Protocol
NB: Alle in dit protocol methoden zijn door de Institutional Animal Care en gebruik Comite.
1. Voorbereiding van de operatietafel
- Stel de verwarming pad met recirculerende warm water op de chirurgische tafel, onder de dissectie microscoop. Plaats de roestvrij stalen plaat op de verwarming pad. Plaats een steriele absorberende pad op de bodemplaat en de verwarming pad.
- Schik steriele chirurgische instrumenten op een aangrenzend steriele absorberende pad. Verzamel twee paar hoekige-fijne tip pincet, twee paar schuine pincet, drie hemostatische tang, twee oprolmechanismen draden, kleine chirurgische schaar, micro-schaar, een angioplastie draad (0,15 inch diameter) en drie 6-inch segmenten van 6,0 zijden hechtdraad .
- Buig het ronde uiteinde van de angioplastiek draad aan de kromming van de femorale slagader passen. Dit zal het gemakkelijker maken om de draad vooruit tijdens de operatie.
2. Bereiding vanMuis voor Heelkunde
- Verdoven een muis door continue inademing van 2,5% isofluraan. Zorg ervoor dat u de status van het dier te volgen tijdens de gehele procedure. Voer een snuifje test van de muis voet om te bevestigen dat het volledig is verdoofd. Zorg ervoor dat het dier niet beweegt wanneer de pinch test wordt toegediend.
- Breng een smerende zalf ogen van het dier om uitdroging te voorkomen. Zet het dier in rugligging op het absorberende kussen met behulp van chirurgische tape. Blijven toedienen van 2,5% isofluraan via neuskegel.
- Met behulp van een ontharingscrème, verwijder bont van het been en buik om het midden van de lijn. Spoel de huid grondig met water. Ontharen kan worden uitgevoerd op een dag van tevoren van de operatie. Merk op dat excessieve behandeling met de crème kan leiden tot irritatie van de huid.
- Vlak voor de operatie toepassing povidonjood op het onthaarde gebied met een wattenstaafje de huid steriliseren. Spoel de onthaarde huid met 70% ethanol en droogmet een steriel wattenstaafje. Herhaal dit 3 keer.
- Dien een preoperatieve dosis van 5 mg / kg van carprofen via subcutane injectie.
3. Isolatie van de femorale slagader
- Met kleine chirurgische schaar, maak een gebogen insnijding in de huid over de femorale slagader. Bot te ontleden en te beveiligen omringende weefsels met behulp van retractors magnetische oprolmechanisme fixators de dijbeenslagader lokaliseren. Bevochtig de weefsels regelmatig met een zoutoplossing voor irrigatie Breng zoutoplossing met behulp van een steriel wattenstaafje.
- Isoleer de femorale slagader met een tang. Voorzichtig scheiden de zenuw van de vasculaire bundel met behulp van fijne punt tang. Niet te beschadigen de ader, en niet de zenuw niet beschadigen. Duw de zenuw weg van de bundel om te voorkomen dat het stimuleren van het.
- Voorzichtig scheiden de dijader van de femorale slagader, het lokaliseren van de femorale bifurcatie. Het gebied van de bifurcatie bijzonder moeilijk te ontleden.
- Posterior tot aan de splitsing, loop een 6,0 zijden hechtdraad onder de femorale slagader en veilig met een hemostat. Dit proximale hechtdraad wordt gebruikt om de bloedstroom in de slagader te beperken.
Opmerking: Er is een kleine variatie in de band bij het uitvoeren van de ligatie methode versus de cauterisatie methode (zie figuur 1 en figuur 2). - Distaal van de splitsing, lus 6,0 zijden hechtdraad onder de femorale slagader en veilig met een hemostat. Het distale hechtdraad helpt bij het positioneren van de slagader.
- Loop twee hechtingen onder de gespierde tak van de arteria femoralis, pre-bind ze en veilig met een hemostat. Vergeet niet om de weefsels te bevochtigen met een zoutoplossing. Als het uitvoeren van de cautery methode draad blessure, slechts één lus hechtdraad is noodzakelijk op de gespierde tak.
4. Uitvoering van Femorale Artery Wire Injury
- Beperken bloedstroom in de femorale slagader door het trekken van de proximale hechtdraad. Trek lichtjes aan de distale Hemostop en vaatklem veiligstellen van de afslag naar de site voor de arteriotomie bloot. Afbinden de gespierde tak door koppelverkoop de hechtdraad omheen.
