Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Выращивание Published: April 6, 2015 doi: 10.3791/52412
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 1, 1, 1
1Institute of Immunology and Infection Research, University of Edinburgh, 2Manchester Collaborative Centre for Inflammation Research

Summary

Heligmosomoides polygyrus является мышиный нематода с мощными иммуномодулирующими возможностей, которые напоминают те, высококвалифицированных распространенной инфекции человека гельминтами. Здесь мы опишем протокол для долгосрочного поддержания H. polygyrus жизненным циклом.

Abstract

Heligmosomoides polygyrus (ранее известный как Nematospiroides камбалы, а также рассказал о некоторых, как Х. Bakeri) является желудочно гельминтов, которая использует несколько иммуномодулирующих механизмов по обеспечению хронической инфекции у мышей и напоминает распространенные инфекции человека гельминтами. H. polygyrus был хорошо изучен в области гельминтов, полученных иммунной регуляции и было установлено, мощно подавить экспериментальные модели аллергии и аутоиммунных заболеваний (как с активной инфекцией и изолированных секретируемых продуктов). Протокол, описанный в этом документе излагаются управление H. polygyrus жизненный цикл для последовательного производства L3 личинок, восстановление взрослых паразитов и сбор их выводных-секреторных продуктов (ГЭК).

Introduction

Heligmosomoides polygyrus является естественным мышиный желудочно-кишечного тракта гельминтов, которые тесно связаны с высоко распространенных нематод паразитов человека 1. В отличие от других моделей, таких как нематоды Nippostrongylus Brasiliensis, H. polygyrus последовательно устанавливает хроническую инфекцию у мышей, как прямой результат множественных механизмов мощный иммуномодулирующих он использует для подавления иммунного ответа 2.

H. polygyrus имеет прямое жизненный цикл: инфекционные личинки L3 поглощаются Feco-оральным передачи (или вводить через желудочный зонд в лабораторных условиях), после чего они мигрируют в subserosal слоя двенадцатиперстной кишки и инкапсулировать перед возвращением в просвете кишечника, как Взрослые черви примерно через восемь дней после первичного инфицирования. Спаривание и производство яиц происходит на 10 день, и это можно собрать взрослых червей для культуры и сбора выделительной-секреторных продуктов дау 14 года 3. H. polygyrus также взаимодействует с комменсальной микрофлоры, с повышенной лактобацилл присутствуют в зараженных восприимчивых мышей 4-6, и повышения уровня H. polygyrus инфекции после воздействия на мышей к лактобацилл 6.

Активный инфекция H. polygyrus было показано для защиты от иммунопатологии во многих животных моделях аутоиммунных заболеваний 7-10, колит 11,12 и аллергии 13-16. Там Следовательно, имело большой интерес в потенциал Экскреторная секреторной молекул из этого паразита («HES») вниз модулировать патологии в естественных условиях 17,18. Действительно, защитные эффекты проявляются после лечения мышей с продуктами ГЭК 19 через пути, которые в настоящее время определены 18,20. Здесь мы опишем протокол для надежного производства Heligmosomoides polygyrus и восстановления его секретируемых продуктов, которые могут быть дополнительно использованы для диапазона функциональных биохимических и иммунологических исследований.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры в этом протоколе осуществляется в соответствии с принципами, изложенными в Соединенном Королевстве внутренних дел и Университета Эдинбурга Ветеринарных служб.

1. Заражение мышей через желудочный зонд

  1. Магазин Heligmosomoides polygyrus L3 личинки в дистиллированной воде в течение шести месяцев при 4 ° С.
  2. Перед использованием, вымойте L3 личинки три раза в дистиллированной воде: центрифуги при 300 мкг в течение 10 мин (с тормозом), удалить все, кроме 500 мкл воды (чтобы не потревожить гранулированную личинок L3) и ресуспендируют осадок каждый раз.
  3. Для третьей промывки, добавить воду к точному объема (обычно 40 мл) и аспирации 20 мкл с 200 мкл разреза наконечника, чтобы расширить свой отверстие. Поместите два 20 мкл образцов на поверхности 60 мм чашки для культивирования и подсчета личинок L3 (обычно мобильный, и лучше всего рассматривать в соответствии с 50-кратном увеличении с препаративным микроскопом). Ресуспендируют осадок в окончательный дистиллированной водой до concentratioп 2000 L3 личинок на мл.
  4. Для жизненного цикла продукции, заразить 8-недельных F1 (C57BL / 6xCBA) мышей с 400 H. polygyrus L3 личинки в 200 мкл дистиллированной воды через желудочный зонд (сдерживать мышей в вертикальном положении на загривок и аккуратно пройти тупой через зонд иглу через рот и пищевод в желудок). Перемешивайте тщательно перед каждой инфекции (личинки быстро оседают в воде) и аспирации 200 мкл в 1 мл шприц; использовать выделенный через зонд иглу с закругленным концом. Для экспериментального заражения молодых мышей (6-8 недель), или других инбредных линий (например, C57BL / 6 или BALBc), заразить мышей с 200 L3 личинок.

