Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

התאמת שינויים גנטיים ספציפי DNA מתילציה עם ביטוי ותעתיק פעילות של astrocytic Published: September 26, 2015 doi: 10.3791/52406
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cell Developmental and Integrative Biology, University of Alabama at Birmingham

Protocol

כל בעלי החיים טופלו בהתאם למכונים הלאומי לבריאות הנחיות. ועדת הטיפול בבעלי חיים והשימוש באוניברסיטת אלבמה בבירמינגהם אישרה שימוש בבעלי חיים.

1. קבלת רנ"א ודנ"א ממועשרת astrocytic אוכלוסייה באמצעות Cell הופעל פלורסנט מיון (FACS) של האסטרוציטים מרקמות המוח כולו

  1. בעלי חיים שקט ורגוע עם CO 2 דקות 1 ולאחר מכן במהירות לערוף. לנתח הקורטקס כמתואר באל אלבוקרקי et, 26.; אין צורך להסיר את קרומי המוח.
    הערה: חולדות מהונדסות מבטא eGFP תחת S100β (סמן astrocyte) אמרגן נוצרו על ידי Itakura et al 27 ומנוצלות למיון FACS של האסטרוציטים..
  2. הכן homogenate המוח כולו באמצעות ערכת ניתוק פפאין בתנאים שאינם סטרילי על פי הפרוטוקול של היצרן. חום להפעיל פפאין על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 10 דקות. הערה:פתרון פפאין מסופק על ידי יצרן ומכיל L-ציסטאין וEDTA (ראה טבלה של חומרים).
    1. לחתוך או DREMEL חור בחלק העליון של צינור חרוטי 50 מיליליטר כדי לאפשר צינורות ביצוע 95% O 2: 5% CO 2 להיות מוזנים לתוך צינור חרוטי סגור (איור 1 א). הנח הקורטקס גזור בצלחת תרבות 10mm המכיל תקשורת דיסוציאציה (ממ בתוספת גלוקוז 20mm ופניצילין / סטרפטומיצין (500 U / ml) וequilibrated לO 95% 2: 5% CO 2) ולהשתמש בסכין גילוח נקי לברר ברקמה לתוך 1 x 1 מ"מ 2 חתיכות.
  3. רקמת העברה באמצעות 10 מיליליטר pipetman הידני לצינור חרוטי 50 מיליליטר מכיל פתרון פפאין. לאפשר לרקמות להתיישב לתחתית פיפטה העברה לפני הפריקה כדי למזער את הכמות של תקשורת ניתוק בוצעה על. שמור פתרון פפאין equilibrated עד 95% O 2: 5% CO 2 באמצעות חילוף גזי משטח למשך הדגירה. האם לא soluti פפאין בועהעל. דגירה רקמה למשך 20 דקות ב -37 ° C אמבט מים.
  4. הדגירה הבאה בפתרון פפאין, רקמת triturate 10 פעמים עם פיפטה 10 מיליליטר העברה במהירות איטית. השעיה תא מעונן צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 5 דקות ב RT.
    1. לאזן פתרון DNase / אלבומין מעכב (המסופק על ידי יצרן) באמצעות חילוף גזי משטח מחדש להשעות תאי טבליות ב 3 מיליליטר של פתרון / מעכב אלבומין DNase. הכן שיפוע צפיפות רציפה מסחרי בהתאם להוראות יצרן.
  5. ספין שיפוע צפיפות רציף XG ב 1000 במשך 6 דקות. בודד תאים ניתק מהחלק התחתון של צינור על ידי מציצת גלולה תחתונה בעזרת פיפטה.
  6. להשעות מחדש תאים ניתק ב2-3 מיליליטר של DPBS עם 0.02% אלבומין בסרום שור ו1 מ"ג / מיליליטר DNase או HEPES העדיף שנאגרו תקשורת והתרבות. עובר דרך 40 מיקרומטר סינון לפני FACS (איור 2 א). שמור את התאים על קרח עד מיון.
    1. בצע FACS 28. </ Li>
    2. תאים גלולה ב 1.5 מיליליטר צינורות צנטריפוגה XG ב 2000 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: יכולים להיות מנוצלים האסטרוציטים pelleted מייד או נשמרו ב-80 ° C עד מיצוי DNA.
  7. לחלץ RNA ו- DNA בשיטת בידוד מועדף 29 30. להעריך RNA וריכוז ה- DNA ואיכות באמצעות ספקטרופוטומטר וbioanalyzer 31.
    הערה: לנצל רק RNA באיכות גבוהה וDNA בשלבים הבאים, 260/280 = 2.0-2.2 ו1.8-1.9, בהתאמה. ניתוח bioanalyzer הוא חיוני כדי להעריך לשפלת RNA או פיצול ה- DNA. RNA או DNA יכול להיות מנוצל באופן מיידי או מאוחסן ב-80 ° C או -20 ° C, בהתאמה ללימודים שלאחר מכן.

