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Biology

झिल्ली प्रोटीन की हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन आधारित अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग में Published: January 6, 2015 doi: 10.3791/52357
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,3, 4, 4, 3, 4, 1
1Oxford Protein Production Facility, Research Complex at Harwell, 2Protein Crystallography Group, Ruhr University, 3MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge Biomedical Campus, 4Membrane Protein Laboratory, Diamond Light Source

Summary

हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए फ्यूजन पर आधारित Escherichia कोलाई में पुनः संयोजक झिल्ली प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए स्क्रीनिंग के लिए एक सुव्यवस्थित दृष्टिकोण प्रस्तुत किया है।

Abstract

संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन के लिए पुनः संयोजक झिल्ली प्रोटीन के उत्पादन की वजह से अभिव्यक्ति के निम्न स्तर और एक बार डिटर्जेंट में solubilized कई झिल्ली प्रोटीन के निहित अस्थिरता के लिए तकनीकी रूप से चुनौती बनी हुई है। एक प्रोटोकॉल GFP प्रतिदीप्ति द्वारा पता लगाया Escherichia कोलाई में अभिव्यक्ति के साथ GFP के fusions के रूप में झिल्ली प्रोटीन के बंधाव स्वतंत्र क्लोनिंग को जोड़ती है कि वर्णित है। यह कई झिल्ली प्रोटीन के निर्माण और अभिव्यक्ति की स्क्रीनिंग / समय और प्रयास के आगे निवेश के लिए उपयुक्त उम्मीदवारों की पहचान करने के लिए वेरिएंट में सक्षम बनाता है। GFP संवाददाता एसडीएस polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ) निम्न GFP प्रतिदीप्ति visualizing द्वारा अभिव्यक्ति का एक प्राथमिक स्क्रीन में प्रयोग किया जाता है। मुक्त GFP की अनुपस्थिति से संकेत के रूप में कम से कम गिरावट के साथ एक उच्च अभिव्यक्ति के स्तर दोनों बताते हैं कि झिल्ली प्रोटीन, एक माध्यमिक स्क्रीन के लिए चयन कर रहे हैं। इन निर्माणों पर पहुंचा और एक कुल झिल्ली अंश तैयार है और solubilize रहे हैंचार अलग अलग डिटर्जेंट में डी। डिटर्जेंट-अघुलनशील सामग्री को हटाने के लिए ultracentrifugation के बाद, lysates प्रतिदीप्ति का पता लगाने के आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (FSEC) द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं। GFP प्रतिदीप्ति द्वारा आकार अपवर्जन प्रोफाइल निगरानी अलग डिटर्जेंट में झिल्ली प्रोटीन के मोनो dispersity और अखंडता के बारे में जानकारी प्रदान करता है। प्रोटीन: कम या कोई मुक्त GFP और न्यूनतम एकत्रीकरण के साथ एक सममित चोटी के साथ elute कि डिटर्जेंट संयोजन बाद शुद्धि के लिए उम्मीदवार हैं। इसके बाद के संस्करण कार्यप्रणाली, ई में heterologous अभिव्यक्ति का प्रयोग एसईडी (आकार, बढ़ाव, विभाजन, और sporulation) बैक्टीरिया के 47 विभिन्न प्रजातियों में से प्रोटीन की कोलाई विश्लेषण किया गया था। ये प्रोटीन आम तौर पर दस ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन है और कोशिका विभाजन के लिए आवश्यक हैं। परिणाम बताते हैं कि ई में SEDS orthologues का उत्पादन कोलाई GFP संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर के लिए सम्मान और निष्ठा के साथ अत्यधिक चर रहा था। प्रयोग मैंआगे की जांच के लिए एक सबसेट dentified।

Introduction

यह झिल्ली प्रोटीन मानव जीनोम 2 सहित सभी अनुक्रम जीनोम 1, में कोडित जीनों का लगभग 20-30% के लिए खाते है कि अनुमान लगाया गया है। दवा लक्ष्य चयापचयों, ऊर्जा उत्पादन के उदाहरण परिवहन के लिए और के रूप में कई जैविक प्रक्रियाओं में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका को देखते हुए, उनके तीन आयामी संरचना का निर्धारण करने में गहन रुचि नहीं है। हालांकि घुलनशील प्रोटीन की तुलना में, झिल्ली प्रोटीन अत्यधिक तहत प्रतिनिधित्व प्रोटीन डाटा बैंक में हैं। वास्तव में, पी डी बी (में 99,624 जारी की संरचनाओं के http://www.rcsb.org/pdb/ ) केवल 471 ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) झिल्ली प्रोटीन के रूप में वर्गीकृत किया जाता है। यह स्वाभाविक रूप से अपेक्षाकृत कम स्तर पर व्यक्त कर रहे हैं, जो झिल्ली प्रोटीन के साथ काम करने की तकनीकी कठिनाइयों को दर्शाता है; rhodopsin कुछ अपवादों 3,4 में से एक है। पुनः संयोजक संस्करण की अधिक अभिव्यक्तिheterologous कोशिकाओं में अक्सर उत्पादन के समग्र स्तर जो सीमा झिल्ली को misfolding और गरीब लक्ष्य-निर्धारण में यह परिणाम है। एक बार व्यक्त की एक झिल्ली प्रोटीन की निकासी और solubilization के लिए सबसे अच्छा डिटर्जेंट का चयन बाद में शुद्धीकरण कठिन बना देता है और सावधान अनुकूलन की आवश्यकता है।

Escherichia कोलाई 72% (के लिए लेखांकन झिल्ली प्रोटीन के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया अभिव्यक्ति मेजबान रहता http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ बैक्टीरियल स्रोतों से लगभग विशेष रूप से कर रहे हैं, जो तारीख करने के लिए हल कर संरचनाओं के)। विशिष्ट ई कोलाई उपभेदों, C41 (DE3) और C43 (DE3), झिल्ली प्रोटीन की अधिक अभिव्यक्ति के लिए नेतृत्व और इसलिए अन्य BL21 के लिए मनाया विषाक्तता 5,6 उपभेदों के प्रभाव से बचने के लिए नहीं है, जो अलग-थलग कर दिया गया है। पुनः संयोजक झिल्ली प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर ट्यूनिंग उत्पादन 6,7 के स्तर के अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण प्रतीत होता है।

6-8 का फायदा उठाने के लिए कई orthologues सहित कई संस्करणों के मूल्यांकन की आवश्यकता है। इसलिए, समानांतर में कई झिल्ली प्रोटीन की अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग के लिए एक विधि के लिए आवश्यक है। एक आमतौर पर इस्तेमाल किया दृष्टिकोण प्रोटीन शुद्ध करने के लिए आवश्यकता के बिना पता लगाया जा करने के लिए हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) को सक्रिय करने के अभिव्यक्ति के लिए प्रोटीन फ्यूज करने के लिए है। इस तरह, विभिन्न डिटर्जेंट में अभिव्यक्ति के स्तर, स्थिरता और व्यवहार के बारे में जानकारी संयुक्त राष्ट्र के शुद्ध सामग्री 9-12 की छोटी मात्रा के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है।

इस लेख में हम ई में झिल्ली प्रोटीन की क्लोनिंग और अभिव्यक्ति की स्क्रीनिंग के लिए एक सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल का वर्णन कोलाई उत्पादन और डिटर्जेंट के बाद के लक्षण वर्णन के एक पत्रकार के रूप में GFP के लिए फ्यूजन का उपयोग: प्रोटीन कंप्यूटर अनुप्रयोगlexes (चित्रा 1)।

Protocol

अभिव्यक्ति वैक्टर 1. निर्माण

  1. इस्तेमाल की पीसीआर आसव दृश्यों 13 क्रमशः को cleavable सी टर्मिनल या एन टर्मिनल GFP-His6 fusions या तो जोड़ जो वैक्टर pOPINE -3 सी-GFP और pOPIN-एन-GFP का उपयोग कर समानांतर में 96 अभिव्यक्ति plasmids अप करने के लिए निर्माण करने के लिए क्लोनिंग।
    नोट: GFP के cytosol में व्यक्त करने की जरूरत है क्योंकि वेक्टर के विकल्प इस प्रकार एक साइटोसोलिक एन टर्मिनस और बाह्य सी टर्मिनस हम pOPIN-एन-GFP और के लिए प्रयोग करेंगे के साथ एक प्रोटीन के लिए प्रोटीन की टोपोलॉजी से निर्धारित होता है एक बाह्य एन टर्मिनस और साइटोसोलिक सी टर्मिनस में हम pOPINE -3 सी-GFP का प्रयोग करेंगे। दोनों टर्मिनी साइटोसोलिक हैं कहां सी टर्मिनस टैग करने के लिए नहीं कार्यात्मक कारण नहीं है, जब तक हम pOPINE -3 सी-GFP का प्रयोग करेंगे।
  2. दिखाया निम्नलिखित एक्सटेंशन शामिल प्राइमरों के साथ झिल्ली प्रोटीन एन्कोडिंग डीएनए दृश्यों बढ़ाना:
    pOPINE -3 सी-GFP (आगे प्राइमर - AGGAGATATACCATG; प्राइमर उल्टा - CAGAACTTCCAGTTT) और pOPIN-एन-GFP (आगे प्राइमर - AAGTTCTGTTTCAGGGCCCG; - ATGGTCTAGAAAGCTTTA) प्राइमर उल्टा।
  3. Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा पीसीआर प्रतिक्रिया का विश्लेषण करें। एक बार साफ पीसीआर उत्पादों प्राप्त किया गया है, (1x DpnI प्रतिक्रिया बफर के 5 μl में श्रृंगार) अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 5 यू DpnI जोड़ें। एक 96 अच्छी तरह प्रारूप में चुंबकीय मोती का उपयोग पीसीआर उत्पादों शुद्ध।
    नोट: DpnI टेम्पलेट वेक्टर दूर करने के लिए जोड़ा जाता है; जीनोमिक डीएनए टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया जाता है तो इस चरण आवश्यक नहीं है।
  4. एक पीसीआर थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए उपयुक्त linearized वेक्टर के एक μl (100 एनजी) जोड़ें।
  5. शुद्ध पीसीआर की μl एक multichannel pipettor ऐड एक्स का प्रयोग पीसीआर थाली के उचित वेल्स को सम्मिलित करें। सभी उत्पादों 10-250 एनजी की रेंज में हैं सुनिश्चित करें।
  6. अच्छी तरह से करने के लिए पानी का (9) x μl जोड़ें और सूखी-डाउन में संलयन अभिकर्मक युक्त ट्यूब करने के लिए पूरे 10 μl हस्तांतरण। 30 सेकंड के लिए छोड़ दें।
  7. ऊपर और नीचे pipetting द्वारा संक्षिप्त सामग्री मिलाएं। स्थानांतरणवापस मूल पीसीआर थाली और सील करने के लिए प्रतिक्रियाओं।
  8. एक thermocycler में 42 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  9. तुरंत ते के 40 μl प्रतिक्रिया पूरा हो गया है जैसे ही बर्फ को प्रतिक्रियाओं हस्तांतरण और जोड़ (10 मिमी Tris, पीएच 8.0, 1 मिमी EDTA)।
  10. एक ही बार में फ्रीज या सक्षम कोशिकाओं में बदलना। परिवर्तन के लिए, उच्च योग्यता के 50 μl विभाज्य (> 5 एक्स 10 9 transformants / माइक्रोग्राम प्रति) सक्षम ई प्रति पतला प्रतिक्रिया के 3 μl का उपयोग कोलाई कोशिकाओं।
  11. लेग अगर के 1 मिलीलीटर 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / कार्बेनिसिलिन प्रति अच्छी तरह से एक 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट के साथ पूरक जोड़ें (क्लोनिंग के लिए, निर्माणों की 2 एक्स नंबर के लिए कुओं को तैयार)।
  12. परिणाम थाली के बाद, परिणाम के बाद बाहर 25 μl और 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेटें युक्त अगर पर संस्कृति का एक एक 5 में कमजोर पड़ने के 25 μl।
  13. धीरे थाली झुकने से कोशिकाओं बिखरा हुआ है।
  14. 37 डिग्री सेल्सियस पर या एक फ़्लो में 10-15 मिनट के लिए ढक्कन के साथ थाली बंद सूखीकमरे के तापमान पर डब्ल्यू हुड।
  15. ढक्कन बदलें और उल्टा थाली की बारी है और रात भर में 37 डिग्री सेल्सियस सेते हैं।
  16. दो कालोनियों और मिनी प्रस्तुत करने का वैक्टर उठाओ।
  17. पीसीआर का निर्माण विशिष्ट रिवर्स प्राइमर और एक वेक्टर विशिष्ट आगे प्राइमर (जैसे pOPIN_FOR GAC सीजीए AAT TAA टीएसी GAC टीसीए सीटीए टैग सीजी) का उपयोग निर्माणों की पुष्टि करें।

