Abstract
동시에 세포 내 biocytin 충전 급성 뇌 조각 준비에 두 개 (또는 그 이상)의 시냅스 결합 뉴런 (쌍 녹음)에서 패치 클램프 녹음의 조합은 구조적 및 기능적 특성의 상관 분석을 할 수 있습니다. 이 방법으로 그들의 형태 및 전기 생리 학적 반응 패턴에 의해 모두 사전 및 시냅스 후 뉴런을 식별하고 특성화 할 수있다. 쌍으로 녹음이 뉴런 사이의 연결 패턴뿐만 아니라 모두 화학 및 전기 시냅스 전송의 특성을 연구 할 수 있습니다. 여기서, 우리는 신경 세포 형태의 최적의 복구와 함께 안정적인 페어링 녹화를 얻기 위해 필요한 절차를 단계별로 설명을 제공한다. 우리는 화학적 시냅스 또는 갭 접합을 통해 연결된 뉴런의 쌍 뇌 슬라이스 준비에서 확인하는 방법을 설명합니다. 우리는 뉴런 dendrit 그들의 3 차원 형태를 얻기 위해 재구성 방법을 간략하게 설명 할 것이다IC와 축삭 도메인과 방법 연접 식별 및 지역화됩니다. 우리는 또한 특히 뇌 조각의 준비 기간 동안 수지상 축삭 잘림과 관련된 사람들은이 강하게 연결 추정 영향을 미치므로, 한 쌍의 기록 기술의주의 사항 및 제한 사항에 대해 설명합니다. 그러나, 한 쌍의 기록 방법의 다양성으로는 뇌에서 확인 된 신경 세포의 미세 회로에서 시냅스 전달의 다양한 측면을 특성화에 유용한 도구로 유지됩니다.
Introduction
두 개의 뉴런 사이의 시냅스 결합 미소 신경은 뇌에서 대규모 네트워크의 구성 블록과 시냅스 정보 처리의 기본 단위이다. 이러한 신경 미세 회로의 특성을위한 전제 조건은 형태학 및 사전 및 시냅스 후 뉴런 파트너 모두의 기능적 특성, 시냅스 연결 (들) 및 그 구조 및 기능적 메커니즘의 유형을 아는 것이다. 그러나 시냅스 연결의 많은 연구에 저항기의 뉴런의 적어도 하나의 특징이 잘되지 않는다. 이것은 종종 시냅스 연결의 연구에 사용 비교적 비특이적 자극 프로토콜의 결과. 따라서 시냅스 전 뉴런의 구조적 및 기능적 특성은 모두 하나 또는 단지 약간 작은 정도로 식별되지 않은 (즉, 마커 단백질의 발현 등). 마커들에 의해 세포 내 염색과 함께 짝을 녹음biocytin, neurobiotin 또는 형광 염료 UCH는 작은 신경 세포의 미세 회로를 공부에 더 적합하다. 이 기술은 사람이 동시에 형태학 식별 시냅스 연결의 구조적 및 기능적 많은 파라미터를 조사 할 수있다.
두 개의 뉴런 사이의 소위 '단일'monosynaptic 연결은 급성 슬라이스 준비를 사용하여 두 피질 및 피질 뇌 영역 1-10 조사되었다. 먼저, 날카로운 미소 전극은 이들 실험에 사용 하였다; 이상, 패치 클램프 기록은 낮은 잡음 레벨과 시간 해상도 개선과 시냅스 신호들의 기록을 얻기 위해 사용 하였다.
중요한 기술적 진보는 적외선 미분 간섭 대비 (IR-DIC) 광학 11-14, 크게는 수 t이되도록 뇌 조각에서 뉴런의 가시성과 인식을 개선 현미경 기술을 사용했다O를 시각적으로 확인 된 시냅스 연결 15-17에서 녹음을 구하십시오. 일반적으로 짝을 녹음 급성 슬라이스 준비에서 수행된다 매우 소수의 출판물은 생체 18-20에서 시냅스 연결 뉴런에서 사용할보고 기록이다.
페어링 레코딩의 가장 중요한 장점은, 기능적 특성은 광학 및 전자 현미경 수준 모두에서 형태 학적 분석과 결합 될 수 있다는 사실이다 (참조 예., 7,16,21). 조직 화학적 처리 후 시냅스 신경 접속 쌍의 축삭 돌기 형태가 추적된다. 이어서, 이들 변수는 다음 특정 시냅스 연결의 대물 분류 기준을 제공 할 수있다 등의 길이, 공간적 밀도, 방향 분지 패턴 형태 적 특징을 정량화 할 수있다. 또한, 접속 .. 신경 연구를위한 다른 기술이 사용되는 대부분 대조적vity, 쌍 기록은 단일 시냅스 연결을위한 연접의 식별을 허용합니다. 이는 광학 및 전자 현미경 16,21-27의 조합을 이용하거나 돌기 쪽의 칼슘을 사용하여 28, 29 촬상 직접 행해질 수있다. 그러나, 후자의 접근 방식 만 아니라 흥분 억제 성 연결이 연구 될 수 그것이 시냅스 후 수용체 채널을 통해 칼슘 유입을 필요로.
정의 신경 저항기 쌍의 녹화에서 시냅스 전달의 상세한 분석 외에도 시냅스 규칙 (30, 31)의 조사를 허용 또는 - 아세틸 콜린 (32) 및 아데노신과 같은 신경 전달 물질에 의해 시냅스 전달의 조절 - 작용제 / 길항제 애플리케이션과 함께 (33).