2. Распространение и обслуживание H. polygyrus

  1. Поместите уголь в центре большого пластиковой тубе и позволяют холодной водопроводной воды для запуска над ним в течение как минимум 30 минут (немытые активированный уголь является токсичным для L3 личинок). Слейте воду из ванны и разместить уголь на Т-WO слоев впитывающей бумаги, оставляя его не подвергается воздуха в помещении до полного высыхания.
  2. Если яйца не требуется, очистить фекалии First Out толстой кишки с щипцами (и ножницы при необходимости). Если большое количество личинок L3 необходимо, поместить мышей на проволочной сетке и сбора фекальных гранул в течение нескольких дней.
  3. Смешайте фекалии гранулированным древесным углем в соотношении по меньшей мере 1: 1, чтобы достигнуть консистенции просто влажной достаточно, чтобы присоединиться к фильтровальной бумагой. Намажьте тонким слоем на центре некоторой влажной фильтровальной бумаге в чашках Петри и разместить во влажной камере (добавить влажное полотенце бумаги и блюдо воды) в темноте в течение 12-14 дней.
  4. Удалить L3 личинок из 7 день года, и собрать их, по крайней мере в двух случаях, прежде чем бумага удаляется. Личинки образуют кольцо вокруг края фильтровальной бумаги; поднять фильтровальную бумагу из чашки Петри и промойте личинки, которые остались от пластины (с помощью пипетки и 5 мл стерильной воды в тарелке) в 50 мл пробирку.
  5. Лифтот фильтровальную бумагу и собрать оставшиеся личинки оставляют на пластины с дистиллированной водой в 50 мл пробирку. Центрифуга вытекающего раствора при 300 х г в течение 10 мин. Промыть личинок три раза дистиллированной водой, а затем хранить при температуре 4 ° С в срок до 50 мл дистиллированной водой до тех пор, пока требуется.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Личинки остаются жизнеспособными и инфекционный, по крайней мере, 6 месяцев.

3. Сбор взрослых H. polygyrus черви

  1. Подготовка модифицированный Baermann Аппарат заранее, как показано на рисунке 1.
  2. Cull мышей четырнадцать дней после заражения.
  3. Вымойте живота с 70% этанола. Разрежьте кожу на животе и отступить, чтобы показать переднюю брюшную стенку. Сделайте срединный разрез, чтобы войти в брюшную полость.
  4. Удалить всю тонкой и толстой кишки (от проксимального двенадцатиперстной кишки дистальной кишки). Поместите в сухое чашке Петри.
  5. Выпрямите кишки по всей длине; акцизного кала, содержащего толстой кишки; разместить это в отдельную посуду для яиц препаратов более поздних.
  6. Акцизный проксимальных 20 см тонкой кишки, который содержит взрослых червей -identified на относительно толстой стенкой двенадцатиперстной кишки и часто красный цвет, из-за внутри-просвета червей. Поместите в (диаметр 100 мм) чашки Петри с 5 мл раствора Хенкса, нагревают до 37 ° C (два образца на чашку).
  7. Откройте червями заполнено проксимального кишечника часть в продольном направлении с ножницами (круглые состава ножницы лучше для этого), и отчищать внутри оболочки кишечника с двумя стеклами, чтобы удалить червей. Тогда отказаться от чистой стенки кишечника.
  8. Совет черви в небольших муслин сумки, продуктом закрыты и закрепите скрепки по краям стеклянной воронки (рис 1).
  9. Заполните воронку с раствором Хэнкса и добавить около 4 чашек Петри червей в каждой воронке.
  10. Место аппарат в 37 ° C инкубаторе в течение 1-2 часов, мягко агитировать на полпути через, чтобы сместитьмусор от подготовки кишечника, которые могут закупоривать марли фильтр. Будьте осторожны, чтобы не высыпался мусора за пределами марли мешок - это может привести к загрязнению конечного препарата ГЭК. Взрослых червей следует медленно мигрировали через ткани марли и решен в нижней части стеклянной пробирке. Осторожно снимите пробирку с соединительной резинового шланга над раковиной (заботясь, чтобы избежать потери червей в этой точке).
  11. Использование пластиковой пипетки передачи червей в 50 мл трубки и мыть шесть раз Хэнкса Решение (плюс червей урегулировать под действием силы тяжести, извлекайте носитель с stripette, добавить 40 мл Хэнкса Решение и повторите пять раз).
    ПРИМЕЧАНИЕ: червь культура должна быть стерильной С этого момента.
    1. Перемещение в ламинарном боксе и мыть еще шесть раз в стерильного раствора Хэнкса, дополненной 100 Е / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина, готовый к культуре в пробирке.
  12. ГрафВзрослые черви восстанавливается путем два образца 20 мкл, принятых с желтым разреза наконечника, чтобы расширить свою диафрагму; ожидать примерно 50% от количества засеянных личинками.