LET OP: Het opheffen van de slagader naar boven zal effectiever te beperken bloedstroom dan trekken horizontaal alleen. - Sever de kleine tak met de cauterisatie tussen de twee hechtingen. Met behulp van micro-schaar, het uitvoeren van een arteriotomie in de zijtak van de splitsing. Gebruik een tang in evenwicht op een rol van chirurgische tape om de micro-schaar te stabiliseren.
- Bevestigen de aanwezigheid van de arteriotomie behulp van fijne punt tang. Til de opening van de arteriotomie met de tang. Breng het afgeronde uiteinde van de draad in de arteriotomie behulp van een tang. Om vooruitgang van de draad vergemakkelijken, voeg een of twee druppels van lidocaïne voor de regio met een injectiespuit.
- Wanneer de draad van de proximale hechtdraad werd bereikt, laat de hechtdraad en stel het zo dat het de vooruitgang van de draad niet kan belemmeren. Steek de draad totdat het niet verder kan bevorderen. De tip van the draad moet stoppen in het gebied van het inguinale ligament.
- Laat de draad in de femorale arterie gedurende één minuut. Na een minuut intrekken en vooraf de draad in een zagende beweging tien keer te verwonden en beroven het endotheel van de femorale slagader. Verwondingen van minder ernst, verminderen het aantal keren dat de draad wordt getrokken en uit de slagader of laat de draad in de slagader voor slechts 1 min.
- Trek de draad langzaam. Wanneer het ronde uiteinde van de draad de proximale hechtdraad voorbij beperken stroom in de slagader door aan het proximale hechtdraad. Volledig terug te trekken van de draad.
5. ligateren de Gespierd Branch
- Haal de resterende hechtdraad op de gespierde tak. Hiermee wordt voorkomen dat bloeden uit de arteriotomie. Terug stroom naar de gespierde tak, en bevestigen dat het bloed niet lekt uit het. Snijd de uiteinden van de hechtingen op de gespierde tak.
6. Alternatieve methode: Gelokaliseerde Cauterization van de arteriotomie
Opmerking: Een alternatieve benadering kan worden genomen om ligatie van de spier tak te vermijden en vasculaire toegang via de grotere belangrijkste femorale slagader.
- Vanaf 4.1, beperken stroom naar de femorale slagader door aan het proximale hechtdraad. Trek de distale hechtdraad en de hechtdraad waarmee de spier tak iets naar de site voor de arteriotomie (Figuur 1 en Figuur 2) bloot.
- Met behulp van micro-schaar, het uitvoeren van een arteriotomie op de tak punt van de femorale slagader en de gespierde tak. Wanneer de incisie wordt gemaakt in de zijkant van de slagader, kan het eenvoudiger te verharden worden. Gebruik een tang in evenwicht op een rol van chirurgische tape om de micro-schaar te stabiliseren.
- Om het succes van cauterisatie testen herstellen stroom naar de femorale slagader door de proximale hechting los. Als bloeden optreedt van de arteriotomie, herhaal de cauterisatie. Als de cautery succesvol is, zal de bloedstroom worden hergebruiktopgeslagen distaal van de arteriotomie.
- Introduceer de draad en het uitvoeren van de draad letsel zoals beschreven in hoofdstuk 4.
- Blijven beperken bloedstroom in de femorale slagader. Verhit een-fijne getipt cautery minstens 6 centimeter afstand van de muis. Zoals de cautery tip afkoelt, pas het licht kant van de arteriotomie om de incisie te sluiten.
- Om het succes van cauterisatie testen herstellen stroom naar de femorale slagader door de proximale hechting los. Als bloeden optreedt van de arteriotomie, herhaal de cauterisatie. Als de cautery succesvol is, zal de bloedstroom distale worden hersteld naar de arteriotomie. Verwijder de tijdelijke proximale en distale banden.
7. Implantatie van Perivasculaire Drug Delivery Patch
- Maak een perivasculaire medicijn patch kan worden gemaakt zoals beschreven in eerdere studies 11 of met behulp van vergelijkbare methoden. Stompe hoeken van de barrière gebied van de geneesmiddelafgifte patch met een steriele schaar
- Plaats de drug delivery patch op de benadeelde dijbeenslagader met de drugs vrijgeven kant naar de slagader. Indien nodig, een tang om de positie van de patch te verbeteren.
8. wondsluiting en herstelwet
- Sluit de wond met een eenvoudige onderbroken hechtingen bestaande uit vierkante knopen. Een discontinue hechtdraad verlengt wonden in het geval dat het dier probeert de hechtingen te verwijderen.
- Schakel de anesthesie en verwijder het dier uit de set-up. Laat het dier te laten bekomen van de opwarming pad.