2. הערכת מצב DNA מתילציה של גן באמצעות מתילציה רגישה רזולוציה גבוהה ממיסים ניתוח (MS-HRMA)

  1. הזן את רצף גן של עניין לתוכנת מיפוי מתילציה המקוון העדיפה לזהות כל איי CPG בגןעניין 32.
    1. פריימרים עיצוב נגד bisulfite המירו רצף ה- DNA 33 ולהגביר באמצעות DNA פולימרז המועדף על פי הפרוטוקול של היצרן. ודא גודל מוצר מוגבר על ידי פועל 1% ג'ל DNA agarose ב 100 V 45 דקות. פריימרים חנות בריכוז מניות של 20 מיקרומטר ב-20 ° C.
  2. ביסולפיט להמיר 500-1,000 ng של DNA של כל דגימת DNA והמפוגל סטנדרטים החל 0-100% מאותו המין של בעלי החיים 34. דגימות Elute לספק ריכוז של 20 ng / μl. ודא ריכוז של ה- DNA המרה bisulfite באמצעות ספקטרופוטומטר 31.
  3. 20 תגובות μl התקנה להגברת MS-HRM באמצעות DNA פולימרז מועדף ופריימרים בריכוז 5 מיקרומטר לפי טבלת 1 ו -2. הפעילו את כל הדגימות, לרבות תקני ה- DNA ומפוגלים FACS, בשלושה עותקים.
  4. בהתאם לתוכנת ניתוח, שנקבע לפני ואחרי להתחיל ולהפסיק פרמטריםסביב המעברים של עקום להמיס. התחלה שנקבע מראש להמיס ופרמטרי תחנה מראש להמיס כל כך ההבדל בין השניים הוא 0.2-0.5 מעלות צלזיוס. הגדר תחילת פוסט-להמיס ופוסט-להמיס להפסיק באופן דומה. לחלץ נתונים הבדל טמפרטורת שיא עבור כל דגימה.
  5. שימוש בתקני אחוזים מפוגלים (y-ערך) והבדלים ביניהם המקבילים ממוצע טמפרטורת שיא (x-ערך) ליצור משוואת רגרסיה ליניארית (איור 3 א-B, שולחן 3-4). השתמש במשוואת רגרסיה ליניארית זה להעריך מצב מתילציה של דגימות ידועות 35.