4. Настройка культур для ГЭК: средний подготовки, стиральная взрослых червей

  1. Замачивание червей 3,11 примерно 10 мл RPMI с добавкой 10% гентамицина в течение 20 мин, в результате чего труба отдыхает под углом, чтобы обеспечить черви полностью покрыты.
  2. Выполнение этого в ламинарном боксе: мыть раз в шесть раз раствором Хэнкса (с добавлением 5 ед / мл пенициллина и 5 мкг / мл стрептомицина).
  3. Подготовка H. polygrus массовой информации.
  4. Поддержание стерильности в ламинарном проточном боксе, 500 мл RPMI 1640, добавить 11,1 мл 45% глюкозы (конечная концентрация 1,2%, как RPMI1640, содержит 0,2% глюкозы), 5 мл 100x Peniclllin-стрептомицина (конечная концентрация 5 ед / мл пенициллина, 5 мкг / мл стрептомицина), 5 мл L-глутамина (конечная концентрация 2 мМ), и5 мл гентамицина (конечная концентрация 1%). Не добавляйте FCS.
  5. Кратные черви в вентилируемых колбы Т25, ок. 1000 червей в 15 мл H. polygyrus средствах массовой информации в колбе, и место в вертикальном положении в 37 ° C инкубатор (5% СО 2) в течение 3 недель.

5. Получение HES

  1. Сбор ГЭС, содержащие питательные среды из культур с интервалом не более чем в два раза в неделю, отложив в сторону свою первую коллекцию после 24 часов культуры (из-за высоких уровней загрязнения ЛПС и белков хозяина - может быть обработана отдельно или отбрасываются). Держите каждую коллекцию отдельным и четко обозначена цифрой даты и партии. Заменить с равным объемом H. polygyrus СМИ в каждом случае.
  2. Центрифуга HES-носитель, содержащий по 400 г в течение 5 мин. Затем процедить стерилизации через 0,2 мкм с низким содержанием белка-связывающих фильтров в 50 мл пробирки. Хранить в -20 ° C морозильнике четко обозначены с указанием даты сбора урожая червя и даты ГЭС сollection.
  3. После 21 дней сбора ГЭС от культуры, отбросить червей.
  4. Бассейн 500-1000 мл ГЭК супернатанта (как правило, из замороженных складе, а не в том числе сбор первых 24 ч) и сосредоточиться над 3000 MWCO фильтр ультрафильтрации устройства под давлением азота.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте очень осторожны, чтобы не позволить фильтр всухую.
    1. Чтобы настроить устройство фильтра, в первую мыть 3 кДа мембраны блестящей стороной вниз в 1 л стакан с дистиллированной водой в течение 3 х 20 мин при перемешивании. Соберите устройства для ультрафильтрации в соответствии с инструкциями изготовителя с мембранного фильтра блестящей стороной вверх. Место в шкафу при 4 ° С и передать 50 мл дистиллированной воды через перед началом сконцентрировать объединенные HES.
    2. Добавить каждую пробирку ГЭК в устройство фильтрации в соответствии с требованиями (100-140 мл в день), до тех пор, пока объем концентрируют до 2-5 мл.
  5. Для удаления загрязнений из HES-культуральной среде, содержащей, добавить 50 мл Pyrоген свободной PBS, к устройству фильтрации и затем концентрируют до примерно 2 мл. Повторите этот шаг дважды (150 мл PBS в общей сложности). Передача HES в 15 мл пробирку, фильтр стерилизуют (с 0,2 мкм фильтр) в ламинарном боксе и измерения концентрации белка с использованием спектрофотометра (E 280 = 10) или с помощью анализа Брэдфорда.
  6. Аликвоты, этикетка с номером партии и датой, и замерзает при температуре -80 ° С.
  7. Выполните хромогенную LAL анализа в соответствии с протоколами производителя на каждую партию ГЭС до использования. Если уровни LPS больше, чем 1 U ЛПС на 1 мкг белка, рассматривать не с помощью этой партии для естественных условиях экспериментов в или в культурах пробирке.
  8. Процесс ГЭК, собранные через 24 часа по отдельности таким же образом; он будет содержать LPS и некоторые белки и хост, в то время как не подходит для функциональных экспериментов, он является полезным источником индивидуальных молекул, которые могут быть выделены с помощью моноклонального антитела аффинной очистки.

Representative Results

Восприимчивость к инфекции H. polygyrus управляется в значительной степени генетического фона штамма мыши (Таблица 1); C57BL / 6 и мышах линии СВА являются весьма чувствительными 21,22. Для поддержания жизненного цикла паразита, гибридный F1 между этими двумя штаммов был выбран за его способность выдерживать значительно более высокие нагрузки червь без чрезмерного заболеваемости (кишечной эпителиальной повреждений) по сравнению с родительским штаммом либо. Желудочный зонд 400 личинок L3 используется для поддержания жизненного цикла в F1 мышей (в результате чего взрослых червей бремени, показанных на фиг.2), в то время как в дозе 200 L3 личинок обычно используется для экспериментов в гомозиготных инбредных линий (например, линии C57BL / 6 или BALBc). Тем не менее, эта доза может потребоваться уменьшить в зависимости от окружающей среды сопутствующих факторов, которые могут отличаться между объектами животного, такого как различия в кишечной флоре.

Партии ГЭК доказали воспроизводимый склада иадвокатирования в функциональных анализов и белкового состава; Кроме того, при анализе супернатанты из каждой последующей недели культуры, до в общей сложности 4 недели, профили белков оказались очень похожи (фиг.3). При концентрации ГЭК измеряется Бредфорда (см 5.5), общее белка обычно около 1 мг / мл (рис 4).

Альтернативный способ концентрирования HES является центробежным концентратором (например Vivaspin 3-кДа отсечки мембраны), в котором образцы центрифугировали при до 4000 г в поворотно-откидной ротор центрифуги, удаление буферные соли и низкомолекул рные компоненты. Центробежный концентрации лучше всего подходят для малых объемов переработки (1-10 мл) и ограничены до максимального коэффициента концентрации приблизительно 30x.

При сборе ГЭС, отказ от загрязнения является критическим. Чтобы избежать загрязнения с молекулами хозяина, отбросить HES-продолжениеAining питательных сред из первых 24 ч после взрослого урожая червя в кишечнике мыши. Мы также количественной оценки уровня загрязнения LPS в каждой партии ГЭС с анализом Chromogenic LAL (см 5.7). 1 U ЛПС приравнивается к ~ 100 пг LPS и уровни ниже этого считаются пренебрежимо мало 23. В наших руках, большинство партий ГЭК значительно ниже этого предела, средняя концентрация ЛПС ГЭК быть 0,23 U / мг (Рисунок 5). Эффекты ЛПС в модели в естественных условиях патологии (например, подавление астматических ответов) требует по меньшей мере 10 нг LPS 23. Таким образом, в естественных условиях введения 5 мкг ГЭС из партии с 100 пг LPS / мкг ГЭС будет включать в себя 500 пг LPS, что значительно ниже эффективной концентрации, где LPS становится проблемой.

Фигура 1
Рисунок 1: Baermann Аппарат BaerМанн установки Аппараты для сбора взрослых H. polygyrus (как описано в разделе 2).

Фиг.2
Рисунок 2: Средняя Worm Бремя 14 дней после заражения с 400 L3 личинки среднего червя обременяет 14 дней после заражения 400 L3 личинок. Точки данных Указаны от 19 отдельных выстрелов инфекции мышей C57BL / 6xCBA. Средняя ± SEM показано на рисунке.

Рисунок 3
Рисунок 3: Белки Профили ГЭК с последовательных недель культивирования профиль SDS-ПААГ ГЭК белков, собранных в последовательных недель культуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: Финал Количество ГЭС с 500 мл ES средах, содержащих Доходность ГЭС белка из 11 различных партий, полученных из примерно 500 мл супернатанта культуры. Средняя ± SEM показано на рисунке.