- Doorgaan met het herstel van de muis te controleren. Controleer de incisieplaats elke dag zodat deze gesloten blijft. Voor de behandeling van postoperatieve pijn, toedienen van een subcutane injectie van 5 mg / kg van carprofen elke 12 uur na de operatie en elke 12 uur gedurende 2 dagen. Als de pijn blijft na de eerste 2 dagen, raadpleeg dan een dierenarts voor een routebeschrijving op verdere pijnmedicatie.
9. Oogsten dijbeenslagaders voor Histologie
- Op 28 dagen na de operatie, uitgevoerd kooldioxide euthanasie op de muis.
OPMERKING: De geschikte stroomsnelheid van kooldioxide moet verdringen 10-30% van de kamer per minuut en is afhankelijk van de grootte van de gebruikte kamer. Het snijden van het membraan en cardiale punctie moet worden uitgevoerd als een secundaire methode euthanasie. - Zet de muis in rugligging met behulp van chirurgische tape. Maak een insnijding over de femoralis, waar de initiële chirurgische incisie werd gemaakt.
- Voor zowel de gewonde slagader en de niet gewonde slagader van het contralaterale been, bot te ontleden en te beveiligen omliggende weefsels met behulp van retractors en magnetische oprolmechanisme fixators de dijbeenslagader lokaliseren. Bevochtig de weefsels regelmatig met een zoutoplossing voor irrigatie. Solliciteer zoutoplossing met behulp van een steriel wattenstaafje. Zorg ervoor dat de slagader niet beschadigen.
- Na de femorale arterie werd geïsoleerd uit de plaats van de oorspronkelijke arteriotomie de abdominale aorta, das een segment van zijden hechtdraad in de buurt van de oorspronkelijke site van de arteriotomie. Deze hechting zal helpen de meest distale uiteinde van de femorale slagader en gemak behandeling van het monster.
- Met behulp van de micro-dissectie schaar om de dijbeenslagader accijnzen. Maak een insnijding distaal van de hechtdraad. Maak de andere insnijding op het tegenoverliggende uiteinde van de femorale slagader, naast de abdominale aorta.
- Breng de gesneden slagader om een glas petrischaaltje met een zoutoplossing. Ontleden de slagader verder om overtollig bindweefsel of vet te verwijderen. Verwijder voorzichtig het bloed uit het lumen door spoelen met een zoutoplossing.
- Breng de slagader aan een flacon van 10% gebufferde formaline. Bewaar de flacon bij 4 ° C onder zacht schommelen 48 uur.
- Breng de vaste slagader 70% ethanol, opslaan totdat het wordt verwerkt voor histologie.
- Insluiten de slagader in paraffine blokken en sectie van de blokken voor het kleuren.
- Voeren histochemische en immunochemische kleuring aan de omvang van de schade en de intima hyp beoordelenerplasia.
OPMERKING: Voor de representatieve resultaten, gebruikten we Hematoxylin en eosine om de kernen en de algemene morfologie of een Movat's Pentachrome vlek visualiseren aan de elastische lamellen en andere arteriële componenten te visualiseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgende draad letsel, neointimale hyperplasie ontwikkelt in de tijd en wordt na 14 tot 28 dagen meestal onderzocht. De in dit werk beschreven leiden robuuste generatie intimale hyperplasie bij muizen zoals de histologische resultaten in Figuur 3 technieken. Een niet-beschadigde femorale slagader intact elastische lamellen en een normale dikte en omtrek demonstreren. Een gewonde dijbeenslagader zal hyperplasie tonen, gedegradeerd elastische lamellen en demonstreren opnieuw endotheelvorming op latere tijdstippen. Re-endotheel is gewoonlijk voltooid in ongeveer 21 dagen, maar dit is afhankelijk van de achtergrond stam van muizen gebruikt en kan beoordeeld worden met immunokleuring voor endotheliale markers op secties of, bij voorkeur, gemeten en face preparaten met blauwe kleurstof van de Evan's, scanning elektronenmicroscopie of immunokleuring met confocale microscopie op en face preparaten van de slagader. 17,18 Voor kwantificering van intimale hyperplasie hetbest de intimale gebied of intimale tot media verhouding, op drie plaatsen langs de verwonde slagader om rekening te houden potentiaalvariaties langs de lengte van het gewonde gebied van de slagader.
Figuur 1: Foto van de kritische stappen van de twee methoden voor draad schade in de femorale slagader Een vergelijking van de stappen voor de ligatie methode (boven) de cauterisatie methode (onder) voor het uitvoeren draad letsel.. In de ligatie werkwijze, de twee hechtingen waarmee de spier branch vooraf gebonden zodat ze kunnen worden verscherpt om de spieren branch ligeren. De meer distale van de twee gespierde tak hechtingen vastzit. De arteriotomie en draad inbrengen worden uitgevoerd in de gespierde tak. Na het letsel wordt uitgevoerd, wordt de resterende hechtdraad op de gespierde tak aangescherpt en getrimd. In de cauterisatie werkwijze, maar een suture zit in een lus onder de gespierde tak. De arteriotomie en draad inbrengen worden uitgevoerd in het kantoor punt van de gespierde tak van de arteria femoralis. Na het letsel wordt uitgevoerd, wordt de incisie dichtgeschroeid zonder ligateren ofwel de femorale slagader of gespierde tak. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Hogere vergroting foto van de kritische stappen van de twee technieken voor draad letsel Close-up vergelijking van stappen voor de ligatie methode (boven) de cauterisatie methode (onder).. De locatie van de arteriotomie wordt afgebakend met de stippellijn. Klik hier om een grotere versie van deze fotofiguur.
Figuur 3:. Representatieve histologische resultaten van draad letsel 14 dagen na de procedure histologische van de slagaders werden gekleurd met hematoxyline en eosine (boven) en Movat's Pentachrome kleuring (onder). Geëtiketteerd in het beeld zijn de lumen (L), intima (I) en elastische lamina (EL).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight spring wire, 0.15” diameter | Cook | G02426 | |
| High Temperature cautery | Bovie Medical Corp. | HIT1 | |
| High-temperature fine tip for cautery | Bovie Medical Corp. | H101 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-13 | For performance of arteriotomy |
| Angled fine-tipped forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | For blunt dissection of vascular bundle |
| Angled forceps | Roboz | RS-5069 | For clearing tissues |
| Surgical scissors | Roboz | RS-5840 | For cutting skin |
| Retractor | Fine Science Tools | 18200-10 | |
| Retractor wire | Fine Science Tools | 18200-05 | Attached to retractor |
| Base plate | Fine Science Tools | 18200-03 | For use with retractor |
| Magnetic retractor fixator | Fine Science Tools | 18200-01 | |
| Needle Holder | Roboz | RS-7822 | |
| Hemostatic forceps | Biomedical Research Instruments, Inc. | 34-1000 | |
| Dissecting microscope | Meiji Techno | EMZ-5TR | |
| Microscope light source | Meiji Techno | FT191 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-500 | For maintaining mouse body temperature |
| Reusable heating pad | Gaymar | TP-R 22G | For maintaining mouse body temperature |
| Lidocaine | Various | ||
| 4.0 Vicryl suture with half circle needle | Ethicon | J494G | For post-surgical wound closure |
| Sterile cotton-tipped applicators | Puritan | 25-806-2WC | For application of depilatory cream and absorbing fluids |
| Depilatory cream | Nair | ||
| Isoflurane | Various | ||
| Betadine | Various | ||
| 70% ethanol | Various | ||
| 6.0 braided silk suture | Teleflex Medical | 4-S | For isolation of femoral artery during surgery |
| 0.9% sodium chloride | Various | For irrigating tissues | |
| Gel eye lubricant | Various | ||
| Glass Petri dish | Pyrex | 3160-60 | For femoral artery harvest |
| 10% buffered formalin | Various | For fixation of femoral artery | |
| 70% ethanol | Various | For fixation of femoral artery | |
| Bouin's fluid | Electron Microscopy Sciences | For Movat's Pentachrome staining | |
| Alcian blue, 1% | Electron Microscopy Sciences | 26385-01 | For Movat's Pentachrome staining |
| Alkaline alcohol | Electron Microscopy Sciences | 26385-02 | For Movat's Pentachrome staining |
| Orcein, 0.2% | Electron Microscopy Sciences | 26385-03 | For Movat's Pentachrome staining |
| Hematoxylin alcoholic, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26385-04 | For Movat's Pentachrome staining |
| Ferric chloride, 10% | Electron Microscopy Sciences | 26385-05 | For Movat's Pentachrome staining |
| Lugol's Iodine | Electron Microscopy Sciences | 26385-06 | For Movat's Pentachrome staining |
| Woodstain scarlet-acid fuchsin working solution | Electron Microscopy Sciences | 26385-07 | For Movat's Pentachrome staining |
| Acetic acid, 0.5% | Electron Microscopy Sciences | Various | For Movat's Pentachrome staining |
| Phosphotungstic acid, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26385-09 | For Movat's Pentachrome staining |
| Alcoholic saffron, 6% | Electron Microscopy Sciences | 26385-10 | For Movat's Pentachrome staining |
References
- Hoffmann, R., Mintz, G. S. Coronary in-stent restenosis - predictors, treatment and prevention. Eur Heart J. 21 (21), 1739-1749 (2000).
- Erbel, R., et al. Coronary-artery stenting compared with balloon angioplasty for restenosis after initial balloon angioplasty. Restenosis Stent Study Group. N Engl J Med. 339 (23), 1672-1678 (1998).
- Farooq, V., Gogas, B. D., Serruys, P. W. Restenosis: delineating the numerous causes of drug-eluting stent restenosis. Circ Cardiovasc Interv. 4 (2), 195-205 (2011).
- Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. Coronary stents: historical development, current status and future directions. Br Med Bull. 106, 193-211 (2013).
- Garg, S., Serruys, P. W.
- Park, S. J., Kim, Y. H. Current status of percutaneous coronary intervention with drug-eluting stents in Asia. Circulation. 118 (25), 2730-2737 (2008).
- Alfonso, F. Treatment of drug-eluting stent restenosis the new pilgrimage: quo vadis. J Am Coll Cardiol. 55 (24), 2717-2720 (2010).
- Dake, M. D., et al. Paclitaxel-eluting stents show superiority to balloon angioplasty and bare metal stents in femoropopliteal disease: twelve-month Zilver PTX randomized study results. Circ Cardiovasc Interv. 4 (5), 495-504 (2011).
- Bosiers, M., et al. Results of the Protege EverFlex 200-mm-long nitinol stent (ev3) in TASC C and D femoropopliteal lesions. J Vasc Surg. 54 (4), 1042-1050 (2011).
- Duda, S. H., et al. Drug-eluting and bare nitinol stents for the treatment of atherosclerotic lesions in the superficial femoral artery: long-term results from the SIROCCO trial. J Endovasc Ther. 13 (6), 701-710 (2006).
- Kumar, A., Lindner, V. Remodeling with neointima formation in the mouse carotid artery after cessation of blood flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17 (10), 2238-2244 (1997).
- Sata, M., et al. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32 (11), 2097-2104 (2000).
- Roque, M., et al. Mouse model of femoral artery denudation injury associated with the rapid accumulation of adhesion molecules on the luminal surface and recruitment of neutrophils. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20 (2), 335-342 (2000).
- Lindner, V., Fingerle, J., Reidy, M. A.
- Edelman, E. R., Adams, D. H., Karnovsky, M. J. Effect of controlled adventitial heparin delivery on smooth muscle cell proliferation following endothelial injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (10), 3773-3777 (1990).
- Stemerman, M. B., Ross, R. Experimental arteriosclerosis. I. Fibrous plaque formation in primates, an electron microscope study. J Exp Med. 136 (4), 769-789 (1972).
- Brouchet, L., et al. Estradiol accelerates reendothelialization in mouse carotid artery through estrogen receptor-alpha but not estrogen receptor-beta. Circulation. 103 (3), 423-428 (2001).
- Filipe, C., et al. Estradiol accelerates endothelial healing through the retrograde commitment of uninjured endothelium. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2822-H2830 (2008).
- Feuls, R., et al. Microvascular denudation of the femoral artery of the mouse as a model for restenosis. Rofo. 175 (7), 952-957 (2003).
- Holt, A. W., Tulis, D. A. Experimental Rat and Mouse Carotid Artery Surgery: Injury & Remodeling Studies. ISRN Minim Invasive Surg. 2013, (2013).
- Iafrati, M. D., et al. Estrogen inhibits the vascular injury response in estrogen receptor alpha-deficient mice. Nat Med. 3 (5), 545-548 (1997).
- Sullivan, T. R., et al. Estrogen inhibits the response-to-injury in a mouse carotid artery model. J Clin Invest. 96 (5), 2482-2488 (1995).
- Yin, Y., Zhao, X., Fang, Y., Huang, L. Carotid artery wire injury mouse model with a nonmicrosurgical procedure. Vascular. 18 (4), 221-226 (2010).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 297 (4), H1535-H1543 (2009).
- Nam, D., et al. A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium. J Vis Exp. (40), (2010).
- Kuhlmann, M. T., et al. Implantation of a carotid cuff for triggering shear-stress induced atherosclerosis in mice. J Vis Exp. (59), (2012).
- Carmeliet, P., et al. Vascular wound healing and neointima formation induced by perivascular electric injury in mice. Am J Pathol. 150 (2), 761-776 (1997).