3. הערכת פעילות יזם מפוגל-Hyper באמצעות השימוש בAssay בלוציפראז

  1. לזהות איי CPG של גן המטרה (שלב 2.1). PCR להגביר אזורים של עניין 36 וכפיל במעלה הזרם של גן הכתב בלוציפראז luc2 Firefly לייצר פלסמידים CPG-אי-luc2 37.
  2. Linearize 30 מיקרוגרם של פלסמיד CPG-אי-luc2 באמצעות הגבלהעיכול אנזים 38. ודאו אתרים להגבלה לעכל ולהימנע מקיצוצים כפולים באמצעות תוכנה חותך מועדף 38. חום להשבית אנזימים בטמפרטורה מתאימה ומשך הבא עיכול על פי הפרוטוקול של היצרן. הפסד מינימאלי של DNA מתרחש במהלך שלב linearization.
  3. פלסמידים Methylate לינארית באמצעות O methylase CPG (M.Sssl) / N על 30 מעלות צלזיוס או להשאיר פרוטוקול היצרן הבא שלא טופל למעט ההתאמות הבאות.
  4. בצע 50 תגובות μl.
  5. השתמש 5 יחידות של methylase CPG לmethylate 700 ננוגרם של פלסמיד לינארית.
  6. הפעל תגובות O / N ל13-19 שעות.
  7. בעקבות תגובת methylase CPG, לבצע ניקוי DNA באמצעות סטנדרטי, מסחרי קרום סיליקה ג'ל זמין לנקות ערכה על פי הפרוטוקול של היצרן. הפסדים משמעותיים של ה- DNA להתרחש בעקבות תגובת methylase CPG, 30-60% הפסד.
  8. ודא מתילציה של פלסמידים באמצעות הגבלת HPA השני לעכל. קח 1 מיקרוגרם של ה- DNA מפוגל או שאינו מפוגל והגבלה לעכל עם HPA השני עבור שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס. השתמש 5-10 יחידות של HPA השני עבור כל ה- DNA מיקרוגרם. בעקבות עיכול HPA השני, לבצע ניקוי DNA באמצעות ערכה לנקות מועדפת, קרום סיליקה ג'ל זמין מסחרי. להפעיל את שני פלסמידים מפוגלים ואינם מפוגלים CPG על 1% ג'ל DNA agarose במאגר טה או TBE ב 100 V 45 דקות להדמיה (איור 4).
  9. פלסמידים נושא שני מפוגלים ו- מפוגלים שאינו לעיכול כפול עם אנזימי הגבלה מתאימים לשחרר באורך מלא לוק 2 (וקטור) ואי CPG (להוסיף) שברי 38. בצע O הכפול העיכול / N בטמפרטורה מתאימה ואנזימי חום להשבית הבא עיכול על פי הפרוטוקול של היצרן. הפסד מינימאלי של ריכוז ה- DNA מתרחש במהלך הגבלה כפולה לעכל.
  10. הפעל פלסמידים כפולים מתעכלים על 1% ג'ל agarose DNA ב 100 V עבור שעה 1 כדי לאפשר הפרדה oוקטור f והכנס (איור 4C). זהירות. לובש מגן מגן פנים UV, למקם ג'ל DNA באור שחור שולחן לדמיין להקות. בהתבסס על גודל, הוספה מפוגל ואינו מפוגל בלו ווקטור שאינו מפוגל באמצעות להב כירורגים נקי.
  11. DNA תמצית ג'ל באמצעות פנול רווי, pH 6.6. בקצרה, שוקל ג'ל DNA המכיל וקטור או להוסיף. שימוש בפנול 100 μl ל0.1 גרם של ג'ל DNA. Homogenize ג'ל DNA בפנול באמצעות homogenizer dounce הזכוכית.
  12. להוסיף כלורופורם (באמצעות 1/5 של פנול נפח) ולנער דגימות במשך 20 שניות. דגירה דגימות ב RT במשך 2-3 דקות. צנטריפוגה במשך 15 דקות במהירות מקסימלית (16.1 x 1,000 XG) על 4 מעלות צלזיוס.
  13. הסר תמיסה מימית ולהוסיף 0.1X נפח של נתרן אצטט 3 M ו2.5x נפח של אתנול. דגירה דגימות עבור שעה 1 ב -80 ° C. לאחר דגירה, להסיר אתנול מחדש להשעות DNA ב -30 μl של חיץ מועדף. אובדן משמעותי של ה- DNA מתרחש בידוד של מוסיף ווקטורים הבאים, הנה 30-50%ss.
  14. מפוגל-אי מחדש לקשור מוסיף מפוגל ואינו מפוגלים לוקטור באמצעות האנזים T4 DNA 38. להשתמש ביחס של 1: 4 של וקטור להכניס לתגובות קשירה. תגובת התקנה בהתאם להוראות יצרן. השתמש בהיקף כולל של 50 μl לתגובות דגירה O / N ב -20 ° C או על קרח עם מכסה מעל דלי קרח.
  15. בעקבות קשירה, לבצע ניקוי DNA באמצעות ערכה לנקות מועדפת, קרום סיליקה ג'ל זמין מסחרי. אובדן משמעותי של ה- DNA להתרחש בעקבות תגובת קשירה, אובדן 30-50% משוער של ה- DNA. ודא מחדש קשירה ידי הפעלה על 1% ג'ל DNA agarose ב 100 V 45 דקות ולהעריך ריכוז של פלסמידים-ligated מחדש (איור 4D).
  16. Transfect פלסמידים מפוגלים או שאינו מפוגלים לתאי D54 באמצעות מגיב transfection מסחרי על פי הפרוטוקול של היצרן. תאי זרע D54 לצלחת 12 גם ב0.14 x 10 6 תאים / טוב.
  17. , Wi תאי transfect הבא 24 שעותריכוזים שווים ה של שני (1) פלסמיד-methyated אינו CPG-luc2 + Renilla או וקטור לוציפראז שליטה אחר או (2) פלסמיד מפוגל CPG-luc2 + Renilla או וקטור לוציפראז שליטה אחר.
  18. לאפשר לתאי transfect למשך 24 שעות לפני ביצוע assay בלוציפראז הכפול. בצע assay לפי הוראות יצרן. לבצע קריאות באמצעות luminometer. קראו היטב כל בשלושה עותקים.
  19. חישוב יחס בין פעילות לוציפראז גחלילית לRenilla או פעילות לוציפראז שליטה אחרת. לנרמל Firefly מפוגל: פעילות לוציפראז שליטה לFirefly-מפוגל עישון: פעילות לוציפראז שליטה על ידי חלוקת פעילות לוציפראז מפוגל על ידי פעילות בלוציפראז אינה מפוגל