Рисунок 5
Рисунок 5: LPS Загрязнение ГЭК уровни загрязнения ЛПС в 41 партиях ГЭС, измеренных ameobocyte анализа Limulus. Средняя концентрация ЛПС = 86 U на мг ГЭС.

Рисунок 6
Рисунок 6: Анимированные Схема H. polygyrus жизненного цикла Краткое изложение основных этапов жизненного цикла от орального введения через зонд L3 личинок, через восстановление личинок и взрослых гельминтов к выделению ГЭС.


Рисунок 7: Анимированные Схема ГЭС и ее функции Основные иммуномодулирующим действием растворимых медиаторов и экзосом, содержащихся в ГЭК.

Генотип (и фон деформации) Первичная инфекция фенотип Ссылка
Инбредных линий
/ J, CBA, C3H Очень восприимчивы 22,29
C57BL / 6 и C57BL / 10 Восприимчивый 22,30
BALB / C, DBA / 2, 129 / J Промежуточный 22,31
NIH, SJL, КСВ Низкая чувствительность 22,32
Трансгенные цитокинов или рецепторов цитокинов
IL-1β - / - Более восприимчивы 33
IL-1R - / - Менее подвержены (а); никаких изменений в восприимчивости, но увеличение гранулемы (б) () 33
(Б) 34
ИЛ-2Rβ Трансгенные (C57BL / 6) Стойкий 35
IL-4 - / - Высшее плодовитость 36
IL-4R - / - (C57BL / 6 или BALB / C) Очень восприимчивы 22
ИЛ-6 - / - (линии BALB / C или C57BL / 6) Высокой устойчивостью 37
IL-9 Трансгенные(FVB) Стойкий 38
IL-21R - / - (C57BL / 6) Недостаточное Th2, снижение гранулемы gormation 39,40
ИЛ-25 - / - (линии BALB / C) Более восприимчивы 33
ИЛ-33R (Т1 / ST2) - / - (линии BALB / C) Никаких изменений в восприимчивости 33
TGFβRIIdn (C57BL / 6) Высокая Th1, повышенная восприимчивость 41,42
Трансгенные для Т-клеточных маркеров
CD28 - / - (линии BALB / C) Незначительно выше плодовитость 43
CD86 (В7-2) - / - (линии BALB / C) Высшее плодовитость 44
OX40L - / - (линии BALB / C) Высшее плодовитость и# 160; 45
Трансгенные для врожденной иммунной локусов
Тип 1 рецептора интерферона (IFNAR) - / - (C57BL / 6) Высшее плодовитость, более гранулемы 34
MyD88 - / - (C57BL / 6) Более стойкие, больше гранулемы 34
C-KitW / Wv (WBB6) Более восприимчивы 46,47

Таблица 1: Основные инфекции с H. polygyrus генетически различных и генно-целенаправленные линий мышей.

Discussion

Жизненный цикл Н. polygyrus протекает в надежно последовательным образом. После приема природного или перорально через зонд из L3 личинок на день 0, кисты начинают формировать под двенадцатиперстной серозной по 5-й день, продвигается в личиночной линьки, а затем превращается в взрослых червей в просвете кишечника от 10 день, яйца можно увидеть в кале из 14 день и гранулемы видны на двенадцатиперстной серозной поверхности от 21-й день протоколу, описанному выше (и представлены на Рисунке 6) позволяет с высокой пропускной способностью производства H. polygyrus выделительной секреторная продукты (HES), в дополнение к надежной восстановление жизнеспособных личинок L3 для будущих экспериментальных и жизни инфекций цикла.

H. polygyrus инфекция была показано, что защищает в моделях астмы в зависимости от OVA или Der р 1 (Дом пылевого клеща аллерген) 14. Кроме того, подавление воспаления дыхательных путей могут быть переданы с CD4 + CD25 + 14 или CD19 + CD23 привет нормативные В-клетки 24 от не-сенсибилизированные, H. polygyrus -infected мышей. В моделях аутоиммунных заболеваний, H. polygyrus инфекции было показано, что подавляющее в экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЕ) модели множественного склероза 9, и подавление могут быть переданы либо с CD4 + Т-клеток или CD19 + В-клеток от мышей, зараженных 24.

Heligmosomoides polygyrus выделительной секреторная продукты (HES) модулировать иммунный ответ и подавить Th2-опосредованного воспаление целого ряда механизмов (указаны на рисунке 7), в том числе: а) ингибирование дендритных отзывчивости клеток к стимуляции 25, б) индукцию CD4 + FOXP3 + регуляторные Т-клетки 18. и в) блокада IL-33 производства 20. ГЭК было показано, что при введении защитнойт сенсибилизация или вызов в OVA-квасцов модели астмы 19, а также при интраназальном с экстрактом Alternaria аллергена 20, через подавление ранней IL-33 выпуска. Избежание LPS загрязнения ГЭС зачастую имеет решающее значение для успеха будущих иммунологических экспериментов. В протоколе, изложенной здесь, критические шаги в достижении этой цели являются: обеспечение того, чтобы мусор, содержащийся в муслин мешки аппарата Baermann не войти в окончательный препарат ГЭК (см 2,10) и отложить решение ES с первого 24 ч культуры (см 5.1).

За последние годы, ГЭС была полностью характеризуется в протеомного уровне с более чем 370 различных белков, выявленных 26,27. Кроме того, ES с 4-го этапа личинок был подвергнут протеомного анализа 28. Текущая работа включает в себя, характеризующие основные гликана компоненты ГЭК, как известно, сильно иммуногенной 3 и спрятали микро-РНКак, которые заключены в 50-100 нм пузырьков или экзосом (Buck и др., Представленных для публикации). С созданием воспроизводимых протоколов для сбора ES от этого очень иммуномодулирующим паразита, и с обширными протеомных данных, указывающих на молекулярные компоненты ГЭС, настоящее время созданы для выявления и терапевтического испытания отдельных молекул из H. polygyrus, которые могут опосредовать действие на основные иммунной системы хозяина.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon concentrator Millipore 5112 Model 8050 50 ml
http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM
_NF-5122
Hanks’ buffered salt solution Sigma H9394 500 ml
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&region=GB
Penicillin streptomycin Invitrogen 15070-063 100 ml
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063
L-glutamine Invitrogen 25030-081 200 MM 100ml
https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081
Activated charcoal Merck 1.09624.0500 18-35 mesh
http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624
Glucose solution Sigma G8769 100 ml 45% solution
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&region=GB
Falcon tubes Sarstedt 62.547.254 50 ml
http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon
T25 Flasks Sigma CLS430639  25cm vented flask
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&region=GB
Chromogenic LAL assay Lonza 50-647U QCL-1000 assay
http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx
Gentamicin Gibco 15710-049 100 ml
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Gibco 11875093 500 ml; without L-glutamine
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Monroy, F. G., Enriquez, F. J. Heligmosomoides polygyrus : a model for chronic gastrointestinal helminthiasis. Parasitol. Today. 8, 49-54 (1992).
  2. Maizels, R. M., et al. Immune modulation and modulators in Heligmosomoides polygyrus infection. Exp. Parasitol. 132, 76-89 (2012).
  3. Hewitson, J. P., et al. Heligmosomoides polygyrus elicits a dominant nonprotective antibody response directed at restricted glycan and peptide epitopes. J Immunol. 187, 4764-4777 (2011).
  4. Walk, S. T., Blum, A. M., Ewing, S. A., Weinstock, J. V., Young, V. B. Alteration of the murine gut microbiota during infection with the parasitic helminth Heligmosomoides polygyrus. Inflamm Bowel Dis. 16, 1841-1849 (2010).
  5. Rausch, S., et al. Small intestinal nematode infection of mice Is associated with increased enterobacterial loads alongside the intestinal tract. PLoS ONE. 8, e74026 (2013).
  6. Reynolds, L. A., et al. Commensal-pathogen interactions in the intestinal tract: Lactobacilli promote infection with, and are promoted by, helminth parasites. Gut Microbes. 5, 10-19 (2014).
  7. Saunders, K. A., Raine, T., Cooke, A., Lawrence, C. E. Inhibition of autoimmune type 1 diabetes by gastrointestinal helminth infection. Infect Immun. 75, 397-407 (2007).
  8. Liu, Q., et al. Helminth infection can reduce insulitis and type 1 diabetes through CD25- and IL-10-independent mechanisms. Infect Immun. 77, 5347-5358 (2009).
  9. Donskow-Łysoniewska, K., Krawczak, K., Doligalska, M. Heligmosomoides polygyrus: EAE remission is correlated with different systemic cytokine profiles provoked by L4 and adult nematodes. Exp Parasitol. 132, 243-248 (2012).
  10. Mishra, P. K., Patel, N., Wu, W., Bleich, D., Gause, W. C. Prevention of type 1 diabetes through infection with an intestinal nematode parasite requires IL-10 in the absence of a Th2-type response. Mucosal Immunol. 6, 297-308 (2013).
  11. Sutton, T. L., et al. Anti-Inflammatory mechanisms of enteric Heligmosomoides polygyrus infection against trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis in a murine model. Infect Immun. 76, 4772-4782 (2008).
  12. Hang, L., et al. Heligmosomoides polygyrus bakeri infection activates colonic Foxp3+ T cells enhancing their capacity to prevent colitis. J Immunol. 191, 1927-1934 (2013).
  13. Bashir, M. E., Andersen, P., Fuss, I. J., Shi, H. N., Nagler-Anderson, C. An enteric helminth infection protects against an allergic response to dietary antigen. J Immunol. 169, 3284-3292 (2002).
  14. Wilson, M. S., et al. Suppression of allergic airway inflammation by helminth-induced regulatory T cells. J. Exp. Med. 202, 1199-1212 (2005).
  15. Kitagaki, K., et al. Intestinal helminths protect in a murine model of asthma. J Immunol. 177, 1628-1635 (2006).
  16. Hartmann, S., et al. Gastrointestinal nematode infection interferes with experimental allergic airway inflammation but not atopic dermatitis. Clin Exp Allergy. 39, 1585-1596 (2009).
  17. Pritchard, D. I., Lawrence, C. E., Appleby, P., Gibb, I. A., Glover, K. Immunosuppressive proteins secreted by the gastrointestinal nematode parasite Heligmosomoides polygyrus. Int. J. Parasitol. 24, 495-500 (1994).
  18. Grainger, J. R., et al. Helminth secretions induce de novo T cell Foxp3 expression and regulatory function through the TGF-β pathway. J Exp Med. 207, 2331-2341 (2010).
  19. McSorley, H. J., et al. Suppression of type 2 immunity and allergic airway inflammation by secreted products of the helminth Heligmosomoides polygyrus. Eur. J. Immunol. 42, 2667-2682 (2012).
  20. McSorley, H. J., Blair, N. F., Smith, K. A., McKenzie, A. N. J., Maizels, R. M. Blockade of IL-33 release and suppression of type 2 innate lymphoid cell responses by helminth secreted products in airway allergy. Mucosal Immunol. 7, 1068-1078 (2014).
  21. Behnke, J. M., Menge, D. M., Noyes, H. Heligmosomoides bakeri: a model for exploring the biology and genetics of restance to chronic gastrointestinal nematode infections. Parasitology. 136, 1565-1580 (2009).
  22. Filbey, K. J., et al. Innate and adaptive type 2 immune cell responses in genetically controlled resistance to intestinal helminth infection. Immunology and Cell Biology. 92, 436-448 (2014).
  23. Bortolatto, J., et al. Toll-like receptor 4 agonists adsorbed to aluminium hydroxide adjuvant attenuate ovalbumin-specific allergic airway disease: role of MyD88 adaptor molecule and interleukin-12/interferon-gamma axis. Clin Exp Allergy. 38, 1668-1679 (2008).
  24. Wilson, M. S., et al. Helminth-induced CD19+CD23hi B cells modulate experimental allergic and autoimmune inflammation. Eur J Immunol. 40, 1682-1696 (2010).
  25. Segura, M., Su, Z., Piccirillo, C., Stevenson, M. M. Impairment of dendritic cell function by excretory-secretory products: A potential mechanism for nematode-induced immunosuppression. Eur J Immunol. 37, 1887-1904 (2007).
  26. Hewitson, J. P., et al. Proteomic analysis of secretory products from the model gastrointestinal nematode Heligmosomoides polygyrus reveals dominance of Venom Allergen-Like (VAL) proteins. J Proteomics. 74, 1573-1594 (2011).
  27. Moreno, Y., et al. Proteomic analysis of excretory-secretory products of Heligmosomoides polygyrus assessed with next-generation sequencing transcriptomic information. PLoS Negl Trop Dis. 5, e1370 (2011).
  28. Hewitson, J. P., et al. Secretion of protective antigens by tissue-stage nematode larvae revealed by proteomic analysis and vaccination-induced sterile immunity. PLOS Pathogens. 9, e1003492 (2013).
  29. Prowse, S. J., Mitchell, G. F. On the choice of mice for dissection of strain variations in the development of resistance to infection with Nematospiroides dubius. Austral J Exp Biol Med. 58, 603-605 (1980).
  30. Behnke, J. M., Robinson, M. Genetic control of immunity to Nematospiroides dubius: a 9-day anthelmintic abbreviated immunizing regime which separates weak and strong responder strains of mice. Parasite Immunol. 7, 235-253 (1985).
  31. Zhong, S., Dobson, C. Heligmosomoides polygyrus: resistance in inbred, outbred, and selected mice. Exp. Parasitol. 82, 122-131 (1996).
  32. Behnke, J. M., et al. Genetic variation in resistance to repeated infections with Heligmosomoides polygyrus bakeri, in inbred mouse strains selected for the mouse genome project. Parasite Immunol. 28, 85-94 (2006).
  33. Zaiss, M. M., et al. IL-1β suppresses innate IL-25 and IL-33 production and maintains helminth chronicity. PLoS Pathog. 9, e1003531 (2013).
  34. Reynolds, L. A., et al. MyD88 signaling inhibits protective immunity to the gastrointestinal helminth parasite Heligmosomoides polygyrus. J Immunol. , (2014).
  35. Morimoto, M., Utsumiya, K. Enhanced protection against Heligmosomoides polygyrus in IL-2 receptor β-chain overexpressed transgenic mice with intestinal mastocytosis. J Vet Med Sci. 73, 849-851 (2011).
  36. Urban, J. F., Katona, I. M., Paul, W. E., Finkelman, F. D. Interleukin 4 is important in protective immunity to a gastrointestinal nematode infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 5513-5517 (1991).
  37. Smith, K. A., Maizels, R. M. IL-6 controls susceptibility to helminth infection by impeding Th2 responsiveness and altering the Treg phenotype in vivo. Eur J Immunol. 44, 150-161 (2014).
  38. Hayes, K. S., Bancroft, A. J., Grencis, R. K. Immune-mediated regulation of chronic intestinal nematode infection. Immunol Rev. 201, 75-88 (2004).
  39. Fröhlich, A., et al. IL-21 receptor signaling is integral to the development of Th2 effector responses in vivo. Blood. 109, 2023-2031 (2007).
  40. King, I. L., Mohrs, K., Mohrs, M. A nonredundant role for IL-21 receptor signaling in plasma cell differentiation and protective type 2 immunity against gastrointestinal helminth infection. J Immunol. 185, 6138-6145 (2010).
  41. Ince, M. N., et al. Role of T cell TGF-β signaling in intestinal cytokine responses and helminthic immune modulation. Eur J Immunol. 39, 1870-1878 (2009).
  42. Reynolds, L. A., Maizels, R. M. Cutting Edge: In the absence of TGF-β signaling in T cells, fewer CD103+ regulatory T cells develop, but exuberant IFN-γ production renders mice more susceptible to helminth infection. J Immunol. 189, 1113-1117 (2012).
  43. Ekkens, M. J., et al. Memory Th2 effector cells can develop in the absence of B7-1/B7-2, CD28 interactions, and effector Th cells after priming with an intestinal nematode parasite. J Immunol. 168, 6344-6351 (2002).
  44. Greenwald, R. J., et al. B7-2 is required for the progression but not the initiation of the type 2 immune response to a gastrointestinal nematode parasite. J. Immunol. 162, 4133-4139 (1999).
  45. Ekkens, M. J., et al. The role of OX40 ligand interactions in the development of the Th2 response to the gastrointestinal nematode parasite Heligmosomoides polygyrus. J. Immunol. 170, 384-393 (2003).
  46. Hashimoto, K., et al. Immunity-mediated regulation of fecundity in the nematode Heligmosomoides polygyrus--the potential role of mast cells. Parasitology. 137, 881-887 (2010).
  47. Hepworth, M. R., et al. Mast cells orchestrate type 2 immunity to helminths through regulation of tissue-derived cytokines. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 6644-6649 (2012).

Tags

Иммунология выпуск 98, жизненный цикл выводные-секреторных продуктов иммунологии инфекции мышь
Выращивание<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus:</em&gt; Иммуномодулирующая нематода Паразит и его секретируемые продукты
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Johnston, C. J. C., Robertson, E.,… More

Johnston, C. J. C., Robertson, E., Harcus, Y., Grainger, J. R., Coakley, G., Smyth, D. J., McSorley, H. J., Maizels, R. Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products. J. Vis. Exp. (98), e52412, doi:10.3791/52412 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter