Abstract
El sistema linfático intestinal juega un papel clave en el transporte de líquidos, la absorción de lípidos y la función inmune. La linfa fluye directamente desde el intestino delgado a través de una serie de vasos linfáticos y los nodos que convergen en el conducto linfático mesentérico superior. La canulación del conducto linfático mesentérico por lo tanto permite la recogida de la linfa mesentérica que fluye desde el intestino. Linfático mesentérico consiste en una fracción celular de las células inmunes (99% de linfocitos), fracción acuosa (líquido, péptidos y proteínas tales como citocinas y hormonas intestinales) y la fracción de lipoproteínas (lípidos, moléculas lipófilas y apo-proteínas). Por consiguiente, el modelo de la canulación del conducto linfático mesentérico se puede utilizar para medir la concentración y la velocidad de transporte de una serie de factores del intestino a través del sistema linfático. Los cambios en estos factores en respuesta a diferentes retos (por ejemplo, las dietas, antígenos, fármacos) y en la enfermedad (por ejemplo, enfermedad inflamatoria del intestino, VIH, diabetes) puede también be determinada. Un área de expansión de interés es el papel del transporte linfático en la absorción de fármacos lipófilos administrados por vía oral y profármacos que se asocian con las vías de absorción de lípidos intestinales. Aquí se describe, en detalle, un modelo de rata canulado conducto linfático mesentérico, que permite la evaluación de la velocidad y extensión de los lípidos y el transporte del fármaco a través del sistema linfático durante varias horas después del parto intestinal. El método es fácilmente adaptable a la medición de otros parámetros en los ganglios. Proporcionamos una descripción detallada de las dificultades que se pueden encontrar al establecer este método quirúrgico complejo, así como los datos representativos de experimentos fallidos y exitosos para proveer instrucción sobre cómo confirmar el éxito experimental e interpretar los datos obtenidos.
Introduction
La linfa fluye desde el intestino delgado a través de un proceso unidireccional que se origina en lactíferos individuales que están contenidos dentro de cada pequeño vellosidades intestinales 1. Lacteales son relativamente permeable al fluido, macromoléculas y células y la formación de la linfa por lo tanto comienza con la entrada de estos factores en lacteales. La linfa inicial en los lacteales fluye posteriormente desde el intestino a través de una red de microvasos linfáticos, la recolección (aferente) los vasos linfáticos, una serie de ganglios linfáticos mesentéricos y en última instancia los post-ganglionar (eferente) los vasos linfáticos. Dentro de los nodos, la linfa pasa a través de una serie de senos medulares donde se produce el intercambio con las células inmunes residentes nodo, así como material que entran en el nodo de la sangre. Todos los ganglios que fluye desde el intestino delgado finalmente converge en el conducto linfático eferente mesentérica superior y, posteriormente, la cisterna del quilo. La cisterna del quilo además contiene linfático de drenaje de los tejidos periféricos caudales, intestinal, regiones hepáticas y lumbares y se une al conducto linfático torácico junto con la linfa del mediastino y partes craneales del cuerpo. El conducto linfático torácico vacía linfático directamente en el sistema venoso en la unión de las venas yugular interna y subclavia izquierda. El protocolo descrito aquí, que permite la recogida de la linfa directamente desde el conducto linfático mesentérico superior, por lo tanto facilita el análisis de diversos factores que transitan directamente desde el intestino a la circulación (general) sistémica a través del sistema linfático intestinal.
Las principales funciones fisiológicas asignados al sistema linfático intestinal son para mantener el equilibrio de fluidos, para facilitar la absorción de los lípidos y la molécula lipófila, y para permitir respuestas inmunes apropiadas 1. Las células tumorales y virus también se propagan a través de los vasos linfáticos intestinales 2-4 y principales cambios se producen dentro de los vasos linfáticos en diversas patologías inflamatorias y metabólicas 5-7. Latanulation del conducto linfático mesentérico para recoger la linfa en el mesenterio permite un análisis de flujo de fluido mayor a través de los vasos linfáticos intestinales, así como la cuantificación de la tasa de concentración y el transporte de varias células y moléculas. Los cambios en la concentración o el tránsito de estos factores en respuesta a diversos desafíos (por ejemplo, dietas, antígenos, drogas) y en modelos de enfermedad (por ejemplo, colitis, VIH, diabetes) pueden también ser evaluados. Si bien es imposible describir ampliamente cada componente linfático que puede ser analizada y comparada aquí, linfático mesentérico consiste simplista de acuosa, lípidos y las fases celulares. Componentes de interés en la fase acuosa incluyen péptidos y proteínas tales como antígenos o tolerógenos 8, mensajeros inmunes tales como citoquinas y mediadores de mastocitos, 9 y mediadores metabólicos tales como incretinas 10. La fracción celular de la linfa mesentérica post-nodal consiste casi completamente (más del 99%) de lymphocytes 11. Varias células inmunes (células dendríticas, mastocitos, etc.) entran en los vasos linfáticos mesentéricos pre-nodales pero permanecen dentro del nodo 12. Si las células dentro de la linfa aferente son de interés, es posible recoger estas células a través de la eliminación de la nódulos linfáticos mesentéricos varios días antes de la canulación del conducto linfático mesentérico 12. De esta manera los aferentes y eferentes conductos linfáticos están directamente conectados y las células en los ganglios linfáticos aferentes pasan directamente en el conducto linfático mesentérico. El tránsito y el fenotipo de varias células inmunes que pasan a través de los vasos linfáticos intestinales por lo tanto pueden ser examinados. Quizás la razón más común citada para la recogida de la linfa mesentérica hasta la fecha, sin embargo, es estudiar el procesamiento intestinal, la absorción y el transporte de lípidos de la dieta y las moléculas lipofílicas 10.
Después de la ingestión, lípidos de la dieta son digeridos (por ejemplo, de triglicéridos de ácidos grasos y monoglicéridos, phospholipid a los ácidos grasos y lisofosfolípidos, colesterol y éster de ácido graso y colesterol, etc.) y dispersas dentro de la luz intestinal en pequeñas micela y las estructuras vesiculares por medio de la adición de anfífilos de la bilis (fosfolípidos, colesterol y sales biliares) y la acción de enzimas pancreáticas 10,13. De aquí que se absorben en los enterocitos. Una proporción de los componentes absorbidos se re-esterificados para formar triglicéridos, fosfolípidos y ésteres de colesterol dentro de las células absorbentes (enterocitos). Estas re-esterificados lípidos se ensamblan a partir de una combinación de componentes lipídicos exógena ingerida y componentes de lípidos endógenos de la bilis secretada, piscinas de lípidos de la mucosa o el suministro de sangre intestinal 13. Desde aquí los lípidos esterificados se almacenan ya sea dentro de los enterocitos o ensamblados en lipoproteínas intestinales (quilomicrones, lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL)), junto con diversos apoproteínas y otras moléculas lipófilas (
La recogida de la linfa mesentérica por lo tanto permite la evaluación del transporte de lipoproteínas y componentes asociados (lípidos, moléculas lipófilas, APO-proteínas) desde el intestino. Las lipoproteínas se pueden cuantificar y caracterizados con la ventaja de que las lipoproteínas ganglios mesentéricos, en general, están en una nascent estado, ya que no han sido ampliamente modificado por enzimas sistémicas tales como la lipoproteína lipasa 15. Mientras que el modelo de rata canulada linfático mesentérico ha históricamente quizás ha descrito más ampliamente para el análisis de transporte de lípidos / lipoproteínas de desde el intestino, un área de interés es la ampliación de la función de los vasos linfáticos en el transporte de fármacos lipófilos, profármacos y otros xenobióticos 13,16 que es el foco del modelo descrito aquí. Drogas lipofílicas (generalmente aquellos con log P> 5 y solubilidad en cadena larga de triglicéridos> 50 mg / g, aunque excepciones son evidentes) 17,18, profármacos 19 y otros xenobióticos 13,16 puede tener acceso a los linfáticos intestinales de forma pasiva o por integrando activamente en las vías de transporte de lipoproteínas intestinal 19.
