Summary
Здесь мы приводим протокол постоянно количественно клеточной адгезии и де-адгезионные процессы с высоким временным разрешением в неинвазивным способом импедансными клеток-субстрат и изображений живых клеток анализов. Эти подходы выявить динамику клеточной адгезии / де адгезии процессов, вызванных модификацией матрицы и их временных отношений к адгезии зависит от сигнальных событий.
Abstract
Cell-матрица адгезии играет ключевую роль в контроле клеточной морфологии и сигнализации. Стимулы, которые разрушают клетки-матрица адгезии (например, миелопероксидазы и другие матричные модифицирующие ферменты окислители / Наличие при воспалении) участвуют в вызове патологические изменения в клеточной функции, фенотип и жизнеспособность в ряде заболеваний. Здесь мы опишем, как сопротивление ячейки-субстрат и живые подходы изображений клетка может быть легко использована для получения точных количественных изменений в режиме реального времени в клеточной адгезии и де адгезии, вызванной модификации матрицы (с использованием эндотелиальных клеток и миелопероксидазы в патофизиологической матрицы, модифицирующие стимула) с высоким временным разрешением и в неинвазивным способом. Система сопротивление клеток подложки xCELLigence непрерывно количественно площадь клеток-матрицы адгезии путем измерения электрического импеданса на поверхности клетки с субстратом в клетках, выращенных на золотых массивов микроэлектродов. Анализ изображений в заданный промежуток времени дифферециал интерференционный контраст фильмы количественно изменения в области проекции отдельных клеток с течением времени, представляя изменения в области клеточной матрицы контакта. Оба метода точной количественной быстрые изменения в клеточной адгезии и де-адгезионных процессов. Cell-подложка сопротивление на микроэлектрод биосенсоров массивов обеспечивает платформу для измерений надежный, с высокой пропускной способностью. Изображений живых клеток анализирует обеспечить дополнительные сведения о характере и динамике морфологических изменений количественно измерения импеданса клетки с субстратом. Эти дополнительные подходы обеспечивают новые ценные знания о том, миелопероксидазы, катализируемых окислительной модификации субклеточных компонентов внеклеточного матрикса вызывает быстрые изменения в клеточной адгезии, морфологии и сигнализации в эндотелиальных клетках. Эти подходы также применимы для изучения динамики клеточной адгезии в ответ на другие матрицы, модифицирующие раздражителей и в смежных адгезивных клеток (например, эпителиальных клеток).
Introduction
Стабильные клеевые контакты между клетками и их окружающей внеклеточного матрикса необходимы для поддержания гомеостаза ткани. Например, эндотелиальной клеточной адгезии к субэндотелиального матрицы в кровеносных сосудах играет важную роль в поддержании целостности эндотелия слоя и его гомеостаза функцию в качестве регулирующего, полу-проницаемой сосудистой барьер 1. Актинового цитоскелета механически соединен с адгезивных молекул матрицы на участках клеток-матрицы адгезии и адгезионных контактов на границе ячейки матрицы играют важную роль в определении положения клеточной мембране с помощью сопротивление центрально-направленного актомиозинового растягивающие усилия. Внеклеточные стимулы, которые изменяют клетка-матрикс адгезии обязательно изменить баланс сил на границе ячейки матрицы, событие, которое быстро "почувствовал" по механо-чувствительных сигнальных белков, в результате чего в трансдукции "снаружи-внутрь сигнализации". Это перекрестные помехи ставкаWEEN клетки и окружающей их внеклеточный матрикс, играет ключевую роль в контроле формы клеток, подвижность, функцию, пролиферации и выживания 2.
Разнообразные патофизиологических процессов (эмбриональное развитие, воспаления, заживления ран и метастазирования рака) характеризуются динамической реконструкции клейкой матричных субстратов матрикс окислителей и / или ферментов 3,4. Например, клейкие субэндотелиальных матричные белки в кровеносных сосудах (например, фибронектин) участвуют в качестве основных целей для модификации или деградации при воспалительных заболеваниях человека из-за локализованного производства реактивных оксидантов (например, хлорноватистой кислоты, HOCl) на производный лейкоцитов фермента миелопероксидаза (MPO), который накапливается в субэндотелию при воспалительных сосудистых заболеваний (рис 1) 5-9. Изменения в клеточной матрицы адгезии, вызванные МПО, полученных из окислителей и других матричных изменения раздражителей ЛикЭли, играют важную роль в изменении сосудистой гомеостаза во различных патологических процессов: например, путем изменения сигнализации эндотелиальных клеток, морфологии и жизнеспособности, который, в свою очередь возмущает функцию эндотелия и целостности барьера. Тем не менее, морфологические и клеточные ответы сигнализации прикрепленных клеток на внеклеточные изменения матричных только начинают понимать.