ई 2. परिवर्तन कोलाई ई है xpression खींच

नोट: इस से पहले प्रोटोकॉल, ई करने के लिए प्रदर्शन कोलाई सक्षम कोशिकाओं, बनाया aliquotted और पहले 13 में वर्णित के रूप में -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए जमा हो जाती है। झिल्ली प्रोटीन अभिव्यक्ति नियमित तौर पर दो नस्लों में जांच की है, Lemo21 (DE3) और C41 (DE3) pLysS। परिणामों की व्याख्या के लिए सहायता करने के लिए यह उदाहरण के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण, एक प्लाज्मिड व्यक्त GFP या व्यक्त करने के लिए जाना जाता है GFP के लिए जुड़े हुए एक झिल्ली प्रोटीन और एक खाली वेक्टर नकारात्मक नियंत्रण शामिल करने के लिए सहायक हो सकता है।

  1. अली पिघलनाquotted ई बर्फ पर कोलाई। सक्षम कोशिकाओं में से प्रत्येक विभाज्य मिनी तैयार प्लाज्मिड अभिव्यक्ति के 3 μl जोड़ें।
  2. 30 मिनट के लिए बर्फ पर मिश्रण सेते हैं।
  3. 42 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के लिए कोशिकाओं हीट शॉक।
  4. कोशिकाओं दो मिनट के लिए बर्फ पर वसूली के लिए और फिर प्रत्येक ट्यूब सत्ता शोरबा के 300 μl जोड़ने के लिए अनुमति दें।
  5. एक 37 डिग्री सेल्सियस स्थिर इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  6. 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / कार्बेनिसिलिन और 35 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल chloramphenicol के साथ पूरक, 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में लेग अगर तैयार करें। Lemo21 (DE3) युक्त वेल्स को 0.25 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए rhamnose जोड़ें।
    नोट: उत्पाद C41 युक्त कुओं विषाक्त होने की संभावना है (यदि DE3) pLysS 1% (डब्ल्यू / वी) ग्लूकोज के साथ पूरक किया जा सकता है।
  7. स्थानांतरण लेग अगर प्लेटों पर परिवर्तन मिश्रण से कोशिकाओं के 30 μl। बिखरा हुआ है और 1.13-1.15 में वर्णित के रूप में थाली सूखी।

रातों रात स्टार्टर संस्कृतियों का 3. तैयारी

नोट: हमेशा एक पुराने परिवर्तन थाली से कभी नहीं परिवर्तन के बाद रात भर संस्कृतियों दिन तैयार करते हैं।

  1. 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / कार्बेनिसिलिन और 35 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल chloramphenicol के साथ पूरक एक 96 अच्छी तरह से गहरी अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 0.7 मिलीलीटर शक्ति शोरबा जोड़ें। 0.25 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए Lemo21 (DE3) युक्त वेल्स को rhamnose जोड़ें। वैकल्पिक रूप से, 1% (डब्ल्यू / वी) ग्लूकोज के साथ C41 (DE3) pLysS के पूरक; इसके बाद के संस्करण (2.6) नोट देखते हैं।
  2. अच्छी तरह से प्रत्येक में रातोंरात परिवर्तन प्लेटों से एक कॉलोनी उठाओ। एक गैस पारगम्य मुहर के साथ ब्लॉक सील।
  3. रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस पर एक छोटा सा फेंक (जैसे एक 4.3 मिमी कक्षा) के साथ एक मशीन में एक बड़ी फेंक (जैसे एक 25 मिमी कक्षा) या 600 rpm पर साथ एक मशीन में 250 rpm पर ब्लॉक हिलाएँ।

4. ग्रोथ और संस्कृतियों की प्रेरण

  1. बिजली शोरबा के 3 मिलीलीटर प्रत्येक के लिए 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / कार्बेनिसिलिन और 35 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल chloramphenicol डब्ल्यू के साथ पूरक जोड़ें24 अच्छी तरह से गहरी अच्छी तरह से थाली के पक्ष। धारा 3.1 में वर्णित के रूप में एल rhamnose (और ग्लूकोज) जोड़ें। दो प्रतियों में कटाई की अनुमति के लिए संस्कृति के 3 मिलीलीटर का प्रयोग करें और गैस पारगम्य मुहर के माध्यम से पानी की कुछ वाष्पीकरण के लिए अनुमति देने के लिए।
  2. 24 अच्छी तरह से गहरे अच्छी तरह से ब्लॉक के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए Lemo21 (DE3) या C41 (DE3) pLysS रातोंरात संस्कृतियों के 150 μl जोड़कर अभिव्यक्ति संस्कृतियों को निर्धारित करें।
  3. 595 एनएम पर औसत आयुध डिपो तक 37 डिग्री सेल्सियस पर ब्लॉक हिला ~ प्लेट के माध्यम से 0.5 है।
  4. 1.0 मिमी IPTG के अंतिम एकाग्रता के लिए संस्कृतियों के लिए IPTG जोड़कर अभिव्यक्ति प्रेरित।
  5. 20 डिग्री सेल्सियस पर झटकों के साथ संस्कृतियों रातोंरात (18-20 घंटा) आगे बढ़ें।

में जेल प्रतिदीप्ति द्वारा अभिव्यक्ति की 5. विश्लेषण

  1. दो प्रतियों में हार्वेस्ट। एक वर्ग अच्छी तरह से, शंक्वाकार नीचे, 96 अच्छी तरह से गहरे अच्छी तरह से ब्लॉक में प्रत्येक अच्छी तरह से संस्कृति का स्थानांतरण 1 मिलीलीटर।
    नोट: हार्वेस्ट दो प्रतियों में ब्लॉक या का टूटना के मामले में एक alternati के के परीक्षण की अनुमति के लिएअगर वांछित डिटर्जेंट किया है।
  2. ब्लॉक सील और 10 मिनट के लिए 6000 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं फसल।
  3. ब्लॉक पलटना और मीडिया छानना। शेष मीडिया के निकास के लिए एक कागज तौलिया पर धीरे ब्लॉक ठोकर।
  4. 20 मिनट की एक न्यूनतम के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें और दुकान सील। वैकल्पिक रूप से, इस बिंदु पर प्रयोग और जब सुविधाजनक संसाधित ब्लॉक छोड़ दें।
  5. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए छर्रों डी-ठंढ।
  6. Lysis बफर (50 मिमी नाह 2 पीओ 4, 300 मिमी NaCl 10 मिमी Imidazole 1% वी के 200 μl में पूरी तरह से कोशिकाओं resuspend 4 डिग्री सेल्सियस पर एक मल्टी चैनल पिपेट या एक कक्षीय प्रकार के बरतन (10 मिनट के लिए 1000 आरपीएम) या तो प्रयोग करें / वी बीच 20) NaOH के उपयोग करते हुए 8.0 पीएच को समायोजित करें।
  7. (पानी के 2 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा में 20 μl DNaseI (4,000 इकाइयों / एमएल), 20 मिलीग्राम लाइसोजाइम, और 20 μl protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल) 20 DLPI समाधान के μl जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर (~ 1000 आरपीएम) झटकों के साथ 10 मिनट के लिए सेते हैं।
    8. एन -Dodecyl β-डी-maltoside (DDM) के 25 μl जोड़ें।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर (~ 1000 आरपीएम) झटकों के साथ 60 मिनट के लिए सेते हैं।
  9. अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 6000 XG पर गहरे अच्छी तरह से ब्लॉक।
  10. एक microtitre थाली करने के लिए मंजूरी दे दी lysate के 10 μl स्थानांतरण और एसडीएस पृष्ठ जेल लोड हो रहा बफर (100 मिमी Tris, पीएच 6.8, डब्ल्यू 4% की 10 μl जोड़ें / एसडीएस वी, 0.2% डब्ल्यू Bromophenol नीले, 10% वी / वी β वी / -mercaptoethanol, और 20% वी / वी ग्लिसरॉल)। चेतावनी! नमूना फोड़ा नहीं करते।
  11. लोड कदम 5.11 से नमूना के 10 μl / अच्छी तरह से एसडीएस पृष्ठ जेल (एस) पर और डाई सामने नीचे (2-2.5 घंटा) तक पहुँच जाता है, जब तक एक ठंडे कमरे में 100-120 वी (निरंतर वोल्टेज) पर चलाते हैं।
  12. (GFP संलयन प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक नीली बत्ती फिल्टर के साथ जैसे) एक इमेजर पर जेल रखें। जोखिम समय प्रतिभाशाली बैंड संतृप्त नहीं कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए चुना है।

सेल संस्कृतियों के 6. पैमाने अप

  1. सक्षम की एक विभाज्य रूपांतरण
  2. (धारा 3 में वर्णित के रूप में पूरक) सत्ता शोरबा के 10 एमएल में एक कॉलोनी उठाओ और 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात हो जाना।
  3. 500 मिलीलीटर शक्ति शोरबा में रातोंरात संस्कृति के 5 मिलीलीटर पतला।
  4. 595 एनएम पर आयुध डिपो तक 37 डिग्री सेल्सियस पर 250 rpm पर झटकों के साथ आगे बढ़ें ~ 0.5 है।
  5. 1.0 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए IPTG जोड़कर अभिव्यक्ति प्रेरित।
  6. 20 डिग्री सेल्सियस पर 250 rpm पर झटकों के साथ रात भर के लिए आगे बढ़ें।
  7. Centrifugation द्वारा हार्वेस्ट कोशिकाओं 15 मिनट के लिए 5000 XG पर।
  8. सतह पर तैरनेवाला त्यागें। सेल छर्रों -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

झिल्ली के 7. तैयारी

  1. सेल गोली के ग्राम प्रति 5ml की एक मात्रा में 1x पीबीएस पीएच 7.5 में कमरे के तापमान और resuspend पर पिघलना कोशिकाओं (यदि आवश्यक हो); चिपचिपापन बह रही स्थिरता के लिए कम कर देता है जब तक आवश्यक रूप मात्रा बढ़ाएँ। 10 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल और एक के अंतिम एकाग्रता के लिए 1 मिमी, DNase मैं के अंतिम एकाग्रता के लिए 2 MgCl जोड़ेंसेल गोली के 20 ग्राम प्रति protease अवरोध करनेवाला गोली पूर्व पैक। 30 KPSI के दबाव में एक ठंडा सेल disrupter का उपयोग कर खुला कोशिकाओं को तोड़ने।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 30,000 ग्राम पर अटूट कोशिकाओं और मलबे गोली। एक अल्ट्रा centrifugation ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 200,000 XG पर एक अल्ट्रा अपकेंद्रित्र में सतह पर तैरनेवाला नीचे कताई द्वारा कुल झिल्ली अंश लीजिए।
  4. सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  5. एक सेल homogenizer का उपयोग कर ठंडा 10 मिलीलीटर पीबीएस पीएच 7.5 में झिल्ली गोली फिर से निलंबित। झिल्ली resuspended 1 मिलीलीटर प्रत्येक डिटर्जेंट के लिए आवश्यक हैं। वैकल्पिक रूप से, इस स्तर पर, फ्लैश -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में झिल्ली निलंबन फ्रीज।

झिल्ली अंश की 8. solubilization और विश्लेषण

  1. पिघलना झिल्ली अंश (यदि आवश्यक), और प्रत्येक डिटर्जेंट के लिए solubilization के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, एक 1.5 एमएल में झिल्ली निलंबन की विभाज्य 900 μl polyallomer सूक्ष्म centrifuजीई ट्यूब।
  2. निर्दिष्ट 1.5 मिलीलीटर ट्यूब के लिए 1% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए प्रत्येक हौसले से तैयार डिटर्जेंट के 100 μl (डब्ल्यू 10% / DDM, डीएम के वी समाधान, Cymal -6 और LDAO) जोड़ें। यूकेरियोटिक झिल्ली प्रोटीन कोलेस्ट्रॉल hemisuccinate (0.2% अंतिम एकाग्रता) के solubilization के लिए डिटर्जेंट के लिए जोड़ा जा सकता है।
  3. हल्के आंदोलन के साथ 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण सेते हैं।
  4. 45 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 150,000 जी पर, यह सुनिश्चित करने की नलियों में कम से कम आधे भरे हुए हैं, एक बेंच शीर्ष अल्ट्रा सेंट्रीफ्यूज के साथ डिटर्जेंट अघुलनशील अंश गोली और सतह पर तैरनेवाला बरकरार रहती है।
    नोट: डिटर्जेंट solubilization की प्रभावशीलता पीबीएस का एक ही मात्रा में resuspended डिटर्जेंट अघुलनशील अंश के साथ solubilized झिल्ली की GFP प्रतिदीप्ति मापने के द्वारा एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर का उपयोग कर अनुमान लगाया जा सकता है।
  5. विभिन्न डिटर्जेंट का मोनो dispersity का विश्लेषण करें: झिल्ली प्रोटीन परिसरों प्रतिदीप्ति का पता चला आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर (FSEC)।
  6. FSEC विश्लेषण के लिए, / मिनट 0.3 मिलीलीटर की एक प्रवाह दर पर बफर (20 ​​मिमी Tris पीएच 7.5, 150 मिमी NaCl, 0.03% DDM) चलाने के साथ, आणविक वजन में 5,000,000 करने के लिए एक व्यापक विभाजन रेंज के साथ एक आकार अपवर्जन स्तंभ, जैसे 5000 संतुलित करना । सभी नमूनों के लिए इस बफर का प्रयोग करें, यह परीक्षण प्रत्येक डिटर्जेंट के लिए नहीं बदला है अर्थात्।
  7. / मिनट 0.3 मिलीलीटर की एक प्रवाह दर पर स्तंभ पर solubilized झिल्ली के 100 μl इंजेक्षन। प्रतिदीप्ति प्रकाशिकी (488 एनएम पर उत्तेजना और उत्सर्जन 512 एनएम) का उपयोग क्षालन प्रोफ़ाइल मॉनिटर। एक इनलाइन प्रतिदीप्ति की निगरानी उपलब्ध नहीं है, भिन्न इकट्ठा करने और एक प्लेट रीडर में प्रतिदीप्ति पढ़ें।
  8. चित्रमय प्रदर्शन के लिए एक स्प्रेडशीट कार्यक्रम में आयात क्षालन मात्रा और प्रतिदीप्ति तीव्रता डेटा।
  9. खंड 5 में वर्णित के रूप में जेल प्रतिदीप्ति द्वारा solubilized झिल्ली सामग्री शेष का विश्लेषण कीजिए।

Representative Results

प्रोटीन (आकार, बढ़ाव, विभाजन, और sporulation) की SEDS परिवार बैक्टीरिया कोशिका विभाजन के लिए आवश्यक है। ये अभिन्न प्रोटीन आम तौर पर सेल के अंदर दोनों अमीनो और carboxy टर्मिनी के साथ दस ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन है। ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उदाहरण देना करने के लिए, 47 SEDS orthologues वेक्टर pOPINE -3 सी-EGFP में क्लोन किया गया। निर्माणों के एक छोटे पैमाने पर अभिव्यक्ति स्क्रीन दो ई .coli उपभेदों में बाहर किया गया था, 0.25 मिमी की उपस्थिति में उगाई Lemo21 (DE3) नियमित तौर पर झिल्ली की अभिव्यक्ति के लिए उपयोग किया जाता है जो टपकाया अभिव्यक्ति और C41 (DE3) pLysS, ब्लॉक करने के लिए rhamnose प्रोटीन 5-8।

प्रेरित संस्कृतियों का डिटर्जेंट solubilized lysates एसडीएस polyacrylamide वैद्युतकणसंचलन द्वारा विश्लेषण किया गया। में जेल प्रतिदीप्ति का प्रयोग व्यक्त GFP संलयन प्रोटीन 47 SEDS निर्माणों के बाहर दो उपभेदों के बीच 38 का उत्पादन किया गया पता चला है कि कल्पना करने के लिए। दिलचस्प बात यह है दो अभिव्यक्ति उपभेदों के बीच मतभेद थे। 38 निर्माणों व्यक्त की, केवल 18 दोनों में तनाव, केवल केवल C41 (DE3) pLysS में Lemo21 (DE3) और 6 में व्यक्त 14 में उत्पादन किया गया था। कुल मिलाकर, C41 (DE3) pLysS (24 बनाम 38) की तुलना में Lemo21 (DE3) के लिए एक उच्च सफलता दर वहां गया था। हालांकि कुछ प्रोटीन तनाव विशिष्ट होना को दिखाई अवलोकन है कि दोनों में स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी है कि इसका मतलब है।

47 seds के 24 के लिए प्रतिनिधि डेटा निर्माणों चित्र 1 में दिखाया जाता है। बैंड की तीव्रता हालांकि दोनों उपभेदों में अच्छी तरह से अतिरिक्त व्यक्त किया जाता है जैसे चित्रा 1 ए और 1 बी में अच्छी तरह से c4 में संलयन प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर का संकेत देता है, कम आणविक भार बैंड प्रोटीन आंशिक रूप से अपमानित है कि सलाह देते हैं। कई गलियों में अकेले GFP के लिए आकार में मेल खाती है, जो एक बैंड है। प्रोटीन की अखंडता के एक गुणात्मक मूल्यांकन मुक्त GFP के लिए संलयन प्रोटीन रिश्तेदार की तीव्रता को देखकर बाहर किया जा सकता है;उदाहरण के लिए जी -4 और एच 4 पूरी तरह से कुछ बरकरार प्रोटीन (चित्रा 1 ए) है Lemo21 (DE3) में जबकि C41 (DE3) pLysS (चित्रा 1 बी) में नि: शुल्क GFP के लिए टूट रहे हैं। 38 व्यक्त प्रोटीन के बाहर 14 के लिए नि: शुल्क GFP के बैंड की तीव्रता (मुक्त GFP के बैंड की तीव्रता संलयन प्रोटीन और संलयन प्रोटीन की एक अल्पसंख्यक की तुलना में अधिक है 21 के लिए, 3 संलयन प्रोटीन के समान है / 38) व्यक्त जैसे F6 और चित्रा 1 ए में G6 संलयन प्रोटीन की तुलना में अपेक्षाकृत कम मुक्त GFP है।

और G6 (लिटिल मुक्त GFP) के व्यक्त किए गए थे और 500 मिलीलीटर सेल संस्कृति से तैयार कुल झिल्ली अंश (मुक्त GFP और संलयन प्रोटीन के लिए उच्च तीव्रता बैंड) प्राथमिक स्क्रीन बी 5 में अच्छी तरह से व्यक्त किया कि निर्माणों में से दो। Resuspended झिल्ली aliquots में विभाजित है और प्रतिदीप्ति का पता चला आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (FSEC) द्वारा विश्लेषण किया गया। FSEC प्रोफाइल के Figur में प्रस्तुत कर रहे हैंई 2A और 2B क्रमशः और दो ​​SEDS प्रोटीन का परीक्षण चार डिटर्जेंट में अलग तरीके से व्यवहार करता है। एक मामले में (2A चित्रा: नमूना बी 5) प्रोटीन केवल इसलिए बाद में शुद्धीकरण के लिए पसंद की डिटर्जेंट होगा जो DDM में थोड़ा एकत्रीकरण के साथ एक सममित शिखर दे दी है। इसके विपरीत अन्य संलयन प्रोटीन द्वारा (चित्रा 2B: नमूना G6) का परीक्षण सभी डिटर्जेंट में एक समान प्रोफ़ाइल दिया।

चित्रा 1
चित्रा 1: ई में झिल्ली प्रोटीन अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग के लिए कार्यप्रवाह के चित्र कोलाई एक GFP संवाददाता का उपयोग कर।

चित्रा 2
चित्रा 2: में जेल प्रतिदीप्ति का उपयोग कर झिल्ली प्रोटीन अभिव्यक्ति की प्राथमिक स्क्रीन। ई के> डिटर्जेंट lysates कोलाई एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण किया गया कोशिकाओं और जैल ब्लू महामारी रोशनी और एक 530/28 फिल्टर का उपयोग imaged। परिणाम (एक 96 अच्छी तरह से थाली में अपनी स्थिति के आधार पर ए 4-H6 लेबल) 24 निर्माणों के लिए दिखाए जाते हैं। मुक्त GFP और GFP संलयन प्रोटीन के लिए बैंड के पदों संकेत कर रहे हैं। Lemo21 (DE3)। (बी) C41 (DE3) pLysS में व्यक्त प्रोटीन में व्यक्त (ए) प्रोटीन।

चित्रा 3
चित्रा 3:। झिल्ली प्रोटीन अभिव्यक्ति की माध्यमिक स्क्रीन प्रतिदीप्ति का पता चला आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (FSEC) का उपयोग कर कुल झिल्ली अंशों चार अलग अलग डिटर्जेंट में निकाले गए थे और solubilized झिल्ली प्रोटीन एक प्रतिदीप्ति डिटेक्टर के लिए युग्मित एक FPLC प्रणाली का उपयोग कर आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा विश्लेषण किया। के लिए FSEC प्रोफाइल (ए) झिल्ली प्रोटीन B5 और (बी)

Discussion

इस आलेख में वर्णित प्रोटोकॉल में, एक GFP संवाददाता वेक्टर में बंधाव स्वतंत्र क्लोनिंग तेजी से ई में कई झिल्ली प्रोटीन के रिश्तेदार अभिव्यक्ति स्क्रीन करने के लिए प्रतिदीप्ति का पता लगाने के साथ संयुक्त है कोलाई। वैक्टर प्राथमिक अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग एक और सप्ताह लेने के साथ चार कार्य दिवसों में किया जा सकता है। में जेल पूरे कोशिकाओं के डिटर्जेंट lysates के प्रतिदीप्ति अभिव्यक्ति एक माध्यमिक स्क्रीन में आगे के विश्लेषण के लिए हिट पद के लिए प्रयोग किया जाता है। के रूप में प्रस्तुत प्राथमिक अभिव्यक्ति स्क्रीन के अलावा गहरे कुएं ब्लॉकों में कोशिकाओं को उगाने के लिए उपयुक्त एक प्रकार के बरतन इनक्यूबेटर से किसी भी विशेषज्ञ उपकरण की आवश्यकता नहीं है। 96 अच्छी तरह से एसबीएस प्लेटों से जुड़े अन्य सभी तरल से निपटने मल्टी चैनल pipettes का उपयोग किया जा सकता है। प्रोटोकॉल आसानी से अलग अभिव्यक्ति शर्तों (जैसे कम तापमान) के तहत उगाया अन्य कोलाई उपभेदों शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। Rhamnose के स्तर titrating LEMO21 (DE3) के मामले में (0 से 2.0 मिमी करने के लिए)कुछ झिल्ली प्रोटीन 7 की अभिव्यक्ति के स्तर को बढ़ा सकते हैं प्रतिलेखन की दर मिलाना के लिए कहा। कठोर डिटर्जेंट शामिल किए जाने के शरीर से प्रोटीन solubilize और इसलिए झूठी सकारात्मक दे सकते हैं, हालांकि DDM के अलावा अन्य डिटर्जेंट प्राथमिक स्क्रीन में निकासी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। जाहिर है, अधिक प्रारंभिक स्क्रीन हो जाता है विस्तृत, और अधिक समय लेने वाली प्रयोग।

माध्यमिक स्क्रीन प्राथमिक स्क्रीन में पहचान की अभिव्यक्ति हिट से कुल झिल्ली अंश की तैयारी शामिल है। यह यह ई की झिल्ली को संलयन प्रोटीन का स्थानीयकरण की पुष्टि करेगा के रूप में एक महत्वपूर्ण कदम है कोलाई कोशिकाओं। विभिन्न डिटर्जेंट में GFP संलयन प्रोटीन के बाद निकासी डिटर्जेंट प्रोटीन परिसरों की मोनो dispersity आकलन करने के लिए solubilized सामग्री की प्रतिदीप्ति का पता चला आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा नजर रखी है। इसके लिए सबसे उपयुक्त डिटर्जेंट की पहचान करता है के बाद से यह एक महत्वपूर्ण कदम हैबाद के बहाव के प्रसंस्करण के लिए झिल्ली प्रोटीन के solubilization। हालांकि, अनुभव डिटर्जेंट (एस) की पसंद के आगे अनुकूलन अभी भी शुद्धि और क्रिस्टलीकरण के दौरान आवश्यक हो सकता है कि पता चलता है। एक अपेक्षाकृत छोटे मिसेल आकार (जैसे LDAO) के साथ लोगों सहित विभिन्न डिटर्जेंट में वर्दी व्यवहार के साक्ष्य में कम से कम प्रोकार्योटिक झिल्ली प्रोटीन 14 के लिए क्रिस्टल diffracting अच्छी तरह से फार्म करने के लिए एक प्रवृत्ति का अच्छा संकेत प्रतीत होता है। इस संबंध में चित्रा 2B में झिल्ली प्रोटीन के लिए दिखाया गया प्रोफाइल अत्यधिक अनुकूल प्रतीत होता है।

एक GFP संवाददाता का उपयोग करने का मुख्य लाभ यह है कि संयुक्त राष्ट्र के शुद्ध नमूनों में अभिव्यक्ति की एक तेजी से पढ़ने के लिए बाहर देता है। एक नुकसान यह GFP संलयन प्रोटीन क्रिस्टलीकरण के लिए प्रोटीन की शुद्धि के दौरान हटा दिया जाना चाहिए कि है। यहां इस्तेमाल वैक्टर के मामले में, एक rhinovirus -3 सी प्रोटीज साइट GFP की दरार में सक्षम बनाता है। वैकल्पिक रूप से, यह स्पष्ट हैकेवल बाद शुद्धि के लिए एक polyhistidine या अन्य आत्मीयता टैग जोड़ने जो वैक्टर में स्क्रीन में पहचान उम्मीदवार प्रोटीन,-क्लोन फिर से करने के लिए। इस GFP के लिए फ्यूजन अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक नहीं है कि मानता है। झिल्ली प्रोटीन अभिव्यक्ति और solubilization का पता लगाने के लिए GFP के लिए संलयन का उपयोग करने के लिए मुख्य विकल्प केवल एक हिस्टडीन टैग जोड़ने के लिए है। हालांकि इस दृष्टिकोण आम तौर पर कई वेरिएंट के मूल्यांकन के लिए बहुत समय लेने वाली बन जाएगा जो एक झिल्ली अंश 15 के साथ शुरू की आवश्यकता है।

सारांश में, इस आलेख में वर्णित प्रोटोकॉल का मुख्य उद्देश्य झिल्ली प्रोटीन अनुक्रम की एक बड़ी संख्या तेजी से अभिव्यक्ति और डिटर्जेंट solubilization की दृष्टि से मूल्यांकन और गहरा विश्लेषण के लिए प्राथमिकता के आधार पर किया जाना है वेरिएंट के लिए सक्षम है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pOPIN-N-GFP addgene (www.addgene.org)
pOPINE-3C-GFP addgene (www.addgene.org)
C41(DE3)pLysS Lucigen (http://lucigen.com/) 60444-1
LEMO21(DE3) New England Biolabs C2528H
In-Fusion HD EcoDry Cloning System, 96 Rxns Clontech/Takara 639688
Power broth Molecular Dimensions (http://www.moleculardimensions.com/) MD12-106-1
Protease Inhibitor tablets Roche 11697498001
cOmplete, Mini, EDTA-Free; Protease Inhibitor Cocktail  Roche 11836170001
L-Rhamnose monohydrate Sigma-Aldrich 83650
Protease Inhibitor Cocktail  Sigma-Aldrich P8849
DNAse 1 Sigma-Aldrich DN25
Lysozyme Sigma-Aldrich L7651
Cholesterol hemisuccinate Sigma-Aldrich C6512
CYMAL-6 (6-Cyclohexyl-1-Hexyl-β-D-Maltoside) Anatrace C326
DDM (n-Dodecyl β-maltoside) Generon D97002
DM (n-Decyl β-maltoside) Generon D99003
LDAO (N,N-Dimethyl-n-dodecylamine N-oxide) Generon D71111
E1 ClipTip Eq384 8 channel 1-30 µl Thermo Scientific  4672030
Rainin Pipette Pipet-Lite XLS 6ch 100-1,200 µl LTS Spacer Anachem LA6-300XLS
Rainin Pipette Light XLS+ 8ch 2-20 µl LTS Anachem L8-20XLSPLUS
Pipette Pipet-Lite XLS 8ch 100-1,200 µl LTS Tip Anachem L8-1200XLS
24 well V bottom deep well blocks Porvair sciences 360115
BenchMark Fluorescent Protein Standard Life Technologies LC5928
NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 well Life Technologies WG1203BOX
XCell4 SureLock Midi-Cell Life Technologies WR0100
Vibramax 100 Heidolph 544-21200-00
Tension rollers attachment Heidolph 549-81000-00
ptima L-100 Ultracentrifuge running 45-Ti rotor Beckman Coulter 393253
Optima Max-XP ultracentrifuge running TLA-55 rotor Beckman Coulter 393315
Floor standing centrifuge, Avanti J-26S XPI running JA-17 and JS-5.3 rotors  Beckman Coulter B14535
Prominence UFLC with RF-20A Fluorescence detector Shimadzu
Sepharose 6 10/300 GL size exclusion column GE Healthcare 17-5172-01 
SSI5R-HS SHEL LAB Floor Model Shaking Incubator, 5 Cu.Ft. (144 L), 30-850 rpm Shel Lab  SSI5R-HS
Innova44R incubator New Brunswick /Eppendorf Innova44R
TS Series 0.75 kW Disrupter 230 V 50 Hz 1 PH (40 kpsi) Constant systems PL083016
L-Rhamnose monohydrate Sigma 83650

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References

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माइक्रोबायोलॉजी अंक 95 झिल्ली प्रोटीन हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन प्रतिदीप्ति का पता लगाने, अभिव्यक्ति की स्क्रीनिंग
झिल्ली प्रोटीन की हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन आधारित अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग में<em&gt; Escherichia कोलाई</em
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Bird, L. E., Rada, H., Verma, A.,… More

Bird, L. E., Rada, H., Verma, A., Gasper, R., Birch, J., Jennions, M., Lӧwe, J., Moraes, I., Owens, R. J. Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (95), e52357, doi:10.3791/52357 (2015).

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