Así, la técnica de canulación linfático mesentérico de rata tiene muchas aplicaciones. Bollman et al. Descrita por primera vez un technique para canular el conducto linfático mesentérico en ratas en 1948 20. Desde entonces un número de variaciones sobre el modelo se han descrito. Por ejemplo, la colección se puede producir cuando la rata se anestesió con varios anestésicos 21,22, o en el estado consciente mientras refrenado 15 o se mueve libremente 23,24. Las ratas se pueden administrar diferentes soluciones de rehidratación y otras sustancias tales como lípidos y formulaciones de fármacos a diferentes velocidades en el estómago, intestino o parenteral (típicamente 0-5 ml / hr) 25. En algunos estudios, el conducto linfático torácico en lugar de conducto linfático mesentérico se canula para estimar el transporte desde el intestino a través de los vasos linfáticos aunque esto puede sobreestimar el tránsito en el intestino delgado, en función del factor de interés, ya que el conducto linfático torácico también recibe la linfa de otra regiones 22,26. Modelos de canulación linfáticos también se han descrito en varias otras especies, incluyendo ratones 15,27, mini-pigs 12, 28,29 ovejas, cerdos y perros 30 31. Sin embargo, el modelo de rata es la más amplia y coherente citado. Los protocolos detallados para la canulación del conducto linfático mesentérico seguida de la recogida de la linfa en consciente 25 o anestesiado 22 ratas y ratones 15,27 se han publicado previamente y el lector interesado se dirige a estos protocolos. Este protocolo es el primero en demostrar la técnica en un formato visualizado.
El modelo de rata linfático canulado tiene ventajas sobre los modelos animales más grandes en términos de costo, la facilidad de la cirugía y las consideraciones éticas. Cuando se compara con el modelo de ratón, la cirugía canulación linfático mesentérico es también más fácil en la rata Aunque el modelo de ratón permite estudios más detallados en los animales transgénicos 27. Sin embargo, hay algunas limitaciones del modelo de rata, en particular aquellos asociados con diferencias en la fisiología, que extrapolat límiteiones a otras situaciones pre-clínicos y clínicos. Por ejemplo, en el flujo de bilis de rata es constante e independiente de la ingesta de alimentos mientras que en mayor alimentos especie o lípidos estimulan el flujo de bilis 32. Esto crea desafíos para la obtención de los entornos de pre y post-prandial de representación en la rata que reflejan lo que se ve en las especies y los seres humanos más grandes. Para los estudios de administración de fármacos, las especies más grandes también pueden ser preferidos cuando se evalúa el transporte linfático después de la administración de la dosis humana realista forma 25. En un estudio reciente, se encontró que las tasas de transporte de lípidos en la linfa mesentérica ser comparables entre especies (ratón, rata, perro) después de la administración de una masa equivalente y el tipo de lípidos que proporciona cierta confianza en la extrapolación de los datos de transporte de lípidos a través de especies 27. Sin embargo, el transporte de un modelo lipofílica drogas, halofantrina, clasificados en orden de tamaño de los animales (es decir, perro> rata> ratón). Un factor de escala puede, pues, ser obligado a exextrapolar los datos de transporte de drogas linfáticos de rata para otras especies.
Una limitación de los modelos de canulación de la linfa, en general, es que la recogida pasiva linfático directamente de un conducto linfático puede modificar el flujo y transporte linfático desde los vasos linfáticos trabajan en contra de un gradiente de presión que se altera una vez que el recipiente se canula 33. El modelo canulación linfáticos también puede ser difícil de establecer en los laboratorios que no están familiarizados con la técnica. Así, se han descrito modelos alternativos. Por ejemplo, el tránsito de factores través del sistema linfático intestinal, tales como lipoproteínas y moléculas lipofílicas, se ha estudiado indirectamente a través de la colección de la sangre. Uno de estos modelos consiste en comparar las concentraciones sanguíneas de lípidos y / o drogas tras la administración oral en presencia y ausencia de inhibidores (por ejemplo, colchicina, Pluronic L81, cicloheximida) de la producción de lipoproteínas intestinal que bloquean el transporte linfático 34. Una ventajade los modelos que cuantifican el transporte linfático indirectamente a través de la recolección de muestras de sangre es que permite cierta evaluación del transporte linfático en los seres humanos como no se requiere cirugía invasiva 35. Sin embargo, los inhibidores de transporte linfático no son específicos y los factores que son transportados a través de los vasos linfáticos se diluyen y se modifican en la circulación sistémica que complica tales evaluaciones. In vitro alternativas también se han descrito. Por ejemplo, los cultivos de células Caco-2 o aislado de los enterocitos se han utilizado para estudiar en más detalle la secreción intestinal de moléculas que entran en los vasos linfáticos 36-38. Un modelo avanzado in vitro que es más representativo del microambiente intestinal humano también fue recientemente descrito 39. En este modelo de una capa de células endoteliales linfáticas es co-cultivadas con células Caco-2 que permite análisis más detallado de la transferencia de sustancias desde el intestino en los vasos linfáticos. Sin embargo, en vitro sistemas de células carecen de flujo de intercambio y transferencia denominado interconexión con un lumen intestinal y sangre subyacente y de aporte vascular linfático. En un enfoque alternativo, Kassis et al. Estableció un doble canal (vídeo de alta velocidad de campo claro y fluorescencia) en el sistema de formación de imágenes in situ que permite comparaciones cuantitativas entre contracción de los vasos, el flujo de la linfa y las concentraciones de lípidos fluorescentes en los vasos linfáticos mesentéricos 33. Una ventaja de este modelo sobre el mencionado en sistemas in vitro es que permite un seguimiento preciso del paso de las células inmunes a través de los vasos linfáticos. Las medidas absolutas de lípidos masa (o drogas) de transporte son, sin embargo, aún no se establecerán a partir de los métodos de imagen. In vitro e in silico enfoques para predecir específicamente el grado de transporte del fármaco lipofílico a través de los vasos linfáticos intestinales también se han publicado 40-42. Por ejemplo, la afinidad ex vivo de varios ccomuestos para quilomicrones plasma se encontró correlación razonablemente bien con su transporte linfático en vivo 41. Posteriormente, el mismo grupo estableció un modelo en silico para predecir la afinidad fármaco para quilomicrones basados en múltiples propiedades fisicoquímicas 40. Holm et al. También estableció un relativamente complejo en el modelo de silico para predecir de plano de transporte linfático de compuestos lipófilos sobre la base de los descriptores moleculares 42. Estos modelos pueden proporcionar un enfoque útil para predecir el grado de transporte linfático de fármacos desconocidos. Será, sin embargo, se requerirá la validación de los modelos con una amplia gama de medicamentos y en los diferentes laboratorios para confirmar su exactitud y reproducibilidad.
La canulación del conducto linfático mesentérico por lo tanto sigue siendo el único medio para examinar directamente el contenido de drenaje linfático del intestino delgado y la velocidad de tránsito de la compleja serie de factores (células, proteínas,péptidos, lípidos, drogas) en la linfa en una situación in vivo. Aquí se describe un protocolo para la canulación del conducto linfático y carótida arteria mesentérica que permite la recogida de la linfa mesentérica y la sangre sistémica de las ratas anestesiadas. Los datos representativos demuestran cómo el modelo puede ser utilizado para examinar los lípidos y el transporte del fármaco desde el intestino a través del sistema linfático mesentérico. Esto es seguido por una discusión de las dificultades que se pueden encontrar en el establecimiento del modelo y una guía para resolver problemas. Una vez establecido el modelo es una herramienta poderosa para investigar el transporte linfático intestinal.
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Protocol
Los estudios descritos en este manuscrito fueron aprobados por el comité de ética animal local y se llevaron a cabo de acuerdo con el Consejo de Australia y Nueva Zelanda para el cuidado de los animales en las directrices de investigación y docencia. Antes de iniciar cualquier procedimiento de animal, asegúrese de que el permiso adecuado se obtiene a través de la institución / organización local. Al igual que con todas las cirugías animales, asegúrese de que la cirugía es realizada por operadores debidamente capacitado, en condiciones asépticas y que los anestésicos, analgésicos y antibióticos se administran cuando sea necesario para asegurar un resultado ético y exitoso.
1. Preparativos el día antes del procedimiento quirúrgico
- Fast la rata la noche antes de la cirugía si es necesario. Asegúrese de que la rata tiene libre acceso al agua.
- Preparar las soluciones que se administran a la rata.
- Preparar una solución de rehidratación tal como solución salina estéril o solución de Ringer.
- Preparar unsoluciones estéticas como se requiere. El anestésico utilizado en los experimentos descritos aquí consistía en "Cocktail 1" preparada combinando 1,9 ml de ketamina 100 mg / ml, 0,5 ml de xilazina 100 mg / ml, 0,2 ml de acepromacina 10 mg / ml y 2,5 ml de solución salina y " Cocktail 2 "que consta de 1 ml de ketamina 100 mg / ml y 0,1 ml acepromacina 10 mg / ml. NOTA: inhalado isoflurano o sevoflurano pueden ser preferibles ya que puede proporcionar un plano quirúrgico de anestesia durante un período de tiempo más largo.
- Opcionalmente preparar una formulación que contiene el fármaco, por ejemplo, una emulsión de lípidos. Realizar estudios de estabilidad apropiadas para asegurar la estabilidad de la formulación durante el período de almacenamiento y administración.
NOTA: La naturaleza exacta de la formulación y fármaco a administrar variará con cada estudio como el objetivo de los estudios de transporte de drogas linfático es más a menudo para evaluar la eficiencia del transporte de drogas linfático como una función de la formulación y de drogas administrado.- La formulación utilizada en los experimentos representativos en la figura 4 y 5 aquí se prepara, como se ha descrito previamente 43. En pocas palabras, incorporar 14 C ácido oleico (2-5 Ci) y halofantrina (200 mg) en 40 mg de ácido oleico antes de la dispersión en 5,6 ml de una fase acuosa que consta de taurocolato de sodio 5 mM en tampón fosfato salino (pH 6,9).
- Para las formulaciones que contienen 2-monooleına, añadir 7,1 mg de 2-monooleına junto con otros componentes, a la fase acuosa, al mismo tiempo que la fase de ácido oleico que contiene halofantrina. Preparar las formulaciones que contienen 2-monooleına inmediatamente antes de la administración a la rata como 2-monooleına es relativamente inestable y isomerises a 1-monooleına.
- Posteriormente emulsionar las formulaciones por ultrasonidos durante 2 min a TA.
NOTA: Como se ha descrito previamente 43, vigilar la estabilidad de las formulaciones por i) inspección visual de la emulSion bajo luz polarizada para asegurar que la emulsión no se separa en fases, ii) análisis de tamaño de partículas inmediatamente después de la preparación y después de la dosificación utilizando dispersión dinámica de la luz para proporcionar una indicación de cualquier cambio de fase y / o la separación, y iii) el análisis de las concentraciones de halofantrina usando un ensayo de HPLC validado.
- Preparar la solución de anti-coagulante que contiene 10 mg / ml de EDTA en agua estéril o 10 UI / ml de heparina en solución salina para lavar la cánula linfático. También preparar la solución de anti-coagulante que contiene 2,5 a 10 IU / ml de heparina en solución salina para lavar la cánula de la arteria carótida.
- Preparar las cánulas de polietileno para la inserción en el conducto linfático mesentérico (0,8 mm OD, 0,5 mm ID), la arteria carótida (0,96 mm OD, 0,58 mm ID o 0,8 mm OD, 0,5 mm ID) y el duodeno (0,96 mm OD, 0,58 mm ID )
- Cortar las cánulas a la longitud requerida (típicamente de 25 - 30 cm de la arteria carótida y la cánula duodenal y 10 - 15 cm para la Cann linfáticoULA) y colocar un bisel en la punta de las cánulas utilizando una cuchilla quirúrgica estéril (véase la Figura 1).
NOTA: Esto aumenta la facilidad de inserción de la cánula y reduce la incidencia de la obstrucción de la cánula post-inserción. - Colocar un punto de anclaje forma J en la cánula intraduodenal colocando un pequeña porción de la cánula sobre sí mismo, calentándolo con una placa más claro o más caliente y luego cortar al tamaño (véase la Figura 1).
- Cortar las cánulas a la longitud requerida (típicamente de 25 - 30 cm de la arteria carótida y la cánula duodenal y 10 - 15 cm para la Cann linfáticoULA) y colocar un bisel en la punta de las cánulas utilizando una cuchilla quirúrgica estéril (véase la Figura 1).
- Coloque la cánula linfático a una aguja 25 G y la jeringa que contiene una solución anticoagulante (preparado en el paso 1.3). Llene la cánula linfático con la solución de anti-coagulante y dejar la solución en la cánula O / N para reducir la incidencia de formación de coágulos en la cánula linfático durante la recogida de la linfa.
- Preparar tubos de linfa y muestra de sangre recogida. Pre-sopesar tubos de recogida de la linfa, tubos de etiquetas para la linfa y muestra de sangre recogida y añadir solución anticoagulante. Añadir suficiente solut anticoagulanteion para lograr una concentración final de 1 mg / ml de EDTA en agua estéril o 10 a 20 UI / ml de heparina en la linfa o la sangre recogida.
2. Preparativos Inmediatamente antes de comenzar el procedimiento quirúrgico
- Compruebe todas las cánulas mediante el lavado con solución salina estéril o solución anti-coagulante para asegurarse de que son patentes.
- Preparar la rata para el procedimiento quirúrgico.
NOTA: El conducto linfático mesentérico es más visible en las ratas que han comido o han administrado una dosis de aceite como la linfa mesentérica vuelve lechoso y opaco, con una mayor carga de lípidos. Algunos operadores, especialmente los nuevos en la cirugía, por lo tanto, les resulta más fácil para canular el conducto linfático mesentérico cuando las ratas son pre-dosificados con un aceite (alrededor de 0.1 - 1 ml) como el de oliva o aceite de soja 0,5 a 2 horas antes de la cirugía de comenzar . Sin embargo, antes de la dosificación de aceite afecta el transporte linfático de los lípidos, medicamentos lipofílicos y otros factores en los ganglios de tal manera que puede no ser ideal para pre-dosis de aceitedependiendo del objetivo del experimento.- Anestesiar la rata durante todo el periodo de recolección de la cirugía y de la muestra.
- Por ejemplo, iniciar la anestesia mediante inyección subcutánea de 1,5 ml / kg de cóctel I (de la etapa 1.2.2) en un pliegue de piel en la parte posterior del cuello ratas usando una jeringa de 1 ml unida a una aguja 25 G. Mantener la anestesia mediante inyección intraperitoneal de 0,44 ml / kg de Cocktail 2 (de la etapa 1.2.2) aproximadamente cada hora según se requiera, usando una jeringa de 1 ml unida a una aguja 25 G.
- Antes de comenzar la cirugía asegurar que la profundidad de la anestesia es suficiente mediante la observación de la frecuencia respiratoria, el movimiento de la barba, el tono muscular y respuestas a estímulos tales como pinzamiento de pie. Administrar anestesia adicionales según sea necesario.
- Afeitarse la piel de las regiones quirúrgicos, que incluyen el lado derecho del abdomen para la linfa y la canulación duodeno, y el cuello y la región de la clavícula izquierda para cánula de la arteria carótidación.
- Limpie las regiones quirúrgicos asépticamente utilizando solución de clorhexidina o solución de povidona yodada y un exfoliante etanol al 70%. Repita esto 3 veces para cada región, terminando con una limpieza final con etanol al 70%.
- Anestesiar la rata durante todo el periodo de recolección de la cirugía y de la muestra.
- Colocar el animal en decúbito dorsal en una hoja limpia por encima de un cojín quirúrgico climatizada (37 ° C).