Чтобы понять, как изменения матричные езды изменения в динамике клеточной адгезии и адгезии зависит от клеточных сигнальных путей, методы требовали, чтобы точно определить их изменения в клеточной матрицы адгезии в режиме реального времени, с высоким временным разрешением. Здесь мы опишем дополнительную сопротивление клетки с субстратом и живыми методы визуализации клеток, которые отвечают этим критериям и обеспечить платформу для количественной оценки адгезии клеток и де-адгезионные процессы в неинвазивным способом.
Мы покажем, как эти импеданс клетки с субстратом и живая соответствую изображений клетокболи могут быть легко использованы для (I) отслеживать динамику прикрепление клеток и распространения (т.е. заново клеточной адгезии) на нативных и модифицированных матричных субстратов и (II), чтобы измерить динамику клеток-матрицы отряда (т.е. де-адгезии ) по прикрепленных клеток, подвергшихся воздействию матричных изменения стимулов. Система xCELLigence клеток подложки сопротивление биосенсор обеспечивает непрерывное измерение области клеточной матрицы контакте с количественной электрического импеданса на поверхности массивов золота микроэлектродов 96-луночных и выражает эти электрические измерения импеданса, как «индекс клеток", безразмерная величина, которая в значительной степени пропорционально площади клеточной подложки контакта 10 (рисунок 2), в то же время будучи чувствительным к изменениям среднего расстояния между (изолирующего) клеточной мембраны и поверхности электрода 11. Дальнейшее увеличение значений индекса клеток достигается также при образовании плотного межклеточных контактов Тат ограничить парацеллюлярная течет ток, 11 условий, которые не преобладают в экспериментах, описанных в данном исследовании. Измерение площади проекции отдельных клеток с течением времени путем анализа изображения в заданный промежуток времени дифференциально-интерференционного контраста (DIC) фильмы обеспечивает дополнительную меру изменений в области клеточной подложки контакта и обеспечивает дополнительную информацию о точной природе и динамике морфологические изменения в количественном подходом импеданса клетки с субстратом.
В частности, мы опишем применение этих подходов для мониторинга, как МПО-перекисного окисления клеевых субэндотелиальных матричных белков (например, фибронектин) (I) снижает De Novo адгезии взвешенных эндотелиальных клеток на очищенной фибронектина и (II) вызывает клеток матрицы де -adhesion в эндотелиальных клетках с установленным сцепления на фибронектина. Выполняя сигнализации параллельной клеток анализирует более времени, используя соответствующую Biochemческие анализы (например, Вестерн-блоттинга), временные и причинно-следственные связи между адгезии / де-адгезии процессов и связанных с ними изменений в клеточных сигнальных событий в зависимости от адгезии может быть определена.
Эти подходы были использованы недавно, чтобы продемонстрировать, что внеклеточный матрикс окисления катализируется субэндотелиальных месторождений MPO вызывает быструю потерю в клетки-матрицы адгезии эндотелиальных клеток, который приводится в уже существующих актомиозин сократительных сил 9. Важно отметить, что, позволяя временную связь между изменениями как клеточной адгезии и адгезии зависимой клеточной сигнализации должны быть определены, эти подходы установлено, что МПО-индуцированной модификации матрицы и сотовой де-адгезия вызывает изменений в важных адгезии зависит от клеточных сигнальных путей, включая Src киназы -зависимой паксиллина фосфорилирования и легкой цепи миозина II фосфорилирования (рис 1) 9. Этот режим окислительно-восстановительной зависит сигнализации, инвolving активацию внутриклеточных сигнальных событий внеклеточными окислительных реакций, которые разрушают клетки-матрикс адгезии, представляет роман режим клеточной сигнализации называют "вне-в окислительно-восстановительных сигнализации" (Рисунок 1) 9.
В общем, эти комплементарной биосенсора клеток подложки сопротивление и живые клетки подходы изображений должно быть ценным в выявлении, как различные матричные модифицирующие агенты или раздражители привод изменения в динамике клеточной адгезии, морфологии и сигнализации в различных адгезивных типов клеток, подлежащих широкого спектра экспериментальные установки.
