Abstract
A criptococose é uma infecção potencialmente fatal causada por fungos patogênicos do gênero Cryptococcus. A infecção ocorre quando da inalação de esporos, que são capazes de replicar no pulmão profundo. A fagocitose por macrófagos de Cryptococcus é uma das formas que a doença é capaz de se espalhar para o sistema nervoso central para causar meningoencefalite letal. Portanto, o estudo da associação entre Cryptococcus e macrófagos é importante para entender a progressão da infecção. O presente estudo descreve um protocolo passo-a-passo para estudar macrófagos infecciosidade por C. neoformans in vitro. Usando este protocolo, o papel de esteróis de acolhimento em interações patógeno-hospedeiro é estudado. Diferentes concentrações de metil - ciclodextrina (MCD) foram usadas para esgotar o colesterol do sarcoma murino retículo semelhantes a macrófagos linha celular J774A.1. Depleção de colesterol foi confirmada e quantificada utilizando tanto um dis comercialmentee kit de colesterol quantificação e cromatografia em camada fina. Células de colesterol empobrecido foram activadas utilizando lipopolissacarídeo (LPS) e interferão gama (IFNy) e infectados com opsonizadas com anticorpos Cryptococcus neoformans de tipo selvagem em células H99 uma razão efector-para-alvo de 1: 1. As células infectadas foram monitorados após 2 horas de incubação com C. neoformans e seu índice fagocitário foi calculado. Depleção de colesterol resultou numa redução significativa do índice de fagocitose. Os protocolos apresentados oferecer um método conveniente para imitar o início do processo de infecção em ambiente de laboratório e estudar o papel da composição lipídica alojamento na infectividade.
Introduction
A fagocitose é um processo pelo qual as entidades extracelulares são internalizados pelas células hospedeiras. É uma arma fundamental no arsenal do sistema imunológico para se defender contra patógenos, mas o processo pode muitas vezes ser subvertida por patógenos para permitir a internalização e se espalhando por todo o corpo 1. A fagocitose é mediada por vários eventos de sinalização que resultam em anexo e imersão através de rearranjos do citoesqueleto da célula hospedeira. Fagócitos "profissionais" são capazes de reconhecer e ligar-se a opsoninas sobre a superfície do agente patogénico invasor para sinalizar para a ligação e a formação de lamelip�ios, que engolir o patógeno e formar um fagossoma 2. Entre as chamadas fagócitos 'profissionais' são os macrófagos. Os macrófagos são células altamente especializadas que realizam funções de proteção que incluem procurando e eliminando os agentes que causam doenças, reparar tecidos danificados, e mediação da inflamação, a maioria dosestes através do processo de fagocitose 1,2.
Cryptococcus neoformans é uma espécie de fungo patogênico que causa uma doença grave conhecida como criptococose. Esporos Cryptococcus são inaladas pelo acolhimento e resultar em uma infecção pulmonar, que é geralmente assintomática. Pensa-se que a exposição é extremamente predominante; uma amostra de 61 crianças a partir dos Infectologia Pediátrica do Hospital Clinic Center Bronx-Lebanon descobriu que todos os entrevistados tinham anticorpos para o glucuronoxylomannan polissacarídeo cryptococcal e outros estudos têm mostrado prevalência em ambos os vírus da imunodeficiência humana (HIV) não infectado e adultos infectados 3, 4. macrófagos alveolares são a primeira linha de resposta à infecção pulmonar e na maioria dos casos com sucesso claro o patógeno. No entanto, em indivíduos imunodeprimidos (pacientes por exemplo, HIV e AIDS) o fermento é capaz de sobreviver dentro dos macrófagos. Nestescasos, os macrófagos podem servir como um nicho para a replicação do patógeno e pode facilitar a sua difusão para o sistema nervoso central (SNC) em que a doença se torna fatal 5-8. Pensa-se que os macrófagos podem até mesmo entregar o fermento diretamente nas meninges, ajudando a levedura de atravessar a barreira hemato-encefálica através do modelo de "cavalo de Tróia" 3,9 - 11. Assim, é importante compreender o processo de fagocitose e os factores que a afectam, especialmente na infecção pelo fungo.
Trabalhos anteriores em outros sistemas de patógenos apontam para colesterol e lipídios jangadas formadas por colesterol como tendo um papel importante a desempenhar na fagocitose 12-15. O colesterol é as espécies mais abundantes de lípidos nas células de mamíferos e compreende 25 - 50% da membrana da célula de mamífero 16. Verificou-se que desempenham um papel na modulação da BIOPpropriedades hysical de membranas, alterando a sua rigidez 17. O colesterol e esfingolípidos em conjunto formam microdomínios lipídicos dentro da membrana conhecida como jangadas lipídicas. Jangadas lipídicas foram encontrados para ser envolvida na formação de caveolas, bem como o fornecimento de um domínio isolado para certos tipos de sinalização 16-18. Devido ao seu tamanho pequeno, é difícil estudar as jangadas lipídicas in vivo. Uma forma útil para estudar o papel de jangadas lipídicas é alterar os seus constituintes. Metil-β-ciclodextrina (MβCD) é um composto que foi encontrado para esgotar o colesterol das membranas de mamíferos e é normalmente utilizado para estudar o papel das jangadas lipídicas 18.
Neste protocolo, que apresentam um método para esgotar o colesterol das membranas das células hospedeiras e quantificar o efeito do esgotamento da capacidade das células hospedeiras para fagocitar C. neoformans in vitro. Este procedimento faz uso de cultura de células techniques sobre um macrófago imortalizado como linha celular (J774A.1) como um modelo para a infecção. Depleção de colesterol foi realizada por exposição a MβCD, que tem um núcleo hidrofóbico específico para o tamanho de esteróis e é capaz de actuar como um dissipador para o colesterol desenhá-lo para fora da membrana 19. Depleção de colesterol foi medida quantitativamente usando um kit disponível comercialmente e qualitativamente utilizando uma extracção de lípidos Bligh-Dyer modificado, seguidas por cromatografia em camada fina (TLC) 20. . Fagocitose foi medida através da infecção da linha celular com uma cultura de fermento opsonizado misturado com um cocktail de interferão-γ e lipopolissacárido para activar os macrófagos Cryptococcus foi opsonizadas utilizando um anticorpo glucuronoxylomannan (GXM) 21-23. A coloração e microscopia de experiências permitiu a visualização de células e do cálculo do índice de fagocitose de avaliar o grau de fagocitose. Tomados em conjunto, este protocolo describes um método de base que integra a alteração da composição lipídica com um processo fisiológico.
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Protocol
1. Colesterol depleção de células J774A.1 com MβCD
- Em uma cabine de segurança biológica estéril, sementes células tipo macrófagos J774A.1 5 10 por poço numa placa de 96 poços de cultura de células em 200 ul de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina / estreptomicina (P / S). Incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 O / N.
- Remover mídia da monocamada de células e lava-se as células duas vezes com solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) que foi filtrado e autoclavado.
- Adicionar 200 ul de solução MβCD na concentração desejada (10 mM mM ou 30 em PBS) ou 1x PBS como um controlo e incubar durante 30 min a 37 ° C com agitação. Remover o sobrenadante e reserva a RT para a análise quantitativa com um kit disponível comercialmente imediatamente após o procedimento.
- Lavar as células duas a três vezes com PBS 1x ou DMEM isento de soro e continuar com infecção ou lisam as células por pipetting de duas a três vezes com H2O desionizada para análise com cromatografia de camada fina ou com um kit.
NOTA: Após a depleção de colesterol um kit de colesterol quantificação disponíveis comercialmente podem ser utilizados. Consulte a seção de materiais para obter detalhes. Siga as instruções do fabricante, conforme escrito.
2. Observação de Colesterol conteúdo por cromatografia em camada delgada (TLC)
- Lavar um tanque TLC duas vezes com acetona e uma vez com uma solução de éter de petróleo: éter dietílico: ácido acético (65: 30: 1 por volume). Saturar o tanque com o éter de petróleo: éter dietílico: ácido acético (65: 30: 1 por volume) e solução deixar S / N.
NOTA: Organic solventes deve sempre ser usado sob uma coifa para evitar a inalação de vapor. Luvas e jaleco deve ser usado em todos os momentos. O ácido acético é um ácido forte e devem ser utilizados com cautela. - Em um gabinete de biossegurança estéril, semente 10 macrófagos-like 6 J774A.1 por poço em uma de 6 poços cell placa de cultura num volume de 5 ml de DMEM morno, suplementado com 10% FBS e 1% de P / S. Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 O / N.
- Esgotar macrófagos de colesterol, seguindo passos 1,2-1,4, substituindo 1 ml para 200 ul onde aplicável para explicar o maior tamanho bem.
- Adicionar 500 ul de Tripsina-EDTA a cada poço, incubar durante 3 min a 37 ° C, e raspe as células com um raspador de células.
- Transferir para um tubo de microcentrífuga e adicionar um adicional de 500 ul de DMEM morno, suplementado com 10% FBS e 1% de P / S.
- Rodar as células durante 5 min a 300 xg e remover o sobrenadante.
- Adicionar um adicional de 500 ul de DMEM morno, suplementado com 10% FBS e 1% de P / S para a pelete de células e ressuspender cuidadosamente, pipetando para cima e para baixo.
- Retirar 10 ml de células e contagem de células em um hemocitômetro. Normalizar as concentrações de células a partir de cada amostra e adicionar um número igual de células para tubos de vidro.
NOTA: Neste passo, um maioescolher a combinação de células a partir dos mesmos grupos de tratamento para se obter um extracto mais concentrado final de lípido. - Centrifugar células a 300 xg por 5 min a RT e remover mídia.
- Adicionar 2 ml de metanol e vortex. Em seguida, adicione 1 ml de clorofórmio e vortex. Verifique o estado de fase para garantir que a solução em monofásico.
NOTA: Os tubos podem ser armazenados a 4 ° CO / N. - Centrifugar a 1.700 xg durante 10 min à temperatura ambiente e transferir o sobrenadante para um novo tubo
- Adicionar um adicional de 1 ml de clorofórmio, seguido de 1 ml de dH 2 O. Vortex duas vezes durante 30 segundos. Centrifugar a 1.700 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
- Pesar um tubo de vidro sobre uma balança sensível e utilizar uma pipeta de Pasteur de vidro para transferir a fase mais baixa no tubo de vidro de peso conhecido.
- Seque-se lipídios em um evaporador centrífugo até secar (cerca de 2 horas). Pesar tubo com lípidos secos e calcular o peso seco de lípidos.
NOTA: lípidos secos podem ser armazenados em -20 ° C até estar pronto para executar TLC. - Dilui-se lípidos secos em clorofórmio suficiente para normalizar a concentração de lípido (geralmente 20 - 50 ul) e 20 ul de carga do lípido diluído em uma placa de TLC de sílica. Carga de 20 ug de colesterol diluída em 20 ul de clorofórmio como um padrão.
- Adicionar placa TLC seco para o tanque TLC saturado e permitir solvente migrar até 1 cm antes da borda da placa. Retire a placa de TLC de tanque e deixe-a secar cerca de 5 min.
- Visualize lipídios, colocando em um tanque de vapor de iodo para verificar a migração. Remover manchas e permitir a desvanecer-se para cerca de 10 - 15 min sob o capô.
NOTA: O iodo é um perigo de inalação. Utilize sempre sob uma coifa. - Prepara-se uma solução para a coloração de lípidos neutros através da combinação de 60 ml de metanol com 60 ml de H2O desionizada, 4 ml de ácido sulfúrico, e 630 mg de cloreto de manganês.
- Cuidadosa e lentamente mergulhar na placa de TLC em solução de coloração de lípidos neutros em uma bandeja e remover sem desprendendo-se a sílica layer.
NOTA: A solução de coloração lípido neutro pode ser reutilizado várias vezes e por isso pode ser recuperado a partir da bandeja e colocados em um frasco de volta para uso posterior. - Permitir que a placa secar sob o capô à temperatura ambiente até que todas as bolhas desapareceu. Aquecer a placa de TLC em um conjunto de blocos de calor a 160 ° C e char para a cor desejada.
NOTA: Um programa de densitometria como funciona a visão LS pode ser utilizado para quantificar as bandas carbonizados para comparar amostras de lipídios.
3. A infecção de macrófagos com C. neoformans (H99)
- Em uma cabine de segurança biológica estéril, semente 10 5 células semelhantes a macrófagos por cavidade em uma placa de 96 poços de cultura de células em 200 ul de DMEM suplementado com 10% FBS e 1% de P / S. Incubar a 37 ° C, 5% CO 2, 5% de CO 2 O / N.
NOTA: A infecção também pode ser feito de vidro de fundo pratos confocal para imagens mais fácil; todas as quantidades permanecem as mesmas. - Crescer uma cultura de C. neoformans (H99)através da inoculação de 10 ml de YNB com uma colónia obtida a partir de uma placa atingido e incubando-O / N a 30 ° C com agitação.
- Lave e contar C. neoformans (H99) células.
- Centrífuga C. neoformans cultura O / N a 1700 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Remova a mídia e descarte. Lavar as células com 5 ml de PBS 1x. Centrifugar a 1.700 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Remover PBS e lavar com 5 ml de PBS 1x filtrada. Centrifugar a 1.700 xg durante 10 min a 4 ° C. Repita este passo mais 2 vezes.
- Remover PBS e ressuspender em 5 ml de PBS 1x.
- Fazer uma diluição em série em PBS para obter uma diluição de 1: 500 a cultura lavada.
- Adicionar 100 ul da amostra original de 900 ul de 1x PBS para obter uma diluição de 1:10.
- Adicionar 100 ul de amostra diluída a 1:10 900 ul de 1x PBS para obter uma diluição de 1: 100.
- Adicionar 200 ul de 1: 100 da amostra diluída para 800 ul de 1x PBS para se obter uma mistura 1: 500 dilutiem
- Tomar 10 ul de 1: 500 de diluição e contar com hemocitómetro para calcular o número de células.
- Prepare a solução de trabalho para ativar macrófagos e opsonizantes C. neoformans.
- Diluir LPS e IFN-y 100x de soluções estoque, adicionando 10 ml para 990 mL.
NOTA: LPS e IFN-y são utilizados para aumentar a absorção fagocíticas, mas não são necessárias para a fagocitose. Se houver um interesse na actividade fungicida de macrófagos, realizar activação de O / N a 37 ° C com agitação antes da infecção. - Por exemplo combinar 7,5 ul de LPS diluídas, 1,25 ul de IFNy diluída, 1,25 ul de anticorpo GXM e o volume da C. cultura neoformans que dá 1,25 x 10 5 células. Levar o volume até 250 ul multiplicado pelo número de amostras com DMEM suplementado com 10% FBS e 1% de P / S.
- Vortex e incubar solução durante 20 min a 37 ° C com agitação.
NOTA:Depleção de colesterol (passos 1,2-1,4) pode ser feita simultaneamente com o passo de opsonização. Certifique-se de tratar os macrófagos antes de se combinar a solução de trabalho, como as células opsonizadas deve ser otimamente não é mais usado do que 20 minutos após o passo 3.4.3 incubação.
- Diluir LPS e IFN-y 100x de soluções estoque, adicionando 10 ml para 990 mL.
- Infectam macrófagos
- Macrófagos lavar duas vezes com DMEM isento de soro e adicionar 200 mL de opsonizado C. neoformans solução de trabalho a cada poço.
- Incubar durante 2 horas a 37 ° C.
- Fixar e corar as células
- Remova a mídia e lavar as células duas vezes com DMEM.
- Secar a monocamada de células durante 10 min e adicionar 200 uL de metanol arrefecido em gelo para fixar as células.
- Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente e remover qualquer metanol remanescente.
- Adicionar 200 ul de 10x Giemsa e incubar durante 5 min à TA.
- Lave 2-3 vezes com água deionizada e seco O / N com tampa off.
NOTA: Imagem pode ser feito no dia seguinte ou até uma semana followicoloração ng.
- Visualize e Contagem
- Usando um microscópio, a contagem de 300 células por ponto de dados (se houver 2 do mesmo tratamento contar 150 por poço) e anote o número de macrófagos infectados e número de células Cryptococcus engoliram.
NOTA: Para garantir ainda amostragem per use ponto de dados 2 placas por estado, escolher 3 áreas não sobrepostas por placa e conte 50 células por área. - Calcular o índice fagocitário multiplicando a percentagem de macrófagos infectados pelo número significativo de C. neoformans por macrófago. Normalizar o índice fagocitário, expressando os valores como uma percentagem do controlo tratado com PBS 1x. Depois de vários ensaios calcular o valor médio e o desvio padrão da média para determinar as tendências no índice de fagocitose. Use t de Student para determinar a significância.
- Tome micrografias das células de 1000X ou aumento de 400X.
- Usando um microscópio, a contagem de 300 células por ponto de dados (se houver 2 do mesmo tratamento contar 150 por poço) e anote o número de macrófagos infectados e número de células Cryptococcus engoliram.
4. Ensaio de Azul de Tripano
- Em uma cabine de segurança biológica estéril, semente 10 6 células tipo macrófagos por cavidade em uma placa de 6 poços de cultura de células num volume de 5 ml de meio essencial mínimo de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina / estreptomicina . Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 O / N.
- Esgotar macrófagos de colesterol, seguindo passos 1,2-1,4 substituindo 2 ml para 200 ul onde aplicável para explicar o maior tamanho bem.
NOTA: Certifique-se de incluir um controle tratado com 1x PBS, bem como um controle que é raspado antes de qualquer tratamento. - Adicionar 500 ul de 1x PBS a cada poço e suavemente raspar as células com um raspador de células. Transferir para um tubo de microcentrífuga e suspender as células cuidado pipetando para cima e para baixo.
- Retirar 10 ml de células e mancha com 1 ml de 4% Trypan azul.
- Contagem de células em um hemocitômetro e calcular a viabilidade usando a seguinte equação:% de viabilidade = [1 - (células azuis / células totais)]x 100. Os valores de normalização para o controle que não foi tratado. Depois de vários ensaios calcular o valor médio eo desvio-padrão para determinar as tendências da viabilidade. Use t de Student para determinar a significância.
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Representative Results
Colesterol Esgotamento
Análise do sobrenadante reservado no passo 1.3 do protocolo, seguindo as instruções do fabricante no kit de Ensaio de Colesterol Amplex Red produz uma concentração elevada de colesterol na amostra MβCD tratados em comparação com o controlo de PBS 1x. Dependendo do tipo de célula e a depleção de colesterol concentração MβCD utilizada pode variar. Para J774 tratados com 10 mM de MβCD, foi observada uma diminuição de aproximadamente 50%. A depleção pode ser calculado utilizando os valores obtidos a partir do sobrenadante e lisado celular recolhido na etapa 1,4 (Figura 1).
O lisado celular analisada utilizando TLC mostra uma acentuada diminuição na coloração de colesterol nas células tratadas com concentrações crescentes de MβCD (Figura 2A). Análise de densitometria de TLC mostra uma tendência semelhante ao ensaio quantitativo (Figura 2B). O método de Bligh-Dyer dá uma ext brutoRact do total de lípidos, e é essencial para permitir a separação adequada de lípidos, a fim de identificar a banda correcta utilizando o padrão de colesterol.
Infecção
Após seguir o procedimento infecção, as células permanecem aderentes e intacta. A morfologia celular permanece inalterado entre os grupos de tratamento. Um grupo de controlo que não tenha sido exposto a C. neoformans serve como um ponto de verificação (Figura 3). É possível obter resultados sub-óptimos e podem manifestar-se como a lise das células e outros morfologias anormais. A causa mais provável é a contaminação da linha de células ou reagentes utilizados no procedimento. Micrografias das células infectadas de forma óptima mostram claramente C. neoformans tragado dentro das células de mamífero. Diferenças no número de levedura fagocitada pode ser observado por observação entre grupos de tratamento (Figura 4). Depois de calcular o índice fagocitário de 300 células de macrófagos por tratamento grupo umredução do índice de fagocitose é encontrada em células de colesterol empobrecido (Figura 5). A redução do índice de fagocitose não parece ser dependente de potenciais diferenças na activação de macrófagos, embora possam ocorrer. Realizando a infecção, na ausência de activadores de macrófagos, mas após tratamento com resultados MCD em uma redução semelhante do índice de fagocitose (dados não mostrados).
Trypan Blue
Coloração com Trypan Blue é utilizado para avaliar a viabilidade das células após a depleção de colesterol. Nenhuma mudança na viabilidade é observada entre PBS tratada e 10 mM MCD trataram células. Viabilidade parece cair ligeiramente após o tratamento com 30 mM de MCD, que pode ser esperado devido à depleção, aproximadamente, de 75% nos níveis de colesterol (um lípido essencial) observada na análise de densitometria (Figura 6 e Figura 2B).
Figura 1. Teor de Colesterol do sobrenadante após o tratamento. A quantificação de colesterol no sobrenadante recolhido a partir de células tratadas mostra enriquecimento em MCD quando comparado com 1x PBS. Depleção de colesterol é de 50 ± 5%, calculada a partir de níveis de colesterol total em 1x PBS (+ sobrenadante lisado celular). As barras de erro mostram o desvio padrão (n = 5).
Figura 2. TLC de colesterol no ligado celular e densitometria. Imagem da placa de TLC desenvolvido visualizado com MnCl 2 carbonização. Uma queda acentuada nos níveis de colesterol é observada após tratamento MβCD (A). Análise de densitometria das bandas, em comparação com o controlo tratado com PBS (mostrado como 100%), confirma tendência encontrado no ensaio de quantificação do colesterol (B Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. micrografias de controlo não infectadas de macrófagos J774 tratados. Imagens de células J774 não infectados tomadas a ampliação de 200X. Barra de escala é de 50 mm. 1x PBS (A), 10 mM MβCD (B), e MβCD 30 mM (C) células tratadas não mostram nenhuma mudança. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. A infecção de macrófagos J774, comC. neoformans Imagens de células J774 infectados tomadas a 400X (top de linha A.1 - C.1). E 1000X (linha inferior A.2 - C.2) ampliação são mostradas. Internalized C. células neoformans aparecem como esferas azuis-violeta com um anel mais leve que os rodeia. As células tratadas com 1x PBS (A), 10 mM MβCD (B), e MβCD 30 mM (C) mostram diferenças em C. neoformans captação. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. O índice fagocitário índice fagocitário. É mostrado em relação ao grupo de controlo que foi tratada com PBS (marcado a 100 para comparação). O índice fagocitário foi reduzida em 25% em 10MβCD mM de tratamento e por quase 55% por tratamento de 30 mM. As barras de erro mostram o desvio padrão da média (n = 4).
Figura 6. Viabilidade celular. Variações na viabilidade celular por ensaio azul de tripano mostram pouca variação em todos os três grupos de tratamento. Há uma ligeira queda na viabilidade no MβCD mM grupo de tratamento de 30, o que pode ser esperado de esgotamento de um componente tão importante da membrana. As barras de erro mostram o desvio padrão (n = 4).
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Discussion
Ao trabalhar com este protocolo é importante para obter a contagem de células precisos ao cultivo de células de mamíferos e opsonizantes C. células neoformans. Isto minimiza a variação entre ensaios e garante uma precisas 1: 1 de alvo da razão efector ao longo do estudo. Também é crítico para coordenar o momento da depleção de colesterol e para prevenir a infecção das células de levedura ou células opsonizadas macrófagos tratados de repouso à temperatura ambiente entre os processos. Longos períodos de espera poderia levar à perda de anticorpo opsonization ou a reposição de colesterol esgotados antes da infecção pode começar. Se as experiências são feitas com precisão a análise dos dados permite conclusões a ser discernido sobre o papel do colesterol na fagocitose.
As limitações da técnica impedir quaisquer conclusões sobre o mecanismo específico pelo qual o esgotamento colesterol reduz o índice fagocitário dos macrófagos como células, e não está claro se o effect decorre diretamente de colesterol ou devido a um mecanismo secundário. Mais trabalho ao longo desta veia investiga outros constituintes de jangadas lipídicas, tais como esf ingolípidos ou proteínas conhecidos em função de fagocitose, como o receptor Fcy e do receptor para o complemento 3 2. A modificação desta técnica para utilizar um anticorpo opsonização ou apenas complemento poderia ajudar a distinguir um papel para colesterol em uma ou ambas estas vias conhecidas. É também importante recordar que MβCD extrai colesterol com base na sua hidrofobicidade e tamanho, assim os esteróis de um tamanho semelhante podem também ser empobrecido e vai migrar a uma velocidade semelhante à do colesterol num TLC. É também importante notar que a depleção de colesterol podem afectar parcialmente a activação de macrófagos, isto é pouco provável que seja responsável pela diferença observada na captação como na realização da infecção, na ausência de IFN-y e com LPS mostra a mesma redução na absorção de C. neoformans (dados não mostrados), but é de interesse ao modificar esta técnica para estudar as atividades anti-fúngicos de macrófagos e o papel da ativação. Este método também não permite-nos a discernir se o esgotamento colesterol tem quaisquer implicações terapêuticas em infecção fúngica. Mais trabalho in vivo com medicamentos para baixar o colesterol e estudos epidemiológicos de pacientes em uso de medicamentos para baixar o colesterol poderia elucidar um papel para a depleção de colesterol no tratamento da doença e pode oferecer uma maneira mais seletiva para inibir o acúmulo de colesterol.
Este procedimento pode ser facilmente utilizado para estudar a absorção de outros agentes patogénicos ou partículas sólidas (isto é, pérolas de vidro) a ser fagocitado e permitem o estudo da biologia básica de fagocitose. Modificações poderia permitir o estudo de outros aspectos da fagocitose por tratamento das células macrófagos com enzimas para degradar selectivamente outros componentes de membrana ou vários fármacos e que podem ser inibidores de entreest. Deve também ser notado que a citometria de fluxo pode apresentar uma forma mais precisa e quantitativa para caracterizar a fagocitose e poderia ser utilizado para substituir a contagem microscópica directa 24. Ao todo, esta é uma técnica relativamente simples que pode ser utilizado como um ponto de partida para mais estudos aprofundados que respondem a perguntas sobre como lípidos podem desempenhar um papel importante na infecção e resposta imune.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH concede AI56168, AI71142, AI87541 e AI100631 de MDP. Maurizio Del Poeta é Burroughs Wellcome Investigator em Doenças Infecciosas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Class II type A2 Biosafety Cabinet | Labconco | 3460009 | |
| J774A.1 cell line | ATCC | TIB-67 | Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use |
| HI Fetal Bovine Serum Performance Plus | Gibco | 10082-147 | Keep frozen at -20 °C and thaw before adding to DMEM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | Used to suplement DMEM |
| Isotemp Cell culture incubator | Fisher Scientific | Model # 3530 | |
| 96-Well culture dish | Corning Inc. Costar | 3595 | |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific BioReagents | BP3994 | Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use. |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma Life Science | C4555-10G | Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10 mM and 30 mM concentrations |
| Orbital shaker | Labline | ||
| Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Life Technologies Molecular Probes | A12216 | All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions. |
| 96-Well Black Assay plate | Corning Inc. Costar | 3603 | |
| FilterMax microplate reader | Molecular Devices | Model F5 | |
| TLC chamber | Sigma-Aldrich | Z126195-1EA | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498-4L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-2L-R | |
| TLC Paper | Whatman | 3030917 | Cut down to size needed for TLC tank |
| Fume hood | Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards | ||
| 6-Well plate | Corning Inc. Costar | 3506 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Cell scraper | Corning Inc. Costar | 3010 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Model Alegra x-30R | |
| Votex mixer | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Balance | Mettler Toledo | Model # MS104S meaures down to 0.1 mg | |
| Glass Pasteur pipette | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | |
| SpeedVac concentrator | Thermo Scientific | Model # SPD2010 | |
| Petroleum ether | Fisher Scientific | E139-1 | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 309966 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| TLC Silica Gel 60 with concentrating zone | Analytical Chromatograhy Millipore | 1.11845.0001 | |
| Iodine chips | Sigma-Aldrich | 376558-50G | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| Manganese chloride | Sigma-Aldrich | 244589 | |
| UVP EC3 Imaging System | Ultra-Violet Products Ltd. | Use the Vision Works LS software for densitometry analysis | |
| Glass bottom confocal dish | MatTek | P35G-1.5-10C | www.glassbottomdishes.com |
| Cryptococcus neoformans (H99) | Obtained from Duke University Medical Center | ||
| YNB | BD | 239210 | See manufacturer for preparation instructions. Use a glucose concentration of 20 g/L. |
| Lipopolysaccharide | Sigma | L4391-1MG | Dissolve in 1x PBS to make 1 mg/ml stock. Store at -20 °C. |
| Interferon gamma | Sigma | I4777 | Dissolve in 1x PBS to make 0.1 mg/ml stock solution |
| Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM) | Gift from Arturo Casadevall's Lab concentration is 1.98 mg/ml | ||
| Giemsa | MP Biomedicals | 194591 | Dissolve 0.8 g of Giemsa in 25 ml of glycerol and heat to 60 °C for 1 hr. Add 25 ml of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month. |
| Microscope | Zeiss | Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images |
References
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