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Protocol
모든 실험 절차는 동물의 보호, 독일의 동물 복지법에 대한 EU 지침 (Tierschutzgesetz)과 유럽 실험 동물 학회의 연맹의 지침에 따라 수행되고있다.
전기 생리학 1. 셋업
한 쌍의 기록으로 시작하기 전에, 전기 생리학 설정 내장되어야한다. 이러한 셋업은 아래와 같습니다 조립 방법에 대한 간략한 개요 :
- 현미경, 매니퓰레이터와 모든 다른 장비가 배치 될되는 방진 테이블을 설치한다.
주 : 진동 운동의 임의의 다른 종류의 문제는 (기록 전극으로 대체 검색 전극) 피펫의 변경을 요구하기 때문에 시냅스 연결에 기록 할 때 가능한 한 작게 할 필요가있다. - 전기적 잡음을 감소시키는 방진 테이블 주위에 패러데이 케이지를 놓는다. 패러데이 캘리포니아 내에서 모든 장비를 연결합니다전기 접지와 GE.
- 제조자의 지침에 따라 방진 테이블 전동식 XY 테이블에 기초 동력 축과 초점 현미경을 설치한다. 이것은 신뢰성 좋게 신피질에 연결 전이 층의 경우와 같은 시야에없는 뉴런 현미경을 이동할 수있다.
- 현미경 카메라 포트에 비디오 카메라를 설치하고 슬라이스 준비 및 전극의 움직임을 관찰 및 / 또는 디지털 - 아날로그 화면을 연결한다. 시냅스 결합 된 신경 세포 쌍의 각각 저와 개요를 얻을 수있는 높은 전력 배율 확대 이미지를 전환 할 수있는 카메라를 사용합니다. 이것은 또한 패치 전극의 움직임을 제어하는 것을 돕는다.
- 목욕 챔버에 대한 인세를 포함하는 표본 테이블을 설치 뇌 슬라이스 준비 (방풍 블록에서 사내 드릴). 이 표본 테이블에 연결되지 않아야현미경, 즉, 에어 테이블에 고정되어야하며 현미경은 그 아래의 기동성이 있어야한다.
- 마운트 두 개 (또는 필요한 경우 그 이상)의 모든 입체적으로 이동 될 수 고정밀 미세 조작기. 조작기에 패치 클램프 프리 앰프를 설치하고 메인 앰프에 연결합니다.
주 : 필요한 추가 조작기는, 예를 들어 두 개 이상의 프리 앰프, 세포 외 자극 전극, 약물 전달 시스템 등을 설치할 수 있다면 - 시편 테이블에서 목욕 챔버를 놓습니다. 솔루션 입구를 설치하고 콘센트와 관류 시스템에 연결합니다.
- / 분 최적의 슬라이스에 대해 6 ml의 생존 - (4)의 안정적인 유속 (표 1 ACSF) 인공 뇌척수액과 기록 챔버의 관류를 유지하는 연동 펌프를 사용한다.
참고 :이 ASCF에서 난류 및 슬라이스 따라서 운동 발생합니다 상당히으로이 유량을 초과하지 마십시오. 시편 테이블 위에 온도 프로브와의 Ag / AgCl을 접지 전극 용 홀더를 설치합니다. 이는 챔버 내의 욕을 샘플링 프로브와 전극을 허용 할 필요가있다. - 슬라이스 준비 뉴런의 좋은 시야 현미경에 적외선 조명을 사용합니다. 이 때문에 빛의 회절 및 이미지 흐림 현상을 줄일 수 있습니다. 현미경이 '3D' 같은 시각화를 달성하기 위해 미분 간섭 대비 광학 장착되어 있는지 확인합니다. 이 신경 세포 패치 도움 슬라이스 (60 μm의 또는 깊이)에 깊이 신경 세포를 대상으로 수 있습니다.
- 실험 기간 동안, 바닥에 유리 커버 슬립과 실험 실에서 뇌 조각을 유지합니다. 부동에서 슬라이스를 방지하기 위해 슬라이스의 상단에 '백금 하프'를 놓습니다. 백금 하프는에 붙어 치실의 문자열을 U 자형, 평평 백금 와이어에서 이루어집니다.
- OPT를 보장하기 위해 35 °의 C - (32)의 온도에서 슬라이스를 관류 ACSF 유지산소와 pH를 imal 제어 할 수 있습니다. 이것은 욕 챔버로 유입 ACSF 가깝게 설치 펠티에 장치와 용액을 가열하여 수행 할 수있다.
주 : 사용 초박형 커버 높은 개구 짧은 작동 거리 심지어 현미경 응축기 시험편에 집중 될 수 있도록 슬립. 이는 슬라이스의 최적의 조명을 위해 필요하다.
이미지와 뇌 슬라이스 준비 쌍 녹음에 최적화 된 전기 생리학 설정에 대한 설명은 참조. (34) 그림 4 참조.
2. 뇌 슬라이스 준비
- 온화 뇌 조직은 이소 플루 란 (최종 농도 <0.1 %)로 촬영되어야하는 동물을 마취.
주의 : 다른 마취제가 또한 사용될 수있다. 마취의 사용은 각각의 동물위원회의 권고 사항과 규정을 준수해야한다. 항상 동물이 추가 한 후에 염증이나 스트레스가 아닌지 확인마취. - 상기 동물의 목을 벨 두개골을 열고 참고 문헌에 기재된 절차. (34, 35)을 사용하여 가능한 한 빨리 뇌를 제거한다.
- 95 % O 2 5 % CO 2와 carbogen 가스의 혼합물로 폭기 냉각 (4 ° C에서) 인공 뇌척수액으로 뇌를 전송합니다.
- 공부해야하는 뇌 영역을 분리합니다.
참고 : 매개 변수가 최적의 보존과 수상 돌기 및 사전 및 시냅스 후 뉴런의 축색 돌기의 최소한의 절단을 얻기 조사에서 각 신경 세포의 연결 및 발달 단계에 대해 사전에 결정되어야한다. 최적 해부 뇌 슬라이스에서 시냅스 전 신경 세포의 축삭은 슬라이스 표면 평행 할 필요는 없다. 오히려, 그들은 얕은 각도로 조각으로 표시해야한다. 이 시냅스 피라미드 뉴런의 수상 돌기 꼭대기에 적용; 이는 빛을 현미경으로 확인해야합니다. 로컬이 아닌 또는 t 특히 중요하다ranslaminar 시냅스 연결, 즉., 사전 및 시냅스 세포체 200 개 이상의 μm의 떨어져와 수지상 축삭 잘림 확률이 로컬 연결에 대한보다 상당히 높을 수 것입니다. - 마이크로톰 챔버로 뇌를 전송합니다. 실험 결과에 따라, 다른 세포 외 슬라이스 솔루션은 동물의 나이에 따라 사용되는 (; 도움이되는 정보도 '에서 찾을 수 있습니다 표 2, 3 참조 http://www.brainslicemethods.com/ '참조).
- 대상 영역이 보일 때까지 뇌 트림.
- 동물이 성숙 경우 (3 주>) 400 μm의 두께 뇌 조각 - 좋은 세포 가시성 조각을 얻으려면 300를 잘라. 실질적으로 손상 세포 visib없이 800 μm의 - 동물 (1 ~ 2 성 차 생쥐와 쥐 출생 주) 조각 미숙 한 경우 ~ 600의 두께로 잘라 될 수 있습니다ility.
주 :이 미성숙 슬라이스의 안정성 향상 및 장거리 축삭 돌기 담보 가능 잘림의 수를 감소시킬 것이다. - 95 % O 2 및 5 % CO 2의 혼합물을 통기 슬라이싱 용액으로 채워져 배양실로 마이크로톰 슬라이스 챔버로부터 전송. 실험의 종류에 따라, 또는 RT ~ 30 ° C에서 어느 적어도 30 분에서 1 시간 동안 배양 챔버에서 슬라이스를 보관.
3. 페어 패치 클램프 녹음 및 Biocytin 필링
시냅스 연결 유형에 따라 서로 다른 세 가지 접근법은 시냅스 결합 뉴런을 찾기 위해 사용된다. (대부분의 흥분성 연결 예상 될 수있는) 접속 확률이 낮을 경우 다음과 같이 진행 :
- 낮은 연결을 통해 신경 세포의 연결
- 나열된 조성물의 내부 용액으로 패치 피펫 채우기표 4에서 전체 셀 구성에있는 모든 기록은 3 사이의 농도 biocytin 추가 -. 사전 및 시냅스 후 뉴런에 대한 좋은 염색 결과를 얻기 위해 내부 (피펫) 솔루션 5mg / ml가. (신경 세포의 크기에 따라) 30 분 - 적어도 15 세포 내로 확산 biocytin하자.
참고 : 아래에 언급 된 '검색'피펫에 사용되는 용액에 biocytin 추가하지 마십시오. - 전체 세포 모드 추정 시냅스 후 뉴런 패치. 가늘고 긴 생크와 패치 피펫을 사용합니다. 이것은 대물하에 피펫의 기동성을 용이하게하고 전극 슬라이스에 도입 될 때 발생할 수있는 움직임 아티팩트를 감소시킨다.
- 10 MΩ 저항과 작은 팁 직경 - 그럼, (8)의 '검색'패치 피펫을 사용하여 세포 부착 구성에서 잠재적 인 시냅스 전 뉴런 패치. 이 피펫으로 '느슨한'세포 부착 된 패치를 설정합니다. FILK + L은 시냅스 세포에 대한 검색 동안 뉴런 탈분극하지 않도록 나 + (표 5)에 의해 교체되는 내부 용액과 '검색'피펫.
참고 : '느슨한'씰 저항이 GΩ 범위에없는 있지만, 일반적으로 약 30-300 MΩ. - 현재 클램프 모드에서 약 -30 MV -60에 '느슨한'실에서 막 전위를 잡습니다. 잠재적 인 시냅스 세포의 활동 전위를 유도하기 - (2 nA의 0.2) 다음에, 큰 전류 펄스를 적용합니다. 전압 응답에 작은 이삭으로이 활동 전위를 관찰합니다.
- 시냅스 응답의 런 다운을 방지하기 위해 0.1 Hz로 자극 주파수를 설정합니다. 뇌 조직은 매우 미숙 또는 시냅스 연결이 매우 신뢰할 수 없습니다 경우에 낮은 자극 주파수를 사용합니다.
- 경우 '시냅스'뉴런 시험 '시냅스'NEU의 자극에 응답하지론은 '느슨한'씰 모드에서 새로운 신경 세포를 패치. 30 MΩ이 설정>의 저항 씰만큼 '검색'패치 전극을 교체하지 마십시오. 이 방법으로 30 잠재적 시냅스 신경 세포까지 테스트합니다.
주 : 느슨한 패치 클램프 검색 절차 동안 신경 손상을 방지하기 위해, 단지 부드럽게 흡입 전 세포 패치 피펫에 적용된 것과 비교 검색 피펫에 적용되어야한다. - 대기 시간 EPSP / IPSP의 '느슨한'씰 모드 결과에 자극은 <시냅스 후 뉴런에 5 밀리 초는 시냅스 전 뉴런에서 '검색'피펫을 제거합니다.
- biocytin 함유, 정기적 인 내부 용액으로 충전 패치 전극과 '검색'패치 피펫을 교체합니다. 이 기록 패치 피펫을 확인하는 것은 4의 저항이 - 8 MΩ을; 전극 저항이 될 수있는 낮은 소마 크기가 클수록.
- 시냅스 패치전 세포 전류 - 클램프 모드 뉴런 기록. 시냅스 전 뉴런에서 전류 주입에 의해 활동 전위를 유도하고 시냅스 응답을 기록합니다. 나중에 오프라인 분석을 위해 컴퓨터에 데이터를 저장합니다.
- 나열된 조성물의 내부 용액으로 패치 피펫 채우기표 4에서 전체 셀 구성에있는 모든 기록은 3 사이의 농도 biocytin 추가 -. 사전 및 시냅스 후 뉴런에 대한 좋은 염색 결과를 얻기 위해 내부 (피펫) 솔루션 5mg / ml가. (신경 세포의 크기에 따라) 30 분 - 적어도 15 세포 내로 확산 biocytin하자.
- 높은 연결을 통해 신경 세포의 연결
참고 : 높은 연결 비율 (> 30 %)와 신경 세포의 미세 회로를 들어 시냅스 연결을 찾기 위해 다른 절차를 사용합니다. 이 절차는 아래에 설명하고 자주 흥분 연결 (36) 평균보다 높은 연결 비율이 억제 시냅스 연결에 사용됩니다. 연결 비율이이 값 이하로 떨어질 때 사용되어서는 안된다.- 전 세포 모드에서 직접 시냅스 신경 패치. 그 후, 잠재적 인 시냅스 신경 패치 또한 전체 셀 모드. 두 세포는 현재 클램프 통제하에 있어야한다. 시냅스 세포에서 활동 전위를 유도. postsy에 대한 미래의 시냅스 후 뉴런을 모니터naptic 가능성.
- 경우 뉴런은 시냅스 전 자극에 반응을 보여 정규 내부 용액으로 충전 패치 전극을 사용하여 전체 세포 모드에서 새로운 뉴런 패치 않는다. 연결이 발견되면, 패치 피펫을 변경하지만 녹화를 진행하지 않는다. 그런 다음, 단계 3.1.9에서와 같이 진행합니다.
- 갭 접합을 통해 신경 세포의 연결
참고 : 전기 (갭 접합) 연결을 검색하려면 가능성이 낮은 연결에 사용되는 수정 된 버전입니다 다음 절차를 사용합니다.- 전 세포 패치 클램프 구성에서 시냅스 후 뉴런 패치.
- 10 MΩ 저항 - 7의 '검색'패치 피펫을 사용하여 - 그 후, 느슨한 밀봉 구성의 추정 시냅스 전 뉴런 (300 MΩ (30)의 낮은 씰 저항) 패치. 이 피펫은 느슨한 밀봉 자극에 대한 수정 된 높은 나 + 내부 용액으로 충전해야합니다.
- Inject 100-300 밀리 초 '느슨한'씰을 통해 긴 과분극 전류 펄스; 피펫 명령 잠재력은 약 -60 MV -70로 설정해야합니다. '시냅스'신경 세포에있는 작은 과분극 응답이 자극 결과의 경우 간극 결합 연결을 확인하십시오.
- 전체 세포 모드 '연접'뉴런 재 패치 및 전술 한 바와 같이 진행.
참고 : 축삭과 수상 돌기 프로세스의 좋은 염색을 위해 아래의 프로토콜을 사용합니다. 이 프로토콜은 간략하게 설명되어 있지만, 우리 실험실에서 사용 조직 화학적 처리를위한 상세한 프로토콜은 참고 문헌에 제시되어있다. (37).
4. 조직 화학 처리
- 0.1 M 인산 완충액 4 % 파라 포름 알데히드를 함유하는 바이알로 연결된 뉴런의 시냅스 쌍 뇌 슬라이스 옮기고 24 시간 동안 슬라이스를 흥분시키는. 전자 현미경의 경우, 2.5 %를 사용 glutar 슬라이스를 흥분시키는알데히드 및 1 % 파라 포름 알데히드.
- 다음날 더 정착액을 함유하지 않는 통상의 포스페이트 버퍼로 슬라이스를 옮긴다. 10 8 배 - - 6 인산염 완충 조각을 씻어 15 분 각 초과 정착을 제거합니다.
- 내인성 퍼 옥시 다제 반응을 최소화하기 위해 3 % H 0.1 M 인산 완충액 2 O 2 용액을 20 분 동안 인큐베이션 슬라이스. 강한 거품 형성을 관찰한다. 더 이상 거품이 생성되지 않을 때까지 반응을 계속합니다. 나머지 H 2 O 2를 제거하기 위해 (각 10 분) 8 시간 -이어서, 6 0.1 M 인산 완충액 슬라이스를 헹군다.
- 면역 세포 화학 및 발색 반응
biocytin 채워진 뉴런 가시화 디아 미노 벤지딘 촉매로 스트렙 타비 딘 - 비오틴 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 반응에 기초한다; 이 높은 공간 해상도로 선명한 얼룩을 생산하는 어두운 침전물을 생성합니다. 다음 절차는 발색 반응에 사용되는 <OL> - 제조의 프로토콜에 따라, ABC 솔루션을 준비합니다. (에만 광학 현미경 표 6)과 어둠 속에서 약 30 분 동안 솔루션을 유지 150 μL 10 % 트리톤 X100 보충 14.55 ml의 인산 버퍼에 추가합니다. 이 솔루션 O에서 / N 사용하기 전에 조각을 품어.
- RT에서 1 시간 동안 진탕하고 어두운 ABC 용액 슬라이스 부화. 그 후, 냉장고에서 4 ° C에서 조각 O / N를 유지합니다. 다음 날 아침에, 추가 시간 동안 실온에서 조각 품어.
- 그 후, 인산 완충액을 10 분마다 조각을 적어도 네 번 씻어. 그리고, 니켈 - 강화 3-3'-디아 미노 벤지딘 용액 (표 7)을 2 ㎖로 어둠 속에서 30 분 동안 진탕 배양한다. 디아 미노을 처리하고 만 흄 후드를 사용할 때주의해야합니다; 심지어 매우 낮은 농도에서 매우 발암 물질이다.
- 6.5 μL 3 % H 2 O 2를 추가 디아 미노 함유솔루션입니다. 갈색 검은 색 스테인드 신경 세포가 눈에 잘 때까지 광학 현미경 하에서 발색 반응을 모니터링합니다. 그런 다음, 인산염 버퍼에 조각을 여러 번 세척하여 즉시 반응을 중지합니다.
- 접착제, 실란 코팅 Histobond 또는 호화 표준 개체 슬라이드에 묻은 신경 세포와 산 조각.
- 적어도 80 %의 습도 O / N와 습한 챔버에서 슬라이드 유지. 다음 날, 조각은 자연 건조 추가로 10 분 동안 할 수 있습니다. 이들을 탈수하기 위해 - (100 %, 20)의 에탄올 농도가 증가함에 따라 용액에, 이전 슬라이드를 매립하기 전에.
주 : 탈수 과정이 그렇지 수지상 축삭 프로세스 왜곡 37 발생할 가능성이 저하 될 것이다. 대안 매립 절차가 선택되면, 예를 들면, 글리세롤 계 Moviol 하나는, 탈수는 필요하지 않다; 그러나이 때문에 불균일 한 조각의 압축과 왜곡 된 신경 morpholo를받을 수 있으므로GY. - 마지막으로, 크 실롤에서 10 분 동안 품어 광학 현미경에 대한 소수성 매입 매체에 조각을 포함하고 위에 초박형 된 커버를 배치합니다. 슬라이드는 실온에서 20 분 동안 건조 시키십시오.
5. 신경 재건 및 시냅틱 연락 현지화
- 60X / 100X 오일 침지 목적과 최적의 공간 해상도에 대한 높은 개구와 냉각기가 장착 된 광학 현미경 biocytin 표지 신경 세포와 슬라이드를 검사합니다. 그 축삭의 종말을 확인하고 돌기 쪽이 명확하게 볼 수 있습니다.
- 추적 시스템을 사용하여 상업적 신경 뉴런 또는 시냅스 신경 결합 쌍을 추적 신경 3D 재구성을 얻는다 (구체적인 재료 / 장비의 도표 참조). 심지어 작은 축삭 돌기 또는 담보를 검출하기 위해 일정 육안 검사에서 수동으로 추적을 수행합니다. 시냅스 결합 뉴런에서 짝을 기록 수동 추적은 여전히의 방법입니다선택 예를 들어, 사전 또는 시냅스 후 뉴런 중 하나에 축삭 프로파일의 속성은 실질적인 재건 경험이 필요하기 때문이다.
- 필요한 경우, 축삭 종말 및 / 또는 돌기 쪽의 수를 확인합니다. 척추 또는 척추 아형 축삭 종말이 예 피질 층 또는 영역에 대해 특정 분포 및 밀도를 나타낼 수 있기 때문에, 이는 신경 세포 유형의 특성을 도울 수.
- 시냅스 결합 신경 쌍의 경우, 사용할 수있는 최대 배율로 가까운 appositions의 시냅스 축삭과 수상 돌기 시냅스를 확인합니다. 축삭 팽대를 관찰하고 시냅스 돌기 척추 또는 샤프트는 추정 시냅스 접촉으로 간주 될 수있는 동일한 초점면에 있습니다. 재건이 연락처를 표시합니다.
- 추적 프로그램의 해당 섹션에 세 가지 차원 공간에서 수축 신경 재건을 수정합니다.
참고 : 고정 동안, 조직 화학적 처리탈수 상당한 기계적 변형 및 수축이 발생; 이것은 축삭 및 수상 돌기 길이 측정에 영향을 심하게 그들의 공간 배열을 왜곡한다. 매립 매체 수축 정정 인자는 Z 방향 (37) ~ x 및 y 방향에 대한 1.1 ~ 2.1이다. - 정량적 형태소 분석 (특정 재료 / 장비의 표 참조)에 대한 신경 생리 데이터 분석 프로그램을 사용한다.
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Representative Results
짝 기록은 형태 학적으로 확인 된 대학 또는 양방향 시냅스 연결에 대한 심도있는 특성에 대한 선택의 방법뿐만 아니라 간극 결합 (전기) 연결 (그림 1)입니다. 체성 감각 피질 배럴의 층 (4)에 한 쌍의 기록의 예는도 1a에 도시된다. 단방향 흥분성과 억제 성 시냅스 연결 둘 다 (그림 1B, C)을 특징으로 할 수있다. 또한 짝을 녹음 한 쌍의 두 신경 사전 및 서로 연접되어있는 연결에서, 즉 양방향 시냅스 연결에서 기록 할 수 있습니다. 이는 억제 interneuron 및 흥분성 뉴런으로부터 기록을 도시도 1d에 도시되어있다. 시냅스 억제 interneuron (검은 흔적)에 EPSP의 액션 흥분성 신경 세포의 전위 (붉은 흔적) 결과를 도출. 그러나, 활동 전위는 EVO 때interneuron에 KED, IPSP가. 흥분성 신경 세포에 기록 된 그림 1E는 간극 결합을 통해 또는 간극 결합과 화학적 시냅스를 통해 연결된 뉴런에서 기록하는 것도 가능하다 것을 알 수있다. 갭과 상호 접합 연결은 원경 아니라 다른 기술에 의해 전기 생리 학적 기록 페어링에 의해 식별 될 수있다.
패치 피펫 및 전기 생리학 녹음을 통해 연결된 뉴런의 biocytin 충전의 조합은 시냅스 속성에 신경 세포의 형태 학적 특성의 상관 관계를 할 수 있습니다. 조직 화학적 처리 뉴런은 집착 조각 (그림 2A)에 어두운 구조로 볼 수 있습니다 후. 그 후 기록 된 신경 세포의 형태 학적 쌍 재구성 될 수 있고, 신경 세포 유형이 식별 될 수있다. 또한, 추정 연접 (도 2A 및 우측 패널 Figur의 수 및 위치를 식별 할 수있다전자 2B 인세 트). 도 2b에 도시 된 신경 쌍 왕복 접속되고, 이에 연접 뉴런 모두에서 확립된다. 정확성 16,21,26의 90 % 정도 - 우리의 손에, 추정, 빛 현미경으로 확인 연접는 80 전자 현미경 사실 시냅스 연락처로 확인되었다.
도 3에 설명 된 탐색 절차를 사용하여 식별 될 수있는이 전이 층 신경 저항기가 낮은 연결 가능성이 있지만 배럴 피질 신피질 층 (6)에 연접 피라미드 뉴런 층 (4)에서 흥분성 가시 뉴런에서 페어링 기록의 예를 도시 낮은 연결을 통해 신경 세포의 연결을 위해 3.1.9 - 3.1.1 단계를 반복합니다. 한 쌍의 기록 기술에 또한 신경 사이에 장거리 전이 층 연결부 (예) 또는 접속의 경우에서와 같이 매우 낮은 연결성 시냅스 연결을 식별 할 수있다다른 대뇌 피질의 '열'(간 원주 시냅스 연결)에 위치한 NS.
시냅스 결합 세포 쌍에서 1 쌍으로 녹음을 그림. (A) 왼쪽, 뇌 조각의 IR-DIC 이미지입니다. 오른쪽, interneuron (위)과 흥분성 신경 세포의 흥분성 신경 세포 (아래). (B) 시냅스 활동 전위 (상단)은 다른 흥분성 신경 세포 (아래)의 monosynaptic 흥분성 시냅스 후 전위 (EPSP)를 이끌어. (C)를 시냅스 억제 interneuron의 활동 전위 (상단)은 흥분성 신경 세포 (아래)에 monosynaptic 억제 시냅스 후 전위 (IPSP)을 불러 일으킨다. (D) 시냅스 흥분성 신경 세포의 활동 전위 (왼쪽) EPSP (왼쪽 아래)의 끝, 억제 interneuron. 차례로, 활동 전위억제 interneuron (오른쪽 위)에 (아래가 오른쪽). (E) 신경 세포에 현재의 주사에 의해 유발 하이퍼과 탈분극 전압 단계의 시리즈 (상단이 왼쪽) 갭 접합에 반영됩니다 흥분성 신경 세포에 IPSP를 이끌어 결합 된 두 번째 신경 세포 (왼쪽 아래). 또한, 제 신경 세포의 시냅스 활동 전위가 (오른쪽 위) 두 번째 신경 세포 (오른쪽 아래)의 막 전위 늦은 깊은 과분극 (IPSP) 다음 초기 작은 탈분극 (이삭, 삽입)을 불러 일으킨다. (B)에서 스케일 바 (C)에도 적용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
시냅스 연락처 및 형태 학적 reconstr 그림 2. 식별biocytin 가득한 세포 쌍의 uction. (A) 왼쪽, 가시 성상 및 녹음 중에 biocytin 가득 차 있었다 층 4 빠르게 요동 치고 interneuron을 포함하는 상호 결합 세포 쌍의 저전력 현미경 사진. 시냅스 가시 뉴런과 시냅스 interneuron 사이의 빛 현미경으로 확인 된 추정 흥분성 시냅스 연락처는 녹색 점으로 표시됩니다. 추정 상호 억제 시냅스 연락처는 파란색 점으로 표시됩니다. 연접의 오른쪽, 고전력 이미지. 녹색 열린 원, 흥분 접촉을 블루 열린 원, 억제 연락처. 레이어 테두리는 저전력 현미경 염색 뇌 슬라이스 cytoarchitectonic 구조에 의해 결정 하였다. (A) 및도 1C에 도시 된 동일한 셀의 쌍 (B) Neurolucida 재구성. 블루, interneuron 축색 돌기; 빨강, interneuron 소마와 수상 돌기; 녹색, 가시 신경 세포의 축색 돌기; 흰색, 가시 신경 소마와 수상 돌기. 삽입함께 추정 연접와 사전 및 시냅스 후 뉴런의 somatodendritic 구획을 보여줍니다. 배럴 윤곽이 급성 뇌 조각에서 만든 저전력 밝은 필드 현미경 사진에서 확인되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 매우 낮은 연결 비율 대표 시냅스 연결. (A) 층 (6) 피라미드 세포의 시냅스 활동 전위 (상단)은 레이어 4 성급 피라미드 신경 세포의 monosynaptic 흥분성 시냅스 후 전위 (아래)을 불러 일으킨다. 지역 내 층류 연결 (≈1.0 밀리 초)에 비해이 트랜스 층류 연결의 긴 대기 시간 (> 3.0 밀리 초)을 확인합니다. (B) 시냅스 응 답을층 (6) 피라미드 세포에서 유도 10 Hz에서 두 개의 활동 전위에 층 4 성급 피라미드 신경 세포의 전자. 로컬 연결 단기 우울 비해이 연결 단기 촉진 주 (데이터 미기재). 동일한 연결의 포커스 촬상의 (C) 확장 깊이에서와 같이 (A, B). 삽입 된 레이어 4 성급 피라미드 신경 세포의 somato / 수지상 도메인. 화살표로 표시 저명한 혀끝의 수상 돌기의 존재를합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| mM의 | g / L | |
| 염화나트륨 | (125) | 7.305 |
| 의 KCl | 2.5 | 0.186 |
| 포도당 | (25) | 4.5 |
| 의 NaHCO3 | 2.1 | |
| 의 NaH 2 PO 4 | 1.25 | 0.173 |
| 염화칼슘 2 | 이 | 0.294 |
| 의 MgCl 2 | (1) | 0.095 |
| 삼투압 ~ 310 mOsmol / L | ||
| 95 % O 2 및 5 % CO 2 가스실 | ||
촬영하는 동안 관류 표 1. 인공 뇌척수액 (ACSF).
| mM의 | g / L | |
| 염화나트륨 | (125) | 7.305 |
| 의 KCl | 2.5 | 0.186 |
| 포도당 | (25) | 4.5 |
| 의 NaHCO3 | (25) | 2.1 |
| 의 NaH 2 PO 4 | 1.25 | 0.173 |
| 염화칼슘 2 | (1) | 0.147 |
| 의 MgCl 2 | (5) | 0.476 |
| 이노시톨 | 3 | 0.54 |
| 나 - 피루 베이트 | 이 | 0.22 |
| 아스코르브 산 (비타민 C) | 0.4 | 0.07 |
| 삼투압 ~ 310 mOsmol / L | ||
| 95 % O 2 및 5 % CO 2 가스실 | ||
미성숙 동물의 급성 뇌 조각 표 2. 세포 외 솔루션입니다.
| mM의 | g / L | |
| 자당 | (206) | 70.51 |
| 의 KCl | 2.5 | 0.186 |
| 포도당 | (25) | 4.5 |
| 의 NaHCO3 | (25) | 2.1 |
| 의 NaH 2 PO 4 | 1.25 | 0.173 |
| 염화칼슘 2 | (1) | 0.147 |
| 의 MgCl 2 | 3 | 0.286 |
| 이노시톨 | 3 | 0.54 |
| 나 - 피루 베이트 | 이 | 0.22 |
| 아스코르브 산 (비타민 C) | 0.4 | 0.07 |
| 삼투압 ~ 310 mOsmol / L | ||
| 95 % O 2 및 5 % CO 2 가스실 | ||
성숙한 동물의 급성 뇌 조각 표 3. 세포 외 용액 (Sucrose 식염수).
| mM의 | g / L | g / 50 ㎖ | |
| K-글루 콘산 | (135) | 31.622 | 1.5811 |
| 의 KCl | 4 | 0.298 | 0.0149 |
| HEPES | (10) | 2.384 | 0.1192 |
| 포스 포 | (10) | 2.552 | 0.1276 |
| ATP-의 Mg 2+ | 4 | 2.028 | 0.1014 |
| GTP-나 | 0.3 | 0.156 | 0.0078 |
| KOH와 7.3의 pH를 조정 | |||
| 삼투압 ~ 300 mOsmol / L | |||
| 추가 3-5 ㎎ / ㎖ biocytin | |||
표 4. 저 염화 피펫 솔루션입니다.
| mM의 | g / L | g / 50 ㎖ | |
| 나 글루코 네이트 | (105) | 22.92 | 1.146 |
| 염화나트륨 | (30) | 1.76 | 0.088 |
| HEPES | (10) | 2.384 | 0.1192 |
| 포스 포 | (10) | 2.552 | 0.1276 |
| ATP-의 Mg 2+ | 4 | 2.028 | 0.1014 |
| GTP-나 | 0.3 | 0.156 | 0.0078 |
| NaOH로 7.3의 pH를 조정 | |||
| 삼투압 ~ 300 mOsmol / L | |||
표 5. 높은 나시냅스 결합 뉴런을 검색하기위한 피펫 솔루션입니다.
| 비 | ml의 | |
| 시약 | (1) | 0.15 |
| 시약 B | (1) | 0.15 |
| 10 % 트리톤 X100 | (1) | 0.15 |
| 0.1 M 인산 완충액 | (97) | 14.55 |
| 사용 전에 어둠 속에서 30 분 동안 유지 | ||
조직 화학 반응 표 6. ABC 솔루션입니다.
| 무게 | 체적 | |
| 3-3' - 디아 미노 | 10 ㎎ | - |
| 0.1 M 인산 완충액 | - | 20 ㎖ |
| 1 % (NH 4) 2 니켈 (SO 4) 2 | - | 5-10 μL |
| 1 %의 CoCl2 | - | 5 μL |
| 용액을 교반하면서 1 % (NH 4) (2)은 니켈 (SO 4) (2) 및 1 %의 CoCl2는 적가 첨가 하였다. | ||
표 디아 미노 벤지딘 (DAB) 반응 7. 솔루션.
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Discussion
시냅스 결합 흥분성 및 / 또는 억제 뉴런에서 짝 기록은 신경 세포의 미세 회로의 연구에 매우 다양한 접근 방법이다. 뿐만 아니라, 이러한 접근 방식은 하나의 신경 세포 유형 간 시냅스 연결을 추정 할 수 있도록 할뿐만 아니라 연결 및 사전 및 시냅스 후 뉴런의 형태의 기능적 특성을 결정 허용 않는다. 또한, 작용제 및 / 또는 길항제 쉽게 슬라이스 제제 뉴런에 적용될 수있다. 이것은 하나의 예를 들어, 시냅스 전달 (32)의 속성 또는 사용하여 정의 된 단일 시냅스 연결에 대한 심층적 인 특성에 신경 조절의 효과를 연구 할 수 있도록, 시냅스 릴리스 16,17,38,39의 계량 적 분석. 화학 및 / 또는 전기 (간극 결합) 시냅스 연결의 발견은이 프로토콜의 가장 중요한 단계입니다. 따라서 우리는 비 연결 및 그에 따라 시냅스 연결을 찾기 위해 다른 접근법을 목록으로 만들었다유형 (화학 / 전기).
축삭의 총 축삭 길이의 단지 작은 부분이 복구되도록 슬라이스 준비의 가장 큰 단점은 장거리 축삭 돌기가 종종 상당한 절단입니다. 일부 피라미드 세포 유형의 경우, 수 최대 90 % 혹은 그 이상 계정에 다른 피질 영역 또는 피질 영역에 대한 예측을 촬영할 때 절단의 정도. 이 세포 기관이있는 더 μm의 300>보다 떨어져있는 신경 세포 사이의 시냅스 연결의 연구를위한 슬라이스 준비가 부적당. 그러나, 급성 슬라이스 제제에서, 로컬 축삭 돌기, 특히 지방의 interneurons 가진자는 일반적 때문에 축삭 정자 제한된 수평 및 수직 전계 범위의 수지상 축삭 절단 (~ 10 % 이하)의 상대적으로 낮은 수준으로 회수 . 이러한 유형의 뉴런을 포함한 연결 따라서 reliab 정확도와 높은 수준의 특징으로 할 수있다ility과는 크게 올바른 연결 추정치를 얻을 수 있습니다. 이 지역의 시냅스 연결을 제외하고, 슬라이스 준비에서 얻은 두 개의 신경 세포 유형 간의 연결 비율에 대한 절대 값은 시냅스 연결 intralaminar 전이 층 또는 비 - 로컬, 장거리에서와 같이 큰 간 체세포 거리와 뉴런 특히, 매우 문제가있다 . 슬라이스 조건이 정의 된 나이에 주어진 시냅스 연결에 최적화되지 않은 경우이 문제는 더욱 악화된다. 이러한 고밀도 전자 현미경 복원 (40) 및 구조 AXO-수지상 오버랩 (41)와 같은보다 현실적인 연결 추정 새로운 방법론 개발되었다. 그러나, 이러한 기술은 계정으로 억제의 interneurons 또한 흥분성 신경 세포의 높은 다양성을해야합니다.
연결 추정치 추가 문제는 말단 시냅스 연락처, 예를 들면, 피라미드 뉴런의 정점 술에 그, 5 월탐지되지. 소마에서 측정 할 때 그들의 시냅스 응답의 진폭이 매우 작고 잡음 사라질 가능성 (치 등., 2014, 복종). 그러나, 이러한 종류의 문제는 한 쌍의 기록 방식에 한정되지 않고, 시냅스 연결을 연구하는 데 다른 기술과 함께 발생할 것이다.
(즉, 갇힌 글루타메이트의 사진 방출하거나 channelrhodopsin의 활성화에 의해) 신경 세포의 미세 회로의 최근 년간의 빛에 의한 활성화에도 큰 규모의 42-52에, 신경 세포의 연결을 조사하기 위해 사용되었다. 그러나, 이러한 광학 접근 방법으로는 시냅스 전 신경 세포 유형의 구조적 특성을 파악하는 것은 불가능하다. 또한, 신경 연결 설립 연접의 개수 및 위치는 적어도 현재까지 식별 될 수 없다. 짝 녹음, 다른 한편으로는, 양자 모두 사전 및 시냅스 neur의 특성화를 허용시냅스 마이크로의 유형에 대한. 이것은 많은 연구가 GABA 성에서의 interneurons과 흥분성 신경 세포 모두가 자신의 형태에 대한 존중과 시냅스 생리학 53-56으로 매우 다양 한 것으로 나타났습니다 때문에 특히 중요하다. 따라서, 모두 사전 및 시냅스 후 뉴런의 식별은 시냅스 연결 (57)의 설명을위한 필수 조건이다. 마지막으로, 한 쌍의 기록은 시냅스 연결의 다른 구성 (상호 연결, 공존 갭 접합 및 화학적 시냅스)의 기록을 허용한다. 따라서, 한 쌍의 기록 기술은 신경 세포의 미세 회로를 연구하기위한 중요한 방법 남아있을 것이다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifier | HEKA | EPC 10 USB Triple | with 2 - 3 preamplifiers |
| Microscope | Olympus | BX51WI | with 2 camera ports, a 4X objective, and a 40X water-immersion objective |
| Camera | TILL Photonics | VX55 | infrared CCD camera |
| Workstation | Luigs & Neumann | Infrapatch 240 | with a motorized x-y stage and a motorized focus axis for the microscope |
| Micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-5 | x-y-z manipulators for 2 - 3 preamplifiers |
| Faraday cage | Luigs & Neumann | ||
| Anti-vibration table | Newport Spectra-Physics | ||
| Patchmaster | HEKA | ||
| Microtome | Microm International | HM650V | |
| Micropipette puller | HEKA | Sutter P-97 | |
| Neurolucida system | Microbrightfield | with Neurolucida and Neuroexplorer softwares |
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