3. La canulación de la mesentérica linfa del conducto
- Colocar el animal con el lado derecho hacia el operador. Realizar la cirugía con o sin la ayuda de un microscopio quirúrgico según sea necesario.
- Abra la capa superior de la pared muscular abdominal con una incisión recta 4 cm que se extiende desde la línea media (apéndice xifoides) para el flanco derecho de aproximadamente 2 cm por debajo de la caja torácica (margen costal) usando una hoja de bisturí estéril (véase la Figura 2B).
- Abra las capas restantes de la pared muscular abdominal 4-5 mm laterales a la línea media a la banda derecha con un pequeño parde tijeras quirúrgicas (véase la figura 2B).
- Retraer el intestino delgado debajo de la pared muscular abdominal izquierda y mantenerlo en su lugar con 2-3 piezas de gasa estéril saturadas con solución salina normal.
- Puente la rata a través de una jeringa de plástico de 10 ml en posición horizontal debajo de la espalda de la rata a nivel de riñón derecho para facilitar la visualización del conducto linfático mesentérico.
- Localizar el conducto linfático mesentérica superior: un recipiente de aproximadamente 0,5 a 1 mm de diámetro, que es perpendicular a la riñón derecho e inmediatamente rostral y paralela a la arteria mesentérica (un recipiente pulsante de sangre de color rojo oscuro; véase la Figura 2C).
NOTA: En ratas pre-dosificados no de ayuno o de aceite de la vasija es de color blanco, opaco y más fácil de visualizar que en ratas en ayunas en los que es bastante translúcido. - Inspeccionar el área inmediatamente caudal a la gran conducto linfático mesentérico superior y la arteria mesentérica para determinar si un segundo conducto linfático accesorio más pequeño, espresente. Si está presente, bloquear el flujo de la linfa a través del conducto cortando el conducto y ocluir con superglue, o atando una sutura alrededor del conducto, para asegurar que todo el volumen de la linfa que fluye desde el intestino se recoge desde el conducto linfático mesentérico superior.
- Pasar un par de pinzas rectas a través del lecho de grasa peri-renal en el margen inferior del riñón derecho, ya través de las capas de tejido conectivo inmediatamente por debajo de la vena cava, en una dirección paralela con el conducto linfático mesentérica superior.
- Con la punta de las pinzas apoderarse de la cánula linfático y tire de ella a través del lecho de grasa peri-renal con un extremo inmediatamente adyacente al conducto linfático mesentérico y el otro exteriorizado del animal a nivel del riñón derecho.
- Aislar el conducto linfático mesentérico de capas superpuestas de tejido conectivo y grasa por disección roma. Tenga cuidado de no perforar o dañar el conducto linfático.
- Después de aislar el conducto linfático, hacer un pequeño hole en el conducto linfático, ya sea con micro-tijeras, la punta afilada de pinzas de joyero o una aguja de 25 G. Tenga cuidado de no cortar completamente el recipiente.
- Asegúrese de que la cánula linfático está completamente llena con una solución de anti-coagulante (usando una jeringa y aguja de 25 G) sin espacios de aire. Insertar la cánula linfático aproximadamente 2 - 4 mm en el interior del conducto linfático mesentérico a través del pequeño agujero con la ayuda de un pequeño par de fórceps.
- Observe la cánula linfático durante un par de minutos. Observe un flujo gradual de la linfa intestinal desde el extremo de recogida gratuita de la cánula si la canalización se realiza correctamente. Si la canalización no es correcta, repita los pasos 3.8 a 3.12.
- Si la canulación es exitosa, asegurar la cánula mediante la colocación de una pequeña gota de adhesivo veterinaria sobre el orificio de entrada en el conducto linfático. Tenga cuidado de no ocluir el vaso a través de la aplicación de un exceso de adhesivo veterinaria.
- A la espera de que el adhesivo veterinario para establecer, observe el flujo de la linfa durante varios minutos para asegurar que el procedimiento de canulación fue exitosa. Una vez determinado el éxito de la canulación, retirar las piezas de gasa que se colocaron en la cavidad abdominal con cuidado y colocar el intestino delgado en su posición original.
- Colocar un tubo de recogida de la linfa que contiene anti-coagulante (véase el paso 1.6) en el extremo de la cánula para recoger la linfa de flujo libre.
- A continuación, canular el duodeno para la infusión de soluciones de rehidratación y / o formulaciones.
4. La canulación del duodeno
- Coloque la cánula duodeno a una jeringa (por ejemplo, 10 ml) lleno con la solución de rehidratación.
- Identificar el duodeno como el rosa brillante (con más vasos sanguíneos) sección del intestino delgado, que al suave hacia abajo tirando revela el estómago.
- Hacer un pequeño orificio de punción en el duodeno aproximadamente 2 cm por debajo de la unión del estómago y el duodeno (píloro) usandoun estéril 23 G aguja.
- Insertar el extremo de gancho en forma de J de la cánula duodenal a través del orificio de punción. Asegure en su lugar con una gota de pegamento de cianoacrilato.
- Comenzar la hidratación de la rata mediante la unión de la cánula a la jeringa de rehidratación cargada en una bomba de infusión. De acuerdo con la literatura tasas de rehidratación van 0,5-3 ml / hr 15,25.
- Después de la terminación de la linfa y la canulación duodeno, cerrar la incisión en la pared muscular abdominal con suturas. Entonces cerrar la incisión de la piel mediante la aplicación de unas cuantas gotas de adhesivo de tejido (cianoacrilato) a lo largo del lado de la incisión y pellizcando la piel en ambos lados de la incisión juntos.
5. La canulación de la arteria carótida
La canulación de la arteria carótida se puede realizar antes o después de la canulación del conducto linfático mesentérico. Algunos operadores prefieren para canular la arteria carótida antes de la canulación del conducto linfático a fin de reducir pocialmente desalojar la cánula linfático cuando se mueve el animal.
- Colocar una marca en la cánula de la arteria carótida 2,5 cm desde la punta de bisel para identificar la porción del tubo para insertar en la arteria. Conectar el otro extremo de la cánula (es decir, sin bisel) a una aguja G 23 o 25 unida a una jeringa llena con solución de anti-coagulante y llenar la cánula con la solución de anti-coagulante asegurándose de que no están presentes los espacios de aire.
- Para facilitar la canalización, coloque la rata anestesiada en decúbito dorsal con el cuello estirado y la cabeza apuntando hacia el operador. Tenga en cuenta que algunos operadores prefieren realizar esta técnica con la cola de la rata que apunta hacia el operador.
- Coloque un 1 - incisión longitudinal de 1,5 cm a través de la capa de piel por encima de la izquierda de la tráquea en el plano sagital.
- Diseccionar el tejido conectivo subcutáneo usando pinzas de punta roma para exponer los músculos del cuello pareadas subyacentes.
- Retraer los músculos del cuello to revelar la arteria carótida izquierda (ubicado ~ 1 cm por debajo de la superficie de la piel e intermitente). Limpiar el tejido conectivo suprayacente de la arteria mediante disección roma.
- Aislar una sección ~ 1 cm de la arteria cuidadosamente usando pinzas de tejido contundentes, teniendo cuidado de no dañar el nervio vago pista adyacente. Realice esto mediante la apertura y el cierre de las pinzas de punta roma verticalmente a lo largo de cada lado de la arteria para liberarlo del tejido circundante y el nervio vago.
- Con unas pinzas de punta fina, enhebrar dos suturas de seda por debajo de la arteria carótida y colocarlos en cada extremo de la sección de la arteria aislado. Tie fuera de la sutura más próximo al operador y más lejos de corazón y la clavícula (Figura 3A) de la rata.
- Ocluir el flujo sanguíneo a través de la arteria por la colocación de un par de pinzas de punta fina directamente debajo de la arteria (Figura 3B).
- Utilizando las tijeras iris de punta fina, colocar una pequeña incisión en la superficie superior de la arteria (alrededor de 1/3 de lacamino hacia abajo desde la parte superior de la zona aislada). Lave toda la sangre derramada en la superficie de la arteria con solución salina heparinizada y limpie suavemente con puntas de algodón.
- Inserte la punta de la cánula en la arteria con un par de pinzas punta curvada. Una vez insertado, retirar las pinzas de punta fina rectas ocluir el flujo de sangre y avanzar la cánula de 2,5 cm en la arteria utilizando dos pares de pinzas, una para sujetar la cánula dentro de la arteria para evitar que la sangre se escape hacia atrás y la otra para insertar la cánula.
- Utilice una abrazadera arteria pequeño para contener la cánula dentro de la arteria y retirar las pinzas de punta fina rectas que fueron colocados debajo de la arteria en el paso 5.8 para ocluir el flujo de sangre.
- Confirmar la permeabilidad de la cánula mediante la inyección de solución de anti-coagulante en la cánula y el dibujo de nuevo una pequeña cantidad de sangre (Figura 3C). A continuación, enjuagar la cánula con una solución anticoagulante y sellar el extremo usando la llama de un mechero o un tapón de la cánula.
- Ate ªe cánula en su lugar con las dos suturas colocadas debajo de la arteria en el paso 5.8.
- Retire la abrazadera arteria y asegurar una tercera sutura alrededor de la arteria y la cánula. Cierre del cuello de la herida con puntos de sutura.
Período 6. Post-quirúrgica y Formulación Infusión
- Seguir manteniendo la rata bajo anestesia y en la almohadilla caliente.
- Rehidratar la rata a través de la infusión de solución de rehidratación en el duodeno durante al menos 0,5 horas tras la finalización de las canulaciones. Observe la disminución de la tasa de flujo de la linfa (~ 0,1-0,5 ml / h) durante el período inicial después de la canulación y pronto aumentará a una línea de base estable (0,4 a 2,5 ml / hr dependiendo de la velocidad de rehidratación).
- Tras el período de recuperación, infundir la formulación de interés (que contiene lípidos, medicamentos, etc.) en el duodeno a través de la cánula. Opcionalmente, utilizar una bomba de infusión para regular la velocidad de flujo de formulación. NOTA: En el protocolo descrito aquí los animales permanecen ANAESthetised durante todo el período de la cirugía y la recogida de la linfa y por eutanasia bajo anestesia de tal manera que no se requiere analgesia adicional. Si el protocolo se modificó y los animales están habilitadas para recuperar la conciencia, se requerirán analgesia adecuada y la atención post-operatoria.
- A la finalización de la infusión de la formulación de continuar para rehidratar la rata a una velocidad de 1,5-3 ml / hr con solución salina normal en el duodeno para prevenir la deshidratación.
- Siga manteniendo la rata en la plataforma quirúrgica climatizada 37 ° C para mantener la temperatura (como en el paso 2.3), orina expresa de la vejiga a través de suave empujón hacia abajo en la parte inferior del abdomen como sea necesario y volver a aplicar la pomada oftálmica cada hora (como en el paso 2.2. 3). Se recomiendan los cambios de posición del cuerpo regulares si el animal es recuperar la conciencia después del procedimiento.
7. Recogida de los nódulos linfáticos y las muestras de sangre para evaluar los lípidos y la absorción del fármaco
- Recogen linfa continuamente entubos que contienen anti-coagulante. Cambio de tubos en los intervalos de tiempo requeridos (por ejemplo, cada hora).
- Recoger muestras de sangre en los puntos de tiempo establecidos.
- Ocluir el flujo sanguíneo a través de la cánula por la flexión de la cánula hacia atrás aproximadamente 2 cm desde el extremo sellado. Quitar el sello de la cánula cortando el extremo sellado o quitar el tapón de la cánula.
- Usando una jeringa vacía, retirar salina heparinizada de la cánula hasta que la sangre llena toda la cánula.
- Utilizando una nueva jeringa vacía, retire el volumen deseado de sangre y colocar en un tubo que contiene anticoagulante.
- Utilizando la primera jeringa, reemplace la sangre tomada antes del muestreo para reducir la pérdida de sangre innecesario. Antes de la inyección, golpecitos en la jeringa mientras lo mantiene en posición vertical para asegurarse de que no hay burbujas de aire entran en la cánula.
- Usando una jeringa, reemplazar el volumen de sangre extraída de la rata con una solución de anti-coagulante. Asegúrese de que no hay sangre residual es visible en la cánula como cualquier restante puede coagulary bloquear la cánula.
- Doble la cánula aproximadamente 2 cm del extremo no sellado para bloquear el flujo de sangre y retire la jeringa. Uso de la llama de un mechero o un tapón de la cánula, vuelva a sellar la cánula.
- A la finalización de la sangre y la linfa colección de la rata, la eutanasia a las ratas mediante la administración intraperitoneal de> 100 mg kg pentobarbital / sodio.
- Determinar la tasa de flujo de la linfa mediante la medición de la masa de la linfa recogida durante cada período de tiempo.
- Medir la concentración de fármaco y el lípido en la linfa y la sangre utilizando, por ejemplo, HPLC, HPLC-MS o el uso de kits comerciales, para evaluar los lípidos y la absorción del fármaco eficiencia.
- Calcular el transporte de masa de fármaco y los lípidos en los ganglios partir del producto de las concentraciones y el volumen de la linfa medidos recogidos.
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Representative Results
Los resultados de un experimento representativo para cuantificar la medida acumulativa y la tasa de lípidos y el transporte del fármaco a través del sistema linfático intestinal después de la entrega utilizando el modelo de canulación linfático mesentérico se muestra en la Figura 4 y la Figura 5. En este experimento, 200 g de el modelo lipófilo halofantrina fármaco se administró en el duodeno de ratas durante 2 h en una formulación que contiene 40 mg de ácido oleico (incluyendo 2 - 5 Ci 14 ácido C-oleico) y 7,1 mg 2-monooleına dispersado en 5,6 ml de 5 mM de taurocolato de sodio en tampón fosfato pH 6,9 solución salina. Después de la administración formulación de las ratas fueron rehidratados a una velocidad de 2,8 ml / hr con solución salina normal infundida en el duodeno. La linfa se recogió continuamente en tubos cambiado cada hora durante 10 horas. La formulación se preparó, y el experimento lleva a cabo, de acuerdo con un protocolo descrito previamente para una formulación que contiene todos iguales COMPONpadres, excepto que no se incluyen 2-monooleına 43.
Como se muestra en la Figura 4, en estas condiciones experimentales la tasa de flujo de la linfa media para ratas canuladas éxito fue entre 0,4 a 1,3 ml / hr. En algunas ratas la tasa de flujo de la linfa fue ligeramente inferior en la primera de 1 - 3 horas después de la canulación y luego aumentó. Esto se ve comúnmente después de la canulación linfático. También se muestra en la Figura 4 es la tasa de flujo de la linfa para un experimento fallido. En este caso la velocidad de flujo se mantuvo sustancialmente menor que la observada en los experimentos exitosos en todo el período de recolección. Del mismo modo, el transporte linfático acumulativo de triglicéridos y halofantrina fue sustancialmente menor en el experimento sin éxito (Figura 5A y B). El transporte halofantrina media acumulada en el grupo de éxito fue del 15,1% de la dosis, el transporte de triglicéridos acumulada fue de 61 mg durante 10 horas y la proporción de la r administradodosis de lípidos exógenos adiolabelled transportados en la linfa fue del 54% (Figura 5C). Estos valores no son significativamente diferentes a la observada previamente para una formulación similar que contenía los mismos componentes excepto por la ausencia de 2-monooleına 43 (Tabla 1). Esto sugiere que las formulaciones que contienen ácidos grasos en ausencia de una fuente de monoglicérido pueden apoyar de lípidos similar y el transporte del fármaco en los ganglios a los que sí contienen monoglicérido. Este resultado se describe adicionalmente en la sección de discusión.
Figura 5D muestra datos representativos sobre la tasa de halofantrina y el transporte de triglicéridos en la linfa en el tiempo después de la administración. La tasa de transporte de tanto de triglicéridos y fármaco en la linfa picos de un par de horas después de lípidos y la administración del fármaco y luego vuelve a los niveles basales. Como es típico en los experimentos de lípidos y de transporte de drogas linfáticos intestinales, la tasa de transpor drogast en los ganglios durante cada período de tiempo espejos que la observada para el transporte de triglicéridos como fármaco es transportado a la linfa en asociación con las lipoproteínas ricas en triglicéridos.
Figura 1. Representación esquemática de la forma de la punta biselada de una cánula de la arteria carótida o la linfa, y la punta biselada en forma de J de una cánula duodenal.
Figura 2. Fotografías de (A) el abdomen afeitado en preparación para canular el conducto linfático, (B) de la pared muscular abdominal se abrió con una incisión recta 4 cm que se extiende desde la línea media para el flanco derecho para acceder al conducto linfático, y (C ) el conducto superior de la linfa mesentérica (en círculo amarillo) perpendicular al riñón derecho. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Fotografías de (A) de la arteria carótida aislada con dos suturas de seda con la más cercana al operador atado, (B) de la arteria carótida aislada y el flujo sanguíneo ocluido con un par de pinzas de punta fina rectas colocada debajo de la arteria, y (C) de la arteria carótida con la cánula en su lugar y la permeabilidad que se comprueba mediante la elaboración de nuevo una pequeña cantidad de sangre. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 "src =" / files / ftp_upload / 52389 / 52389fig4highres.jpg "/>
Figura 4. Los datos representativos para la tasa de flujo de la linfa mesentérica (l / h) en el tiempo. Las ratas se les administró una formulación que contiene 200 mg de halofantrina, 40 mg de ácido oleico (ácido con 2 Ci 14 C-oleico) y 7,1 mg de 2 monooleına en 5.6 5 ml de taurocolato de sodio mM en tampón fosfato salino (pH 6,9) 0-2 hr. Los datos mostrados son la media ± SEM para n = 3 experimentos exitosos (círculos cerrados, ●) y n = 1 resultado infructuosos (triángulos abiertos, Δ).
Figura 5. Los datos representativos para los lípidos y el transporte de fármacos a los ganglios mesentéricos. Acumulativa de transporte (A) la halofantrina fármaco modelo (Hf,% de dosis), (B) de triglicéridos (TG, mg) y (C) de ácido graso exógeno (% dose), y la tasa de transporte de (D) TG (mg / hr) y Hf (% de dosis / h) en linfático mesentérico con el tiempo tras la administración de una formulación que contiene 200 mg de halofantrina, 40 mg de ácido oleico (con 2 Ci 14 ácido C-oleico) y 7,1 mg 2-monooleına en 5,6 ml de 5 mM de taurocolato de sodio en solución salina tamponada con fosfato (pH 6,9) 0-2 hr. Los datos mostrados son la media ± SEM para n = 4 experimentos exitosos (círculos cerrados, ●) y n = 1 resultado infructuosos (triángulos abiertos, Δ). Transporte de ácidos grasos exógenos no se midió en el experimento de éxito, pero es típicamente baja en experimentos fallidos. Los datos para el experimento fallido se omite desde el Panel D para mayor claridad. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Sin monoolein | Con 2-monolein | |||
| Significar | SEM | Significar | SEM | |
| La halofantrina (% de dosis) | 15.1 | 0.8 | 15 | 1.6 |
| Triglicéridos (mg) | 67 | 4 | 61 | 6 |
| De ácido graso total (mol) | 261 | 16 | 248 | 23 |
| Ácido oleico exógeno (mol) | 82 | 5 | 65 | 6 |
| Endógena de ácidos grasos (mol) | 180 | 17 | 183 | 28 |
Tabla 1. Comparación de los datos de transporte linfáticos acumulados más de 10 horas después de la administración de 200 mg de halofantrina mesentérica conductos linfáticos ratas canuladas en formulaciones que contienen 40 mg de ácido oleico (containing 1 Ci ácido 14 C-oleico) emulsionado en taurocolato de sodio 5 mM en tampón fosfato salino (pH 6,9) con y sin 7,1 mg 2-monooleına. Los datos representan la media ± SEM de n = 4 ratas. No hubo diferencias estadísticamente significativas se observaron entre los 2 grupos.
a En el grupo dosificado con 2-monooleına esto no es una medida exacta de transporte de ácidos grasos endógenos como el ácido oleico unido a la cadena 2-monooleına no se contabiliza en el transporte oleico exógeno medido ácido en la linfa.
b Los datos de halofantrina y el transporte total de ácidos grasos en el grupo dosificado sin 2-monooleına se publicó anteriormente en la figura 5 de referencia 43 y se reproduce aquí en formato de tabla.
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Discussion
El modelo de rata mesentérica linfáticos canulación permite la cuantificación directa de la concentración y la velocidad de transporte de varias células y moléculas (tales como lípidos y fármacos) del intestino a la linfa y los cambios a estos que se producen en respuesta al desafío de diversas sustancias (dieta , antígenos, fármacos, formulaciones, etc.) 10,27 y la enfermedad (cáncer, los virus, la colitis, la resistencia a la insulina, etc.) 5-7. Los componentes recogidos en los ganglios también se pueden usar adicionalmente en experimentos adicionales. Por ejemplo, las células pueden ser cultivadas 44, lipoproteínas fraccionado y linfático o de sus componentes, tales como lipoproteínas o células, cargadas con marcadores incluyendo drogas, radiomarcadores y sondas fluorescentes. Estos pueden ser re-infunden en los animales receptores para evaluar más directamente su función, el metabolismo, la remoción y / o patrones de disposición tejido 45-47. El modelo de la canulación linfáticos de rata tiene varias ventajas sobre la OTHer in vitro, in situ, in silico, y en modelos in vivo que se describe en la introducción. Lo más importante, la canulación es el único método que permite el acceso directo a todo el volumen de los componentes en el fluido linfático. Cuando se realiza en las manos de un operador experimentado el modelo es robusto, reproducibles y experimentales tasas de éxito de> 80% se puede lograr. Sin embargo, la técnica quirúrgica puede ser difícil de dominar inicialmente, en particular en un laboratorio que no está familiarizado con la técnica.
Varios pasos son críticos para el éxito del modelo de canalización linfático mesentérico. El primero es la elección correcta de los instrumentos quirúrgicos y el tipo de cánula y preparación. Nuestro laboratorio utiliza cánulas PE con dimensiones OD 0,8 x 0,5 mm ID. Sin embargo, otros laboratorios han tenido éxito con cánulas de PVC de la misma dimensión 15. Biselado de la punta de la cánula y pre-remojo en un anti-coagulante también ayuda a preveniroclusión de, y la formación de coágulos dentro de, la cánula post-inserción (paso 3,13). El primer paso del procedimiento quirúrgico que algunos operadores encuentran particularmente crítico está tomando cuidado de limpiar las capas de tejido conectivo y grasa por encima del conducto linfático (paso 3,10). Esto ayuda a evitar la inserción de la cánula entre el conducto de tejido linfático y en lugar de en el conducto linfático. Sin embargo, esta etapa de limpieza es difícil, ya que el conducto linfático es frágil y fácil de dañar. Para algunos, este paso y la inserción de la cánula se completan con más éxito con la ayuda de un microscopio quirúrgico aunque otros encontrar un microscopio no es necesario. Al insertar la cánula en el conducto de la dirección y la profundidad de inserción respecto a la punta biselada requiere cierta consideración con el fin de evitar que la cánula está ocluido por la pared del vaso (paso 3,12). Cada operador tiende a encontrar su propia preferencia individual. También es importante evitar la formación de burbujas de aire dentro de la cannula durante la inserción como espacios de aire se aplican de nuevo la presión para el libre flujo de la linfa (paso 3,12). Finalmente, la aplicación de adhesivo veterinaria para asegurar la cánula en su lugar debería estar por debajo del punto de inserción en el conducto como un adhesivo colocado directamente en la parte superior del conducto puede hacer que el vaso a colapsar y ocluir la punta de la cánula (paso 3,14).
La guía inicial más fácil en cuanto a si una cirugía es exitosa es la tasa de flujo de la linfa. Una vez que la cánula está en su lugar linfáticos generalmente comienza a fluir lentamente en el primero 30 min y luego aumenta. Típicamente, las tasas de flujo para canulaciones éxito en ratas> 250 g son> 0,1 ml / h en la primera hora y luego aumentar a> 0,4 ml / hr en estado estacionario como se muestra en la Figura 4. Aunque, por supuesto, esto puede variar dependiendo de la . condición experimental En cuanto a la solución de problemas, si no la linfa fluye a través de la cánula o el caudal es bajo esto puede ser porque:
- la cánula no se insertó correctamente en el conducto
- la cánula está en el conducto pero ocluido por el lado de la pared del vaso
- la cánula está en el conducto pero ocluido por adhesivo aplicado en la posición incorrecta
- la cánula está en el conducto y una burbuja de aire en la cánula está desacelerando el flujo
- ha formado un coágulo dentro de la cánula
La inspección cuidadosa revela generalmente el factor subyacente. Si el operador considera que la cánula no se colocó correctamente en el primer lugar (es decir, la linfa fue nunca fluye) y luego re-inserción es necesario. Si la cánula parece estar en el lugar correcto, entonces el primer factor para comprobar es si una burbuja de aire o un coágulo está presente. Las burbujas de aire generalmente pasar por la cánula como flujos linfáticos y el flujo temporalmente lento. A veces es posible para eliminar las burbujas de aire o coágulos mediante la elaboración de nuevo en la cánula utilizando una aguja de 25 G unido a, por ejemplo, una jeringa de 1 ml. Si no hay ninguna burbuja de aire o coágulo puede ser útil para tratar de re-posicionamiento de la rata y / o girando o tirando de la cánula ligeramente. Esto a veces puede realinear la cánula de tal manera que no se bloquea contra la pared del vaso. Eliminación Ocasionalmente el adhesivo con o sin movimiento pequeño de la cánula permite la linfa fluya de nuevo también. Sin embargo, si todo lo demás falla la cánula debe ser reinsertado. En nuestra experiencia experimentos tienen menos éxito cuando la cánula no se insertó correctamente en el primer intento. Sin embargo, el rescate quirúrgico es posible. Otra complicación que puede surgir es la dificultad en la canulación debido a la variación anatómica entre ratas. Por ejemplo, el conducto linfático mesentérico de vez en cuando pasa en una dirección torpe o hay un conducto linfático accesorio en el lado opuesto de la arteria mesentérica al conducto linfático mesentérico superior más grande. En experimentos que requieren colección de todo el volumen de la linfa que fluye desde el intestino delgado (como es el casoal evaluar lípido total y el transporte del fármaco desde el intestino a través de los vasos linfáticos), el conducto linfático accesorio debe ser ocluido de tal manera que todos los ganglios se dirige al conducto linfático superior. Esto es difícil de lograr, pero puede intentarse atando una sutura alrededor del conducto accesorio o cortar el conducto accesorio y ocluir con adhesivo veterinaria (paso 3.6). La presencia de un conducto linfático accesorio es uno de los principales factores que provoca una insuficiencia experimental en linfáticos experimentos de transporte de drogas. Si el buque accesorio no está totalmente ocluida, el flujo de la linfa y los lípidos y el transporte de drogas son mucho más bajos de lo esperado.
En el protocolo presentado aquí el animal permanece anestesiado durante todo el período de recogida de la linfa. El modelo de rata anestesiada (en lugar de los modelos conscientes descritos a continuación) aumenta el rendimiento experimental como la cirugía y el experimento se puede realizar más de un lugar de varios días y el éxito quirúrgico rcomió es mayor, ya que es más fácil de mantener permeabilidad de la cánula en animales inmovilizados. Anestesia, teóricamente, puede reducir el vaciado gástrico, el procesamiento de los lípidos intestinal y el flujo linfático y el transporte. En nuestra experiencia, sin embargo, los lípidos linfático y el transporte de fármacos son similares en ratas anestesiadas administrado el fármaco directamente en el duodeno (de estómago derivación vaciado) dentro de los vehículos pre-digerida y pre-disperso (sistemas por ejemplo, ácidos grasos y micelares monoglicérido dispersos con tensioactivos ) en comparación con ratas conscientes administra el fármaco a través de una sonda oral en el estómago en una 21,23,27 triglicéridos equivalente. De hecho, la mayoría de los experimentos de transporte intestinal de drogas linfáticos en nuestro laboratorio en los últimos 10 años se han realizado en el modelo anestesiado debido a la mayor rendimiento que se puede lograr. En estos experimentos más a menudo hemos administrado fármacos en formulaciones que contienen ácido graso (por ejemplo, ácido oleico) y el tensioactivo 43.Los ácidos grasos se sintetizan en triglicéridos antes de su incorporación a las lipoproteínas de ganglios intestinales y esto requiere la fuente de los componentes para formar la columna vertebral de glicerol de los triglicéridos (es decir, 2-monoglicérido o glicerol-3-fosfato). Esto sugiere que la administración de ácidos grasos en la ausencia de una fuente de glicerol puede conducir a la reducción de transporte linfático. La administración de ácido graso, sin embargo, permite el cálculo directo de la contribución del ácido graso exógeno administrado y lípidos endógenos a lípidos linfático y el transporte del fármaco 43. Además, 2-monoglicérido es caro y generalmente inestables, ya que isomerises fácilmente para 1-monoglicérido que se digiere a glicerol en el lumen intestinal. En los estudios que aquí se demuestra, además, que los lípidos linfático y el transporte de drogas es equivalente después de la administración de la halofantrina fármaco modelo con un ácido graso (por ejemplo, ácido oleico) y surfactante (sales biliares) formulación, ya sea en el presencia o ausencia de la fuente de glicerol 2-monooleına (Tabla 1). Las fuentes endógenas de glicerol por lo tanto parecen suficientes para apoyar el flujo linfático equivalente y los lípidos y el transporte del fármaco después de la administración de este fármaco modelo con ácidos grasos (por ejemplo, ácido oleico) en ausencia de una fuente de glicerol. Esto proporciona la confianza de que los datos de transporte linfáticos representativos se pueden obtener con las formulaciones de ácidos grasos simples.
El modelo anestesiado se extiende fácilmente a un modelo consciente cuando sea necesario. En los modelos conscientes formulaciones se pueden gavaged directamente en el estómago o infundida en el duodeno o intravenosa, las comparaciones directas se pueden hacer a los estudios farmacocinéticos realizados en los ganglios no canulado animales conscientes y los resultados pueden considerarse más fisiológicamente relevante. El período de tiempo más largo permitido en animales conscientes también tiene la ventaja de permitir la recogida de perfiles farmacocinéticos más completas para drconcentraciones ug en la sangre, mientras que en los experimentos anestesiados, perfiles de sangre son a menudo incompleta, especialmente durante largos fármacos de vida media. Como se describió anteriormente, sin embargo, la tasa de éxito para los estudios de los ganglios canulado conscientes es inferior y experimentos tomar más tiempo para completar. Hay dos tipos de modelos de canulación linfático conscientes descritos en la literatura. En los modelos restringidas conscientes 15, después de la cirugía canulación linfático, el animal es simplemente giró en su parte delantera y se coloca en una limitación adecuado para el resto del experimento con la cánula linfático exteriorizado y se inserta en un tubo de recogida. El animal se deja entonces a recuperar la conciencia y recuperarse del procedimiento quirúrgico O / N. La tasa de éxito con este modelo es muy buena en las manos de los operadores experimentados pero puede ser difícil obtener la aprobación ética para sujetar a los animales para el período prolongado de tiempo requerido para la recogida de la linfa. Un modelo alternativo es donde se recoge la linfade ratas conscientes y con libertad de movimientos. Este modelo se ha detallado anteriormente 25. En este modelo cánulas largas se insertan en el conducto linfático, duodeno y arteria carótida mesentérica. Las cánulas son entonces un túnel por debajo de la piel, exteriorizado en la parte posterior del cuello y colocado a través de un sistema giratorio. La rata se coloca en un arnés unido a la pieza giratoria y se dejó recuperar la conciencia y para recuperarse de la intervención quirúrgica O / N. El animal tiene libre circulación dentro de una jaula metabólica y los ganglios y muestras de sangre se puede recoger de las cánulas externalizados fuera de la jaula.
Canulación linfa mesentérica sigue siendo la única herramienta que permite la evaluación directa de los componentes de los ganglios en su estado naciente. La linfa canulación más a menudo se describe en ratas que la cirugía es menos complejo que los animales más pequeños y grandes, el modelo menos caro que los animales grandes y los resultados parecen razonablemente comparables entre especies 27. El modo de ratal se puede modificar según las necesidades experimental y la tasa de éxito es alta en las manos de los operadores con experiencia. El modelo también puede combinarse con otros in vitro o in vivo para examinar, en detalle, el metabolismo o la función de los componentes de los ganglios intestinales. Una vez establecido el modelo de rata canulada linfático mesentérico es por tanto una poderosa herramienta para evaluar la concentración, el transporte, la función y el metabolismo de diversos parámetros que pasan directamente desde el intestino al sistema linfático (y en muchos casos fluir finalmente a la circulación sistémica).
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile saline | Baxter healthcare | AHB 1307 | Any brand can be used. Example here is Baxter 100 ml saline bags, box of 50 |
| 70 % ethanol in water | Any | Any brand can be used | |
| Chlorhexidine gluconate solution (Microshield 4) | Livingstone International | JJ60243L | Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =JJ60243L |
| Betadine solution | Livingstone International | BU0510 | Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =BU0510 |
| Ilium Ketamil (Ketamine 100 mg/ml) | PROVET VICTORIA | KETA I 1 | http://www.provet.com.au/ |
| Ilium Xylazil (Xylazine 100 mg/ml) | PROVET VICTORIA | TRO-3828 | http://www.provet.com.au/ |
| ACP 10 Injection (Acepromazine 10 mg/ml) | PROVET VICTORIA | VTG-DACP010020 | http://www.provet.com.au/ |
| Sodium pentobarbitone | PROVET VICTORIA | 24529 | Any brand can be used. Example here is Lethabarb® 325 mg/ml sodium pentobarbitone, Virbac Animal Health. http://www.provet.com.au |
| Heparin (35000I.U. in 35 mL) | Sigma Pharmaceuticals | 337220 | http://sigmaco.com.au/ |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E1644 | Any brand can be used. Example here is disodium salt of EDTA from Sigma. |
| Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.96 mm x i.d. 0.58 mm | Microtube extensions | PE8050 | Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.96 x0.58 mm, 30 m |
| Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.8 mm x i.d. 0.5 mm | Microtube extensions | PE9658 | Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.8 x0.5 mm, 30 m |
| Ruler | Any | Any brand can be used | |
| Markers | Any | Any brand can be used | |
| Cigarette lighter | Any | Any brand can be used | |
| Veterinary adhesive | Any | Any brand can be used | |
| 23 gauge needles | Livingstone International | DN23GX0.75LV | Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 23GX0.75inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT= 6&search=DN23GX0.75LV |
| 25 gauge needles | Livingstone International | DN25GX1.0LV | Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 25GX1.0inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search= DN25GX1.0LV |
| 1 ml syringe | Livingstone International | T3SS01TA | Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 1 ml Slip Tuberculin 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS01TA |
| 10 ml syringe | Livingstone International | T3SS10SA | Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 10 ml Slip 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS10SA |
| Gauze swabs | Livingstone International | GSC075 | Any brand can be used and cut to required size. Example here is gauze swabs cotton filled 7.5x7.5 cm, 8 ply. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =GSC075 |
| Cotton buds | Livingstone International | CTAST075DP | Any brand can be used. Example here is Livingstone cotton applicator plastic double tipped. 75MM. 100/PK. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =CTAST075DP |
| Heating pad | Ratek | WT1 | Any brand that keeps temperature at 37C can be used. Example here is Ratek warming tray. |
| Surgical light | Harvard Apparatus | 72-0215 with 72-0267 | Any brand can be used. Example here is Harvard apparatus V-Lux 1000 Cold Light Source with Bifurcated Gooseneck Light Guide, Black, 4.7 mm fiber diameter (each arm). http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_50601_ -1_HAI_ProductDetail and http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_35487_ -1_HAI_ProductDetail___ |
| Surgical microscope | Zeiss | 495005-0014-000 | Any brand can be used. Example here is Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000-C with Stand S Double Spot and KL 300 LED. https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=e&i=10143 |
| Silk suture | Livingstone International | DTSK163019F4 | Any brand can be used. Example here is 3/8 Circle Reverse Cut Silk Suture 3/0 Thread 19mm. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =DTSK163019F4 |
| Scalpel blades | Fine Science Tools (FST) | 10020-00 | Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Blade #20. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191 |
| Scalpel handle | Fine Science Tools (FST) | 10004-13 | Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Handle #4. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&CategoryId=51 |
| 1 x Small surgical scissors | Fine Science Tools (FST) | 14060-09 | Any brand can be used. Example here is FST Fine Scissors, 9 cm with 21 mm cutting edge, sharp, straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&CategoryId=17 |
| 2 x Forceps with serrated curved tip | Fine Science Tools (FST) | 11001-13 | Any brand can be used. Example here is FST 13 cm standard pattern forceps with curved 2.8x1.4 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&CategoryId=32 |
| 1 x Iridectomy scissors | Fine Science Tools (FST) | 15000-08 | Any brand can be used. Example here is FST Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge, Straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=17&CategoryId=16 |
| 1 x Forceps with straight serated tip | Fine Science Tools (FST) | 11650-10 | Any brand can be used. Example here is FST Graefe 10 cm straight with serrated 1 x 0.99 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=390&CategoryId=32 |
| 1 x Forceps with smooth sharp straight fine tip | Fine Science Tools (FST) | 11251-10 | Any brand can be used. Example here is FST Dumont #5 forceps straight 11cm with 0.08 x 0.04mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=335&CategoryId=29 |
| 1 x Forceps with smooth fine curved forceps | Fine Science Tools (FST) | 11063-07 | Any brand can be used. Example here is FST Delicate Forceps 9 cm with smooth 0.4 x 0.3mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=360 |
| 2 x Hemostats | Fine Science Tools (FST) | 13010-12 | Any brand can be used. Not all operators use the hemostats. Example is FST 12 cm Micro-Mosquito Hemostats with 20 mm length x 1.3 mm width serrated, straight tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&CategoryId=33 |
| 1 x Suture needle holder | Fine Science Tools (FST) | 12001-13 | Any brand can be used. Example here is FST 13cm Hasley Needle Holder with 16 mm length x 1.9 mm width tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&CategoryId=70 |
| 1 x Artery clamp | Fine Science Tools (FST) | 18050-28 | Any brand can be used. Example here is FST Bulldog Serrefines straight, 28 mm long, 9x1.6 mm jaw dimension with medium clamp press. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=270&CategoryId=82 |
| Oleic acid | Sigma Aldrich | O1008 | When required, any brand can be used. Example here is 99% pure oleic acid. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/o1008?lang=en®ion=AU |
| 14C-oleic acid | Perkin | NEC317050UC | Any brand can be used. Example here is Oleic Acid, [1-14C]-, 50µCi (1.85MBq). http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/NEC317050UC |
| Sodium taurocholate | Sigma Aldrich | T4009 | Any brand can be used. Example here is taurocholic acid sodium salt hydrate ≥95% (TLC) . http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4009?lang=en®ion=AU |
| Halofantrine | Glaxo Smith Kline | Halofantrine was kindly provided as a gift from Glaxo Smith Kline | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | 71507 | Any brand can be used. Example here is sodium phosphate monobasic monohydrate, BioXtra, for molecular biology, >99.5%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71643?lang=en®ion=AU |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | 71643 | Any brand can be used. Example here is sodium phosphate dibasic dihydrate, BioUltra, for molecular biology, >99%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71507?lang=en®ion=AU |
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