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אוכלוסייה מועשרת של האסטרוציטים נרכשה באמצעות מיון FACS של בעלי חיים מהונדסים eGFP-S100β 27. בשל ירידה באיכות של תאים ומולקולות מולקולריות מבודדות מבעלי חיים מבוגרים יותר לאחר הלידה היום 50 (P50), בעלי חיים בגילים P0-P40 הם אופטימליים לניסויים כאלה. רקמת קליפת המוח שימשה לניסויים אלה. קליפת מוח משניים עד שישה בעלי חיים היו נקווה יחד. FACS בוצע במתקן UAB המקיף cytometry הזרימה Core. מיון בוצע על קיטון דיקינסון FACSAria השני. עירור eGFP הושג באמצעות לייזר 488 ננומטר; לא היה צורך פיצוי. אוכלוסייה מגודרת הייתה ממוקדת על סמך קדימה וצד פיזור (איור 1). אוכלוסיית תא חי נקבעה באמצעות מחוון תאים המתים ברומיד ethidium ומגודר (איור 1 ג). שתי אוכלוסיות שונות נצפו מבוססת על פרופיל eGFP (1D איור). באמצעות בדיקה אמפירית, אוכלוסיית התא עם eGFP גבוה יותרפרופיל זוהה כאוכלוסיית תא eGFP-חיובי (איור 1F-F ''). ניתוח חזותי של האוכלוסייה השנייה עם פרופיל נמוך eGFP גילה שברי תא להביע eGFP, אבל נטול גרעינים, סביר להניח שמייצג פסולת מתהליכי astrocytic (איור 1G-G ''). נציג תמונות של האסטרוציטים חיוביים eGFP ניתקו הבאים דיסוציאציה אבל לפני המיון (איור 2 א) ולאחר המיון (איור 2) מוצגים. אוכלוסיית תאים חיוביים מבודדת eGFP הפגינה עלייה של 40 פי בALDH1L1 mRNA, סמן ספציפי astrocytic 39 (איור 2 ג). בנוסף, למרות ביטוי משותף של S100β בNG2 + OPCs והאסטרוציטים 39, צפינו ירידה של פי 4 של NG2 mRNA, סמן לתאי מבשר oligodendrocyte 39, המצביע על בידודה של אוכלוסיית תאי astrocytic מועשרת (איור 2C-D). RNAוDNA מבודד מFACS מיון האסטרוציטים היו באיכות ובכמות מספיקות כדי לשמש למחקרי מתילציה שלאחר מכן. RNA סה"כ וDNA מבודד מגילים ומספר בעלי החיים שונים מופיע כהתייחסות לתשואה צפויה של מולקולות מולקולריות הבאה FACS (לוח 5). יש לציין כי התשואה תהיה גם משתנית בהתאם למספר בעלי החיים מנוצלים, תקופת דגירה, וניסיון של חוקר. לוח 6 מדגים את השונות של אירועים שנרכשו בהתאם למספר בעלי החיים מנוצלים ותקופות דגירה.

ללימודי מתילציה, החל באיכות גבוהה ובכמויות מספקות של ה- DNA היא חיונית ליישומים במורד הזרם מוצלחים. כדי להבטיח תמוגה מספקת של רקמה לRNA או מיצוי DNA, כל הומוגניזציה של רקמה או תאים בעקבות טחינה דקה באמצעות מחט 23G 7x, לטפל כדי למנוע קצף במהלך תמוגה. ברגע שה- DNA באיכות גבוהה מופק ולהמיר bisulfiteאד, אזורים של עניין יכול להיות ממוקד עבור MS-HRMA. שים לב שכאשר הערכת איכות וריכוז של ה- DNA המרה bisulfite, ספקטרופוטומטר צריך להיות מוגדר לקריאה בגורם OD של 33 bisulfite כמומר DNA הוא יחיד שנתקע. 260/280 הערכים לDNA המרה bisulfite נעו 2.20-2.70.

לפני תחילת לימודי מתילציה, זה קריטי כדי לבחור כראוי ולכייל Cycler תרמית ללימודי MS-HRMA. בנוסף, יש לקבוע כיצד לייצא ולנצל נתונים גולמיים המופקים מMS-HRMA. ההתכה רזולוציה גבוהה Biosystems יישומית מדריך לתחילת העבודה נוצלה כדי לסייע בכיול Cycler תרמית 7900HT. לבסוף, הנתונים הופק ומיובאים לתוכנת ניתוח HRM לניתוח נתונים שלאחר מכן. כמפורט בפרוטוקול, לפני ואחרי ההתחלה ולהפסיק פרמטרים נקבעו ליד המעברים של עקום להמיס. הבדלי טמפרטורת שיא שמשו להסיק מעמד מתילציה של sa לא ידועmples. נתונים מתילציה משוערים רכשו מ- MS-HRMA תואם באופן הדוק לנתונים מתילציה שנוצרו מpyrosequencing (נתונים pyrosequencing נוצרו בבית באמצעות פריימרים מיקוד אותו אזורים כפריימרים MS-HRM) (איור 3 ג) 15.

Assay בלוציפראז כפול נוצל כדי להעריך את פעילות תעתיק של אזורים-מפוגל היפר של הגן של העניין (איור 4 א). כל פלסמיד CPG-אי-luc2 היה לינארית ולאחר מכן מפוגל. עם זאת, מכיוון ששניהם להוסיף (אי CPG) ווקטור (luc2) הם מפוגלים בתגובה, אחד חייב לכרות את הכנס מפוגל מחדש לקשור לוקטור מפוגל שאינו. בשל מניפולציה נרחבת של פלסמיד, הפסדים משמעותיים להתרחש ואחד צריך להתחיל עם חומר התחלה מספיק. עיכול HpaII נוצל כדי לאמת את מצב מתילציה של כל פלסמיד כHpaII מעכל DNA שאינו מפוגל (איור 4) בלבד. יש לציין כיאם מתילציה O / N לא מספיק, 1x נוסף של SAM ו1x של methylase CPG ניתן להוסיף הבא 1 שעה של דגירה על 30 מעלות צלזיוס. המשך O דגירה / N הבא תוספת של methylase SAM וCPG המשלים. דור של פלסמיד CPG האי-luc2 מפוגל ואינו מפוגל מאפשר הערכה ישירה של שינויים בין מתילציה DNA ופעילות תעתיק באמצעות מדידה של פעילות בלוציפראז.

