и 80% -ным этанолом, чтобы удалить ароматы.
      2. После каждого сеанса SE, вернуть мышей их EE клетке. Ручка SH и RW мышей же, как и у мышей SE протяжении всего этого периода (для самого SE исключением) (например, удалить и вернуть каждый SH и РАО мышь от и до своей клетке).

  1. Подготовка
    1. Используйте стерильные осмотические насосы и мозг инфузионные наборы, которые имеются в продаже. День до имплантации, используя асептики, премьер-имплантаты, заполнив каждый насос, соединительная трубка и канюли стерильным раствором лекарства или транспортного средства (как описано в инструкциях, прилагаемых к насосам). Соединить их вместе и инкубируют в стерильном физиологическом растворе в течение ночи при 37 ° С. Выдержите за лекарственной и транспортных средств заполненные имплантаты отдельно, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
  2. Хирургическое.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от страны экспериментатора, специальных разрешений экспериментов на животных или пособия должны проводить такие виды операций и послеоперационных экспериментов.
    1. Стерилизовать всех хирургических оборудования и использовать асептики во всем. Обезболить мышь (например, с помощью 1-2% изофлуораном в воздухе) и поместите его в стерotaxic Headframe. Проверьте глубину анестезии на протяжении всей процедуры и управлять дальнейшее анестезии при необходимости (например, отсутствие вывода конечностей на вредные лапы крайнем случае свидетельствует о адекватную анестезию). Убедитесь, что глаза защищены от высыхания смазкой глазной мази, и что температура тела мыши остается нормальным в течение всей процедуры.
    2. Сделайте срединный разрез через кожу, начиная с между глазами и заканчивая 2 см кзади от заднего края черепа. Тупым рассекают кожу от базовой панелью вниз в задней части мыши, чтобы создать подкожный карман '' достаточно большой, чтобы соответствовать удобно насос и соединительную трубку после того, как канюлю имплантировали (соединительная трубка не должна быть изогнута по завершении). Очистите очистить панель из более чем спинной части черепа.
    3. Использование примерно 1,5 мм Диаметр стоматологической заусенцев, углубиться в черепе на необходимости стереотаксической координаты иntil тонкий, гибкий слой костных останков. Пил этот слой от использования тонких щипцов (это позволяет избежать повреждения, лежащий в основе твердую мозговую оболочку и мозг с зубной заусенцев). Убедитесь, череп не очищается от любых крови и фрагменты костей, и что в дальнейшем нет кровотечения.
    4. С канюли, удерживаемые держателем канюли, установите насос и соединительную трубку в подкожной "карман", лежащей спиной мыши. Далее, положение кончика канюли в соответствующих стереотаксических координат и на поверхности мозга. Осторожно опустить канюлю в мозг, но остановки приблизительно 1 мм короче на требуемую глубину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: остаточную глубину будет обсуждаться после нанесения первого слоя зубной акрила.
    5. Убедитесь, снова поверхность черепа чистой и сухой, а затем подготовить небольшой объем стоматологической акриловой и использовать зубочистку, чтобы сгладить ее по всей площади открытой черепа, в том числе в заусенцев отверстие через череп вокруг йе канюли. Перед акриловая затвердевает, снизить канюли чаевые остаточную глубину в цель.
    6. Подготовьте другой небольшой объем зубной акриловой и слой над этим первым, а также над белой пластиковой поддержки канюли, чтобы зафиксировать канюлю на месте. Повторите с дополнительными слоями акрила, как это необходимо.
    7. После того, как акрил затвердеет, аккуратно снимите держатель канюли и отрезать пластиковую съемную вкладку Белый канюли, используя лезвие скальпеля с подогревом и бутан пламени. Наконец, пришейте кожу закрыт по всей имплантата.
  3. После хирургического лечения животных
    1. Применяют как антисептическое мази на обочину кожи, и управлять противовоспалительное к мыши (например Мелоксикам, 3 мг / кг, подкожно). Отключив мышь от рамы, поместите его под инфракрасной лампой, и наблюдать, пока она не приходит в сознание. Не возвращайте мышь, которая претерпела операцию по компании других животных, пока полностью выздоровел.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Experimental манипуляции, такие как пол спаривания и обогащения среды может быть начато или возобновлено на следующий день после операции в ближайшее время.
    2. Следить за своим весом тела, общее поведение и внешний вид в день. Лечить признаки инфекции (например, отек, покраснение, гной) вокруг хирургических разрезов с местного антисептической мазью. Лечить каких-либо признаков болезни, боль, стресс или дискомфорт (например, потеря> 10% от массы тела, социальное отчуждение, отсутствие ухода, "разрыхлить", движение дисфункции, судорог) с системными анальгетиков и / или антибиотиков, по мере необходимости.
    3. Эвтаназии мышей, если> 15% потери веса или симптомы болезни, боли, стресса или дискомфорта не являются возмещены в течение 1 недели исправлению лечения.

3. Мозговая ткань Подготовка, Иммуногистохимический Обработка и стереологии

  1. Перфузия
    1. Сразу же после манипуляции / наркотиков окружающей среды, подготовить мозг для изучения.
    2. Во-первых администрирования передозировки анестетика, чтобы убить мышей (например, 100 мг / кг, внутрибрюшинно натрия пентобарбитона). После того, как под наркозом, но до остановки сердца биться, заложить мыши на его спине и галстук или придавить как передние конечности.
    3. Использование скальпеля срежьте кожу вышележащих грудной клетки, то надрезать через мышцу чуть ниже грудной клетки в брюшную полость. Поставьте зажим на мечевидного отростка грудной клетки и поднимите грудную клетку вверх и от печени, подвергая диафрагмы.
    4. Вырезать через диафрагму и через ребра сбоку на обеих сторонах, использующих большие ножницы, пока грудная клетка не может быть сложены над головой, чтобы разоблачить легкие и сердце. Использование тонких ножниц сделать небольшой разрез в правом предсердии в качестве точки выхода крови и перфузии растворов, а затем разрезать на базе левой VentriCLE и место канюли через левый желудочек, левое предсердие и в аорте.
    5. Зажим канюлю в месте, то насос теплой (37 ° С) гепаринизированной и 0,1 М фосфатный буферный физиологический раствор (PBS), через сосудистую до раствора, выходящего в правое предсердие полностью свободны от крови. Далее, насос холодный (4 ° С) Фиксирующий раствор (например, 4% параформальдегида в PBS) через сосудистую пока весь мыши не хорошо фиксированной. Удалите мозг и место в PBS с 30% сахарозы в течение 2-3 дней, пока раковины головного мозга.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другие виды тканевого препарата могут применяться в зависимости от опыта в соответствующей лаборатории.
  2. Подготовка свободно плавающего криосрезы
    1. Вырезать серийные срезы по регионам мозга, представляющих интерес и собирают их в PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы сократили 40 мкм разделы, используя криостат. Другие типы ткани срезов могут применяться в зависимости от опыта в соответствующегнг лаборатория.
  3. Иммуногистохимия
    1. Выполнение стандартного иммуногистохимии для белков, представляющих интерес. Инкубируйте разделы в 5% нормальной козьей сывороткой и 0,3% Тритон Х-100 в PBS при комнатной температуре в течение 30 мин, затем иммунную реакцию с поликлональной кроличьей анти-й (1: 400) при 4 ° С в течение 48 ч, а затем поликлональной биотинилированного козьего антитела -rabbit (1: 1000) при комнатной температуре в течение 2 ч.
    2. Далее, инкубировать в авидин-пероксидазы (1: 500) при комнатной температуре в течение 1 ч, затем в кобальта и никеля усиливается диамино-бензидина (0,5 мг / мл) при комнатной температуре в течение 18-20 мин; за последний 3-5 мин в диамино-бензидина инкубации добавляют пероксид водорода (0,01%), чтобы катализировать хромоген осадков. Промыть разделы три раза в течение 10 минут каждый в PBS до, после и между каждой из вышеуказанных стадий.
    3. Установите в разделах, посвященных желатинизированные микроскопа, воздух сушат их, то Ниссля пятно (нейтральный красный), обезвоживают в спирте, ясно (X-3B), и покровное.
  4. Оценить общее количество TH + и Th- SNc (и ВТА и LC) нейронов с помощью беспристрастных Стереологический методы. Убедитесь, что stereologist слеп к лечению получили. Исключить глии на основе диаметра сомы <5 мкм и рассчитывать только те клетки с видимого ядра.
  5. Определить SNC (и ВТА и LC) пространственными местах TH + клеток и анатомические ориентиры / границ в соответствии с мозга атласа Paxinos и Ватсона 7. Количество Th + клеток в счетной кадра (55 х 55 мкм = 3025 мкм 2) через регулярные заданные интервалы (X = 140 мкм, Y = 140 мкм для SNc; х = 100 мкм, Y = 100 мкм для ВТА и LC) в течение каждого ядра в каждом четвертом разделе.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Взрослые мышей, подвергнутых воздействию этих экологических манипуляций изменили номера мозга (SNC и VTA), но не LC, TH + нейроны, и EE плюс одновременно средний мозг настой или пикротоксина или бикукуллином (ГАМК А рецепторов) отменяет EE-индукцию более SNC TH + нейроны. Эти данные ранее были опубликованы в 6. Полученные данные были сведены в повторных экспериментах, выполненных в рамках этой предыдущем исследовании, но не были опубликованы в другом месте.

В частности, взрослые самцов мышей, которые были в паре с взрослым самкам мышей имеют больше Th + SNC и VTA (средний мозг) нейронов, чем у мужчин в паре с мужчинами, в то время как самки в паре с мужчинами имеют меньше Th + SNC и VTA нейронов, чем у женщин в паре с женщинами (рис 1 в 6). Другой пример этого приводится здесь на рисунке 1, который показывает среднее ± SE числа TH + SNC нейронов в мужских и женских мышей сразу FOllowing Пол спаривания. Мужчины в паре с самками в течение 7 дней примерно 12% больше TH + SNC нейронов, чем у мужчин в паре с мужчинами (две синие колонны на рисунке 1). С другой стороны, женщины в паре с мужчинами имеют примерно 12% меньше TH + SNC нейронов, чем женщин в паре с женщинами (два красных столбца, на рисунке 1).

Количество TH + SNC и VTA нейронов также увеличивается во взрослой самцов мышей с учетом EE (рис 2 в 6), и EE-индукция более SNC Th + нейронов отменены одновременным блокады среднего мозга рецепторов ГАМК А (рис 3 в 6). Другой пример этого приводится здесь на рисунке 2, где EE с настоем транспортного средства в результате примерно на 14% больше TH + SNC нейронов, чем SH с настоем транспортного средства (слева Две колонки на рисунке 2). Тем не менее, EE с ГАМК рецепторов антагонист настой (или 10 мкМ пикротоксин или 51; M бикукуллин) полностью отменили это увеличение (справа две колонки на рисунке 2). Обратите внимание, что эти данные взяты из SNC контралатеральный инфузионной канюли, и почти идентичны эффектов, наблюдаемых в ипсилатеральном SNc о которых было сообщено в 6.

Рисунок 1
Рисунок 1:. Влияние гендерной спаривания по количеству SNC TH + нейронов Сразу после 7 дней гендерного спаривания (протокол 1.1) для взрослых мышей перфузированной (3,1), их средний мозг разрезали (3.2), срезы обработаны для тирозингидроксилазы (TH , ограничение скорости фермента в синтезе DA) иммуногистохимии (3.3), а число TH + SNC нейронов были оценены с использованием стереологии (3,4). Подготовленный здесь средняя ± SE числа SNC Th + нейронов в мышах-самцах в паре с самцов мышей (N = 4 самцов мышей с N = 2 мужского пола, пар, светло-голубой ColУМН), мужчины в паре с женщинами (N = 6 самцов мышей с 6 мужчинами и женщинами пар, темно-синий столбцов), женщины в паре с женщинами (N = 8 самок мышей от N = 4 мама-мама пар, светло-красный столбец) и женщины в паре с мужчинами (N = 6 самок мышей от п = 6 мужчиной и женщиной пар, темно-красный столбец). Сопряжение с противоположным полом привело к увеличению числа SNC TH + нейронов у мужчин, а снижение числа SNC Th + нейронов у женщин (р <0,001 в одну сторону ANOVA; * р <0,05 Тьюки попарно множественные сравнения).

Фиг.2
Рисунок 2: Влияние обогащения среды с среднего мозга ГАМК-рецептор блокада по количеству SNC Th + нейронов Сразу после 14 дней обогащения среды (протокол 1.2) с одновременным вливанием или транспортного средства, ГАМК рецепторов антагонист р.icrotoxin (10 мкМ), или ГАМК антагонист рецептора бикукуллин (5 мкМ) в левую мозга (протокол 2), взрослых самцов мышей перфузии (3,1), их средний мозг разрезали (3,2), срезы обрабатывали для тирозингидроксилазы ( TH, ограничение скорости фермента в DA синтеза) иммуногистохимии (3.3), а число Th + нейронов в праве (противоположной) SNC были оценены с использованием стереологии (3,4). Подготовленный здесь средняя ± SE числа SNC Th + нейронов в стандарте размещается (SH) самцов мышей настоем транспортного средства (п = 6, светло-голубой столбец), окружающая среда обогащается (EE) Мужчины с настоем транспортного средства (п = 6, сначала темно-синий колонка), Е. Е. мужчин с пикротоксина инфузии (п = 6, второй темно-синий столбец) и ЭЭ самцов с бикукуллин инфузии (N = 6, третий темно-синего столбца). EE привело к увеличению числа SNC TH + нейронов, но это было отменено инфузии пикротоксина или бикукуллин в противоположную мозга (р <0,001 Односторонний ANOVA; * Р <0,001 Тьюки попарно множественные сравнения).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Экологические манипуляции

Мотивация разработке этих экологических манипуляций (пол спаривания и окружающей среды обогащения) было определить, является ли окружающую среду, и / или поведения вызвано окружающей среды, связано с изменениями в количестве среднего мозга нейронов DA. Внимание было, следовательно, на создание среды и стимулирование поведения, которые склонны к мозга сигнализации DA. К ним относятся спаривание с противоположным полом, и окружающей среды обогащения, включающий доступ к ходовые колеса, веревки, лестницы, тоннели и объекты изучения, играть, лазить, скрывать, и гнездо. Оба этих условиях должна способствовать вознаграждение почве познавательные, эмоциональные и моторные поведения, которые были связаны с острыми увеличивается в среднем мозге нейронов разряда DA и DA выпуска (например, 8). Наша гипотеза они также связаны с более долговечные изменений в среднем мозге DA сигнализации BRдолжны вызванное изменением числа среднего мозга нейронов DA. Здесь и далее 6, доказательства представлены, что это действительно так.

Наши исследования начали использовать протокол Пол спаривания (1,1), потому что она включает в себя первичную и важную награду-мотивированное поведение ядра (т.е. совокупления). Кроме того, репродуктивной, пара-соединение, и социального поведения, как известно, вызывают аналогичные изменения в других нейрохимических систем (например, изменения в плотности окситоцина, вазопрессина и кортикотропина-рилизинг гормона клеток в гипоталамусе 9). Действительно, после 7 дней непрерывного сопряжения с противоположным полом, мы показываем здесь и в других местах 6, что мужчины имеют примерно на 10% больше Th + мозга нейроны в то время как женщины имеют примерно 10% меньше Th + мозга нейроны [Примечание: Эти эффекты включают в себя SNC (в настоящее время изучение и 6) и 6 ВТА, но не голубого пятна 6, где ТД помогает синтезировать норадреналин].Это подтверждает мнение, что число среднего мозга нейронов дофамина в головном мозге взрослого человека не исправить, но изменяется в зависимости от окружающей среды, поведение, или окружающей среды / поведения взаимодействий. Другие доказательства утверждает, эти изменения вызваны изменениями в экспрессии гена-й и белка в дошедших до нас среднего мозга нейронов, в отличие от Д. нейрогенеза или дегенерации. (1) Д. нейрогенез в мозге взрослых мышей происходит либо вообще не 10-14, или по ставкам значительно ниже, чем можно объяснить добавлением приблизительно 500 новых нейронов DA SNC в неделю 15,16. (2) Исследования количественно изменения в ряде SNC нейронов следующие 2 неделю настои различных лекарственных препаратов, направленных на электрическую активность среднего мозга нейроны последовательно показали равные (опять примерно 10%), но противоположные изменения TH клеток + и Th-, что приводит к отсутствию чистого изменения в Общее количество клеток 4,5. Это согласуется с регулирования уровня белка TH выше или ниже иммуногистохимическое Detectable уровни без сложения или вычитания нейронов. (3) Многие исследования сообщают о деятельности в зависимости от изменений в ген-й и экспрессии белка в клетках в течение масштабах в несколько часов 17-23, и то же самое было зарегистрировано в мозге 4.

Возникает вопрос: каковы механизмы, лежащие в основе изменений в экспрессии гена-й и белка в дошедших до нас среднего мозга нейронов. Возможности включают в себя половых стероидов, которые могут лежать в основе как в базовых различий в количестве TH + среднемозговых нейронов у мужчин и женщин, а также изменения гендерные (увеличивается у мужчин и уменьшается у женщин) следующие спаривания сообщили здесь и ранее 6. Другая возможность состоит в деятельность-зависимой регуляции экспрессии тыс. SNC и VTA нейронов (как DA и не-DA) получают синаптическую вход преимущественно из полосатого тела, гипоталамуса, гипоталамическим ядра, а фронтальная коры 24. В контексте гендерного спаривания, эти входыможет регулироваться по поведению сенсомоторной, обоняния, феромоны, стресс, метаболизм, или воспроизводства. Деятельность-зависимой регуляции TH выражение может быть опосредовано кальция или нейропептида сигнальных путей, влияющих на экспрессию генов и белков (например, 1).

Чтобы помочь различать половых стероидов по сравнению с зависимым от активности механизмы, лежащие в основе эффектов пола спаривания от количества нейронов среднего мозга DA мы использовали протокол обогащения окружающей среды (1.2), в котором лучший контроль в отношении потенциальной действием половых стероидов и, возможно, других гормонов ( например, феромоны, стресс, размножение), так и для потенциального влияния афферентной приводом нейронной активности. Важным фактором здесь является различные группы были гораздо более похожи с точки зрения пола (все мужчины), гормонов, социального статуса и стресса. Хотя социальный статус и стресс может все-таки отличаются между группами (например, более доминирующим и агрессивный мужчинав одной группе), то вряд ли это будет всегда той же группы (например, ЭО), и последствия EE настоящее время воспроизведены несколько раз 6. В ЭО, величина увеличения среднего мозга Th + нейронов был таким же, как в протоколе, пол сопряжения (сравните самцов на фиг.1 и 2 настоящего исследования, и цифры 1 & 2 в 6). Кроме того, увеличение EE-индуцированный в SNC Th + нейронов, вызванных окружающей обогащения был полностью отменен одновременном блокады среднего мозга рецепторов ГАМК А (рис 2 настоящего исследования и рис 3 в 6), которые обеспечивают около 70% всех входных афферентной в среднем мозге DA нейронов 25. Вместе, эти данные свидетельствуют о том афферентных приводом нейронной активности, по крайней мере столь же мощным влиянием на число среднего мозга да нейронов, как гормоны.

Кроме того проникновение в окружающую фактоRS, регулирующие количество среднего мозга Th + нейронов происходит от сравнения эффектов RW и ЭЭ. RW включает хорошо узнал или банальный двигательную активность (бег на колесах), в то время как EE включает такую ​​же сумму такой деятельности, хотя и большего разнообразия (т.е. различные игрушки, но неизменным в течение 14 дней), плюс постоянный контакт с новыми игрушками в Компонент SE (1.2.4). Наши ранее опубликованные данные 6 показал, либо нет или небольшое увеличение SNC и VTA TH + нейронов в РАО по сравнению с SH мышей, но гораздо более значительное увеличение в EE (+ SE) мышей. Это подчеркивает сенсорной стимуляции, познание, новизну и / или обучения и памяти, как более мощные регуляторы числа среднего мозга нейронов DA, ​​чем только банальной физической активности.

EE широко используется, чтобы вызвать терапевтический эффект и повысить ремонт головного мозга в различных животных моделях заболеваний головного мозга, таких как болезнь Альцгеймера, Хантингтона и болезнь Паркинсона 26. Нары из таких экологических манипуляций является то, что они в значительной степени отличаться между лабораториями (как 'нормативно-расположен «условия), однако существуют ключевые аспекты протоколов EE, которые заслуживают внимания, и ранее обсуждавшиеся 27. EE обеспечивает повышенную экологическую новизну и сложность по отношению к стандартным корпусом, с тем чтобы повысить уровень сенсорной стимуляции, познавательной активности и физических упражнений. При разработке ЭЭ эксперименты, необходимо рассмотреть этологическим факторов, в том числе сенсорных и когнитивных способностей животных и их инстинктивных побуждений. Как мышей (и крысы) ведут ночной образ жизни, с худшими визуальных способностей людей, но отличный соматосенсорной и обонятельных Acuities, объекты по обогащению должны отражать врожденные инстинкты и возможности экспериментальных животных. Таким образом, это новизна, форма, текстура и запах объектов, которые могут быть особенно важным, чтобы мышей. Оценки относительной силы Моти грызуновблюдения для различных объектов по обогащению привели к рекомендациям для включения жевательных объектов, чтобы возможность осуществлять фундаментальные, видовые-типичные модели поведения 28,29. Предоставление материала для постройки гнезд считается фундаментальной составляющей протокола по обогащению и мышей инстинктивно оторвать какие-либо предметы, сделанные из бумаги или картона, обеспечивая тем самым возможность для сенсорных, когнитивных и моторных деятельности 30,31. Важно также, что в эксперименте с несколькими клеток EE, эквивалентно новизна и сложность объектов обеспечивается, чтобы свести к минимуму дисперсию в пределах EE группы, и подобные контроль параметров окружающей среды должно осуществляться на SH группы. В идеале, количество мышей в клетке должны быть одинаковыми между ЭО и SH групп (если эффекты размера социальной группы не будучи специально исследовали), и не должны быть использованы не 'пищевые лечит "в EE, как и любые пищевые различий между группами мог Черт тон интерпретация эффектов познавательной деятельности и физических упражнений, что EE повышает 12. Другие ключевые соображения продолжительность воздействия на среде, обогащенной и возраст, в котором обогащение начинается. В то время как дифференциальное выражение генов было показано только после 3 часов в среде, обогащенной 32, более длительные периоды воздействия могут быть необходимы для структурных и функциональных изменений произойти 33,34. Кроме того, обогащение, вызванных пластичности может быть повышена в течение послеродового критические периоды развития 35.

Осмотического насоса и инфузионные мозг канюли имплантаты для вливания наркотиков

В осмотического насоса и канюли имплантаты очень эффективны для доставки лекарств непосредственно в мозг. С опытом, хирургия имплантата занимает около 1 часа на мышь. Один Стоматологическая акриловая достаточно, чтобы исправить канюли на месте в течение длительного периода (Примечание: Мы пошли до 28 дней в оРОЧИЕ эксперименты); нет необходимости в дополнительном оборудовании для крепления, таких как винты кости. Важно, чтобы обеспечить есть много слабину в трубе, соединяющей насос и канюли, чтобы обеспечить максимальную головы и шеи сгибания, не подвергая слишком много внимания на соединениях. Это особенно касается долгосрочных вливаний, где рост соединительной ткани вокруг насоса может закрепить его на месте, тем самым снижая гибкость имплантата. Где это возможно, мышей и одним размещены после операции, чтобы предотвратить соседям, повреждающие имплантата через царапины, потянув или кусаться. Доза препарата в значительной степени определяется количеством добавленного к насосу. Тем не менее, в этом отношении внимание следует обратить на расхода насоса, химической стабильности препарата при 37 ° С, и скорости диффузии лекарственного средства из канюли через мозг. В настоящее время доступны насосы с нашим поставщиком может поддерживать настой на срок до 6 недель при скорости потока 0,15 мкл / ч; быстроТекущая доступны расход составляет 10 мкл / ч, но длится только 1 неделю. Более длительные времена инфузии может быть достигнуто путем выполнения дополнительных операций незначительные замены истощенных насосы с полными насосов на задней части соединительной трубки (т.е. без нарушения имплантированного канюлю). Пространственные масштабы метиленового синего (1% метиленовым синим, МВт 320, в 0,9% NaCl) диффузии из кончика канюли имплантировали 0,3 мм над левой SNC полпути вдоль его медиолатеральной аспекте Было измерено, проходят от бокового края мозга просто по средней линии медиолатерально, и в течение всего дорсовентральной степени среднего мозга (через 2 недели инфузии). Это гораздо более широко, чем небольшое ядро, как SNc и распространение наркотиков может быть больше (или меньше), в зависимости от его МВт, химической стойкостью, буферизации и т.д. Действительно, можно сделать вывод, из имеющихся данных (Рисунок 2), что как пикротоксин и бикукуллин достигли контралатеральной SNC в биологически активной КонцентрацДополнения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isofluorane Baxter Healthcare Pty Ltd, Baxter Drive, NSW 2146, Australia AHN3640
ALZET Osmotic pump 1002 DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 0004317
ALZET Brain infusion kit 1 DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 0004760
ALZET cannula holder 1 DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 0008860
Vertex Monomer Self-curing (dental acrylic solvent) Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, The Netherlands n/a
Vertex Self Curing (dental acrylic powder) Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, The Netherlands n/a
METACAM (Meloxicam) Troy Laboratories, 98 long Street, smithfield NSW 2164 Australia L10100
Sodium Pentobarbitone Lethabarb, Virbac, Milperra, NSW, Australia 571177
Normal goat serum chemicon-temecula, CA S26-Litre
Triton X-100 Merck Millipore Headquarters , 290 Concord road, Billerica, MA 01821 1.08603.1000
Polyclonal rabbit anti-tyrosine hydroxylase Merck Millipore Headquarters , 290 Concord road, Billerica, MA 01821 AB152
Polyclonal biotinylated goat anti-rabbit Dako Australia Pty. Ltd., Suite 4, Level 4, 56 Berry street, North Sydney, NSW, Australia 2060 EO432
Avidin peroxidase Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU A3151-1mg
Diamino-benzidine Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU D-5637
Stereo Investigator MicroBrightField Bioscience, 185 Allen Brook Lane, Suite 101, Williston, VT 05495 n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aumann, T., Horne, M. Activity-dependent regulation of the dopamine phenotype in substantia nigra neurons. Journal of neurochemistry. 121, 497-515 (2012).
  2. Sauer, H., Oertel, W. H. Progressive degeneration of nigrostriatal dopamine neurons following intrastriatal terminal lesions with 6-hydroxydopamine: a combined retrograde tracing and immunocytochemical study in the rat. Neuroscience. 59, 401-415 (1994).
  3. Stanic, D., Finkelstein, D. I., Bourke, D. W., Drago, J., Horne, M. K. Timecourse of striatal re-innervation following lesions of dopaminergic SNpc neurons of the rat. The European journal of neuroscience. 18, 1175-1188 (2003).
  4. Aumann, T. D., et al. Neuronal activity regulates expression of tyrosine hydroxylase in adult mouse substantia nigra pars compacta neurons. Journal of neurochemistry. 116, 646-658 (2011).
  5. Aumann, T. D., et al. SK channel function regulates the dopamine phenotype of neurons in the substantia nigra pars compacta. Experimental neurology. 213, 419-430 (2008).
  6. Aumann, T. D., Tomas, D., Horne, M. K. Environmental and behavioral modulation of the number of substantia nigra dopamine neurons in adult mice. Brain and behavior. 3, 617-625 (2013).
  7. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd, Academic Press. (2001).
  8. Schultz, W. Behavioral dopamine signals. Trends in neurosciences. 30, 203-210 (2007).
  9. Sun, P., Smith, A. S., Lei, K., Liu, Y., Wang, Z. Breaking bonds in male prairie vole: long-term effects on emotional and social behavior, physiology, and neurochemistry. Behavioural brain research. 265, 22-31 (2014).
  10. Aponso, P. M., Faull, R. L., Connor, B. Increased progenitor cell proliferation and astrogenesis in the partial progressive 6-hydroxydopamine model of Parkinson's disease. Neuroscience. 151, 1142-1153 (2008).
  11. Frielingsdorf, H., Schwarz, K., Brundin, P., Mohapel, P. No evidence for new dopaminergic neurons in the adult mammalian substantia nigra. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 10177-10182 (2004).
  12. Lie, D. C., et al. The adult substantia nigra contains progenitor cells with neurogenic potential. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6639-6649 (2002).
  13. Chen, Y., Ai, Y., Slevin, J. R., Maley, B. E., Gash, D. M. Progenitor proliferation in the adult hippocampus and substantia nigra induced by glial cell line-derived neurotrophic factor. Experimental neurology. 196, 87-95 (2005).
  14. Yoshimi, K., et al. Possibility for neurogenesis in substantia nigra of parkinsonian brain. Ann Neurol. 58, 31-40 (2005).
  15. Shan, X., et al. Enhanced de novo neurogenesis and dopaminergic neurogenesis in the substantia nigra of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced Parkinson's disease-like mice. Stem Cells. 24, 1280-1287 (2006).
  16. Zhao, M., et al. Evidence for neurogenesis in the adult mammalian substantia nigra. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7925-7930 (2003).
  17. Baker, H., Kawano, T., Margolis, F. L., Joh, T. H. Transneuronal regulation of tyrosine hydroxylase expression in olfactory bulb of mouse and rat. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 3, 69-78 (1983).
  18. Black, I. B., Chikaraishi, D. M., Lewis, E. J. Trans-synaptic increase in RNA coding for tyrosine hydroxylase in a rat sympathetic ganglion. Brain research. 339, 151-153 (1985).
  19. Zigmond, R. E., Chalazonitis, A., Joh, T. Preganglionic nerve stimulation increases the amount of tyrosine hydroxylase in the rat superior cervical ganglion. Neuroscience letters. 20, 61-65 (1980).
  20. Biguet, N. F., Rittenhouse, A. R., Mallet, J., Zigmond, R. E. Preganglionic nerve stimulation increases mRNA levels for tyrosine hydroxylase in the rat superior cervical ganglion. Neuroscience letters. 104, 189-194 (1989).
  21. Richard, F., et al. Modulation of tyrosine hydroxylase gene expression in rat brain and adrenals by exposure to cold. Journal of neuroscience research. 20, 32-37 (1988).
  22. Schalling, M., Stieg, P. E., Lindquist, C., Goldstein, M., Hokfelt, T. Rapid increase in enzyme and peptide mRNA in sympathetic ganglia after electrical stimulation in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4302-4305 (1989).
  23. Liaw, J. J., He, J. R., Barraclough, C. A. Temporal changes in tyrosine hydroxylase mRNA levels in A1, A2 and locus ceruleus neurons following electrical stimulation of A1 noradrenergic neurons. Brain research. Molecular brain research. 13, 171-174 (1992).
  24. Watabe-Uchida, M., Zhu, L., Ogawa, S. K., Vamanrao, A., Uchida, N. Whole-brain mapping of direct inputs to midbrain dopamine neurons. Neuron. 74, 858-873 (2012).
  25. Tepper, J. M., Lee, C. R. GABAergic control of substantia nigra dopaminergic neurons. Progress in brain research. 160, 189-208 (2007).
  26. Hannan, A. J. Environmental enrichment and brain repair: harnessing the therapeutic effects of cognitive stimulation and physical activity to enhance experience-dependent plasticity. Neuropathology and applied neurobiology. 40, 13-25 (2014).
  27. Nithianantharajah, J., Hannan, A. J. Enriched environments, experience-dependent plasticity and disorders of the nervous system. Nature reviews. Neuroscience. 7, 697-709 (2006).
  28. Chmiel, D. J., Noonan, M. Preference of laboratory rats for potentially enriching stimulus objects. Laboratory animals. 30, 97-101 (1996).
  29. Hanmer, L. A., Riddell, P. M., Williams, C. M. Using a runway paradigm to assess the relative strength of rats' motivations for enrichment objects. Behavior research methods. 42, 517-524 (2010).
  30. Burrows, E. L., McOmish, C. E., Hannan, A. J. Gene-environment interactions and construct validity in preclinical models of psychiatric disorders. Progress in neuro-psychopharmacology & biological psychiatry. 35, 1376-1382 (2011).
  31. Van de Weerd, H. A., Van Loo, P. L. P., Van Zutphen, L. F. M., Koolhaas, J. M., Baumans, V. Strength of preference for nesting material as environmental enrichment for laboratory mice. Applied Animal Behaviour Science. 55, 369-382 (1998).
  32. Rampon, C., et al. Effects of environmental enrichment on gene expression in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 12880-12884 (2000).
  33. Eckert, M. J., Abraham, W. C. Effects of environmental enrichment exposure on synaptic transmission and plasticity in the hippocampus. Current topics in behavioral neurosciences. 15, 165-187 (2013).
  34. Sztainberg, Y., Chen, A. An environmental enrichment model for mice. Nature protocols. 5, 1535-1539 (2010).
  35. Sale, A., Berardi, N., Maffei, L. Environment and brain plasticity: towards an endogenous pharmacotherapy. Physiological reviews. 94, 189-234 (2014).

Tags

Neuroscience выпуск 95 поведение средний мозг тирозингидроксилазы допамин пластичность черного вещества Парс компактов
Экологические модуляций Количество мозга допамина нейронов у взрослых мышей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tomas, D., Prijanto, A. H., Burrows, … More

Tomas, D., Prijanto, A. H., Burrows, E. L., Hannan, A. J., Horne, M. K., Aumann, T. D. Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice. J. Vis. Exp. (95), e52329, doi:10.3791/52329 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter