Abstract
Die Kombination von Patch-Clamp-Aufnahmen von zwei (oder mehr) synaptisch verbunden Neuronen (gepaart Aufnahmen) in akuten Hirnschnittpräparate mit gleichzeitiger intrazellulären Biocytin Füllung ermöglicht eine korrelierte Analyse der strukturellen und funktionellen Eigenschaften. Mit diesem Verfahren ist es möglich, durch ihre Morphologie und elektrophysiologische Antwort-Muster zu identifizieren und zu charakterisieren sowohl prä- und postsynaptischen Neuronen. Gepaart Aufnahmen erlauben die Untersuchung der Verbindungsmuster zwischen diesen Neuronen sowie die Eigenschaften von sowohl chemischen und elektrischen synaptischen Übertragung. Hier geben wir eine Schritt-für-Schritt-Beschreibung der erforderlich ist, um zuverlässige gepaart Aufnahmen zusammen mit einer optimalen Erholung des Neurons Morphologie zu erhalten Verfahren. Wir beschreiben, wie Paare von Neuronen über chemische Synapsen oder Gap Junctions verbunden sind in Hirnschnittpräparate identifiziert. Wir werden darlegen, wie Nervenzellen wieder aufgebaut, um ihre 3D-Morphologie des dendrit erhaltenic und axonalen Domain und wie synaptische Kontakte identifiziert und lokalisiert. Wir diskutieren auch die Vorbehalte und Einschränkungen des gekoppelten Aufnahmetechnik, insbesondere solche mit dendritischen und axonalen Verkürzungen bei der Herstellung von Hirnschnitten verbunden, da diese stark beeinflussen Konnektivität Schätzungen. Jedoch wegen der Vielseitigkeit der gepaarten Aufzeichnungs Ansatz wird ein wertvolles Werkzeug bei der Charakterisierung verschiedener Aspekte der synaptischen Übertragung an identifizierten neuronaler Schaltkreise im Gehirn sein.
Introduction
Neuronaler Schaltkreise zwischen zwei synaptisch gekoppelt Neuronen sind die Bausteine von großer Netzwerke im Gehirn und sind die Grundeinheiten der synaptischen Informationsverarbeitung. Eine Voraussetzung für die Charakterisierung solcher neuronaler Schaltkreise ist, um die Morphologie und funktionellen Eigenschaften sowohl der prä- und postsynaptischen Neuronen Partner, die Art der synaptischen Verbindung (en) und dessen Aufbau und Funktionsmechanismus kennen. In vielen Studien synaptischer Verbindungen zumindest eines der Neuronen in einer Mikroschaltung ist nicht gut charakterisiert. Dies resultiert aus den relativ unspezifisch Stimulationsprotokolle oft in Studien synaptischer Verbindungen verwendet. Deshalb werden die strukturellen und funktionellen Eigenschaften von präsynaptischen Neuron sind entweder gar nicht oder nur in einem ziemlich kleinen Ausmaß identifiziert (dh die Expression von Markerproteine etc.). Gepaart Aufnahmen in Kombination mit intrazelluläre Färbung von Markern such als Biocytin, Neurobiotin oder Fluoreszenzfarbstoffe sind für die Untersuchung kleiner neuronaler Schaltkreise besser geeignet. Diese Technik erlaubt es vielen strukturellen und funktionellen Parameter eines morphologisch identifizierten synaptische Verbindung gleichzeitig zu untersuchen.
So genannte "einheitliche" monosynaptische Verbindungen zwischen zwei Neuronen in beiden kortikalen und subkortikalen Hirnregionen 1-10 mit akuten Schnittpräparate untersucht. Zunächst wurden scharfe Mikroelektroden in diesen Experimenten verwendet; später wurde Patch-Clamp-Aufzeichnung, um Aufnahmen von synaptischer Signale mit einem niedrigeren Geräuschpegel und einer verbesserten zeitlichen Auflösung zu erhalten beschäftigt.
Ein bedeutender technischer Fortschritt war die Verwendung von Infrarot-Differential-Interferenz-Kontrast (IR-DIC) -Optik 11-14, eine mikroskopische Technik, deutlich verbessert die Sichtbarkeit und die Identifizierung von Neuronen im Gehirn Scheibe, so daß es möglich wurde to erhalten Aufnahmen visuell identifiziert synaptischen Verbindungen 15-17. In der Regel werden gepaart Aufnahmen bei akuten Scheibe Vorbereitungen abgeschlossen; nur wenige Publikationen sind Berichterstattung Aufnahmen von synaptisch verbundenen Neuronen in vivo 18-20.
Der wichtigste Vorteil der gekoppelten Aufnahmen ist die Tatsache, dass eine funktionelle Charakterisierung kann mit einer morphologischen Analyse sowohl der Licht- und elektronenmikroskopischen Ebene kombiniert werden (siehe z. B., 7,16,21). Nach histochemische Verarbeitung wird das dendritische und axonale Morphologie des synaptisch verbundenen Neuronenpaar zurückzuführen. Anschließend ist es möglich, morphologische Merkmale, wie Länge, Raumdichte, Orientierung, Verzweigung usw. quantifizieren Diese Parameter können dann die Grundlage für eine objektive Klassifizierung eines bestimmten synaptischen Verbindung. Weiters ist im Gegensatz zu den meisten anderen Techniken zur Untersuchung neuronaler connecti verwendetvität, gepaart Aufnahmen ermöglichen auch die Identifizierung der synaptischen Kontakte für einheitliche synaptischen Verbindungen. Diese kann direkt unter Verwendung einer Kombination von Licht- und Elektronenmikroskopie 16,21-27 oder mit Kalzium-Imaging 28,29 von dendritischen Dornen erfolgen. Jedoch mit dem letzteren Ansatz nur exzitatorischen aber nicht hemmenden Verbindungen untersucht werden, wie es benötigt Calciumeinstrom über die postsynaptische Rezeptorkanäle.
Zusätzlich zu einer genauen Analyse der synaptischen Übertragung in einem definierten neuronalen Mikro gepaart Aufnahmen auch die Untersuchung der synaptischen Plastizität Regeln 30,31 erlauben oder - in Kombination mit Agonist / Antagonist-Anwendung - die Modulation der synaptischen Übertragung von Neurotransmittern wie Acetylcholin 32 und Adenosin 33.
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Protocol
Alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der EU-Richtlinie über den Schutz der Tiere, des Deutschen Tierschutzgesetz (Tierschutzgesetz) und den Richtlinien des Bundesverbandes der europäischen Versuchstierkunde durchgeführt.
1. Set-up für die Elektrophysiologie
Vor Beginn gepaart Aufnahme muss ein Elektro Set-up gebaut werden. Eine kurze Zusammenfassung, wie eine solche Einrichtung zusammengesetzt ist wie folgt:
- Installieren eines Antischwingungstisches, auf dem das Mikroskop die Manipulatoren und alle anderen Geräte platziert werden.
HINWEIS: Vibration oder jede andere Art von Bewegung muss so klein wie möglich zu sein, wenn Sie von synaptischen Verbindungen, da dies eine Änderung von Pipetten (Suche Elektrode durch Aufnahme Elektrode ersetzt). - Platzieren eines Faradayschen Käfigs um die Antischwingungstisch um elektrisches Rauschen zu reduzieren. Schließen Sie das Gerät innerhalb des Faraday-cage mit der elektrischen Erde.
- Installieren eines Mikroskops mit einem motorisierten Fokusachse, die auf einem motorisierten xy-Tisch auf dem Antivibrationstisch nach den Richtlinien des Herstellers basiert. Dies erlaubt es, das Mikroskop zuverlässig zu bewegen, um Nervenzellen, die nicht im selben Sichtfeld wie das der Fall für translaminar Verbindungen in der Großhirnrinde ist.
- Installieren Sie eine Videokamera an den Kameraanschluss des Mikroskops und schließen Sie es an und / oder digitale Bildschirme analog zu den Schnittpräparat und die Bewegung der Elektroden zu beobachten. Verwenden Sie eine Kamera, die zwischen einem niedrigen und einem High-Power-Vergrößerung, um einen Überblick zu erhalten und eine Nahaufnahme Bild bzw. umgeschaltet werden kann,, der synaptisch verbunden neuronalen Zellpaar. Dies hilft auch, um die Bewegung der Flächenelektroden zu steuern.
- Installieren Sie ein Exemplar Tabelle, die einen Einsatz für das Bad Kammer (haus gebohrt aus einem Plexiglasblock) für die Hirnschnittpräparat. Diese Probentisch darf nicht auf die angeschlossen werdenMikroskop, das heißt, muss der Lufttisch befestigt werden und das Mikroskop sollte darunter wendig sein.
- Halterung zwei (oder mehr, falls erforderlich), hochpräzise Mikromanipulatoren, die in allen drei Dimensionen bewegt werden kann. Installieren Sie Patch-Clamp-Vorverstärker auf die Manipulatoren und schließen Sie sie an den Hauptverstärker.
HINWEIS: Bei Bedarf zusätzliche Manipulatoren können zB installiert, mehr als zwei Vorverstärkern, extrazelluläre Stimulationselektroden, Drug-Delivery-Systeme etc. - Legen Sie die Badekammer in dem Probentisch. Installieren Sie eine Lösung, Zu- und Ablauf und schließen diese an den Perfusionssystem.
- Verwenden einer peristaltischen Pumpe, um die Perfusion der Aufnahme Kammer mit künstlichen Cerebrospinalflüssigkeit aufrechtzuerhalten (ACSF; Tabelle 1) mit einer stabilen Strömungsgeschwindigkeit von 4 - 6 ml / min, das optimale Schnittfähigkeit.
HINWEIS: Diese Durchflussmenge erheblich, da es in Turbulenzen im ASCF und damit die Bewegung der Scheibe führen nicht überschreiten. Installieren Halter für die Temperatursonde und Ag / AgCl Masseelektrode auf den Objekttisch. Dies ist erforderlich, um die Sonde und der Elektrode zu ermöglichen, um das Bad in der Kammer abzutasten. - Für eine gute Sichtbarkeit der Neuronen im Schnittpräparat mit Infrarotbeleuchtung im Mikroskop. Dies reduziert die Lichtbeugung und damit Verwacklungsunschärfe. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop ist mit Differentialinterferenzkontrastoptik ausgestattet, um einen '3D' ähnlichen Visualisierung zu erreichen. Dies wird helfen, das Patchen Neuronen und ermöglichen ziel Neuronen tief in der Scheibe (60 & mgr; m oder tiefer).
- Während des Experiments halten Hirnschnitten in einem Versuchsraum mit einem Deckglas an der Unterseite. Legen Sie eine "Platin Harfe 'auf der Spitze des Slice Scheiben von schwimm verhindern. Ein Platin Harfe aus U-förmigen, abgeflacht Platindraht mit Streichern von Zahnseide auf sie geklebt.
- Halten Sie das ACSF Perfusion der Scheibe bei einer Temperatur von 32-35 ° C zu gewährleisten optimal Kontrolle der Sauerstoffversorgung und pH-Wert. Dies kann durch Erhitzen der Lösung mit einer Peltier-Vorrichtung installiert in der Nähe der Einmündung in das ACSF Badkammer erfolgen.
HINWEIS: Die Verwendung ultradünnen Deckgläser so dass auch Mikroskop Kondensatoren mit einer hohen numerischen Apertur und kurze Arbeitsabstand kann auf die Probe fokussiert werden. Dies ist für eine optimale Ausleuchtung der Scheibe notwendig.
Für ein Bild und eine Beschreibung eines Elektrophysiologie-Setup für gepaarte Aufnahmen optimiert im Hirnschnitt Vorbereitung siehe Abbildung 4 in Ref. 34.
2. Hirnschnitt Vorbereitung
- Mild betäuben das Tier, aus dem das Hirngewebe sollte mit Isofluran (Endkonzentration <0,1%) entnommen werden.
ANMERKUNG: Anästhetika können ebenfalls verwendet werden. Die Nutzung der Betäubung sollten mit Empfehlungen und Regeln der jeweiligen Tier Ausschusses entsprechen. Achten Sie immer darauf, dass das Tier nicht gereizt oder unter Stress nach dem Hinzufügendie Narkose. - Enthaupten das Tier, öffnen Sie den Schädel und so schnell zu entfernen, das Gehirn wie möglich mit dem in Lit. beschriebenen Verfahren. 34,35.
- Übertragen das Gehirn in gekühlten (4 ° C) künstliche cerebrospinale mit einer Mischung von Carbogen Gas mit 95% O 2 und 5% CO 2 begast Flüssigkeit.
- Isolieren Sie die Hirnregion, die untersucht werden sollten.
HINWEIS: Die Parameter, um eine optimale Konservierung und minimale Verkürzung von Dendriten und Axone der prä- und postsynaptischen Neuronen erhalten, sollten im Voraus für jede neuronale Verbindung und Entwicklungsstadium der Untersuchung festgelegt werden. In einem optimal präpariert Hirnschnitt wird das Axon des präsynaptischen Neurons nicht notwendig parallel zur Scheibenoberfläche zu sein. Vielmehr sollen sie in Scheiben mit einem flachen Winkel zu zeigen. Das gilt für die Dendriten der postsynaptischen pyramidalen Neuronen; Dies sollte unter dem Lichtmikroskop überprüft werden. Dies ist besonders wichtig für nicht lokale oder translaminar synaptischen Verbindungen, dh., in der prä- und postsynaptischen Zellkörper sind mehr als 200 & mgr; m voneinander entfernt und die Wahrscheinlichkeit, dass dendritische und axonale Verkürzungen dürfte wesentlich höher als für lokale Verbindungen zu sein. - Übertragen Sie das Gehirn, um das Mikrotom Kammer. Auf der Basis empirischer Erkenntnisse werden verschiedene extrazelluläre Slicing Lösungen, je nach Alter des Tieres verwendet wird (siehe Tabellen 2 und 3, hilfreiche Informationen finden Sie auch unter 'gefunden werden http://www.brainslicemethods.com/ ').
- Schneiden Sie das Gehirn, bis der Zielbereich sichtbar ist.
- Für Scheiben mit einer guten Zell Sichtbarkeit erhalten, geschnitten 300-400 um dicke Gehirnschnitte, wenn das Tier ist ausgereift (> 3 Wochen). 800 um, ohne wesentlich zu beeinträchtigen Zell visib - Wenn das Tier unreifen (1. bis 2. Lebenswoche für Mäuse und Ratten) Scheiben bis zu einer Dicke von ca. 600 geschnitten werdenility.
Hinweis: das wird die Stabilität der "unreifen" Scheiben zu verbessern und die Anzahl der möglichen Verkürzungen von Langstrecken dendritische und axonale Kollateralen. - Übertragen von Scheiben von dem Mikrotom Kammer zu einer Inkubationskammer mit Slicing-Lösung mit einer Mischung aus 95% O 2 und 5% CO 2 begast gefüllt. Halten der Scheiben in die Inkubationskammer für mindestens 30 min bis 1 h entweder bei RT oder bei ~ 30 ° C, abhängig von der Art des Versuchs.
3. Gekoppelte Patch-Clamp-Aufzeichnung und Biocytin Füllung
Abhängig von der Art der synaptischen Verbindung drei verschiedene Ansätze verwendet werden, um synaptisch gekoppelt Neuronen gefunden. Wenn die Verbindungswahrscheinlichkeit gering ist (wie für die meisten erregende Verbindungen erwartet werden), gehen Sie folgendermaßen vor:
- Neuronalen Verbindungen mit niedriger Konnektivität
- Füllen Sie die Patch-Pipetten mit einer internen Lösung der Zusammensetzung enthalten sindTabelle 4 Für alle Aufnahmen in der Gesamtzellkonfiguration hinzufügen Biocytin in Konzentrationen zwischen 3 -. 5 mg / ml in den internen (Pipette) Lösung, um gute Färbeergebnisse für die prä- und postsynaptischen Neuronen zu erhalten. Lassen Biocytin diffundieren in die Zelle für mindestens 15 - 30 min (abhängig von der Größe des Neurons).
HINWEIS: Fügen Sie nicht Biocytin auf die in den unten genannten 'Suche' Pipetten Lösung. - Patch eine putative postsynaptischen Neuron in der whole-cell-Modus. Verwenden Sie Patch-Pipetten mit einer langen und schlanken Schaft. Dies erleichtert die Handhabbarkeit des Pipette unter dem Objektiv und reduziert Bewegungsartefakte, die auftreten können, wenn die Elektrode in die Scheibe eingebracht.
- Dann patchen eine mögliche präsynaptischen Neurons in einer Zelle-Attach-Konfiguration mit einem 'Suche' Patch-Pipette von 8-10 MOhm Widerstand und einen kleinen Durchmesser. Mit diesen Pipetten stellen Sie eine "lose" Cell-Attached-Patch. Fill die 'Suche' Pipette mit einer internen Lösung, bei der K + durch Na + (Tabelle 5), um nicht zu Neuronen während der Suche nach einem präsynaptischen Zelle depolarisiert ersetzt.
HINWEIS: Die "lose" Dichtung Widerstand nicht in der GOhm Bereich aber in der Regel um 30 bis 300 MOhm. - Halten Sie das Membranpotential unter der "lose" Siegel auf etwa -30 bis -60 mV in Stromzange Modus. Dann gelten große Stromimpulse (0,2-2 nA), um ein Aktionspotential in dem Potential präsynaptischen Zelle hervorzurufen. Beachten Sie diese Aktionspotential als kleines Ährchen auf der Spannungsantwort.
- Stellen Sie die Stimulationsfrequenz auf 0,1 Hz bis Auslauf eines postsynaptischen Reaktion zu verhindern. Verwenden niedrigeren Stimulationsfrequenzen bei der Hirngewebe ist sehr unreifen oder die synaptische Verbindung nicht sehr zuverlässig.
- Im Falle der "postsynaptischen 'Neuron nicht auf die Stimulation der getesteten" präsynaptischen' neu zu antwortenron, Patch ein neues Neuron in "lose" Siegel-Modus. Stellen Sie das "Suchen" Patch-Elektrode so lange ersetzen nicht die Dichtung mit einem Widerstand von> 30 MOhm wird aufgebaut. Test bis zu 30 potentiell präsynaptischen Neuronen in dieser Weise.
HINWEIS: Um eine Beschädigung der Neuronen während des Suchverfahrens mit lose Patch-Clamp zu verhindern, nur sanft Saugen sollte auf die Suche Pipette verglichen mit dem auf die Ganzzell-Patch-Pipette aufgebracht werden. - Wenn die Stimulation in den "lose" Siegel-Modus führt zu einem EPSP / IPSP mit einer Latenzzeit <5 ms im postsynaptischen Neuron entfernen Sie die 'Suche' Pipette aus der präsynaptischen Neurons.
- Ersetzen Sie die 'Suche' Patch-Pipette mit einem Patch-Elektrode mit Biocytin haltigen, regelmäßige interne Lösung gefüllt. Gewährleisten diese Aufnahme Patchpipette hat einen Widerstand von 4 - 8 M & OHgr; je größer der Soma Größe der untere der Elektrodenwiderstand kann.
- Patchen der präsynaptischenNeuron und ein Rekord im Ganzzell, Current-Clamp-Modus. Entlocken Aktionspotentiale durch Strominjektion in den präsynaptischen Neuronen und notieren Sie die postsynaptischen Antwort. Speichern der Daten auf einem Computer zur späteren Offline-Analyse.
- Füllen Sie die Patch-Pipetten mit einer internen Lösung der Zusammensetzung enthalten sindTabelle 4 Für alle Aufnahmen in der Gesamtzellkonfiguration hinzufügen Biocytin in Konzentrationen zwischen 3 -. 5 mg / ml in den internen (Pipette) Lösung, um gute Färbeergebnisse für die prä- und postsynaptischen Neuronen zu erhalten. Lassen Biocytin diffundieren in die Zelle für mindestens 15 - 30 min (abhängig von der Größe des Neurons).
- Neuronalen Verbindungen mit hoher Konnektivität
HINWEIS: neuronaler Schaltkreise mit hoher Konnektivität Verhältnis (> 30%) verwenden ein anderes Verfahren, um synaptische Verbindungen zu finden. Diese Vorgehensweise wird unten beschrieben und wird oft für hemmende synaptische Verbindung, die im Durchschnitt eine höhere Konnektivität Verhältnis als erregende Verbindungen 36 verwendet. Es sollte nicht verwendet werden, wenn das Verbindungsverhältnis unter diesen Wert fällt.- Patchen eines präsynaptischen Neuron direkt in der Ganzzellmodus. Dann patchen eine mögliche postsynaptischen Neuron, auch in Ganzzell-Modus. Beide Zellen sollte unter Stromzange Kontrolle. Entlocken ein Aktionspotential in der präsynaptischen Zelle. Überwachen Sie das angeh postsynaptischen Neuron für eine postsynaptic Potenzial.
- Für den Fall, das Neuron keine Antwort auf präsynaptischen Stimulierung nicht zu zeigen, Patch ein neues Neuron in Ganzzell-Modus mit einem Patch-Elektrode mit regelmäßigen internen Lösung gefüllt. Wenn eine Verbindung gefunden wird, nicht über die Patch-Pipette ändern, aber fahren Sie mit Aufnahme. Dann gehen Sie wie in Schritt 3.1.9.
- Neuronalen Verbindungen über Gap-Junctions
HINWEIS: Wenn Sie für die elektrische (Gap-Junction) Verbindungen zu suchen, verwenden Sie das folgende Verfahren, das eine modifizierte Version, dass für Low-Wahrscheinlichkeit-Verbindungen verwendet wird.- Patch eine postsynaptische Neuron in der Gesamtzell-Patch-Clamp-Konfiguration.
- Anschließend patchen ein mutmaßliches präsynaptischen Neurons in der loose-Dichtungskonfiguration (niedrige Siegelfestigkeit von 30 bis 300 MOhm) mit einem 'Suche' Patch-Pipette von 7-10 MOhm Widerstand. Diese Pipette mit dem modifizierten Hoch Na + interne Lösung für Schnelldicht Stimulation gefüllt werden.
- Inject 100 bis 300 msec langen hyperpolarisierende Stromimpulse über die "lose" Dichtung; die Pipette Befehl Potenzial sollte auf etwa -60 bis -70 mV eingestellt werden. Beachten Sie eine Gap Junction-Verbindung, wenn diese Stimulation führt zu einer kleinen hyperpolarisierende Reaktion im 'postsynaptischen "Neuron.
- Umstecken die "präsynaptischen" Neuron in der Ganzzellmodus und gehen Sie wie oben beschrieben.
HINWEIS: Um eine gute Färbung der axonalen und dendritischen Prozesse zu gewährleisten, verwenden Sie das Protokoll aufgeführt. Dieses Protokoll wird hier kurz beschrieben, jedoch ein detailliertes Protokoll für histochemische Verarbeitung im Labor verwendet wird in Lit.. 37.
4. Histochemische Verarbeitung
- Übertragen Sie die Hirnschnitt mit dem Paar von synaptisch verbunden Neuronen in ein Fläschchen mit 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer gelöst und fixiert die Scheibe für 24 Stunden. Für die Elektronenmikroskopie, fixieren Sie das Segment mit 2,5% GlutaraldehydAldehyd und 1% Paraformaldehyd.
- Am nächsten Tag, übertragen Sie die Scheiben in normale Phosphatpuffer, der kein Fixiermittel. Waschen Scheiben mit Phosphatpuffer für 6 - 8 mal für 10 bis 15 min jeweils um überschüssiges Fixiermittel zu entfernen.
- Scheiben für 20 min Inkubieren in einer 3% H 2 O 2 -Lösung in 0,1 M Phosphatpuffer, um die endogene Peroxidase-Reaktion zu minimieren. Beachten starke Blasenbildung. Fahren Sie mit der Reaktion, bis keine Luftblasen entstehen. Dann spülen Sie die Scheiben in 0,1 M Phosphatpuffer für 6-8 mal (für 10 Minuten jede), um alle verbleibenden H 2 O 2 zu entfernen.
- Immunzytochemische und chromogene Reaktionen
Visualisierung Biocytin gefüllten Nervenzellen auf einem Streptavidin-biotinylierter Meerrettich-Peroxidase-Reaktion mit Diaminobenzidin katalysiert; Dies erzeugt einen dunklen Niederschlag, die ein knackiges Fleck mit hoher räumlicher Auflösung erzeugt. Die folgenden Verfahren sind für das chromogene Reaktion verwendet: <ol> - Bereiten Sie die ABC-Lösung nach dem Protokoll des Herstellers. Zum 14.55 ml Phosphatpuffer mit 150 ul 10% Triton X100 ergänzt (Tabelle 6; nur für Lichtmikroskopie) und Halten der Lösung für etwa 30 min in der Dunkelheit. Scheiben Inkubation in dieser Lösung O / N vor dem Gebrauch.
- Scheiben in ABC-Lösung inkubieren auf einem Schüttler für 1 Stunde bei RT und im Dunkeln. Anschließend halten Scheiben O / N bei 4 ° C im Kühlschrank. Am nächsten Morgen, inkubieren Scheiben bei Raumtemperatur für eine weitere Stunde.
- Danach gründlich Scheiben mindestens viermal für jeweils 10 min in Phosphatpuffer. Dann inkubiert auf einem Schüttler für etwa 30 min im Dunkeln in 2 ml einer Nickel intensiviert 3-3'-Diaminobenzidin-Lösung (Tabelle 7). Seien Sie sehr vorsichtig beim Umgang mit Diaminobenzidin und nur unter dem Abzug; es äußerst karzinogenen selbst bei sehr niedrigen Konzentrationen.
- Hinzufügen 6,5 ul 3% H 2 O 2 zu der Diaminobenzidin haltigenLösung. Überwachen Sie die Farbreaktion unter einem Lichtmikroskop bis braun-schwarz gefärbten Neuronen sind deutlich sichtbar. Halten Sie dann die Reaktion sofort durch Waschen Scheiben mehrmals in Phosphatpuffer.
- Berg Scheiben mit Bunt Neuronen auf Klebstoff, silanbeschichteten HistoBond oder verkleistert Standardobjektträger.
- Halten Sie die Folien in einer feuchten Kammer mit mindestens 80% Luftfeuchtigkeit O / N. Am nächsten Tag, lassen Sie die Schnitte an der Luft trocknen für weitere 10 min. Vor dem Einbetten, Transfer Folien in Lösungen mit zunehmenden Konzentrationen von Ethanol (20 - 100%), um sie zu entwässern.
HINWEIS: Die Entwässerungsverfahren sollte langsam sonst Verzerrungen in den dendritischen und axonalen Prozesse möglich sind 37. Wenn eine alternative Einbettungsverfahren gewählt wird, zB eine mit dem Glycerin-basierten Moviol eine Dehydrierung ist nicht erforderlich; Allerdings dürfte dies in einem inhomogenen Kompression der Scheibe und somit ein verzerrtes neuronalen morpholo führengy. - Schließlich Inkubation für 10 min in Xylol, betten Sie die Scheiben in einem hydrophoben Einbettung Medium für die Lichtmikroskopie und legen Sie eine ultra-dünne Deckgläser an der Spitze. Lassen Träger trocken 20 Minuten lang bei RT.
5. Neuronale Wiederaufbau und Synaptic Kontakt Lokalisierung
- Untersuchen Folien mit Biocytin-markierten Neuronen unter einem Lichtmikroskop mit einer 60X / 100X Ölimmersionsobjektiv und einem Kondensator mit einer hohen numerischen Apertur für eine optimale räumliche Auflösung ausgestattet. Stellen Sie sicher, dass die axonalen Boutons und dendritischen Dornen sind deutlich sichtbar.
- Trace Neuronen oder Neuronenpaaren synaptisch verbunden mit einem handelsüblichen Neuron Tracing-System (siehe Tabelle der spezifischen Materialien / Ausrüstung) In 3D neuronalen Rekonstruktionen erhalten. Führen Sie manuell unter ständiger Sichtkontrolle Tracing, auch kleine axonalen oder dendritischen Sicherheiten zu erkennen. Für gepaart Aufnahmen von synaptisch verbunden Neuronen manuelle Verfolgung ist immer noch die Methode derWahl, weil die Zuordnung von zB einer axonalen Profil entweder auf die prä- oder postsynaptischen Neuron erfordert umfangreiche Rekonstruktion Erfahrung.
- Nehmen Sie bei Bedarf Grafen von axonalen Boutons und / oder dendritischen Dornen. Da Stacheln oder Wirbelsäule Subtypen und axonalen boutons kann eine spezifische Verteilung und Dichte in Bezug auf zB Rindenschicht oder Bereich aufweisen, könnte dies dazu beitragen, die neuronale Zelltypen zu charakterisieren.
- Für synaptisch verbunden Neuronenpaaren, überprüfen Sie die präsynaptischen Axon und Dendriten postsynaptischen enge Appositionen bei maximaler Vergrößerung zur Verfügung. Beobachten eines axonalen bouton und postsynaptischen dendritischen Dorn oder eine Welle in der gleichen Brennebene kann als putative synaptischen Kontakt berücksichtigen. Markieren Sie diesen Kontakt in der Rekonstruktion.
- Korrigieren Sie die neuronale Rekonstruktionen Schrumpfung in allen drei Raumdimensionen im entsprechenden Abschnitt des Suchprogramms.
HINWEIS: Während der Fixierung, histochemische Verarbeitungund Austrocknung erhebliche mechanische Verformung und Schrumpfung auftreten; dies axonalen und dendritischen Längenmessungen beeinflussen und ihre räumliche Anordnung stark verzerren. Schrumpfung Korrekturfaktoren für die Einbettungsmedium sind ~ 1,1 für x und y-Richtung und ~ 2,1 für die z-Richtung 37. - Für eine quantitative morphologische Analyse mit einem Datenanalyse-Programm für Neurophysiologie (siehe Tabelle der spezifischen Materialien / Geräte).
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Representative Results
Gepaart Aufnahmen sind das Mittel der Wahl für eine eingehende Charakterisierung von morphologisch identifiziert uni- oder bidirektional synaptischen Verbindungen sowie Gap Junction (elektrische) Anschlüsse (Abbildung 1). Ein Beispiel für ein gekoppeltes Aufzeichnungsschicht 4 in der somatosensorischen Kortex Lauf ist in 1A gezeigt. Sowohl unidirektionale exzitatorische und inhibitorische synaptische Verbindungen (1B, C) charakterisiert werden. Weiterhin gepaart Aufnahmen erlauben, von bidirektionalen synaptischen Verbindungen, dh aufzuzeichnen, aus Verbindungen, in denen beide Neuronen in einem Paar prä- und postsynaptischen zueinander. Dies wird in 1D, die Aufnahmen von einer hemmenden Intern und einer erregenden Neuronen zeigt, veranschaulicht. Hervorrufen einer Aktionspotential in der exzitatorischen Neuronen (rot Spuren) zu einer EPSP in der postsynaptischen inhibitorische Intern (schwarze Spuren). Wenn ein Aktionspotential ist jedoch EVOim Intern KED kann ein IPSP exzitatorischen Neuronen aufgezeichnet. 1E zeigt, daß es auch denkbar, von Neuronen über Gap Junction oder über einen Spalt Kreuzung und einer Synapse verbunden aufzuzeichnen. Reciprocal und Gap Junction-Verbindungen können nur gepaarter elektrophysiologischen Ableitungen bisher aber nicht durch irgendeine andere Technik identifiziert werden.
Die Kombination von Biocytin Füllung der gekoppelten Neuronen über die Patch-Pipette und der elektrophysiologischen Ableitungen ermöglicht eine Korrelation von morphologischen Eigenschaften der Neuronen synaptische Eigenschaften. Nach histochemische Verarbeitung Neuronen als dunkle Strukturen in der Scheibe fixiert (Abbildung 2A) sichtbar. Danach wird die aufgezeichneten neuronalen Zellpaar kann morphologisch rekonstruiert werden, und die neuronale Zelltypen identifiziert werden können. Darüber hinaus ist es möglich, die Anzahl und Position der putativen synaptische Kontakte (2A rechte Felder und Figur identifizierene 2B Kasten). Die in 2B gezeigten Neurons Paares reziprok verbunden und somit synaptische Kontakte werden auf beiden Neuronen hergestellt. 90% Genauigkeit 16,21,26 - in unseren Händen, wurden mutmaßliche, lichtmikroskopisch identifiziert synaptische Kontakte als wahr synaptische Kontakte mit dem Elektronenmikroskop mit einer 80 bestätigt.
Abbildung 3 zeigt ein Beispiel für ein gekoppeltes Aufnahme von einem präsynaptischen Pyramidenzelle im Neokortex Schicht 6 des Barrel Cortex und eine erregende stachelige Neuronen in Schicht 4. Diese translaminar neuronalen Mikroschaltkreis hat einen niedrigen Verbindungswahrscheinlichkeit, sondern auch mit dem in beschriebenen Suchverfahren identifiziert werden Schritte 3.1.1 - 3.1.9 für neuronale Verbindungen mit geringer Konnektivität. Mit dem gepaarten Aufzeichnungstechnik ist es möglich, synaptische Verbindungen mit sehr geringer Bandbreite zu identifizieren, wie im Fall von einigen langreichweitige translaminar Verbindungen (dieses Beispiel) oder der Verbindungen zwischen den neurons in verschiedenen kortikalen 'Spalten' (Intersäulen synaptischen Verbindungen) entfernt.
Abbildung 1. Gekoppelte Aufnahmen von synaptisch verbunden Zellpaare. (A) Links, IR-DIC Bild eines Hirnschnitt. Richtig, ein Interneuron (oben) und eine erregende Nervenzelle (unten). (B) A präsynaptischen Aktionspotential (oben) in einer exzitatorischen Neuron löst eine monosynaptische exzitatorischen postsynaptischen Potentials (EPSP) in einem anderen exzitatorischen Neuron (unten). (C) Ein Aktionspotential (oben) in einer präsynaptischen inhibitorischen Intern erinnert an ein monosynaptische hemmende postsynaptische Potential (IPSP) in einer exzitatorischen Neuron (unten). (D) Ein Aktionspotential (oben links) in einer präsynaptischen erregenden Neuronen evoziert eine EPSP (unten links) in eine hemmende Intern. Im Gegenzug wird ein Aktionspotentialin der inhibitorischen Intern (oben rechts) löst eine IPSP in der exzitatorischen Neuron (unten rechts). (E) Eine Reihe von Hyper- und depolarisierende Spannungsschritte von Strominjektionen ausgelöst in ein Neuron (oben links) in einem Spalt-Übergang reflektiert gekoppelten zweiten Neuron (unten links). Zusätzlich ist eine präsynaptischen Aktionspotential (oben rechts) in der ersten Neuron ruft eine frühe kleine Depolarisation (Ährchen, Einschub), gefolgt von einer späten tiefen Hyperpolarisation (IPSP) des Membranpotentials des zweiten Neurons (unten rechts). Gelten Maßstabsbalken in (B) auch (C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2. Bezeichnung des synaptische Kontakte und morphologischen Reconstruction von Biocytin gefüllten Zellpaare. (A) links, Low-Power-Mikrofotografie eines miteinander gekoppelte Zellpaar mit einem stacheligen Stern und ein schnell spiking Intern in Schicht 4, die während der Aufnahme mit Biocytin gefüllt waren. Licht mikroskopisch identifiziert vermeintlichen erregenden synaptischen Kontakte zwischen der präsynaptischen Neurons und stacheligen postsynaptischen Intern durch grüne Punkte gekennzeichnet. Vermeintliche gegenseitige hemmende synaptische Kontakte werden durch blaue Punkte angezeigt. Richtig, High-Power-Bilder der synaptischen Kontakte. Grüne leere Kreise, erregende Kontakte; blau offene Kreise, hemmende Kontakte. Schichtgrenzen wurden durch das zytoarchitektonischen Struktur des gefärbten Hirnschnitten unter dem leistungsschwachen Mikroskop bestimmt. (B) Neurolucida Rekonstruktion der in (A) und 1C gezeigt gleichen Zellenpaar. Blau, Interneuron Axon; rot, Intern Soma und Dendriten; grün, stachelig Neuron Axon; weiß, stachelige Neuronen Soma und Dendriten. Der Einschubzeigt die somatodendritischen Kompartimenten der prä- und postsynaptischen Neuronen zusammen mit den mutmaßlichen synaptische Kontakte. Barrel Konturen wurden in den Low-Power-Hellfeld-Mikrofotografien aus dem akuten Hirnschnitt gemacht gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. Ein Vertreter synaptische Verbindung mit sehr niedriger Anschlussverhältnis. (A) Ein präsynaptischen Aktionspotential (oben) in einer Schicht 6 Pyramidenzell evoziert ein monosynaptic exzitatorischen postsynaptischen Potentials (unten) in einer Schicht 4 Sterne pyramidalen Neuronen. Man beachte die lange Latenz (> 3,0 msec) dieses trans-laminaren Verbindung im Vergleich zu der lokalen intra laminaren Verbindungen (≈1.0 msec). (B) Postsynaptische response der Schicht 4 Sterne Pyramidenzelle auf zwei Aktionspotentiale bei 10 Hz in einer Schicht 6 Pyramidenzellen hervorgerufen. (A, B) Beachten Sie die kurzfristige Erleichterung dieser Verbindung gegenüber dem kurzfristigen Depression der lokalen Anschlüsse (Daten nicht gezeigt). (C) Erweiterte Tiefenschärfe Bild der gleichen Verbindung wie in. Inset, die somato / dendritischen Domäne einer Schicht 4 Sterne Pyramidenzelle. Beachten Sie die Anwesenheit eines prominenten Dendriten durch einen Pfeil gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
| mM | g / L | |
| NaCl | 125 | 7,305 |
| KCl | 2.5 | 0,186 |
| Glucose | 25 | 4.5 |
| NaHCO3 | 2.1 | |
| NaH 2 PO 4 | 1.25 | 0,173 |
| CaCl 2 | 2 | 0,294 |
| MgCl2 | 1 | 0,095 |
| Osmolarität ~ 310 mOsmol / l | ||
| Mit 95% O 2 und 5% CO 2 begast | ||
Tabelle 1 Künstliche Liquor (ACSF) für die Perfusion während der Aufnahme.
| mM | g / L | |
| NaCl | 125 | 7,305 |
| KCl | 2.5 | 0,186 |
| Glucose | 25 | 4.5 |
| NaHCO3 | 25 | 2.1 |
| NaH 2 PO 4 | 1.25 | 0,173 |
| CaCl 2 | 1 | 0,147 |
| MgCl2 | 5 | 0,476 |
| Myo-inositol | 3 | 0.54 |
| Na-Pyruvat | 2 | 0,22 |
| Ascorbinsäure (Vitamin C) | 0.4 | 0,07 |
| Osmolarität ~ 310 mOsmol / l | ||
| Mit 95% O 2 und 5% CO 2 begast | ||
Tabelle 2. Die extrazelluläre Lösung für akute Hirnschnitten von ausgewachsenen Tieren.
| mM | g / L | |
| Saccharose | 206 | 70,51 |
| KCl | 2.5 | 0,186 |
| Glucose | 25 | 4.5 |
| NaHCO3 | 25 | 2.1 |
| NaH 2 PO 4 | 1.25 | 0,173 |
| CaCl 2 | 1 | 0,147 |
| MgCl2 | 3 | 0,286 |
| Myo-inositol | 3 | 0.54 |
| Na-Pyruvat | 2 | 0,22 |
| Ascorbinsäure (Vitamin C) | 0.4 | 0,07 |
| Osmolarität ~ 310 mOsmol / l | ||
| Mit 95% O 2 und 5% CO 2 begast | ||
Tabelle 3. Die extrazelluläre Lösung bei akuten Hirnschnitten von ausgewachsenen Tieren (nucrose Kochsalzlösung).
| mM | g / L | g / 50 ml | |
| K-Gluconat | 135 | 31,622 | 1,5811 |
| KCl | 4 | 0,298 | 0,0149 |
| HEPES | 10 | 2,384 | 0,1192 |
| Phosphokreatin | 10 | 2,552 | 0,1276 |
| ATP-Mg 2+ | 4 | 2,028 | 0,1014 |
| GTP-Na | 0.3 | 0,156 | 0,0078 |
| Einstellen des pH auf 7,3 mit KOH | |||
| ~ Osmolarität 300 mOsmol / l | |||
| Fügen Sie 3-5 mg / ml Biocytin | |||
Tabelle 4. Low Chlorid Pipettenlösung.
| mM | g / L | g / 50 ml | |
| Na-Gluconat | 105 | 22,92 | 1,146 |
| NaCl | 30 | 1.76 | 0,088 |
| HEPES | 10 | 2,384 | 0,1192 |
| Phosphokreatin | 10 | 2,552 | 0,1276 |
| ATP-Mg 2+ | 4 | 2,028 | 0,1014 |
| GTP-Na | 0.3 | 0,156 | 0,0078 |
| Einstellen des pH auf 7,3 mit NaOH | |||
| ~ Osmolarität 300 mOsmol / l | |||
Tabelle 5. Hohe NaPipettenlösung für die Suche synaptisch verbunden Neuronen.
| Verhältnis | ml | |
| Reagenz A | 1 | 0,15 |
| Reagenz B | 1 | 0,15 |
| 10% Triton X100 | 1 | 0,15 |
| 0,1 M Phosphatpuffer | 97 | 14,55 |
| 30 Minuten in der Dunkelheit vor der Verwendung gehalten | ||
Tabelle 6. ABC Lösung für histochemische Reaktion.
| Gewicht | Volumen | |
| 3-3'-Diaminobenzidin | 10 mg | - |
| 0,1 M Phosphatpuffer | - | 20 ml |
| 1% (NH 4) 2 Ni (SO 4) 2 | - | 5-10 & mgr; |
| 1% CoCl 2 | - | 5 & mgr; |
| 1% (NH 4) 2 Ni (SO 4) 2 und 1% CoCl 2 werden tropfenweise zugegeben, während die Lösung gerührt wurde. | ||
Tabelle 7. Lösung für Diaminobenzidin (DAB) Reaktion.
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Discussion
Gekoppelte Aufnahmen von synaptisch gekoppelt erregenden und / oder hemmenden Neuronen eine sehr vielseitige Vorgehensweise für die Untersuchung neuronaler Schaltkreise. Nicht nur, dass diese Vorgehensweise erlauben es, synaptische Verbindungen zwischen Neuronen-Typen schätzen, sondern ermöglicht auch die Bestimmung der funktionellen Eigenschaften der Verbindung und der Morphologie der prä- und postsynaptischen Neuronen. Außerdem Agonisten und / oder Antagonisten kann leicht an Neuronen im Schnittpräparate angewendet werden. Dies erlaubt es, die Wirkungen von Neuromodulatoren zu den Eigenschaften der synaptischen Übertragung 32 oder einer eingehenden Charakterisierung eines definierten Einheits synaptische Verbindung mit zum Beispiel studieren, quantal Analyse synaptischen Freisetzung 16,17,38,39. Finding von chemischen und / oder elektrische (gap junction) synaptischer Verbindungen ist der wichtigste Schritt dieses Protokolls. Wir haben daher verschiedene Ansätze aufgelistet zum Auffinden synaptischen Verbindungen, abhängig von der Verbindungsverhältnis und ihreArt (chemische / elektrisch).
Ein wesentlicher Nachteil der Schnittpräparate ist die oft erheblichen Verkürzung von Langstrecken-axonalen Projektionen, so dass nur kleine Teile der Gesamt axonalen Länge des Axons wiederhergestellt werden. Für einige Pyramidenzelltypen, der Grad der Verkürzung kann bis zu 90% oder sogar noch mehr, wenn man Vorsprünge auf andere kortikale Bereiche oder subkortikaler Regionen berücksichtigen. Dadurch wird für die Untersuchung der synaptischen Verbindungen zwischen Nervenzellen die Zellkörper von denen mehr als> 300 & mgr; m voneinander entfernt sind, das Schnittpräparat nicht geeignet. Bei akuten Schnittpräparate, lokale axonale Projektionen, insbesondere diejenigen der lokalen Inter werden im Allgemeinen mit einem relativ geringen Grad von dendritischen und axonalen Trunkierung (~ 10% oder weniger) durch die begrenzte horizontale und vertikale Feld Spanne ihrer axonale gewonnen . Verbindungen mit dieser Art von Nervenzellen kann daher mit einem hohen Grad an Genauigkeit und zuverlässigen un charakterisiert werdenility und ergeben weitgehend korrekten Konnektivität Schätzungen. Mit Ausnahme dieser lokalen synaptischen Verbindungen, sind Absolutwerte für die Konnektivität Verhältnisse zwischen in Schnittpräparaten erhalten zwei Neuronentypen sehr problematisch, insbesondere für Neuronen bei großer inter somatischen Distanzen wie in translaminar oder nicht-lokale, Langstrecken-intralaminaren synaptischen Verbindungen . Dieses Problem wird verschärft, wenn das Schneiden Bedingungen nicht für eine gegebene synaptischen Verbindung in einem definierten Alter optimiert. Für realistische Konnektivität geschätzten neuartige Methoden wie dichte Elektronenmikroskop Rekonstruktionen 40 und Struktur axo-dendritischen Überlappung 41 entwickelt worden. Jedoch haben selbst diese Techniken zu berücksichtigen, die grosse Vielfalt der hemmenden Inter und exzitatorischen Neuronen nehmen.
Ein zusätzliches Problem bei Anbindung von Schätzungen ist, dass das distale synaptische Kontakte, beispielsweise die am apikalen Büschel pyramidalen Neuronen, kannentkommen Erkennung. Wenn an der Soma gemessen die Amplitude ihrer synaptischen Antwort ist sehr klein und wird voraussichtlich im Rauschen verschwinden (Qi et al., 2014, in der Unterordnung). Allerdings ist diese Art von Problem nicht auf das gekoppelte Aufnahme Ansatz beschränkt, sondern wird auch mit anderen Techniken verwendet werden, um die synaptische Verbindung zu studieren kommen.
In den letzten Jahren lichtinduzierte Aktivierung neuronaler Schaltkreise (dh durch Photo Freisetzung von geschütztem Glutamat oder durch Aktivierung Kanalrhodopsin) verwendet worden ist, um neuronale Konnektivität auch in größerem Maßstab 42-52 untersuchen. Jedoch ist es mit dieser optischen Methoden nicht möglich, die strukturellen Eigenschaften von präsynaptischen Neuron Typ zu identifizieren. Weiterhin kann die Anzahl und Lage der synaptischen Kontakte durch eine neuronale Verbindung aufgebaut nicht identifiziert werden kann, zumindest nicht auf dem Laufenden. Gepaart Aufnahmen, auf der anderen Seite, ermöglicht die Charakterisierung sowohl prä- und postsynaptischen neurauf Typen in einer synaptischen Mikroschaltung. Dies ist besonders wichtig, da viele Studien haben gezeigt, dass sowohl GABAergen Interneuronen und exzitatorischen Neuronen sind sehr unterschiedlich in bezug auf ihre Morphologie und Physiologie synaptischen 53-56. Somit ist die Identifizierung sowohl prä- und postsynaptischen Neuronen eine Voraussetzung für die Beschreibung einer synaptischen Verbindung 57. Schließlich erlauben gepaart Aufnahmen die Aufnahme von verschiedenen Konfigurationen der synaptischen Verbindung (reziproke Verbindungen koexistieren Gap Junctions und chemische Synapsen). Daher wird die paarweise Aufnahmetechnik ein wichtiger Ansatz für die Untersuchung neuronaler Schaltkreise bleiben.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifier | HEKA | EPC 10 USB Triple | with 2 - 3 preamplifiers |
| Microscope | Olympus | BX51WI | with 2 camera ports, a 4X objective, and a 40X water-immersion objective |
| Camera | TILL Photonics | VX55 | infrared CCD camera |
| Workstation | Luigs & Neumann | Infrapatch 240 | with a motorized x-y stage and a motorized focus axis for the microscope |
| Micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-5 | x-y-z manipulators for 2 - 3 preamplifiers |
| Faraday cage | Luigs & Neumann | ||
| Anti-vibration table | Newport Spectra-Physics | ||
| Patchmaster | HEKA | ||
| Microtome | Microm International | HM650V | |
| Micropipette puller | HEKA | Sutter P-97 | |
| Neurolucida system | Microbrightfield | with Neurolucida and Neuroexplorer softwares |
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