איור 1
מיון 1. FACS איור מבודד popoulation תא eGFP +. (א) שימוש בצינור חרוטי 50 מיליליטר עם חור בחלק העליון מאפשר חילוף גזי פני השטח במהלך עיכול פפאין. תאים (B) מסודר היו מגודר המבוססים על קדימה וצד פיזור חלקות. מחוון מת תא מבוסס ברומיד (C) נוצל לשער אוכלוסייה חי תא (אדום). cel חי (D)אוכלוסיית l הפגינה שתי אוכלוסיות - אחד עם פרופיל גבוה eGFP (ירוק) ופרופיל נמוך eGFP (סגול). לכל הגרפים, ציר y מייצג אזור צד פיזור (SSC-); ציר X מייצג אזור קדימה פיזור בצד (FSC-A), אזור ירוק ניאון חלבון (GFP-), או ethidium ברומיד (EtBr). תאים ניתק (EG) הודגרו עם Hoechst ו -20 μl של תאים ניתקו הונח על coverslip וצלם. (EE '') האסטרוציטים eGFP +, עם תהליכים נרחבים היה דמיין לפני המיון (NS). (FF '') בעקבות המיון, גבוה eGFP + אוכלוסייה (POS) להפגין סומה תא eGFP + שהמשותף למקם עם מכתים Hoechst. (GG '') אוכלוסייה נמוכה eGFP מדגימה צביעת eGFP + שלא שיתפו למקם עם מכתים Hoechst, סביר להניח שמייצג astrocytic פסולת (לכל התמונות, בקנה מידה = 20 מיקרומטר). אנאלחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
FACS איור 2. מיון של בעלי חיים מהונדסים β eGFP-S100 מספק אוכלוסייה מועשרת של האסטרוציטים. () 20 μl של תאים ניתקו לפני FACS (NS) מוצגים, תהליכים יישארו ללא שינוי (בסולם = 50 מיקרומטר). (ב) תמונת נציג פוסט FACS-תאים (FACS) מוצגים; תהליכי astrocytic יוסרו ושרידי סומה התא (בסולם = 20 מיקרומטר). נתונים (C) qPCR מדגים עלייה של פי 40 בALDH1L1 mRNA בFACS מיון תאים (FACS) בהשוואה לאוכלוסייה לא מסודרים (NS). (ד) NG2 mRNA הוא מופחת על ידי 4-פי בFACS מיון תאים בהשוואה לאוכלוסייה לא מסודרים (NS). אנא לחץ כאן ל לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. נתונים לדוגמא וניתוח ללימודי MS-HRM. (א) דוגמא של חלקות הבדל טמפרטורה שנוצרו מתקני מתילציה. מתילציה אחוזים המקביל מסומנת עבור כל דוגמא עקומה (B) של משוואת רגרסיה ליניארית שנוצרה מתקני עכברוש מפוגל. השוואה (C) של מתילציה אחוזים שנרכשה מpyrosequencing (pyroseq, פסים ירוקים) ו- MS-HRMA (פסים אפורים) מדגימה רמות דומות של מתילציה למשתנית אזורים של KCNJ10. נתונים pyrosequencing שנוצרו בבית באמצעות פריימרים מיקוד אותו אזורים כמו MS-HRM ניתוח. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

אוהל "FO: לשמור-together.within עמודים =" תמיד "> איור 4
איור 4. assay בלוציפראז הכפול מאפשר להערכה של פעילות תעתיק של אזורי גן דיפרנציאלי מפוגלים. () תרשים של assay פעילות תעתיק לוציפראז מדגים זרימת עבודה של פרוטוקול. הבדלים מציג ג'ל (ב) DNA במפוגל לעומת פלסמידים-מפוגל שאינם הבאים עיכול HpaII. ה- DNA שאינו מתעכל בקלות מפוגל הבא עיכול HpaII בהשוואה ל- DNA מפוגל, מדגים מתילציה המוצלחת של פלסמיד דנ"א. ג'ל (ג) ה- DNA מוכיח הפרדת הווקטור מהכנס הבא עיכול כפול. בעקבות הפרדת DNA, וקטור ולהכניסם ג'ל המופק. ג'ל (ד) DNA מוכיח מחדש קשירה מוצלחת של וקטור ולהוסיף. פלסמיד ligated מחדש בעל משקל מולקולרי דומה כמו פלסמיד שלא טופל (untx). NM, לא נפגשhylated; M, מפוגל; RL, מחדש ligated; untx, שלא טופל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

. נפח (μl) עודף + 10% x3 x # דגימות
MeltDoc MM 10 μl 33 μl
פריימר 1 1.2 μl 3.96 μl
פריימר 2 1.2 μl 3.96 μl
gDNA 1 μl ---
DH 2 0 6.6 μl 21.78 μl

טבלת 1. חישוב לדוגמא של MeltDoctor mastermix. הפעל כל מחשבה MS-HRMction בשלושה עותקים עם עודף של 10% כדי לפצות על שגיאת pipetting. הטור אחרון מצביע על החישוב דרוש למספרים מרובים של דגימות. נפח כולל של כל תגובה הוא 20 μl.

