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Neuroscience

वयस्क चूहों में मध्यमस्तिष्क डोपामिन न्यूरॉन्स की संख्या से पर्यावरण modulations

Published: January 20, 2015 doi: 10.3791/52329
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Florey Institute of Neuroscience and Mental Health, The University of Melbourne

Abstract

मस्तिष्क या 'मस्तिष्क plasticity' में लंबे समय से स्थायी परिवर्तन की बीमारी या चोट के बाद अनुकूली व्यवहार और मस्तिष्क की मरम्मत आबाद। इसके अलावा, हमारे पर्यावरण के साथ बातचीत मस्तिष्क plasticity प्रेरित कर सकते हैं। तेजी से, अनुसंधान मस्तिष्क और व्यवहार विकारों के इलाज के लिए लाभकारी मस्तिष्क plasticity को प्रोत्साहित जो वातावरण की पहचान करने की कोशिश कर रहा है। दो पर्यावरण जोड़तोड़ वर्णित हैं जो वृद्धि या वयस्क माउस मध्यमस्तिष्क में न्यूरॉन्स tyrosine hydroxylase immunopositive की संख्या (वीं + डोपामाइन (डीए) संश्लेषण में दर सीमित एंजाइम) में कमी। पहले बाँधना पुरुष और एक साथ लगातार पुरुषों में लगभग 12% से मध्यमस्तिष्क वें + न्यूरॉन्स बढ़ जाती है जो एक सप्ताह के लिए मादा चूहों शामिल हैं, लेकिन महिलाओं में लगभग 12% से मध्यमस्तिष्क वें + न्यूरॉन्स कम हो जाती है। दूसरा आदि चल पहियों, खिलौने, रस्सी, घोंसले के शिकार सामग्री, युक्त 'समृद्ध वातावरण' (ईई) में दो सप्ताह के लिए लगातार आवास चूहों शामिल हैं जो मैंपुरुषों में लगभग 14% से मध्यमस्तिष्क वें + न्यूरॉन्स ncreases। इसके अतिरिक्त, एक प्रोटोकॉल समवर्ती पर्यावरण की दृष्टि से प्रेरित मस्तिष्क plasticity अंतर्निहित तंत्र की पहचान में मदद करने के लिए इन पर्यावरण जोड़तोड़ के दौरान सीधे मध्यमस्तिष्क में दवाओं infusing के लिए वर्णित है। उदाहरण के लिए, अधिक मध्यमस्तिष्क वें + न्यूरॉन्स की ई-प्रेरण मध्यमस्तिष्क न्यूरॉन्स पर synaptic इनपुट की समवर्ती नाकाबंदी द्वारा समाप्त कर दिया गया है। साथ में, इन आंकड़ों के माहौल के बारे में सूचना के आधार पर या 'डीए' जीनों की अभिव्यक्ति बंद करने के लिए मध्यमस्तिष्क न्यूरॉन्स के लिए synaptic इनपुट के माध्यम से रिले की जाती है कि संकेत मिलता है। इस प्रकार, अंतर्निहित तंत्र की लक्षित कर उचित पर्यावरण उत्तेजना, या दवा, मध्यमस्तिष्क महंगाई भत्ते में असंतुलन के साथ जुड़े मस्तिष्क और व्यवहार विकारों के इलाज के लिए उपयोगी हो सकता है (उदाहरण के लिए पार्किंसंस रोग, ध्यान घाटे और सक्रियता विकार, मानसिक असंतुलन, और मादक पदार्थों की लत)।

Introduction

मध्यमस्तिष्क के उदर tegmental क्षेत्र (वीटीए) और सब्सटेंशिया निग्रा पार्स कॉम्पेक्टा (एसएनसी) में न्यूरॉन्स द्वारा DArgic संकेतन इनाम प्रेरित संज्ञानात्मक, भावनात्मक और मोटर व्यवहार के लिए महत्वपूर्ण माना जाता है। हालांकि, बहुत ज्यादा या बहुत कम मध्यमस्तिष्क डीए संकेतन कई अक्षम करने स्नायविक विकारों की एक किस्म में लक्षण (जैसे पार्किंसंस रोग, ध्यान घाटे और सक्रियता विकार, मानसिक असंतुलन, और मादक पदार्थों की लत) का कारण बनता है। वृद्धि या डीए इन लक्षणों को कम संकेत कमी है कि ड्रग्स, हालांकि उन्होंने यह भी dysregulated संकेतन के कारण एक ओर का प्रभाव और बंद लक्ष्य प्रभाव पैदा करते हैं। दवा की प्रभावकारिता भी कारण मस्तिष्क के प्रतिपूरक जवाब करने के लिए समय के साथ गिरावट आती है। चुनौती इसलिए एक अधिक लक्षित और शारीरिक तरह से सामान्य मध्यमस्तिष्क डीए संकेतन बहाल करने के लिए है, और एक इष्ट दृष्टिकोण बढ़ाने या मध्यमस्तिष्क डीए न्यूरॉन्स की संख्या कम कर रहा है।

साक्ष्य सेव लिए जमा किया गया है(1 में समीक्षा) परिपक्व वयस्क कोशिकाओं में metabolizing और तस्करी महंगाई भत्ते और अन्य catecholamines में शामिल जीन और प्रोटीन की अभिव्यक्ति परिवर्तनीय है कि आम दशकों। गु immunonegative (गु) न्यूरॉन्स की संख्या विपरीत पैटर्न से पता चलता है, जबकि मध्यमस्तिष्क में, tyrosine hydroxylase immunopositive की संख्या (वीं + डीए संश्लेषण में दर सीमित एंजाइम) न्यूरॉन्स तो (यानी बढ़ जाती है न्यूरोटॉक्सिन प्रशासन 2,3 निम्नलिखित बढ़ जाती है घट जाती है तो) 3 कम हो जाती है। यह तो कुछ कोशिकाओं द्वारा 'दा फेनोटाइप' के लाभ हानि के साथ संगत है। गु + और ​​गु एसएनसी न्यूरॉन्स की संख्या भी इन कोशिकाओं 4,5 की विद्युतीय गतिविधि को बदलने वाले विभिन्न उपचार के बाद बराबर लेकिन विपरीत दिशाओं में परिवर्तित करने के लिए दिखाया गया है। उदाहरण के लिए, 2 सप्ताह के लिए मध्यमस्तिष्क में छोटे-प्रवाहकत्त्व के अर्क, कैल्शियम सक्रिय पोटेशियम (एस) चैनल प्रतिपक्षी apamin (एक ही राशि के द्वारा) परमाणु वें + और बढ़ जाती है की संख्या कम हो जाती हैगु एसएनसी के mber 4,5 न्यूरॉन्स। इसके विपरीत, एसके चैनल एगोनिस्ट एक-EBIO के अर्क वें + की संख्या बढ़ जाती है और (एक ही राशि के द्वारा) गु एसएनसी न्यूरॉन्स 4,5 की संख्या कम हो जाती है। इसी प्रकार के परिवर्तन अभिवाही आदानों चार लक्षित जो कुछ सहित एसएनसी neuronal गतिविधि को लक्षित उपचार की एक किस्म निम्नलिखित में देखा गया था। Neuronal गतिविधि और अभिवाही इनपुट से एसएनसी DArgic न्यूरॉन्स की संख्या से यह स्पष्ट विनियमन पर्यावरण या व्यवहार एसएनसी न्यूरॉन्स की संख्या को प्रभावित कर सकते हैं कि संभावना को जन्म देती है। अलग वातावरण के संपर्क में वास्तव में वयस्क चूहों कम या ज्यादा मध्यमस्तिष्क (एसएनसी और वीटीए) वें + न्यूरॉन्स, और ये पर्यावरण प्रेरित परिवर्तन के कम से कम कुछ मध्यमस्तिष्क 6 में synaptic इनपुट की समवर्ती नाकाबंदी द्वारा समाप्त कर दिया जाता है। (1) हमारे पर्यावरण जोड़तोड़ और दवा लेनी लागू करने के तरीके के बारे में अधिक जानकारी प्रदान;: इस संचार के उद्देश्य के लिए कर रहे हैं और (2) ई कि हमारा तर्क का समर्थन करने के लिए आगे डेटा प्रदानnvironment अभिवाही इनपुट के माध्यम से, मध्यमस्तिष्क डीए न्यूरॉन्स की संख्या को नियंत्रित करता है।

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Protocol

नोट: सभी जानवरों पर प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं तंत्रिका विज्ञान और मानसिक स्वास्थ्य पशु आचार समिति के फ्लोरे संस्थान द्वारा अनुमोदित और ऑस्ट्रेलिया के राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद के अनुरूप थे, वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए अभ्यास का कोड (7 वें संस्करण प्रकाशित 2004)।

1. पर्यावरण जोड़तोड़

  1. लिंग बाँधना
    1. यौन परिपक्व (> 8 सप्ताह पुराने), उम्र से मिलान नर और मादा चूहों का प्रयोग करें।
      नोट: हम आम तौर पर C57BL / 6 चूहों का उपयोग करें, लेकिन इस प्रोटोकॉल में स्विस चूहों का उपयोग कर एक ही परिणामों पड़ा है। हम आम तौर पर एन = (एन = 4 पुरुषों) एन = 2 पुरुष-पुरुष जोड़े में विभाजित है, एक प्रयोग के लिए एन = 8 पुरुषों और एन = 8 महिलाओं का उपयोग दो महिला-महिला जोड़े (एन = 4 महिलाओं), और एन = 4 पुरुष-महिला जोड़े (एन = 4 पुरुषों और एन = 4 महिलाओं)।
    2. पशु पकड़े सुविधा, समूह-घर में आगमन पर> 3 दिनों के लिए लिंग द्वारा चूहों acclimatize करने के लिए। यहाँ और througHOUT लिंग बाँधना, बाहरी पर्यावरण उत्तेजनाओं रखने (जैसे परिवेश के तापमान, प्रकाश: अंधेरे चक्र, भोजन, पानी, हैंडलिंग और सफाई) निरंतर या सभी चूहों को समान रूप से वितरित।
    3. बेतरतीब ढंग से एक पुरुष-पुरुष जोड़ी, एक महिला-महिला जोड़ी है, या एक पुरुष-महिला जोड़ी के लिए प्रत्येक माउस आवंटित। भोजन और पानी के लिए यथेच्छ उपयोग के साथ अलगाव में एक साफ पिंजरे (2 चूहों / पिंजरे) में प्रत्येक जोड़ी प्लेस, और बस 7 दिनों के लिए लगातार इस तरह से उन्हें घर।
      नोट: नियमित पशुपालन इस अवधि के दौरान ठीक है, लेकिन सभी चूहों को समान रूप से वितरित किया जाना चाहिए। पुरुष और महिला littermates की जोड़ी से बचने के लिए ध्यान रखना।
  2. पर्यावरण संवर्धन
    1. यौन परिपक्व (> 8 सप्ताह पुराने), उम्र से मिलान पुरुष या महिला चूहों का प्रयोग करें।
      नोट: हम आम तौर पर एन = 6 / इलाज के समूह में बांटा गया एक प्रयोग के लिए एन = 18 चूहे, का उपयोग करें।
    2. समूह-रखे समान मानक में रखे रखने के लिए उन्हें पशु पकड़े सुविधा में आगमन पर (एसएच) (जैसे (जैसे परिवेश के तापमान, प्रकाश: अंधेरे चक्र, भोजन, पानी, हैंडलिंग और सफाई) निरंतर या सभी चूहों को समान रूप से वितरित।
    3. पर्यावरण संवर्धन शुरू करने के लिए, बेतरतीब ढंग से तीन समूहों में से एक के लिए प्रत्येक माउस आवंटित: एसएच; चल पहिया (आरडब्ल्यू), या पर्यावरण को समृद्ध (ईई) और साथ में भोजन और पानी के लिए यथेच्छ उपयोग के साथ एक समान स्वच्छ पिंजरे में चूहों के प्रत्येक समूह के लिए जगह है।
      नोट: सभी समूहों के लिए यहाँ, बड़े चूहे पकड़े पिंजरों, 42 सेमी लंबी, चौड़ी 27 सेमी को मापने, और गहरी 16 सेमी इस्तेमाल किया गया।
      1. इसके अलावा, निम्न पर्यावरण प्रत्येक समूह के लिए शर्तों प्रदान करते हैं: फर्श पर ही कूड़े शामिल एसएच (कागज छर्रों या चूरा); आरडब्ल्यू शामिल एसएच प्लस 2 चल पहियों; ईई (रस्सी, सीढ़ी, सुरंगों, और खाली कागज तौलिया रोल और टिशू पेपर के टुकड़े के रूप में ऐसी वस्तुओं) आरडब्ल्यू प्लस खिलौने शामिल हैं, जिसके साथ पूर्व के लिएplore, नाटक, चढ़ाई, छुपाने के लिए, और घोंसला।
      2. 14 दिनों के लिए लगातार इस तरह से उनके घर।
        नोट: नियमित पशुपालन इस अवधि के दौरान ठीक है, लेकिन सभी चूहों को समान रूप से वितरित किया जाना चाहिए।
    4. 1hour / दिन (एक ही घंटे प्रत्येक दिन), 5days / सप्ताह के लिए उपन्यास खिलौने युक्त एक बड़ा पिंजरे में उन्हें एक साथ रखने से अतिरिक्त 'सुपर-संवर्धन' (एसई) के अधीन ईई चूहों।
      नोट: ये लो, एक 46 सेमी चौड़ा, 69 सेमी लंबा, और 40 सेमी गहरी प्लास्टिक टब इस्तेमाल किया गया था।
      1. खिलौने का एक अलग सेट प्रत्येक सत्र पेश करके नवीनता बनाए रखें। कर रहे हैं कि स्वच्छ खिलौने साबुन पानी और scents दूर करने के लिए 80% इथेनॉल के साथ चूहों को फिर से प्रस्तुत किया।
      2. प्रत्येक एसई सत्र के बाद, उनके ईई पिंजरे में चूहों लौटने। हैंडल एसएच और आरडब्ल्यू चूहों इस अवधि के दौरान (एसई के लिए ही छोड़कर) एसई चूहों के रूप में ही (जैसे हटाने के लिए और से और अपने पिंजरे करने के लिए प्रत्येक एसएच और आरडब्ल्यू माउस वापसी)।

  1. तैयारी
    1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, जो बाँझ आसमाटिक पंप और मस्तिष्क अर्क किट, का प्रयोग करें। आरोपण से पहले दिन, सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग कर, प्रत्येक पंप भरने (पंप के साथ आपूर्ति निर्देश में वर्णित) बाँझ दवा या वाहन के समाधान के साथ ट्यूब और प्रवेशनी जोड़ने के द्वारा प्रधानमंत्री प्रत्यारोपण। उन्हें एक साथ कनेक्ट और 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात बाँझ खारा में सेते हैं। पार संदूषण से बचने के लिए अलग से दवा और वाहन से भरे प्रत्यारोपण सेते हैं।
  2. सर्जरी।
    नोट: प्रयोगकर्ता के देश पर निर्भर करता है, विशेष पशु प्रयोग परमिट या भत्ते सर्जरी और पोस्ट ऑपरेटिव प्रयोगों को इस तरह की आगे बढ़ाने के लिए आवश्यक हैं।
    1. सभी सर्जिकल उपकरण जीवाणुरहित और भर में सड़न रोकनेवाला तकनीक को रोजगार। (जैसे हवा में 1-2% isofluorane का प्रयोग करके) एक माउस anesthetize और एक Stere में जगहotaxic headframe। प्रक्रिया के दौरान संज्ञाहरण की गहराई से जांच और आवश्यक के रूप में आगे संवेदनाहारी प्रशासन (हानिकारक पंजा चुटकी करने के लिए अंग वापसी की जैसे अभाव पर्याप्त संज्ञाहरण का संकेत है)। सुनिश्चित करें आंखों स्नेहक नेत्र मरहम से सुखाना से संरक्षित हैं, और माउस के शरीर का तापमान प्रक्रिया के दौरान सामान्य बनी हुई है कि कर रहे हैं।
    2. सेमी खोपड़ी के पीछे किनारे करने के पीछे दो आंखों के बीच और परिष्करण से शुरू त्वचा के माध्यम से एक midline चीरा बनाओ। आराम से पंप और प्रवेशनी (जोड़ने ट्यूब पूरा होने पर आमादा हो नहीं होना चाहिए) प्रत्यारोपित किया जाता है एक बार जोड़ने ट्यूब फिट करने के लिए एक काफी बड़े के चमड़े के नीचे 'जेब' बनाने के लिए दूर माउस के पीछे के नीचे अंतर्निहित प्रावरणी से त्वचा काटना कुंद। खोपड़ी के पृष्ठीय पहलू भर से प्रावरणी को खाली परिमार्जन।
    3. , एक लगभग 1.5 मिमी व्यास दंत गड़गड़ाहट का प्रयोग उचित stereotaxic यू के निर्देशांक पर खोपड़ी में नीचे ड्रिलntil हड्डी की एक पतली, लचीली परत बनी हुई है। पील दूर ठीक संदंश का उपयोग करते हुए इस परत (इस दंत गड़गड़ाहट के साथ अंतर्निहित ड्यूरा मेटर और मस्तिष्क को नुकसान पहुँचाए से बचा जाता है)। सुनिश्चित करें खोपड़ी किसी भी रक्त और हड्डी के टुकड़े की साफ किया, और वहाँ है कि आगे कोई खून बह रहा है।
    4. एक प्रवेशनी धारक द्वारा आयोजित प्रवेशनी के साथ, माउस की पीठ overlying चमड़े के नीचे 'जेब' में पंप और जोड़ने ट्यूब जगह है। अगला, उचित stereotaxic निर्देशांक पर और मस्तिष्क की सतह पर प्रवेशनी की नोक स्थिति। ध्यान से मस्तिष्क में प्रवेशनी कम है लेकिन अपेक्षित गहराई की कमी लगभग 1 मिमी बंद करो।
      नोट: शेष गहराई दंत एक्रिलिक की पहली परत के आवेदन निम्नलिखित बातचीत के जरिए किया जाएगा।
    5. खोपड़ी की सतह को साफ और शुष्क है फिर से सुनिश्चित करें, तो दंत एक्रिलिक की एक छोटी मात्रा में तैयार करने और वें आसपास खोपड़ी के माध्यम से गड़गड़ाहट से छेद में शामिल हैं, खोपड़ी की पूरी उजागर क्षेत्र पर इसे सुचारू करने के लिए एक दन्तखुदनी का उपयोगई प्रवेशनी। एक्रिलिक hardens से पहले, प्रवेशनी लक्ष्य में शेष गहराई टिप कम है।
    6. जगह में प्रवेशनी ठीक करने के लिए, प्रवेशनी के लिए सफेद प्लास्टिक समर्थन पर है, साथ ही दंत एक्रिलिक की एक और छोटी मात्रा को तैयार है और पहले से अधिक इस परत। आवश्यक के रूप में एक्रिलिक के अतिरिक्त परतों के साथ दोहराएँ।
    7. एक्रिलिक कठोर है, एक बार ध्यान से प्रवेशनी धारक को हटाने और एक ब्यूटेन लौ के साथ गरम एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर सफेद प्लास्टिक हटाने योग्य प्रवेशनी टैब काट दिया। अन्त में, पूरे प्रत्यारोपण के ऊपर बंद हुआ त्वचा सीवन।
  3. पशु की शल्य चिकित्सा के बाद उपचार
    1. त्वचा मार्जिन के लिए एंटीसेप्टिक मरहम लागू करें, और माउस के लिए एक विरोधी भड़काऊ प्रशासन (जैसे Meloxicam, 3 मिलीग्राम / किलो सुप्रीम कोर्ट)। , फ्रेम से माउस निकालें एक गर्मी दीपक के नीचे यह जगह है, और यह होश आएगा जब तक निरीक्षण करते हैं। पूरी तरह से ठीक है जब तक अन्य जानवरों की कंपनी के लिए सर्जरी आया है कि एक माउस वापस नहीं करते।
      नोट: भूतजैसे लिंग बाँधना और पर्यावरण संवर्धन के रूप में erimental जोड़तोड़ शुरू की या जल्द से जल्द सर्जरी के बाद दिन फिर से शुरू किया जा सकता है।
    2. उनके शरीर के वजन, दैनिक सामान्य व्यवहार और उपस्थिति की निगरानी। सामयिक एंटीसेप्टिक मरहम साथ शल्य चीरों चारों ओर संक्रमण के लक्षण (जैसे सूजन, लालिमा, मवाद) का इलाज। आवश्यक के रूप में प्रणालीगत दर्दनाशक दवाओं और / या एंटीबायोटिक दवाओं के साथ किसी भी लक्षण के बीमारी, दर्द, तनाव या बेचैनी (> 10% शरीर के वजन, सामाजिक वापसी, संवारने की कमी के कारण जैसे हानि, "fluffing", आंदोलन में शिथिलता, दौरे) का इलाज।
    3. > 15% वजन घटाने या बीमारी, दर्द, तनाव या बेचैनी के लक्षणों उपचारात्मक उपचार के एक सप्ताह के भीतर गैर वसूली कर रहे हैं अगर चूहों euthanize।

3. मस्तिष्क ऊतक तैयारी, Immunohistochemical प्रसंस्करण, और Stereology

  1. छिड़काव
    1. इसके तत्काल बाद पर्यावरण / दवा जोड़तोड़ के बाद, अध्ययन के लिए मस्तिष्क तैयार करते हैं।
    2. प्रथम (जैसे 100 मिलीग्राम / किग्रा आईपी सोडियम pentobarbitone) चूहों को मारने के लिए संवेदनाहारी की एक ज्यादा प्रशासन। एक बार anesthetized लेकिन दिल की धड़कन बंद हो जाता है, इससे पहले अपनी पीठ पर माउस लेट गया और टाई या दोनों forelimbs नीचे पिन।
    3. एक स्केलपेल का उपयोग छाती तो उदर गुहा में सिर्फ रिब पिंजरे के नीचे मांसपेशियों के माध्यम से काटकर अलग कर देना overlying त्वचा दूर काटा। Ribcage के असिरूप प्रक्रिया पर एक क्लैंप प्लेस और डायाफ्राम उजागर जिगर से ऊपर और दूर ribcage उठा।
    4. डायाफ्राम के माध्यम से और laterally ribcage वापस फेफड़े और दिल को बेनकाब करने के लिए सिर पर तह किया जा सकता जब तक बड़ी कैंची का उपयोग दोनों पक्षों पर पसलियों के माध्यम से कट। ठीक कैंची एक बाहर निकलें रक्त के लिए बिंदु और perfused समाधान के रूप में सही प्रांगण में एक छोटा सा चीरा बनाने का उपयोग करना, फिर छोड़ दिया ventri के आधार के माध्यम से कटौतीCLE और बाएं वेंट्रिकल, बाएं आलिंद के माध्यम से ऊपर एक प्रवेशनी जगह है, और महाधमनी में।
    5. Heparinized गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) पंप तो जगह में प्रवेशनी दबाना और सही आलिंद बाहर निकलने समाधान जब तक वाहिका संरचना के माध्यम से 0.1 एम फॉस्फेट बफर शारीरिक खारा (पीबीएस) रक्त की पूरी तरह से स्वतंत्र है। पूरे माउस अच्छी तरह से तय हो गई है जब तक अगला, वाहिका संरचना के माध्यम से ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) लगानेवाला समाधान (पीबीएस में इस तरह के रूप में 4% paraformaldehyde) पंप। मस्तिष्क डूब तक 2-3 दिनों के लिए 30% sucrose के साथ पीबीएस में मस्तिष्क और जगह निकालें।
      नोट: ऊतक तैयारी के अन्य प्रकार इसी प्रयोगशाला में विशेषज्ञता के आधार पर लागू किया जा सकता है।
  2. मुक्त अस्थायी cryosections की तैयारी
    1. ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्रों के माध्यम से धारावाहिक वर्गों में कटौती और पीबीएस में इन इकट्ठा।
      नोट: हम एक cryostat का उपयोग कर 40 माइक्रोन मोटी वर्गों में कटौती। ऊतक सेक्शनिंग के अन्य प्रकार correspondi में विशेषज्ञता के आधार पर लागू किया जा सकता हैएनजी प्रयोगशाला।
  3. Immunohistochemistry
    1. ब्याज की प्रोटीन के लिए मानक immunohistochemistry के प्रदर्शन करना। 48 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर: (400 1), तो पॉलीक्लोनल biotinylated बकरी विरोधी पॉलीक्लोनल खरगोश विरोधी वें के साथ, फिर 30 मिनट के लिए immunoreact कमरे के तापमान पर पीबीएस में 5% सामान्य बकरी सीरम और 0.3% ट्राइटन X-100 में वर्गों सेते 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर: -rabbit (1000) 1।
    2. 18-20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर फिर cobalt- और निकल तेज diamino-benzidine (0.5 मिलीग्राम / एमएल) में, 1hr के लिए कमरे के तापमान पर;: अगला, avidin-peroxidase (500 1) में सेते diamino-benzidine ऊष्मायन के पिछले 3-5 मिनट के लिए क्रोमाजेन वर्षा उत्प्रेरित करने के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड (0.01%) जोड़ें। इससे पहले, बाद, और ऊपर के चरणों में से प्रत्येक के बीच पीबीएस में वर्गों 10min के लिए तीन बार प्रत्येक धो लें।
    3. तो, हवा उन्हें सूखी, gelatinized खुर्दबीन स्लाइड पर Nissl दाग (तटस्थ) लाल वर्गों माउंट, शराब, स्पष्ट (एक्स-3 बी), और coverslip में निर्जलीकरण।
  4. निष्पक्ष stereological तरीकों का उपयोग वें + और गु एसएनसी (और वीटीए और नियंत्रण रेखा) न्यूरॉन्स की कुल संख्या का अनुमान है। Stereologist प्राप्त उपचार के लिए अंधा होता है कि सुनिश्चित करें। सोमा व्यास <5 माइक्रोन के आधार पर glia बाहर निकालें और एक दृश्य नाभिक के साथ ही उन कोशिकाओं गिनती।
  5. गु + कोशिकाओं और Paxinos और वाटसन 7 के मस्तिष्क एटलस के अनुसार संरचनात्मक स्थलों / सीमाओं के स्थानिक स्थानों से एसएनसी (और वीटीए और नियंत्रण रेखा) को पहचानें। (; एक्स = 100 माइक्रोन, वाई = वीटीए और नियंत्रण रेखा के लिए 100 माइक्रोन एक्स y = 140 माइक्रोन, = एसएनसी के लिए 140 माइक्रोन) नियमित रूप से पूर्व निर्धारित अंतराल पर एक गिनती सीमा के भीतर वें + कोशिकाओं (55 X 55 माइक्रोन = 3025 माइक्रोन 2) गणना हर चौथे खंड में प्रत्येक नाभिक भर में।

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Representative Results

इन पर्यावरण जोड़तोड़ के अधीन वयस्क चूहों मध्यमस्तिष्क की संख्या (एसएनसी और वीटीए), लेकिन नहीं नियंत्रण रेखा बदल दिया है, गु + न्यूरॉन्स, ईई प्लस picrotoxin या bicuculline या तो की समवर्ती मध्यमस्तिष्क अर्क (GABA एक रिसेप्टर विरोधी) और ई-प्रेरण समाप्त अधिक एसएनसी वें + न्यूरॉन्स। इन आंकड़ों में पहले छह में प्रकाशित किए गए थे। वर्तमान डेटा कि पिछले अध्ययन के हिस्से के रूप में प्रदर्शन को दोहराने के प्रयोगों में संकलित किया गया, लेकिन कहीं प्रकाशित नहीं किया गया है।

विशेष रूप से, वयस्क मादा चूहों के साथ रखा गया है कि वयस्क नर चूहों अधिक वें + है महिलाओं (चित्रा 1 में साथ रखा महिलाओं की तुलना में कम वें + एसएनसी और वीटीए न्यूरॉन्स है पुरुषों के साथ जोड़ा महिलाओं जबकि एसएनसी और वीटीए (मध्यमस्तिष्क) पुरुषों के साथ रखा पुरुषों की तुलना में न्यूरॉन्स, 6)। इस बात का एक और उदाहरण के लिए गु + एसएनसी पुरुष में न्यूरॉन्स और मादा चूहों के एसई संख्या ± मतलब तुरंत पता चलता है जो चित्रा 1, में यहाँ प्रदान की गई हैllowing के लिंग बाँधना। 7 दिनों के लिए महिलाओं के साथ रखा नर पुरुषों (चित्रा 1 में दो नीले कॉलम) के साथ रखा पुरुषों की तुलना में लगभग 12% अधिक वें + एसएनसी न्यूरॉन्स है। इसके विपरीत, पुरुषों के साथ जोड़ा महिलाओं महिलाओं (चित्रा 1 में दो लाल स्तंभों) के साथ जोड़ा महिलाओं की तुलना में लगभग 12% कम वें + एसएनसी न्यूरॉन्स है।

गु + एसएनसी और वीटीए न्यूरॉन्स की संख्या भी ईई (6 में चित्रा 2) के अधीन वयस्क नर चूहों में बढ़ जाती है, और अधिक एसएनसी वें + न्यूरॉन्स की ई-प्रेरण मध्यमस्तिष्क GABA एक रिसेप्टर्स (6 में चित्रा 3) के समवर्ती नाकाबंदी द्वारा समाप्त कर दिया गया है। इस बात का एक और उदाहरण वाहन अर्क के साथ ई में वाहन अर्क (चित्रा 2 में बाईं दो कॉलम) के साथ एसएच की तुलना में लगभग 14% अधिक वें + एसएनसी न्यूरॉन्स के परिणामस्वरूप जहां चित्रा 2, में यहाँ प्रदान की जाती है। हालांकि, ईई गाबा के साथ एक रिसेप्टर प्रतिपक्षी अर्क (10 माइक्रोन picrotoxin या 5 या तो1; पूरी तरह से इस वृद्धि (चित्रा 2 में सही दो कॉलम) को समाप्त कर दिया एम bicuculline)। इन आंकड़ों अर्क प्रवेशनी को एसएनसी प्रतिपक्षी से कर रहे हैं, और 6 में सूचित किया गया है जो ipsilateral एसएनसी में मनाया प्रभाव के लिए लगभग समान हैं, ध्यान दें।

चित्रा 1
चित्रा 1:। एसएनसी वें + न्यूरॉन्स की संख्या पर लिंग बाँधना के प्रभाव तुरंत वयस्क चूहों (3.1) perfused थे लिंग बाँधना (प्रोटोकॉल 1.1) के 7 दिनों के बाद, उनके मध्यमस्तिष्क sectioned किया गया था (3.2), वर्गों वें (tyrosine hydroxylase के लिए प्रोसेस किया गया , डीए संश्लेषण में एंजाइम को सीमित दर) immunohistochemistry (3.3), और वें + एसएनसी न्यूरॉन्स की संख्या) Stereology (3.4 का उपयोग कर अनुमान लगाया गया था। पुरुष चूहों (एन = एन = 2 पुरुष-पुरुष जोड़े से चार पुरुष चूहे, हल्के नीले कर्नल के साथ रखा पुरुष चूहों में एसएनसी वें + न्यूरॉन्स के एसई संख्या ± मतलब यहाँ हैं साजिश रची) umn, महिलाओं (के साथ रखा पुरुषों एन = 6 पुरुष-महिला जोड़े, गहरे नीले स्तंभ), महिलाओं (के साथ जोड़ा महिलाओं से छह पुरुष चूहों एन = एन = 4 महिला-महिला जोड़े, प्रकाश लाल स्तंभ), और से 8 मादा चूहों पुरुषों (एन = n से 6 मादा चूहों = 6 पुरुष-महिला जोड़े, गहरे लाल स्तंभ) के साथ जोड़ा महिलाओं। विपरीत लिंग के साथ बाँधना पुरुषों में एसएनसी वें + न्यूरॉन्स की संख्या में वृद्धि हुई है, लेकिन महिलाओं में एसएनसी वें + न्यूरॉन्स की संख्या में कमी के परिणामस्वरूप (पी <0.001 एक तरह से एनोवा, * पी <0.05 Tukey जोड़ो में एकाधिक तुलना)।

चित्रा 2
चित्रा 2: मध्यमस्तिष्क गाबा के साथ पर्यावरण संवर्धन के प्रभाव एसएनसी वें + न्यूरॉन्स की संख्या पर एक रिसेप्टर नाकाबंदी तुरंत वाहन या तो की समवर्ती आसव, GABA एक रिसेप्टर प्रतिपक्षी पी के साथ पर्यावरण संवर्धन (प्रोटोकॉल 1.2) के 14 दिनों के बाद।icrotoxin (10 माइक्रोन), या वयस्क नर चूहों perfused थे छोड़ दिया मध्यमस्तिष्क में GABA एक रिसेप्टर प्रतिपक्षी bicuculline (5 माइक्रोन) (प्रोटोकॉल) 2 (3.1), उनके मध्यमस्तिष्क sectioned किया गया था (3.2), वर्गों (tyrosine hydroxylase के लिए प्रोसेस किया गया वें, डीए संश्लेषण) immunohistochemistry (3.3) में दर सीमित एंजाइम, और सही वें + न्यूरॉन्स की संख्या (प्रतिपक्षी) एसएनसी) Stereology (3.4 का उपयोग कर अनुमान लगाया गया था। (एसएच) वाहन अर्क (एन = 6, हल्के नीले स्तंभ), पर्यावरण को समृद्ध (ई) के साथ पुरुष चूहों रखे मानक में एसएनसी वें + न्यूरॉन्स के एसई संख्या ± मतलब यहाँ हैं साजिश रची (एन = 6, पहली गहरे नीले रंग की वाहन अर्क के साथ पुरुषों स्तंभ), ईई bicuculline अर्क (एन = 6, तीसरे गहरे नीले स्तंभ) के साथ picrotoxin अर्क (एन = 6, दूसरा गहरे नीले स्तंभ), और ईई पुरुषों के साथ पुरुषों। ईई एसएनसी वें + न्यूरॉन्स की संख्या में वृद्धि हुई है, लेकिन इस <0.001 एक तरह से एनोवा प्रतिपक्षी मध्यमस्तिष्क में picrotoxin या bicuculline के अर्क से (पी समाप्त कर दिया गया था; * पी <0.001 Tukey जोड़ो में एकाधिक तुलना)।

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Discussion

पर्यावरण जोड़तोड़

इन पर्यावरण जोड़तोड़ (लिंग बाँधना और पर्यावरण संवर्धन) के डिजाइन के पीछे प्रेरणा पर्यावरण निर्धारित करने के लिए किया गया था, और / या पर्यावरण से प्रेरित व्यवहार, मध्यमस्तिष्क डीए न्यूरॉन्स की संख्या में परिवर्तन के साथ जुड़ा हुआ है। फोकस वातावरण प्रदान करने और मध्यमस्तिष्क डीए संकेतन संलग्न करने की संभावना है कि व्यवहार उत्तेजक पर इसलिए था। इन विपरीत लिंग के साथ शामिल बाँधना, और, नाटक का पता लगाने के लिए चढ़ाई, छिपाने के लिए पहियों, रस्सियों, सीढ़ी, सुरंगों, और वस्तुओं चल रहा है और घोंसला करने के लिए उपयोग शामिल पर्यावरण संवर्धन। इन वातावरण के दोनों मध्यमस्तिष्क डीए न्यूरोनल निर्वहन में तीव्र वृद्धि और महंगाई भत्ते रिलीज के साथ संबद्ध किया गया है, जो इनाम प्रेरित संज्ञानात्मक, भावनात्मक और मोटर व्यवहार, पालक चाहिए (उदाहरण के लिए 8)। हमारी परिकल्पना है कि वे भी मध्यमस्तिष्क डीए संकेत बीआर में लंबे समय तक चलने वाले परिवर्तनों के साथ जुड़े रहे हैं रहा थामध्यमस्तिष्क डीए न्यूरॉन्स की संख्या में परिवर्तन के बारे में चाहिए। यहाँ और कहीं 6, सबूत यह वास्तव में मामला है कि प्रस्तुत किया है।

हमारी जांच में यह एक कोर मौलिक और आवश्यक इनाम प्रेरित व्यवहार (यानी संभोग) शामिल हैं क्योंकि लिंग बाँधना प्रोटोकॉल (1.1) का उपयोग शुरू कर दिया। इसके अलावा, प्रजनन, जोड़ी-संबंध, और सामाजिक व्यवहार (ऑक्सीटोसिन, वैसोप्रेसिन और हाइपोथेलेमस 9 में corticotrophin हार्मोन जारी कोशिकाओं के घनत्व में जैसे परिवर्तन) के अनुरूप अन्य नयूरोचेमिकल सिस्टम में बदलाव के लिए प्रेरित करने के लिए जाना जाता है। दरअसल, विपरीत लिंग के साथ निरंतर बाँधना के 7 दिनों के बाद, हम महिलाओं के लगभग 10% कम वें + मध्यमस्तिष्क न्यूरॉन्स [नोट है, जबकि पुरुषों के लगभग 10% अधिक वें + मध्यमस्तिष्क न्यूरॉन्स है कि 6 यहाँ और कहीं दिखाने: इन प्रभावों को एसएनसी समावेश (वर्तमान अध्ययन और 6) और वीटीए 6, लेकिन नहीं th] noradrenaline synthesize में मदद करता है, जहां ठिकाना coeruleus 6,।इस वयस्क मस्तिष्क में मध्यमस्तिष्क डीए न्यूरॉन्स की संख्या तय नहीं है कि इस धारणा का समर्थन करता है, लेकिन परिवर्तन पर्यावरण, व्यवहार, या पर्यावरण / व्यवहार बातचीत पर निर्भर करता है। अन्य सबूत डीए न्यूरोजेनेसिस या अध: पतन के लिए विरोध के रूप में इन परिवर्तनों, वर्तमान मध्यमस्तिष्क न्यूरॉन्स में वें जीन और प्रोटीन की अभिव्यक्ति में परिवर्तन के बारे में लाया जाता है तर्क है। (1) वयस्क माउस मध्यमस्तिष्क में डीए न्यूरोजेनेसिस या तो बिल्कुल नहीं 10-14, या एक सप्ताह 15,16 में लगभग 500 नए एसएनसी डीए न्यूरॉन्स के अलावा के लिए खाते सकता है की तुलना में काफी कम दरों पर होता है। (2) मध्यमस्तिष्क न्यूरॉन्स की विद्युतीय गतिविधि को लक्षित विभिन्न दवाओं के दो सप्ताह लेनी निम्नलिखित एसएनसी न्यूरॉन्स की संख्या में परिवर्तन बढ़ाता अध्ययन किया है लगातार कोई शुद्ध परिवर्तन में है, जिसके परिणामस्वरूप + और गु कोशिकाओं वें (फिर से लगभग 10%) बराबर लेकिन विपरीत परिवर्तन का पता चला कुल सेल नंबर 4,5। यह ऊपर वें प्रोटीन के स्तर का विनियमन या नीचे immunohistochemically डेट के साथ संगत हैइसके अलावा या न्यूरॉन्स के घटाव के बिना ectable स्तरों। (3) कई अध्ययनों से कई घंटे 17-23 के एक timescale से अधिक कोशिकाओं के भीतर वें जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति में गतिविधि पर निर्भर परिवर्तन की सूचना दी है, और एक ही मध्यमस्तिष्क 4 में सूचना दी गई है।

प्रश्न इस प्रकार वर्तमान मध्यमस्तिष्क न्यूरॉन्स में वें जीन और प्रोटीन की अभिव्यक्ति में परिवर्तन अंतर्निहित तंत्र क्या कर रहे हैं उठता है। संभावनाओं और पहले छह की सूचना दी बाँधना निम्नलिखित अच्छी तरह से लिंग विशेष परिवर्तन (पुरुषों में बढ़ जाती है और महिलाओं में कम हो जाती है) के रूप में, पुरुषों और महिलाओं में वें + मध्यमस्तिष्क न्यूरॉन्स की संख्या में आधारभूत मतभेद दोनों आबाद हो सकता है जो सेक्स स्टेरॉयड, शामिल हैं। एक और संभावना वें अभिव्यक्ति की गतिविधि पर निर्भर विनियमन है। एसएनसी और वीटीए न्यूरॉन्स (डीए और गैर-डीए दोनों) स्ट्रिएटम, हाइपोथैलेमस, सबथैलेमिक नाभिक से मुख्य रूप से synaptic इनपुट प्राप्त करते हैं, और ललाट 24 cortices। लिंग बाँधना, इन सूचनाओं के संदर्भ मेंज्ञानेन्द्रिय व्यवहार, गंध, फेरोमोन, तनाव, चयापचय, या प्रजनन द्वारा विनियमित किया जा सकता है। वें अभिव्यक्ति की गतिविधि पर निर्भर विनियमन जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रभावित करने वाले कैल्शियम या न्यूरोपेप्टाइड संकेत दे रास्ते के माध्यम से मध्यस्थता जा सकता है (उदाहरण के लिए 1)।

मध्यमस्तिष्क डीए न्यूरॉन्स की संख्या पर लिंग बाँधना के प्रभाव अंतर्निहित गतिविधि पर निर्भर तंत्र हम सेक्स स्टेरॉयड और शायद यह भी अन्य हार्मोन के संभावित प्रभाव के खिलाफ पर्यावरण संवर्धन प्रोटोकॉल (1.2), जो बेहतर नियंत्रण कार्यरत बनाम (सेक्स स्टेरॉयड के बीच भेद करने में मदद करने के लिए उदाहरण के लिए फेरोमोन, तनाव, प्रजनन), और अभिवाही संचालित neuronal गतिविधि के संभावित प्रभाव के लिए। यहाँ प्रासंगिक कारक विभिन्न समूहों के लिंग की शर्तें (सभी पुरुषों), हार्मोन, सामाजिक स्थिति और तनाव में और अधिक समान थे है। सामाजिक स्थिति और तनाव अभी भी (समूहों के बीच भिन्न हो सकती है हालांकि उदाहरण के लिए एक अधिक प्रभावी और आक्रामक पुरुषएक समूह) में, यह यह हमेशा एक ही समूह (जैसे ई), और ई के प्रभाव अब कई बार 6 दोहराया गया है हो जाएगा संभावना नहीं है। ई में, मध्यमस्तिष्क वें + न्यूरॉन्स में वृद्धि की भयावहता लिंग बाँधना प्रोटोकॉल के रूप में ही था (आंकड़े 1 और 2 वर्तमान अध्ययन में पुरुषों की तुलना, और 1 और 2 से 6 में आंकड़े)। इसके अलावा, पर्यावरण संवर्धन द्वारा प्रेरित एसएनसी वें + न्यूरॉन्स में ई-प्रेरित वृद्धि पूरी तरह से मध्यमस्तिष्क महंगाई भत्ते के लिए सभी अभिवाही इनपुट का लगभग 70% प्रदान करते हैं जो मध्यमस्तिष्क GABA एक रिसेप्टर्स (चित्रा 2 वर्तमान अध्ययन और 6 में चित्रा 3) के समवर्ती नाकाबंदी द्वारा समाप्त कर दिया गया था 25 न्यूरॉन्स। साथ में, इन आंकड़ों अभिवाही संचालित तंत्रिका गतिविधि हार्मोन के रूप में मध्यमस्तिष्क डीए न्यूरॉन्स की संख्या से अधिक कम से कम के रूप में शक्तिशाली एक प्रभाव है का संकेत मिलता है।

वास्तविक पर्यावरण में और अधिक जानकारीमध्यमस्तिष्क वें + न्यूरॉन्स की संख्या को विनियमित करने रुपये आरडब्ल्यू और ईई के प्रभाव की तुलना से आता है। ईई अधिक विविधता की है, यद्यपि इस तरह की गतिविधि के एक समान राशि शामिल है (यानी विभिन्न खिलौने लेकिन अपरिवर्तित 14 दिनों के दौरान), प्लस उपन्यास खिलौने के लिए चल रहे प्रदर्शन में जबकि आरडब्ल्यू, एक अच्छी तरह से सीखा है या साधारण मोटर गतिविधि (पहियों पर चल रहा है) शामिल एसई घटक (1.2.4)। हमारे पहले प्रकाशित डेटा 6 से पता चला है, या तो नहीं है या एसएच चूहों की तुलना में आरडब्ल्यू में एसएनसी और वीटीए वें + न्यूरॉन्स में छोटे बढ़ जाती है, लेकिन ईई (एसई) चूहों में बहुत बड़ा बढ़ जाती है। अकेले यह साधारण शारीरिक गतिविधि से मध्यमस्तिष्क डीए न्यूरॉन्स की संख्या से अधिक शक्तिशाली नियामकों के रूप में संवेदी उत्तेजना, अनुभूति, नवीनता और / या सीखने और स्मृति पर प्रकाश डाला गया।

ईई ऐसे अल्जाइमर, हटिंगटन और पार्किंसंस रोग 26 के रूप में मस्तिष्क संबंधी विकार, के विभिन्न पशु मॉडल में मस्तिष्क की मरम्मत उपचारात्मक प्रभाव प्रेरित और बढ़ाने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है। NAइस तरह के पर्यावरण जोड़तोड़ की संरचना वे, लेकिन ध्यान देने योग्य हैं और पहले की गई 27 चर्चा की है कि ई प्रोटोकॉल के प्रमुख पहलू हैं ('मानक रखे' शर्तों करते हैं) प्रयोगशालाओं के बीच बड़े पैमाने पर अलग-अलग हो रहा है। संवेदी उत्तेजना, संज्ञानात्मक गतिविधि और शारीरिक व्यायाम के स्तर को बढ़ाने के लिए इतनी के रूप में ईई, पर्यावरण नवीनता और मानक आवास के सापेक्ष जटिलता में वृद्धि हुई प्रदान करता है। ईई प्रयोगों को डिजाइन करने में, एक जानवरों का संवेदी और संज्ञानात्मक क्षमताओं और उनके सहज ड्राइव सहित ethological कारकों पर विचार करने की जरूरत है। चूहों (और चूहों) मनुष्यों लेकिन उत्कृष्ट somatosensory और घ्राण acuities को नीचा दृश्य क्षमताओं के साथ, रात हो रहे हैं, संवर्धन वस्तुओं प्रायोगिक पशुओं की सहज प्रवृत्ति और क्षमताओं को प्रदर्शित करना चाहिए। इसलिए, यह चूहों को विशेष रूप से मुख्य हो सकता है कि वस्तुओं की नवीनता, आकार, बनावट और बू आ रही है। कृन्तकों 'मोती के सापेक्ष शक्ति का आकलनchewable वस्तुओं के शामिल किए जाने के अवसर मौलिक, प्रजाति विशिष्ट व्यवहार 28,29 व्यायाम करने के लिए अनुमति देने के लिए के लिए संवर्धन वस्तुओं की एक किस्म के लिए vations सिफारिशें करने के लिए नेतृत्व किया है। घोंसले के शिकार सामग्री का प्रावधान इस प्रकार संवेदी, संज्ञानात्मक और मोटर गतिविधियों 30,31 के लिए अवसर प्रदान करने, सहज कागज या गत्ते से बना किसी भी वस्तु आंसू जाएगा संवर्धन प्रोटोकॉल और चूहों की एक मौलिक घटक माना जाता है। यह वस्तुओं के बराबर नवीनता और जटिलता ईई समूह के भीतर विचरण कम करने के लिए, और पर्यावरण के मापदंडों के इसी तरह के नियंत्रण एसएच समूह के लिए प्रयोग किया जाना चाहिए, प्रदान की जाती है कई ईई पिंजरों के साथ एक प्रयोग में यह भी कहा कि महत्वपूर्ण है। आदर्श रूप में, पिंजरे प्रति चूहों की संख्या ईई और एसएच समूहों (सामाजिक समूह आकार के प्रभाव विशेष रूप से जांच की जा रही है, जब तक) के बीच ही होना चाहिए, और कोई 'खाद्य व्यवहार करता है' समूहों के बीच किसी भी आहार मतभेद के रूप में, ई में इस्तेमाल किया जाना चाहिए सकता है उलझाना टीई 12 को बढ़ाता है कि संज्ञानात्मक गतिविधि और शारीरिक व्यायाम के प्रभाव से वह व्याख्या। अन्य महत्वपूर्ण विचार एक समृद्ध पर्यावरण के लिए जोखिम की अवधि और संवर्धन शुरू, जिस पर उम्र के हैं। जीन का अंतर अभिव्यक्ति एक समृद्ध वातावरण में 32 में केवल तीन घंटे के बाद दिखाया गया है, वहीं लोगों तक पहुंचाने की लंबी अवधि के 33,34 घटित करने के लिए संरचनात्मक और कार्यात्मक परिवर्तन के लिए आवश्यक हो सकता है। इसके अलावा, संवर्धन प्रेरित plasticity के प्रसव के बाद महत्वपूर्ण विकास की अवधि 35 के दौरान बढ़ाया जा सकता है।

दवा लेनी के लिए आसमाटिक पंप और मस्तिष्क अर्क प्रवेशनी प्रत्यारोपण

आसमाटिक पंप और प्रवेशनी प्रत्यारोपण सीधे मस्तिष्क में दवाओं के वितरण के लिए बहुत प्रभावी रहे हैं। अनुभव के साथ, प्रत्यारोपण सर्जरी माउस के अनुसार लगभग एक घंटा लेता है। अकेले चिकित्सकीय एक्रिलिक विस्तारित अवधि (नोट के लिए जगह में प्रवेशनी तय करने के लिए पर्याप्त है: हम ओ में 28 दिनों तक चले गए हैंवहाँ प्रयोगों); जैसे हड्डी शिकंजा के रूप में अतिरिक्त लगाव हार्डवेयर के लिए कोई जरूरत नहीं है। यह कनेक्शन पर बहुत ज्यादा दबाव डालने के बिना अधिक से अधिक सिर और गर्दन बल के लिए अनुमति देने के लिए पंप और प्रवेशनी जोड़ने ट्यूब में सुस्त के पास बहुत है सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह विशेष रूप से इस तरह के प्रत्यारोपण का लचीलापन कम करने पंप के आसपास संयोजी ऊतक के विकास के लिए यह जगह में लंगर कर सकते हैं जहां लंबी अवधि सुई लेनी, के लिए ऐसा नहीं है। जहां संभव हो, चूहे भी एकल रखे, scratching खींच या काटने के माध्यम से प्रत्यारोपण को नुकसान पहुँचाए हाउसमेट को रोकने के लिए सर्जरी के बाद कर रहे हैं। दवा की खुराक काफी हद तक पंप करने के लिए जोड़ा राशि से निर्धारित होता है। हालांकि, इस संबंध में ध्यान में भी पंप प्रवाह की दर, 37 डिग्री सेल्सियस पर दवा की रासायनिक स्थिरता, और मस्तिष्क के माध्यम से प्रवेशनी से दवा के प्रसार की दर से भुगतान किया जाना चाहिए। वर्तमान में हमारे सप्लायर से उपलब्ध पंपों 0.15 μl / घंटा की एक प्रवाह दर पर अप करने के लिए 6 सप्ताह के लिए अर्क बनाए रख सकते हैं; फास्टस्था उपलब्ध प्रवाह दर 10 μl / घंटा है, लेकिन केवल एक सप्ताह के लिए स्थायी है। लंबे समय तक अर्क बार (प्रत्यारोपित प्रवेशनी परेशान बिना आईई) को जोड़ने ट्यूब की पीठ पर पूर्ण पंपों के साथ समाप्त पंप बदलने के लिए अतिरिक्त मामूली सर्जरी प्रदर्शन से हासिल किया जा सकता है। एक प्रवेशनी सिरे से प्रसार (0.9% सोडियम क्लोराइड में 1% methylene नीले, मेगावाट 320) methylene नीले रंग के स्थानिक हद तक अपनी mediolateral पहलू के साथ छोड़ दिया एसएनसी रास्ते के मध्य से ऊपर 0.3 मिमी मध्यमस्तिष्क के पार्श्व किनारे से विस्तार करने के लिए मापा गया था प्रत्यारोपित बस mediolaterally midline के पार, और मध्यमस्तिष्क के पूरे dorsoventral हद तक भर (निषेचन के दो सप्ताह के बाद)। यह अधिक व्यापक एसएनसी की तरह एक छोटे नाभिक से है, और नशीली दवाओं के प्रसार आदि इसकी मेगावाट, रासायनिक स्थिरता, बफरिंग, पर वास्तव में, एक वर्तमान आंकड़ों से अनुमान कर सकते हैं निर्भर करता है बड़ा (या छोटे) हो सकता है (चित्रा 2) कि picrotoxin और bicuculline दोनों जैविक रूप से सक्रिय concentrati में contralateral एसएनसी पहुंच गयाons है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isofluorane Baxter Healthcare Pty Ltd, Baxter Drive, NSW 2146, Australia AHN3640
ALZET Osmotic pump 1002 DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 0004317
ALZET Brain infusion kit 1 DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 0004760
ALZET cannula holder 1 DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 0008860
Vertex Monomer Self-curing (dental acrylic solvent) Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, The Netherlands n/a
Vertex Self Curing (dental acrylic powder) Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, The Netherlands n/a
METACAM (Meloxicam) Troy Laboratories, 98 long Street, smithfield NSW 2164 Australia L10100
Sodium Pentobarbitone Lethabarb, Virbac, Milperra, NSW, Australia 571177
Normal goat serum chemicon-temecula, CA S26-Litre
Triton X-100 Merck Millipore Headquarters , 290 Concord road, Billerica, MA 01821 1.08603.1000
Polyclonal rabbit anti-tyrosine hydroxylase Merck Millipore Headquarters , 290 Concord road, Billerica, MA 01821 AB152
Polyclonal biotinylated goat anti-rabbit Dako Australia Pty. Ltd., Suite 4, Level 4, 56 Berry street, North Sydney, NSW, Australia 2060 EO432
Avidin peroxidase Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU A3151-1mg
Diamino-benzidine Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU D-5637
Stereo Investigator MicroBrightField Bioscience, 185 Allen Brook Lane, Suite 101, Williston, VT 05495 n/a

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 95 व्यवहार मध्यमस्तिष्क tyrosine hydroxylase डोपामाइन plasticity सब्सटेंशिया निग्रा पार्स कॉम्पेक्टा
वयस्क चूहों में मध्यमस्तिष्क डोपामिन न्यूरॉन्स की संख्या से पर्यावरण modulations
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Tomas, D., Prijanto, A. H., Burrows, E. L., Hannan, A. J., Horne, M. K., Aumann, T. D. Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice. J. Vis. Exp. (95), e52329, doi:10.3791/52329 (2015).

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