Следующий протокол описывает, как количественно оценить влияние МПО-опосредованной матрицы окисления на де Ново эндотелиальной клеточной адгезии (эксперимент 1) и эндотелиальных клеток-де-адгезии (эксперимент 2) процессов. МПО связывается жадно фибронектина и других клейких субэндотелиальных белков внеклеточного матрикса и насES перекись водорода (H 2 O 2), чтобы конвертировать ионы хлорида (Cl -) к высокой реакционной хлорирования окислителя хлорноватистой кислоты (HOCl), который реагирует на местах с этих матричных белков и нарушает их адгезионные клетки свойствами (рис 1) 8,9, 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Общие эндотелиальных клеток Культура
- Культура крупного рогатого скота: клетки эндотелия аорты (переходы 4-9) на покрытые желатином колбу с тканевой культурой (покрытие поверхности тканевой культуры с 0,1% вес / об желатин в PBS при комнатной температуре в течение 15 мин) в EGM-2 СМИ (с EGM-2 пули набор, содержащий 5% эмбриональной телячьей сыворотки, факторы роста и все дополнения, предоставленные производителем, для гидрокортизона, кроме).
- Когда клетки являются почти сливающийся (около 3 дней после посева после 1: 4 раскола), урожай клеток путем обработки 0,05% вес / об трипсина / 0,02% вес / объем ЭДТА в PBS при 37 ° С. После большинство клеток были отключены, добавьте полные EGM-2 СМИ, чтобы утолить трипсина, а затем центрифуги (100 XG, 5 мин).
- Подготовка клеток для исследований по де Ново адгезии эндотелиальных клеток к фибронектина (эксперимент 1: Раздел 2) и последующее де адгезии эндотелиальных клеток с установленным сцепления на этой подложке (эксперимент 2: раздел 3).
- Вымойте собираютКлетки один раз бессывороточной среде 199, содержащей 1% вес / объем бычьего сывороточного альбумина (BSA) и снова центрифуге (100 мкг, 5 мин).
- Повторное приостановить клеток в бессывороточной среде 199, содержащей 1% вес / объем BSA в 2,5 × 10 5 клеток / мл (клетки измерения импеданса-подложки) или 5 × 10 5 клеток / мл (изображений живых клеток анализы) и выдерживают при 37 ° С до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: адгезионные ответы клетки очень чувствительны к температурным перепадам (например, из-за эффектов конвекции), так что все оборудование и решения используются для обработки и лечения клетки в течение следующих протоколов должны храниться при постоянной температуре 37 ° С.
2. Эксперимент 1: Количественная De Novo эндотелиальных клеток Сцепление на отечественных и MPO-окисленного фибронектина (Cell-подложка импеданс)
Примечание: Эксперимент 1 рассматривает степень, в которой МПО-опосредованного окисления фибронектина ухудшает его способность поддерживать заново
- Пальто фибронектин на 96-луночных золотых клетки с субстратом массивов сопротивление микроэлектродов. Добавить 80 мкл / лунку очищают бычий фибронектин на 5 мкг / мл в PBS, инкубируют в течение 2 ч при 37 ° С и удалить раствор.
- Инкубируйте фибронектина покрытием поверхности с MPO, чтобы позволить связывание MPO к поверхностно св занному фибронектина. Добавить 80 мкл / лунку очищенного нейтрофилов человека МРО при 20 нМ в сбалансированном солевом растворе Хенкса (HBSS) и инкубируют в течение 0,5 ч при 37 ° С.
- Вымойте поверхности дважды HBSS для удаления несвязанного MPO.
- Добавить H 2 O 2 (0-10 мкМ конечная концентрация) в лунки микроэлектрода массива пластину, содержащую 80 мкл / лунку, чтобы инициировать HBSS MPO катализируемой, HOCl в зависимости от фибронектина к окислению и инкубируют в течение еще 0,5 ч при 37 ° С.
- Для изучения влияния соответствующих ингибиторов или модуляторов МПО-катализируемых реакций (например, альтернативная МПО ферментасубстраты, ингибиторы ферментов или антиоксиданты; см 9 для деталей), добавить их в HBSS непосредственно перед H 2 O 2 сложения.
- Через 0,5 ч, лечения поверхностей с метионином, чтобы утолить остаточных поверхностно-граница окисляющие видов, то есть реактивного белка связанного хлораминов, которые могут оказать смешанные клеточную активность. Добавить 10 мМ метионин в 80 мкл HBSS на лунку и инкубировали в течение 10 мин при 37 ° С.
- Блок поверхности с BSA. Добавить 80 мкл / лунку BSA в 0,2% вес / объем в ФБР, инкубировали в течение 2 ч при 37 ° С и удалить раствор.
Примечание: Остаточные непокрытые участки поверхности будет поддерживать клеточную адгезию и блокирование их с неклейкой белка (то есть, BSA) гарантирует, что клеточные ответы адгезии строго зависит от очищенного клеточного клей матрицы, используемой, в этом случае фибронектина. - Вымойте поверхности дважды HBSS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ни один из предыдущих поверхностных обработок значительно не влияет на клетки с субстратом читаешьGS. - Семенной подвесные эндотелиальные клетки (200 мкл / лунку при приблизительно 2,5 × 10 5 клеток / мл, приготовленные в бессывороточной среде 199, содержащей 1% BSA, см 1,3) на родных или МПО-окисленных фибронектина покрытием поверхностей.
- Сразу после посева клеток (т.е. до какого-либо прикрепление клеток и распространение), установите микроэлектродного массива пластину на инкубаторе порт (размещается в 37 ° C инкубаторе в присутствии 5% CO 2).
- Использование программного обеспечения прибора немедленно "пустым" чтение для нормализации последующего импеданса клеток-субстрат ("индекс клеток ') значения начальных фоновых значений, полученных в отсутствие клеточной адгезии.
- Инициировать приобретение непрерывных данных индекса клеток (минимум одной ячейки индекса чтения / мин).
- Инкубируйте клетки при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 2 ч, период времени, в течение которого максимальное вложение клеток и распространение достигается; это отражено вна плато значений индекса клеток (рис 3а).
ПРИМЕЧАНИЕ: предыдущий опыт (эксперимент 1) рассматривает, каким образом первоначальные МПО-перекисного окисления липидов фибронектина ограничивает способность эндотелиальных клеток, чтобы установить клеточную адгезию на этой подложке. Следующий эксперимент (эксперимент 2) рассматривает, как МПО-опосредованной фибронектин окисление способствует снижение в клеточной матрицы адгезии (т.е. де-покрытием) в эндотелиальных клетках с установленным адгезии к этой подложке. Лечение в этих двух экспериментов по существу идентичны, за исключением времени МПО-опосредованной фибронектина окисления, кроме (т.е. до клеточной адгезии - Эксперимент 1, после клеточной адгезии - Эксперимент 2).
3. Эксперимент 2: Количественная эндотелиальных клеток De адгезии из фибронектина в ответ на МПО-опосредованной фибронектина окисления (Cell-подложка сопротивление и живых изображений сотовый)
- Пальто фибронектин на 96-луночного золото микроэлектродов аrrays для измерения клетки-подложки импеданса (добавить 80 мкл / лунку фибронектина на 5 мкг / мл в PBS и инкубировали в течение 2 часов при 37 ° С) или 35 мм стеклянным дном чашки для культивирования клеток для анализа изображений живых клеток (добавить 2 мл / блюдо из фибронектина на 5 мкг / мл в PBS и инкубировали в течение 2 часов при 37 ° С).
- Блок поверхности с BSA. Добавить BSA в 0,2% вес / об в PBS в объемах, указанных в 3,1 и инкубируют в течение 2 ч при 37 ° С.
- Инкубируйте поверхности с MPO, чтобы позволить связывание с фибронектином MPO. Добавить 20 нМ очищенного человеческого MPO в HBSS при объемах, указанных в 3,1 и инкубируют в течение 0,5 ч при 37 ° С.
- Вымойте поверхности дважды HBSS для удаления несвязанного MPO.
- Семенной подвесные эндотелиальные клетки (полученного в бессывороточной среде 199, содержащей 1% вес / объем BSA, см 1,3) на нативных или МПО-несущих поверхностей, покрытых фибронектином.
- Добавить 200 мкл / лунку в 2,5 × 10 5 клеток / мл в 96-луночные клеток подложки массивов сопротивление микроэлектродов. <LI> Добавить 2 мл / чашку на 5 х 10 5 клеток / мл до 35 мм стекла дном чашки для культивирования клеток.
- Гора 96 а микроэлектрод массива пластины на клетки с субстратом сопротивление инкубатора порт (размещается в 37 ° C инкубаторе в присутствии 5% CO 2) и принимает "пустые" показания, чтобы начать непрерывное получение данных индекса клеток (см Раздел 2.10 ).
- Передача 35 мм стекла дном чашки для культивирования клеток в 37 ° C инкубаторе в присутствии 5% СО 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: HBSS используется при изучении МПО, катализируемых окислительных реакций вместо полной культуральной СМИ последний содержит окисляемых видов, которые мешают реакций окисления.
ПРИМЕЧАНИЕ: После 0,5 ч уравновешивания в HBSS, значения индекса клеток стабилизируется на уровне чуть более низкими значениями; при предварительной инкубации клеток с ферментные субстраты, и ингибиторов клеточной сигнализации или антиоксиданты, первый обеспечить тHESE существенно не влияет на значения, полученные после уравновешивания.
- Для исследований импеданса клеток с использованием пластин микроэлектрод массива 96 а:
- Удалить Микроэлектрод блока плиты из инкубатора и пауза измерения индекса клеток.
- Добавить H 2 O 2 (конечная концентрация 0-10 мкМ) в HBSS и осторожно перемешать путем многократного пипетки.
- Сразу же, перемонтировать массив микроэлектродного обратно на 37 ° C инкубатора порт и вновь начать приобретение показаний индекса клеток.
- Для живых визуальных исследований клеток с использованием 35 мм стекло дном культуре клеток блюдо:
- Удалить культуры блюдо из инкубатора и смонтировать на 37 ° C нагретого стадии перевернутой конфокальной микроскопии, снабженную 63X воды объектива с подходящими ОПК оптики для записи живых клеток фильмы.
- Сосредоточьтесь на клетки иоптимизировать DIC оптики (Kohler освещение, задержка смещения и камеры смещения / усиления; подробнее см 13).
- Инициировать DIC фильм и записать исходные показания с необработанными клетками в течение 1 мин.
- Добавить H 2 O 2 (конечная концентрация 0-10 мкм) и аккуратно перемешать путем многократного пипетки. Re-фокус микроскопа (при необходимости) и продолжить запись ОПК фильмы обработанных клеток на требуемый период времени.
4. Анализ и представление данных
- Данные сопротивление Cell-подложка
- Экспорт необработанных данных (индекс в зависимости от времени клетка) в электронную таблицу.
- Для клеток де адгезии исследований (эксперимент 2: раздел 3), нормализуют данные путем установки значений, записанных непосредственно до начала MPO-опосредованной фибронектина окисления при значении 1 (то есть, непосредственно перед добавлением H 2 O 2 в 3,11 .1.1).
Примечание: Это гарантирует, что относительнаяизменения в значениях индекса клеток, вызванными МПО-опосредованной фибронектина окисления не маскируется малых начальных различий в абсолютных значениях индекса клеток между скважинами.- Представление данных в виде графиков нормализованного индекса клеток (Y-ось) от времени (ось х).
- Данные изображений живых клеток (клеток-де-налипания исследования в эксперименте 2: раздел 3)
- Откройте DIC живого изображения клеток фильмы, записанные непосредственно до и после начала MPO-опосредованной фибронектина окисления в стандартной программе анализа изображения (например, ImageJ программного обеспечения).
- По крайней мере в двух отдельных ОПК фильмов случайным образом выбрать несколько ячеек и измерять их площадь проекции в виде последовательных кадров (например, в минутными интервалами 1) вручную прослеживая их мембраны край и количественной оценки количества закрытых пикселей.
- Экспорт необработанных данных (площадь проекции клеток в зависимости от времени) в таблицу Excel и нормализовать данные о площади клеток путем установки значений записываются непосредственно перединициирование МПО-опосредованной фибронектина окисления при значении 1 (то есть, непосредственно перед добавлением H 2 O 2 в 3.11.2.3).
- Представление данных в виде графика зависимости нормированного области клеток (ось у) от времени (ось х).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В режиме реального времени количественная оценка эндотелиальных клеток-де-адгезии от фибронектина в ответ на МПО-опосредованной фибронектина окисления (эксперимент 2). Посева эндотелиальных клеточных суспензий на родном (МПО бесплатно) фибронектина или МПО, несущих фибронектина приводит к привязанности максимальной клеток и распространение течение 2 часов, о чем судили по на плато значений индекса клеток в клетки измерения импеданса подложки (фиг.3А). Этот начальный этап прикрепления клеток и распространения заметно снижается, когда МПО-опосредованной фибронектин окисление начинается до посева клеток в экспериментах, проведенных в соответствии с протоколом, детально описанной в примере 1 (данные не показаны; подробнее см 9). После того, как максимальное клеточной адгезии устанавливается на родном или МПО, несущей фибронектина, целевые окисление фибронектина при посредничестве МПО-катализируемой HOCl (инициируется путем добавления МПО со-подложки H 2 O 2) вызывает быстрое снижение сюрплощадью поверхности клеточной матрицы контакта измеряется клетки с субстратом импеданса (рис 3а, б) и живого изображения клеток (рис 3С; для представительной ДВС кино, увидеть фильм 1; индекс ячейку или область ячеек потери после H 2 O 2 сложения являются минимальными в отсутствие МРО 9). Несмотря на то, индекс клеток и площадь клеток изменения во МПО-индуцированной де адгезии были очень похожи, сравнительно медленнее уменьшается в значениях индекса клеток может отражать изоляционные последствий клеточных мембран материалов, присутствующих в 'бесклеточных "регионами на периферии клетки в процессе деформации адгезия, которые не количественно прогнозируемых измерений ячеек. Быстрое сотовой де-адгезии очевидными в эндотелиальных клетках, связанных с МПО несущей фибронектина в ответ на H 2 O 2 лечение отсутствует в клетках, обработанных H 2 O 2 в одиночку (т.е. клетки, которые не содержат MPO) (фиг.3А) и заблокирован бу MPO ингибиторы АПФ или HOCl поглотители (данные не показаны, см 9 для деталей), определение, что этот процесс зависит от МПО-катализируемой производства HOCl (см рис 1). Ингибирование миозина II двигательной функции с blebbistatin тормозит скорость эндотелиальных клеток-де-адгезии, измеренной клетки с субстратом импеданса (рис 3B) и изображений живых клеток (рис 3С, кино 2), выявление, что клеточная де-адгезию и сокращение в ответ в МПО-катализируемой субклеточном матрицы окисления обусловлена актомиозин растягивающих сил 9.
Рисунок 1. МПО-опосредованной внутриклеточной матрицы окисление вызывает клетка-матрикс де-адгезию и клеточной сигнализации. МПО вызывает быструю реакцию де-адгезионные и изменения в адгезии зависит сигнализации на посредничество целевой Oxidation клеевых субэндотелиальных матричных белков, связанных с следующие события 9: () МПО связывается жадно субэндотелиальной матрицы и использует H 2 O 2 для получения высокой реакционной окислитель HOCl, который реагирует на местах с матричными белками (например, фибронектина) и нарушает их сотовые адгезионные свойства. (Б) Это повреждение разрушает адгезионные контакты на интерфейсе клеток-матрицы, что приводит к (С) мембранной отвода управляется без сопротивления напряжения в актинового цитоскелета и изменение адгезии в зависимости от клеточных сигнальных путей (воспроизводится с разрешения Rees и др. 9 ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Figurе 2. Работа потока и принцип клетки с субстратом импеданса анализ для количественного эндотелиальных клеток де-адгезию с фибронектина в ответ на МПО-опосредованной фибронектина окисления (эксперимент 2). Значения индекса Сотовые измеренные в системе клеточного субстрата микрочипов сопротивление биосенсора отразить Способность клеточной мембраны, чтобы ограничить поля, вызванного ионные токи на поверхности электрода и пропорциональны площади клетки с субстратом контакта 10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3. В реальном масштабе времени количественное эндотелиальных клеток де-адгезии от фибронектина в ответ на МРО-опосредованного окисления фибронектина (эксперимент 2). Эндотелиальные клеточные суспензии (в бессывороточной среде 199, содержащей 1%БСА) высевали на родном или МПО несущей фибронектина (фибронектина покрытием на 5 мкг / мл, а затем инкубировали в отсутствие или в присутствии 20 нМ МРО) в 96-луночных массивов микроэлектродов (измерения клеток подложки импеданс) или 35 мм со стеклянным дном чашки для культивирования клеток (визуализация живых клеток анализы). Затем клетки инкубировали при 37 ° С в течение 2 ч, чтобы позволить прикрепление клеток и максимальный распространения до уравновешивания клеток HBSS и инициирование МПО-опосредованного фибронектина окисление путем добавления H 2 O 2 (10 мкм) (время H 2 O 2 Добавление установленный на т = 0 мин). () Очно-курс измерений клетки с субстратом импеданса до и после лечения с H 2 O 2 в присутствии (+ MPO) и отсутствии (-MPO) МРО. (B) измерения Cell-подложка сопротивление и (C) площадь клетки измерения по визуализации живых клеток анализы, после обработки МПО-клеток, содержащих Н 2 О 2 в присутствии (+ Blebbistatin) и отсутствие (-blebbistatin) ингибитора blebbistatin миозина II (40 мкМ). Индекс клеток и площадь клеток значения нормированы к значениям сразу до времени Н 2 O 2 сложения, которые были даны значение 1. индексных данных Cell представляют собой среднее SEM, измерения п = 6 повторных от представителя эксперимента. Значения площади ячейки представляют собой среднее SEM, п = 10 клеток (2 дублирующие кинофильмы, 5 случайно выбранных ячеек в кино: смотреть фильмы 1 и 2). (3В, 3С, Фильм 1 и Фильм 2 воспроизводятся с разрешения Риса и др. 9). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Фильм 1 . Временной интервал DIC микроскопии ролик эндотелиальных клеток, прилипших МПО несущей фибронектина в течение 0 - 15 мин после воздействия H 2 O 2 (10 мкм); 1 сек = 3 мин.
Фильм 2 . Временной интервал ДВС микроскопии ролик эндотелиальных клеток, прилипших МПО несущей фибронектина в течение 0 - 15 мин после воздействия H 2 O 2 (10 мкМ) в присутствии blebbistatin (40 мкМ); 1 сек = 3 мин.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cell-матрица адгезии и де-адгезионные процессы могут быть количественно точно в режиме реального времени с высоким временным разрешением, используя сопротивление клетки с субстратом и живого изображения клеток анализы. Эти реальном времени подходы обеспечивают большое преимущество над конечной точкой анализа клеточной адгезии, которые обеспечивают плохое временное разрешение. Благодаря точному количественного быстрого реагирования де-сцепления с высоким временным разрешением, эти анализы могут обеспечить критические понимание того, как морфологические ответы на изменения матричных регулируются и как они влияют на клеточные процессы сигнализации адгезии зависит от, измеренная параллельно с использованием соответствующих биохимических анализов (например, Вестерн-блоттинга).
В недавних исследованиях, эти подходы были использованы, чтобы показать новый роль МПО-опосредованной окисления субэндотелиальной матрицы в запуске де адгезии эндотелиальных клеток и показали: (я), что скорость де адгезии в решающей степени зависит предварительно существующие актомиозинсократимость (см фиг.3В и 3С) и (II), что потеря клеток-матрицы адгезии вынудили изменения в важных адгезии клеток в зависимости от сигнальных путей, включая Src-зависимой паксиллина фосфорилирования и легкой цепи миозина II фосфорилирования 9 (рисунок 1). Эти данные имеют важное значение для понимания функции эндотелия и целостность барьера при воспалительных реакциях, где субэндотелиальных внеклеточный матрикс участвует в качестве ключевого объекта оксидантов, вырабатываемого субэндотелиальных месторождений матрицы переплете МПО или других источников реактивной окислителей 3,5-9, 14.
Использование микрочипов, клетки с субстратом сопротивление системы биосенсора предоставляет платформу для надежных, измерения клеточной адгезии с высокой пропускной способностью. В каждую лунку 96 а клетки с субстратом массивов сопротивление микроэлектродов имеет потенциал, чтобы одновременно проанализировать 32 различных экспериментальных условиях (например, 3 скважины PER условие). Тем не менее, при сравнении небольших изменений в клеточной адгезии, по меньшей мере, четыре или более скважин должны быть использованы в экспериментальных условиях. Во время посева клеток и последующих клеточных лечения, следует позаботиться, чтобы все решения на 37 ° C и свести к минимуму время, необходимое для лечения клеток вне 37 ° C инкубатора окружающей среды (это позволяет избежать потенциальных разницу температур по матрице микроэлектродов, которые могут повлиять на ответы адгезии ). Следует отметить, что электрический ток на поверхности клетки с субстратом является чувствительным к ионной силы клеточного супернатанта 10: следовательно, клетки должны быть в равновесие после добавления новых Буферы / сред, чтобы получить устойчивый отклик индекс клеток до мониторинга эффекта стимула интереса (см 3,10 и рис 3а). Снижение показателя клеток может не только отражать снижение средней площади клеточной матрицы контакта, но может также отражать снижение количества прикрепленных клеток. Для того чтобы отличитьмежду этими возможностями, изменения в количестве подключенных клеток на микроэлектродов массивов может быть количественно сразу после измерений клетки с субстратом импеданса путем окрашивания фиолетовый кристалл этот подход был использован для подтверждения того, что МПО-опосредованной фибронектин окисление вызывает быстрое уменьшение средней площади клетка-матрикс контакт, но не способствует открепления клеток (подробнее см 9).
Ограничение метода импеданса клетки с субстратом является то, что он обеспечивает среднюю меру адгезии изменений по всем ячейкам, присутствующих на поверхности микроэлектродов и не дает информации о точной природе адгезии или морфологических изменений на уровне отдельных клеток. Для решения этого ограничения, живая клетка DIC микроскопии и анализа изображений обеспечивает дополнительную меру изменений адгезии и показывает морфологические изменения отдельных клеток. Таким образом, уменьшается индекс клеток в ответ на МРО-опосредованного окисления фибронектин MEAренные по импеданса клетки с субстратом (рис 3A) хорошо коррелируют с уменьшением площади проекции клеток измеренных живой анализа клеточного изображения ОПК фильмов (Рисунок 3В). Важно отметить, что ОПК фильмы показывают, что в отдельных клетках, МПО-индуцированной де адгезии предполагает быстрое втягивание периферических клеточных мембран от субстрата и соседних клеток и в конечном итоге приводит к клеток, принимающих компактный 'округляемой' морфологию, но и не приводит в открепления клеток (Фильм 1). Как с измерениями клетки с субстратом импеданса, чтобы обеспечить воспроизводимость клеточные ответы, следует проявлять осторожность, чтобы сохранить решения на 37 ° C до использования на клетки и стадии подогревом микроскопа (или аналогичного устройства контроля температуры) должны быть использованы в течение визуализации живых клеток Recordings.
Протоколы, описанные здесь, могут быть модифицированы путем замены легко фибронектин с другими очищенного матричных субстратов (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют требования к раскрытию информации делают.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array | ACEA Biosciences / Roche | E-Plate 96 | single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system |
| blebbistatin | Sigma | B0560 | selective inhibitor of non-muscle myosin-II |
| Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved | Lonza | BW-6001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | 05470 | |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | endothelial cell growth media kit |
| Fibronectin, lyophilized powder | Sigma | F-4759 | from bovine plasma |
| Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish | World Precision Instruments | FD35-100 | Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | cell culture substratum |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025076 | |
| Hydrogen peroxide | Merck | 107298 | |
| Medium-199 | Life Technologies | 11150-059 | serum-free cell media |
| Methionine | Sigma | M9500 | quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase |
| Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes | Millipore | 475911 | |
| RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system | ACEA Biosciences / Roche | Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 |
References
- Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. J Physiol. 569, 359-366 (2005).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).
- Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J. M., Davies, M. J. Oxidative damage to extracellular matrix and its role in human pathologies. Free Radic Biol Med. 44, 1973-2001 (2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4, 165-178 (2011).
- Baldus, S., et al. Endothelial transcytosis of myeloperoxidase confers specificity to vascular ECM proteins as targets of tyrosine nitration. J Clin Invest. 108, 1759-1770 (2001).
- Baldus, S., et al. Spatial mapping of pulmonary and vascular nitrotyrosine reveals the pivotal role of myeloperoxidase as a catalyst for tyrosine nitration in inflammatory diseases. Free Radic Biol Med. 33, 1010-1019 (2002).
- Thomas, S. R., Witting, P. K., Drummond, G. R. Redox control of endothelial function and dysfunction: molecular mechanisms and therapeutic opportunities. Antioxid Redox Signal. 10, 1713-1765 (2008).
- Rees, M. D., et al. Myeloperoxidase-derived oxidants selectively disrupt the protein core of the heparan sulfate proteoglycan perlecan. Matrix Biol. 29, 63-73 (2010).
- Rees, M. D., et al. Targeted subendothelial matrix oxidation by myeloperoxidase triggers myosin II-dependent de-adhesion and alters signaling in endothelial cells. Free Radic Biol Med. 53, 2344-2356 (2012).
- Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays. Assay Drug Dev Technol. 2, 363-372 (2004).
- Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).
- Vissers, M. C., Thomas, C. Hypochlorous acid disrupts the adhesive properties of subendothelial matrix. Free Radic Biol Med. 23, 401-411 (1997).
- Ziv, N. E., Schiller, J. Differential Interference Contrast (DIC) Imaging of Living Cells. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Kennett, E. C., et al. Peroxynitrite modifies the structure and function of the extracellular matrix proteoglycan perlecan by reaction with both the protein core and the heparan sulfate chains. Free Radic Biol Med. 49, 282-293 (2010).
- Sen, S., Ng, W. P., Kumar, S. Contractility dominates adhesive ligand density in regulating cellular de-adhesion and retraction kinetics. Ann Biomed Eng. 39, 1163-1173 (2011).
- Wildt, B., Wirtz, D., Searson, P. C. Programmed subcellular release for studying the dynamics of cell detachment. Nat Methods. 6, 211-213 (2009).