מחזור Temp (° C) זמן (שניות) שיעור רמפה (%)
95 מעלות צלזיוס : 15 100
40x 95 מעלות צלזיוס : 15 100
60 מעלות צלזיוס : 60 100
פרמטרים התכה 95 מעלות צלזיוס : 10 100
60 מעלות צלזיוס : 60 100
95 מעלות צלזיוס : 15 1
60 מעלות צלזיוס : 15 100
החזק 4 76; ג

טבלה 2:. פרוטוקול דוגמא להגברה לפגל דגימות ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ואחרי 40 מחזורים של הגברה ודור של עקום להמיס. פרמטרים היתוך רשומים בתוך שולחן. הערה שינוי בשיעור רמפה שמאפשר רכישה של טמפרטורת התכה ברזולוציה גבוהה.

מתילציה אחוזים (עכברוש רגיל) הבדל טמפרטורת שיא
y איקס
0 5.670116
5 10.70448
10 15.5044
25 25.52295
50 34.43047
75 43.80894
100 53.88717
NT "> לוח 3. דוגמא של נתונים הבדל טמפרטורת שיא. סטנדרטי מתילציה אחוזים מתויג כy-לתאם. נתוני הבדל טמפרטורת שיא שכותרתו כקואורדינטת x. נתוני הבדל טמפרטורת שיא הנציג נרכשו באמצעות MS-HRM מאזור גן אחד.

הבדל טמפ שיא מתילציה המשוערת
איקס Y
לדוגמא 1 (n = 4)
47.450 81.115
46.292 78.657
41.694 68.894
47.292 80.779
לדוגמא 2 (n = 4)
29.925 43.904
24.269 31.894
25.061 33.575
25.389 34.272

לוח 4. דוגמה למחושבת מתילציה אחוזים מוערכת. הבדל טמפרטורת שיא של דגימות של מעמד מתילציה לא ידוע משמש להעריך מתילציה אחוזים באמצעות משוואת רגרסיה ליניארית. נציגי נתונים משני תנאים שונים, לדוגמא 1 ודוגמה 2, מוצגים; n = 4 עבור כל תנאי.

גיל מספר בעלי החיים RNA סה"כ (ng) DNA סה"כ (ng)
P4-P10 3-6 455-868 265-1523
P19-P22 1-2 220-680 583-1483
P40-P50 3-4 198-260 578-1700

לוח 5. סה"כ RNA וה- DNA שנרכש מFACS מיון תאים. גיל ומספר בעלי החיים המשמש בFAניסויי CS רשומים. שים לב, שני הקורטקס נוצל לכל נ 'סה"כ RNA ו- DNA רשום כהתייחסות לתשואה צפויה.

גיל מספר בעלי החיים אירועים ממוצע אירועי נג זמן דגירה (על 37 מעלות צלזיוס)
P26 1 2.18X10 ^ 6 1.15X10 ^ 6 20:00 דקות
P26 2 4.4X10 ^ 6 2.78X10 ^ 6 20:00 דקות
P26 2 9.2X10 ^ 6 3.3X10 ^ 6 30:00 דק '

מספר לוח 6: האירועים שנרכשו מFACS ביום הלידה 26. במספר P26 של אירועים חיוביים (eGFP +) ואירועים שליליים משתנה בהתאם למספר בעלי החיים מנוצלים ותקופת דגירה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150
AllPrep DNA/RNA Mini Kit Qiagen 80204
Methyl Primer Applied Biosystems online software to localize CpG Islands
EZ DNA methylation Kit Zymo Research D5001
Rat Premixed Calibration Standard EpiGenDx 80-8060R-Premix
CpG Methylase (M.Sssl) Zymo Research E2010
QIAquick Gel Extraction  QIagen 28704 Used for gel extraction and DNA cleanup
Restriction enzymes New England BioLabs
NEB cutter New England BioLabs online verify restriction digest sites
Dual Luciferase Reporter Assay System Promega E1910
Luc2 vector, pGL4.10 Promega E6651
renilla vector, pGL4.74 Promega E2241
TD-20/20 Luminometer Turner Designs
Lipofectamine LTX and Plus Reagent Life Technologies A12621
Phenol, saturated pH 6.6/6.9 Fisher Scientific BP 17501-100
Nanodrop 2000/2000c Spectrophtometer ThermoScientific
MeltDoctor Master Mix Life Technologies 4415440
High Resolution Melt (HRM) Software v2.0 Life Technologies 4397808
AB SDS software v2.3 Life Technologies online
AB High Resolution Melting Getting Started Guide  Life Technologies online
AB 7900HT Fast Real-Time System Life Technologies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16 (1), 6-21 (2002).
  2. Deaton, A. M., Bird, A. CpG islands and the regulation of transcription. Genes Dev. 25, 1010-1022 (2011).
  3. Lorincz, M. C., Dickerson, D. R., Schmitt, M. Intragenic DNA methylation alters chromatin structure and elongation efficiency in mammalian cells. Nat Struct. Mol Biol. 11 (11), 1068-1075 (2004).
  4. Moore, L. D., Le, T. DNA methylation and its basic function. Neuropsychopharmacol. 38, 23-38 (2013).
  5. Santos, K. F., Mazzola, T. N. The prima donna of epigenetics: the regulation of gene expression by DNA methylation. Braz.J.Med.Biol.Res. 38 (10), 1531-1541 (2005).
  6. Day, J. J., Sweatt, J. D. Cognitive neuroepigenetics: a role for epigenetic mechanisms in learning and memory. Neurobiol. Learn.Mem. 96, 2-12 (2011).
  7. Denk, F., McMahon, S. B. Chronic pain: emerging evidence for the involvement of epigenetics. Neuron. 73, 435-444 (2012).
  8. Endres, M., et al. DNA methyltransferase contributes to delayed ischemic brain injury. J. Neuroscience. 20 (9), 3175-3181 (2000).
  9. Qureshi, I. A., Mehler, M. F. Emerging role of epigenetics in stroke: part 1: DNA methylation and chromatin modifications. Arch.Neurol. 67, 1316-1322 (2010).
  10. Tian, R., et al. disease mutant glial fibrillary acidic protein compromises glutamate transport in astrocytes. J Neuropathol. Exp Neurol. 69, 335-345 (2010).
  11. Perisic, T., Holsboer, F., Rein, T. The CpG island shore of the GLT-1 gene acts as a methylation-sensitive enhancer. Glia. 60 (9), 1345-1355 (2012).
  12. Olsen, M. L., Higashimori, H., Campbell, S. L., Hablitz, J. J. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 53 (5), 516-528 (2006).
  13. Poopalasundaram, S., et al. Glial heterogeneity in expression of the inwardly rectifying K+ channel, Kir4.1, in adult rat CNS. Glia. 30, 362-372 (2000).
  14. Hibino, H., Fujita, A., Iwai, K., Yamada, M. Differential assembly of inwardly rectifying K+ channel subunits. Kir4.1 and Kir5.1, in brain astrocytes. 279, 44065-44073 (2004).
  15. Nwaobi, S. E., Lin, E., Peramsetty, S. R. DNA methylation functions as a critical regulator of Kir4.1 expression during CNS development. Glia. 62 (3), 411-427 (2014).
  16. Li, L., Head, V. Identification of an inward rectifier potassium channel gene expressed in mouse cortical astrocytes. Glia. 33, 57-71 (2001).
  17. Kucheryavykh, Y. V., et al. Downregulation of Kir4.1 inward rectifying potassium channel subunits by RNAi impairs potassium transfer and glutamate uptake by cultured cortical astrocytes. Glia. 55 (3), 274-281 (2007).
  18. Djukic, B., Casper, K. B., Philpot, B. D., Chin, L. S. Conditional knock-out of Kir4.1 leads to glial membrane depolarization, inhibition of potassium and glutamate uptake, and enhanced short-term synaptic potentiation. J. Neuroscience. 27, 11354-11365 (2007).
  19. Fujita, A., et al. Clustering of Kir4.1 at specialized compartments of the lateral membrane in ependymal cells of rat brain. Cell Tissue Res. 359 (2), 627-634 (2015).
  20. MacFarlane, S. N., Sontheimer, H. Electrophysiological changes that accompany reactive gliosis in vitro. J Neuroscience. 17 (19), 7316-7329 (1997).
  21. Ambrosio, R., Maris, D. O., Grady, M. S., Winn, H. R. Impaired K(+) homeostasis and altered electrophysiological properties of post-traumatic hippocampal glia. J. Neuroscience. 19 (18), 8152-8162 (1999).
  22. Anderova, M., et al. Voltage-dependent potassium currents in hypertrophied rat astrocytes after a cortical stab wound. Glia. 48 (4), 311-326 (2004).
  23. Olsen, M. L., Campbell, S. C., McFerrin, M. B., Floyd, C. L. Spinal cord injury causes a wide-spread, persistent loss of Kir4.1 and glutamate transporter 1: benefit of 17 beta-oestradiol treatment. Brain. 133, 1013-1025 (2010).
  24. Koller, H., Schroeter, M., Jander, S., Stoll, G. Time course of inwardly rectifying K(+) current reduction in glial cells surrounding ischemic brain lesions. Brain Res. 872, 1-2 (2000).
  25. Bordey, A., Lyons, S. A., Hablitz, J. J. Electrophysiological characteristics of reactive astrocytes in experimental cortical dysplasia. J Neurophysiol. 85 (4), 1719-1731 (2001).
  26. Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P. plating, and maintenance of cortical astrocyte cultures. 8, Cold Spring. 10-1101 (2009).
  27. Itakura, E., et al. Generation of transgenic rats expressing green fluorescent protein in S-100beta-producing pituitary folliculo-stellate cells and brain astrocytes. Endocrinology. 148, 1518-1523 (2007).
  28. Foo, L. C. Purification of astrocytes from transgenic rodents by fluorescence-activated cell sorting. Cold Spring Harb.Protoc. 2013, 551-560 (2013).
  29. Smith, C., Otto, P., Bitner, R. A silica membrane-based method for the isolation of genomic DNA from tissues and cultured cells. CSH. Protoc. 2006, 2006-201 (2006).
  30. Sambrook, J., Russell, D. W. A Single-step Method for the Simultaneous Preparation. of DNA, RNA, and Protein from Cells and. 1, 2006-201 (2006).
  31. Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K. Quantitation of DNA and. , (2007).
  32. Zhao, Z., Han, L. CpG islands: algorithms and applications in methylation studies. Biochem. Biophys. Res. Commun. 382, 643-645 (2009).
  33. Srivastava, G. P., Guo, J., Shi, H. PRIMEGENS-v2: genome-wide primer design for analyzing DNA methylation patterns of CpG islands. Bioinformatics. 24, 1837-1842 (2008).
  34. Patterson, K., Molloy, L., Qu, W. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J.Vis.Exp.(56), doi:3170 [pii];10.3791/3170. , (2011).
  35. Drummond, G. B., Vowler, S. L. Categorized or continuous? Strength of an association-and linear regression. Adv.Physiol Educ. 36, 89-92 (2012).
  36. Sambrook, J., Russell, D. W. The basic polymerase chain reaction. CSH.Protoc. 1, (2006).
  37. Arpa, P. Strategies for cloning PCR products. Cold Spring Harb.Protoc. 8, (2009).
  38. Makovets, S. Basic DNA electrophoresis in molecular cloning: a comprehensive guide for beginners. Methods Mol.Biol. 1054, 11-43 (2013).
  39. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neuroscience. 28, 264-278 (2008).
  40. Maldonado, P. P., Velez-Fort, M., Levavasseur, F. Oligodendrocyte precursor cells are accurate sensors of local K+ in mature gray matter. J Neuroscience. 33, 2432-2442 (2013).
  41. Kalsi, A. S., Greenwood, K., Wilkin, G. Kir4.1 expression by astrocytes and oligodendrocytes in CNS white matter: a developmental study in the rat optic nerve. J.Anat. 204, 475-485 (2004).
  42. Higashi, K., et al. An inwardly rectifying K(+) channel, Kir4.1, expressed in astrocytes surrounds synapses and blood vessels in brain. Am.J.Physiol Cell Physiol. 281 (3), (2001).
  43. Olsen, M. L., Higashimori, H., Campbell, S. L., Hablitz, J. J. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 53 (5), 516-528 (2006).
  44. Neusch, C., Rozengurt, N., Jacobs, R. E., Lester, H. A. Kir4.1 Potassium Channel Subunit Is Crucial for Oligodendrocyte Development and In Vivo Myelination. J. Neuroscience. 21 (15), 5429-5438 (2001).
  45. Kofuji, P., et al. Genetic Inactivation of an Inwardly Rectifying Potassium Channel (Kir4.1 Subunit) in Mice: Phenotypic Impact in Retina. J. Neuroscience. 20 (15), 5733-5740 (2000).
  46. Kofuji, P., Connors, N. C. Molecular substrates of potassium spatial buffering in glial cells. Mol.Neurobiol. 28, 195-208 (2003).
  47. Nwaobi, S. E., Lin, E., Peramsetty, S. R. DNA methylation functions as a critical regulator of Kir4.1 expression during CNS development. Glia. 62 (3), 411-427 (2014).
  48. Wojdacz, T. K., Dobrovic, A. Methylation-sensitive high-resolution melting. Nat.Protoc. 3, 1903-1908 (2008).
  49. Wojdacz, T. K., Dobrovic, A. Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM): a new approach for sensitive and high-throughput assessment of methylation. Nucleic Acids Res. 35, 10-1093 (2007).
  50. Laird, P. W. Principles and challenges of genomewide DNA methylation analysis. Nat.Rev.Genet. 11, 191-203 (2010).

Tags

ביולוגיה מולקולרית גיליון 103 מתילציה DNA MS-HRMA assay אמרגן לוציפראז FACS האסטרוציטים Kir4.1,
התאמת שינויים גנטיים ספציפי DNA מתילציה עם ביטוי ותעתיק פעילות של astrocytic<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nwaobi, S. E., Olsen, M. L.… More

Nwaobi, S. E., Olsen, M. L. Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1). J. Vis. Exp. (103), e52406, doi:10.3791/52406 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter