Introduction
سرطان المبيض هو الورم الخبيث الأكثر فتكا أمراض النساء في الولايات المتحدة مع سببا رئيسيا من أسباب المراضة والوفيات يجري في المتكررة للغاية، وميزات chemoresistant من هذا المرض. المعالجة الأولية تتكون عادة عملية جراحية cytoreductive القصوى واللاحق البلاتين العلاج القائم، على الرغم من أن هناك بعض الأدلة التي تشير إلى العلاج المواد الجديدة المساعدة قد تكون مفيدة في بعض الحالات 1. الغالبية العظمى من المرضى تستجيب بشكل إيجابي للعلاج الأولية، ولكن للأسف نصف والانتكاس خلال 18 شهرا 2.
معظم الأورام الخبيثة سرطان المبيض هي الظهارية ويمكن أن تنشأ في ظهائر سطح المبيض أو قناة فالوب 3،4. العديد من الدراسات تدعم وجود الخلايا الجذعية الجسدية في الجهاز التناسلي للأنثى التي تساعد يفترض في إصلاح الأنسجة أن هناك حاجة التالية الإباضة 5،6. النشاط التكاثري عالية في كل من المبيض وقناة فالوب خلال ovulأوجه قد يكون عاملا مهما في تطور سرطان المبيض (Gharwan، وآخرون. مخطوطة قدم). اشتقاق الخلايا المكونة للورم غير واضح ولكنها قد تنشأ من الخلايا الطبيعية الجذعية، الخلايا الاصلية، أو خلايا متباينة من خلال الطفرات التي تجعلها غير قادرة على تنظيم الانقسام أو مصير. كما تم وصف هذه الخلايا "الخلايا الجذعية السرطانية"، أو "الخلايا بدء السرطان"، ويمكن أن تنمو لتصبح مكون للأورام، الأجسام الشبه الكروية المتعددة الخلايا تحت ظروف الحجز منخفضة. على الرغم من أن نموذج هرمي للتنمية TIC قد تكون دينامية، لا الحيازات تبادل العديد من نفس خصائص الخلايا الجذعية العادية بما في ذلك السكون، ومقاومة للعلاج الكيميائي، على المدى الطويل التجديد الذاتي والقدرة على التمايز إلى مختلف الأنساب الخلية 7،8.
العديد من الدراسات تدعم وجود التشنجات اللاإرادية في سرطان المبيض وهي الجهود الحالية جارية لتوضيح آلية (ق) من هذه الخلايا التي تدعم تكون الأورام 9-11. وقد اقترحت عدة علامات لتحديد الحيازات المبيض مع تعزيز tumorigenicity بما في ذلك CD133، ALDH1A1، CD117، CD44، وMyD88، على الرغم من أن مساهمة الدقيقة لكل علامة غير واضحة وربما تكون نوع من الخلايا محددة 11-16. في حين أن علامة عالمية أو مجموعة من علامات لم يثبت بشكل لا لبس فيه لالحيازات المبيض، ومجموعات مختلفة عزلت الحيازات المبيض أكثر شيوعا عن طريق اختيار لCD44 +، CD133 + و / أو الخلايا مع ارتفاع ألدهيد نازعة (ALDH) النشاط 13،17-21. CD44 هو بروتين سكري عبر الغشاء الذي يعمل بمثابة مستقبلات للحمض الهيالورونيك وينظم العديد من العمليات الهامة لتطور الورم، بما في ذلك التصاق، والانتشار والهجرة والأوعية الدموية والتمايز 22. CD133 هو بروتين سكري عبر الغشاء الذي تتمثل مهمته لا يزال غير واضح ولكن تشير الدراسات إلى أنه ينظم غشاء البلازما طوبولوجيا 23. ALDH، وهو الانزيم الذي يحفز الخلايا أكسدة الألدهيدات، قد يكون معظم الكونتم التعرف آل علامة التشنجات اللاإرادية كنشاط عالية في الخلايا الجذعية المعزولة من مجموعة متنوعة من الأنسجة والأدوار المتعددة وقد نسبت إلى ALDH في دعم الخلايا الجذعية العادية والحيازات 24. اعتبارا من الآن، تظهر CD133 وALDH1 أن تكون علامات الأكثر استنساخه التشنجات اللاإرادية المبيض 13،21.
بالإضافة إلى فهم خصائص التشنجات اللاإرادية، وهناك أيضا جهد كبير لتحديد الأدوية التي تستهدف على وجه التحديد هذا حيوانية. قد يكون راجعا إلى فشل الكيميائي الحالية للقضاء على الحيازات بنجاح معدل الانتكاس عالية المرتبطة بسرطان المبيض. على الرغم من أن الجزء الأكبر من الورم هو عرضة للعلاجات الحالية، ويعتقد أن الحيازة مشتركة لتكون مقاومة وبكثافة لا يمكن الكشف عنها بالطرق العادية. آليات توضيح للمقاومة العلاج وورم انتكاس حيوية لتحسين الاستجابة ومعدلات البقاء على قيد الحياة العامة للمرضى الذين يعانون من سرطان المبيض.
هنا، يتم وصف تقنيات زراعة عشرفي إثراء لالحيازات من خطوط الخلايا السرطانية في المبيض أنشئت والابتدائية. وقد استخدمت الظروف الثقافة الموصوفة هنا من قبل عدة مجموعات للحث على نشر التشنجات اللاإرادية أو خلايا كروي مع صفات الخلايا الجذعية 11،12،14،16،20. على الرغم من أن هناك العديد من الوسائط زراعة الخلايا الجذعية والمكملات الغذائية التي تستخدم عادة لتخصيب الحيازات / الكروية استخدمنا صيغة خالية من المصل وسائل الاعلام مع EGF وجمعية جيل المستقبل، ولكن بدون إضافة B27 أو N-2 ملاحق. هذه الملاحق، وتستخدم عادة لزراعة الخلايا العصبية وإثراء للخلايا الجذعية، وقد ثبت لتعزيز النمط الظاهري الوسيطة 25،26 وهناك لا يزال بعض الشكوك في مجال ما إذا كان الحيازات وجود الوسيطة أو النمط الظاهري الظهارية هي أكثر مكون للأورام 27-29 . للحد من عدم اليقين والمتغيرات اخترنا أن استخدام الصيغة الأكثر شيوعا، حيث أننا نتعامل مع خلايا سرطان المبيض الظهاري.
الحفاظ على الخلايا في مصل الدم خالية من وسائل الاعلام في مرفق قارورة منخفضةيسهل تشكيل كروي وتدعم نشر الخلايا مع التعبير CD133 والنشاط ALDH عالية. وقد أظهر عملنا كذلك أن خلايا العائمة في ظل ظروف ملتصقة العادية يمكن أيضا أن يمثل السكان TIC أكثر مكون للأورام. حقن الخلايا المزروعة في هذه الظروف في الفئران عارية athymic يؤدي إلى إمكانية مكون للأورام أعلى بالمقارنة مع الخلايا المزروعة في ظروف المرفقة في وجود المصل. الكثير من المعلومات فيما يتعلق بدور التشنجات اللاإرادية في بدء المبيض السرطان، والتقدم، والاستجابة العلاجية، وانتكاس المرض ويمكن الحصول من خلال استخدام هذه التقنيات.
Protocol
1. الثقافة التقليدية من المبيض خطوط الخلية السرطانية (تمسكا الشروط)
ملاحظة: جميع التعامل مع الخلايا وسائل الاعلام يجب ان تتم في ثقافة غطاء محرك السيارة الأنسجة العقيمة
- إعداد التقليدي وسائل الإعلام ثقافة الخلية. استخدام 1: 1 DMEM: F12 (+ L-الجلوتامين، + 15 ملي HEPES) وتكملة مع 10٪ الحرارة المعطل مصل بقري جنيني و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين. حل تصفية باستخدام 0.45 ميكرون فلتر فراغ.
- إعداد التقليدية البوليسترين 75CM ثقافة الأنسجة 2 قارورة وصفت مع اسم وتاريخ ورقم مرور خط خلية من interest.Remove القارورة من الخلايا من الفريزر فائقة منخفضة أو النيتروجين السائل. تذويب عن طريق وضع في 37 ° C حمام الماء لمدة 5 دقائق.
- نقل تعليق من القارورة إلى 15 مل أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على 3 مل التقليدي وسائل الإعلام ثقافة الخلية (أعدت أعلاه). تعليق الطرد المركزي في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في 400 ز س. وفي الوقت نفسه، إضافة 16 مل سائل الإعلام ثقافة الخلية التقليدية إلى القارورة.
- نضح طاف. باستخدام 2 مل زراعة الخلايا خلايا الماصة وسائل الإعلام التقليدية صعودا وهبوطا لتخفيف بيليه ونقل إلى قارورة تعليق. بلطف قارورة الصخور لتوزيع بالتساوي cells.Place قارورة في ترطيب حاضنة الثقافة خلية المقرر ان 37 ° C وCO 2 5٪. مراقبة خلايا يوميا حتى يتم التوصل إلى 80٪ التقاء.
- وبمجرد أن الخلايا هي 80٪ متموجة انقسمت الثقافة 1: 2 في الثقافة خلية غطاء محرك السيارة. نضح طاف وتغسل مع الفوسفات مخزنة المالحة الدافئة (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم) (PBS). إضافة 1.5 مل التربسين 0.25٪ -EDTA واحتضان 3-5 دقيقة في RT.
- إعداد 2 البوليسترين جديدة 75CM 2 قوارير وإضافة 16 مل التقليدي وسائل الإعلام ثقافة الخلية إلى كل قارورة. resuspend الخلايا trypsinized في 4 مل سائل الإعلام ثقافة الخلية التقليدية وقسامة أحجام متساوية لكل من قوارير جديدة.
- مكان قوارير في ترطيب حاضنة الثقافة خلية مجموعة إلى 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. مراقبة خلايا يوميا حتى يتم التوصل إلى 80٪ التقاء. مواصلة لتقسيم الخلايا وثقافة أو تجميد وتخزين في -80 أو في النيتروجين السائل.
2. توليد الأجسام الشبه الكروية متعددة الخلايا من المبيض خطوط سرطان الخلية باستخدام العائمة أو منتسب خلايا
ملاحظة: جميع التعامل مع الخلايا وسائل الاعلام يجب ان تتم في غطاء نسيج الثقافة العقيمة. بعد زراعة خطوط الخلايا تحت أساليب الثقافة التقليدية لل2 - 3 في الممرات (القسم 1) المضي قدما في الخطوات التالية.
- إعداد وسائل الاعلام الخلايا الجذعية. استخدام 1: 1 DMEM: F12 (+ L-الجلوتامين، + 15 ملي HEPES) وتكملة مع 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (لتركيز النهائي من 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين)، 1٪ استبدال خروج المغلوب المصل و 0.4٪ ألبومين المصل البقري، و 0.1٪ الانسولين ترانسفيرين السيلينيوم. حل تصفية باستخدام 0.45 ميكرون فلتر فراغ.
- وسائل الاعلام الخلايا الجذعية الملحق مع العامل البشري المؤتلف نمو البشرة (EGF) والمؤتلف عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية البشري (جمعية جيل المستقبل) لتركيز النهائي من 20 نانوغرام / مل و 10 نز / مل على التوالي.
يجب إضافة عوامل النمو الطازج الى وسائل الاعلام الخلايا الجذعية الحق قبل الاستخدام: ملاحظة. - خلق ثقافة TIC العوام. إزالة قارورة من خلايا متكدسة 80٪ نمت في ظروف ثقافة ملتصقة التقليدية. جمع وسائل الإعلام وجميع الخلايا العائمة (واحد ومجاميع)، وترك السكان ملتصقة وراء، ونقل إلى 50 مل البولي بروبلين أنبوب الطرد المركزي. تعليق الطرد المركزي في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في 400 ز س.
ملاحظة: خلايا العائمة والمجاميع واضحة 24-72 ساعة بعد المرفقة الخلايا الملتصقة إلى قارورة تحت الثقافة التقليدية. من 80٪ لوحة متكدسة استرجاع حوالي 1،0-5،0 × 10 ويمكن توقع 5 خلايا عائمة قابلة للحياة، اعتمادا على خط الخلية. في هذه الدراسة أن متوسط عدد الخلايا العائمة التي تم جمعها من متكدسة 80٪ ثقافة ملتصقة كان: 5.0 × 10 5 لACI-23، 4.8 × 10 5 لOVCAR5، 3.5 × 10 5 لCAOV3، و 1.0 × 10 5 لTGS- 3. على نقل والمتعددة الخلاياتشكيل كروي الجزيئية في الثقافة TIC التقليدية والعوام يحدث في غضون بضعة أيام على الرغم من أن هذا هو إلى حد ما خط الخلية التابعة. على سبيل المثال، ACI-23 الخلايا تشكل مجاميع بسهولة أكبر من خلايا CAOV3. - وفي الوقت نفسه، بإعداد فائقة مرفق منخفض البوليسترين سطح 75 سم 2 زراعة الأنسجة قارورة وصفت مع اسم وتاريخ ورقم مرور خط الخلية. إضافة 10 مل وقف وسائل الاعلام خلية تستكمل مع عوامل النمو إلى قارورة.
- مرة واحدة الطرد المركزي هو كاملة، ووسائل الإعلام نضح ونقل بيليه إلى انخفاض مرفق قارورة وذلك بإضافة 6 مل وقف وسائل الاعلام الخلية وpipetting صعودا وهبوطا لتخفيف بيليه. مكان قوارير في ترطيب حاضنة الثقافة خلية مجموعة إلى 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. مراقبة خلايا كل 2 - 3 أيام لمراقبة تشكيل كروي.
- خلق ثقافة TIC التقليدية. إزالة قارورة من خلايا متكدسة 80٪ نمت في ظروف ثقافة ملتصقة التقليدية. وسائل الإعلام نضح ويغسل مع PBS الدافئ. إضافة 1.5 مل التربسين 0.25٪ EDTA واحتضان 3-5دقيقة في RT.
- إعداد فائقة مرفق منخفض البوليسترين سطح 75 سم 2 زراعة الأنسجة قارورة وصفت مع اسم وتاريخ ورقم مرور خط الخلية. إضافة 10 مل وقف وسائل الاعلام الخلية، على أن تستكمل مع EGF وجمعية جيل المستقبل، كما وصفها، إلى القارورة.
- إضافة 6 مل وقف وسائل الاعلام الخلية إلى القارورة مع التربسين. حل الخلية الماصة صعودا وهبوطا ومحاولة لتخفيف الخلايا من سطح القارورة. نقل كامل حجم الخلايا منخفضة جدا قارورة المرفقات التي تحتوي على 10 مل وقف وسائل الاعلام الخلية. مكان قارورة في ترطيب حاضنة الثقافة خلية مجموعة إلى 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- تكملة الثقافات TIC كل 48-72 ساعة مع إضافي 2 مل وقف وسائل الاعلام الخلية وEGF الطازجة وجمعية جيل المستقبل لتركيزات النهائي من 20 نانوغرام / مل و 10 نانوغرام / مل على التوالي.
- مراقبة الخلايا حتى 60 - ووصل إلى 80٪ التقاء. ثقافات سبليت عن طريق وضع كميات متساوية إلى 2 الجديدة فائقة قوارير مرفق منخفضة وإضافة وسائل الإعلام الخلايا الجذعية جديدة لتحقيق الحجم النهائي من 18 مل. بديللاي، الطرد المركزي تعليق بأكمله عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في 400 ز س. Resuspend الخلايا في وسائل الإعلام الخلايا الجذعية تستكمل مع EGF وجمعية جيل المستقبل وتوزع بالتساوي في قوارير مرفق منخفضة للغاية الجديدة. الخلايا لا بد من فصل في تعليق خلية واحدة لالركض.
ملاحظة: عند هذه النقطة الثقافات يمكن أن يستمر تقسيم ومثقف، والمجمدة، أو التلاعب تجريبيا للتحليل. في 60-80٪ التقاء تم استرجاع التركيزات التالية من الخلايا للACI-23: 8.0 × 10 6 لتمسكا التقليدية، 4.0 × 10 6 لTIC التقليدية، و 5.0 × 10 6 للثقافات العوام TIC. على الرغم من أنه قد يكون خط الخلية يعتمد، وجدنا أن 5 - 10 أيام في الثقافة هو الأمثل لتخصيب TIC كنسبة مئوية من CD133 + ALDH خلايا + منخفض في أول 3 أيام، قمم بنسبة 5 - 10 أيام، ويقلل مرة أخرى في 14 يوما.
3. توليد الظهارية الابتدائية سرطان المبيض خطوط الخلايا متعددة الخلايا والأجسام الشبه الكرويةمن الاستسقاء المرضى Chemoresistant
تم الحصول على موافقة مجلس المراجعة المؤسسية لهذا البروتوكول: ملاحظة. جميع التعامل مع الخلايا وسائل الاعلام يجب ان تتم في غطاء نسيج الثقافة العقيمة.
- استسقاء لوحة السوائل 1: 1 مع وسائل الاعلام التقليدية ثقافة الخلية. إعداد وسائل الاعلام كما هو موضح في القسم 1 وإضافة 10 مل لعدة البوليسترين 75 قوارير زراعة الأنسجة سم 2 التقليدية.
- عادة يتم توفير السوائل استسقاء في 1 L زجاجات فراغ معقم. إزالة غطاء فراغ. إضافة بعناية 10 مل استسقاء السائل إلى قارورة تحتوي على 10 مل وسائل الإعلام التقليدية ومكان في ترطيب حاضنة الثقافة خلية المنصوص إلى 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. ترك دون عائق ل72-96 ساعة، قبل القيام تغيير وسائل الإعلام كاملة. تغيير وسائل الاعلام كل 2 - 3 أيام حتى تصل إلى خلايا 60-80٪ التقاء
- مرة واحدة خلايا تصل 60-80٪ التقاء، وتقسيم 1: 2 كما هو موضح في القسم 1. الثقافات بدء TIC كما هو موضح في القسم 2.
ملاحظة: الكريات الحمر موجودة في ascitسيتم إزالة وفاق بعد التغيير سائل الإعلام الأول لأنها غير ملتصقة. أي الخلايا الليفية الحالية سيتم إزالة إلى حد كبير بعد العلاج مع التربسين لأنها أكثر حساسية وسترفع مع الحد الأدنى من التعرض للالتربسين. تم تحديد نقاء خلايا سرطان المبيض عن طريق تحليل التدفق الخلوي باستخدام الأجسام المضادة لCA-125 (MUC16).
4. تلون الخلايا للالتدفق الخلوي تأكيد TIC علامات
- جمع الثقافات TIC. نقل محتويات القارورة في 50 مل البولي بروبلين أنبوب الطرد المركزي. تعليق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 400 ز س. وسائل الإعلام نضح ويغسل مع PBS الدافئ. إضافة 2 مل غير الأنزيمية الحل تفارق الخلية، واحتضان 3-5 دقيقة عند 37 درجة مئوية، والماصة صعودا وهبوطا لتفتيت كتل وفصل إلى الخلايا واحد. إضافة 4 مل وقف وسائل الاعلام الخلية.
- جمع الثقافات ملتصقة. وسائل الإعلام نضح ويغسل مع PBS الدافئ. إضافة 3 مل غير الأنزيمية الحل تفارق الخلية واحتضان 3-5 دقيقة عند 37 ° C. إضافة 3 مل خلية التقليديةوسائل الإعلام والثقافة، والماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لفصل الخلايا من قارورة وجمع في أنبوب الطرد المركزي.
- الطرد المركزي على حد سواء TIC وتعليق ملتصقة مدة 5 دقائق في 400 ز س. تجاهل طاف و resuspend كل بيليه في 1 مل PBS تحتوي على 3٪ مصل بقري جنيني. في احتضان RT 30 دقيقة. وفي الوقت نفسه، عد عدد من خلايا قابلة للحياة باستخدام التريبان الأزرق. مراقبة الخلايا تحت المجهر لتأكد من أن يتم فصل الأجسام الشبه الكروية في الخلايا واحد.
- التسمية 5 × 1.5 مل أنابيب إيبندورف لكل من شروط الثقافة التالية: 1) غير ملوثين (مراقبة غير ملوثين للتعويض)، 2) ALDH (مراقبة وصمة عار واحدة إيجابية للتعويض)، 3) CD133 (مراقبة وصمة عار واحدة إيجابية عن التعويض)، 4 ) ALDH + CD133 (عينة الاختبار التجريبي)، و 5) DEAB + ALDH (ضوابط السلبية لمضان الخلفية في FL-1 وFL-4 قنوات، على التوالي).
- توزيع ما يقرب من 5 × 10 5 خلايا لكل لأنابيب # 1 - 4. تعليق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 400 ز س. نضح supernataالإقليم الشمالي و resuspend الكريات في 500 ميكرولتر Aldefluor الفحص العازلة. إضافة 10 ميكرولتر DEAB (ALDH المانع) إلى أنبوب رقم 5 لسيطرة سلبية التجريبية.
- إضافة 5 ميكرولتر تنشيط Aldefluor كاشف لأنبوب رقم 2 لمراقبة إيجابية التعويض ونفض الغبار إلى المزيج. إضافة 5 ميكرولتر تنشيط Aldefluor كاشف لأنبوب رقم 4 للتحليل التجريبي. أنبوب نفض الغبار لخلط وعلى الفور نقل نصف حجم الخلايا من أنبوب # 4 في أنبوب رقم 5 (250 ميكرولتر) الذي يحتوي على DEAB.
- أنابيب نفض الغبار إلى المزيج جيدا. احتضان جميع أنابيب لل30 - 45 دقيقة في 37 ° C محمية من الضوء. أنابيب نفض الغبار في منتصف الطريق من خلال فترة الحضانة كخلايا سوف تستقر في قاع. الطرد المركزي جميع الأنابيب لمدة 5 دقائق في 400 ز س. نضح طاف و resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر Aldefluor الفحص العازلة.
- للأنابيب مع CD133 تلطيخ (رقم 3 و 4)، إضافة CD133-APC 01:11 مباشرة في Aldefluor عازلة الفحص. احتضان 15 دقيقة على الجليد محمية من الضوء. أنابيب الطرد المركزي CD133 لمدة 5 دقائق في 400 ز س. يغسل مرة واحدة مع500 ميكرولتر Aldefluor عازلة الفحص. Resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر عازلة Aldefluor الفحص، على التوالي.
- فلتر تعليق في البوليسترين الفردية أنابيب أسفل مستديرة مع غطاء مصفاة الخلية. تأكد من أن وحدة التخزين بالكامل يتم تصفية من خلال الغطاء.
- الاستفادة من تدفق عداد الكريات لتحليل السكان الخلية. استخدام أنابيب # 1-3 لوضع ضوابط التعويض. باستخدام الأمام والمعلمات الجانبية مبعثر، بوابة الخلايا، ويجري التأكد من استبعاد الحطام الخلوي. إنشاء ALDH + وCD133 + خلايا مزدوجة باستخدام FL-1 وFL-4 قنوات، على التوالي.
- باستخدام برنامج التحليل cytometric، تأكيد الشروط الثقافة عززت النسبة المئوية للخلايا TIC AS ثقافات-TIC الغنية ينبغي أن يكون أعلى تلطيخ لهذه العلامات اثنين.
ملاحظة: بالإضافة إلى CD133 وALDH، يمكن تحليلها أخرى الحيازات سرطان المبيض markersof مع عدد من علامات استخدامها في أي عينة واحدة تعتمد على قدرات تدفق عداد الكريات.
5. في الجسم الحي
تم الحصول على موافقة مجلس المراجعة المؤسسية لهذا البروتوكول: ملاحظة. توزيع athymic الفئران عارية الإناث 6-8 أسابيع من العمر في المجموعات التجريبية في أقفاص من 3 والسماح ليتأقلم لبضعة أيام قبل الحقن. اتبع الفئران في إطار المبادئ التوجيهية التجريبية إنسانية وفقا NIH رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام. مراقبة وزن الجسم والمظهر الجسدي بما في ذلك فقدان الوزن أو اكتساب أكبر من 20٪، والمظهر الهزال، والإسهال أو التهاب الجلد والموت ببطء الفئران تركيب هذه المعايير من قبل CO 2 اختناق.
- جمع الثقافات كما هو موضح في القسم 2. و resuspend كل السكان الخلية في 1 مل PBS. عدد خلايا قابلة للحياة باستخدام فحص التريبان الأزرق.
- إعداد 15 مل أنابيب الطرد المركزي. لثلاث نسخ التدابير إضافة 1.5 × 10 6 خلايا قابلة للحياة مخففة في 2 مل PBS إلى كل أنبوب (5 × 10 5 الخلايا في حجم 0.5 مل سوف يتم حقنه تحت الجلد في حق وضامر من كل الماوس). إعداد 0.5 مل PBS فقط من أجل السيطرة على الفئران.
- استخدام الإبر 27 G، subcutaneouslyinject 0.5 مل تعليق خلية من ثقافات تمسكا التقليدية والثقافات TIC التقليدية، والعوام الثقافات TIC، أو برنامج تلفزيوني في الجهة اليمنى من كل من 3 الفئران في المجموعة. العودة الفئران لأقفاص الأصلية بعد الحقن.
- وزن الفئران وقياس أي أورام واضح في بعدين مرتين weeklyby الورنية الفرجار، وإنشاء الطول والعرض.
ملاحظة: الوقت ورم الكمون هو عادة 20-50 أيام اعتمادا على خط الخلية. - حساب الورم حجم الرطب بالطرق العادية (V = (العرض) × 2 طول / 2).
ملاحظة: على الرغم من أن هذه الدراسة مقارنة tumorigenicity التشنجات اللاإرادية مقابل الخلايا الملتصقة للجيل الأول فقط، وقد تم الانتهاء في الجسم الحي الركض التسلسلي التشنجات اللاإرادية نمت في ظل ظروف مماثلة من قبل الآخرين 11،20.
Representative Results
أنشئت خطوط الخلايا السرطانية في المبيض وخط الخلية استسقاء الأساسي نمت في ظروف ثقافة ملتصقة التقليدية في وجود عرض المصل المرفقة، المرصوفة بالحصى التشكل، في حين أن نفس الخلايا المزروعة في ظروف ثقافة TIC العرض يتحرك التشكل كروي، شائع في السكان TIC. الصور Brightfield المعروضة في الشكل 1 وتظهر بوضوح الاختلافات المورفولوجية في الظروف الثقافة. 1B الشكل يدل على الأشكال التضاريسية المتفاوتة التي تحققت بعد replating وACI-23 وTGS-3 الثقافات TIC في ظروف تمسكا التقليدية. فقط 24 ساعة بعد البذر العودة في ظروف ملتصقة، أغلبية الأجسام الشبه الكروية المتعددة الخلايا تنفصل ونعلق على السطح، تشبه الخلايا الملتصقة نموذجية.
للتحقق من أن الظروف TIC إثراء للخلايا مع علامات الخلايا الجذعية التدفق الخلوي تم إجراء التحليل باستخدام اثنين من علامات مشتركة التشنجات اللاإرادية المبيض - CD133 expressioن والنشاط ALDH. المؤامرات نقطة هو مبين في الشكل 2 وتسليط الضوء على نسبة متزايدة من CD133 + الخلايا في مرفق منخفضة، وظروف خالية من المصل. وبالمثل، فإن نشاط الإنزيم ALDH أعلى في هذه الظروف مقارنة مع الظروف ثقافة ملتصقة التقليدية. على الرغم من أن الثقافات تمسكا التقليدية تحتوي على CD133 + الخلايا، ويزيد من نسبة في ظل الظروف التي تعزز تشكيل كروي. تحليل علامة تعدد القدرات، TRA-1-60، يضفي المزيد من الدعم أن الظروف TIC إثراء لالحيازات، الشكل 2 B. يوضح الكمي في الشكل 2 C التي إيجابية مزدوج (CD133 + ALDH +) ACI-23 خلايا تقتصر إلى حد كبير على ثقافات نمت في ظل الظروف TIC تعزيز. تم فحص أيضا تغيرات في مستويات البروتين من العوامل النسخي المختلفة التي تحدث في ACI-23 الخلايا بعد خمسة أيام من الثقافة في الظروف TIC. وهناك زيادة مطردة في كل من علامةوينظر الصورة من التقليدية إلى العوام الظروف TIC مقارنة مع مستويات منخفضة نسبيا ينظر في ثقافة ملتصقة، الشكل 2 D. ومن المثير للاهتمام خط الخلية استسقاء البشري تزرع في مختلف الظروف يعرض أعلى النمط الظاهري علامة في ظل الظروف TIC التقليدية مع قليل من دون تلطيخ الحاضر في ظل الظروف TIC العوام، الشكل 2 E.
تم التحقق من صحة tumorigenicity الشروط الثقافة TIC من خلال الحقن تحت الجلد من عدد متساو من خلايا قابلة للحياة تم الحصول عليها من جميع الظروف إلى أفواج من الفئران عارية athymic الشكل 3 يدل على أن ACI-23 (A، B) وOVCAR-5 (C) الخلايا من كانت ملتصقة الثقافات التقليدية أقل مكون للأورام من تلك التي من الثقافات TIC. لاحظ أن العوام الثقافات TIC أنتجت الأورام الكبيرة في فترة زمنية أقصر من الثقافات التقليدية TIC ملتصقة أو التقليدية. هذه دآتا تشير إلى أنه حتى مع زيادة متواضعة في علامات TIC المبيض، يحدث تغير دراماتيكي المظهري. ولكن مع خطوط الخلايا الأخرى (لا يظهر) الثقافات TIC التقليدية كانت أكثر من مكون للأورام الخلايا ثقافة ملتصقة TIC والعوام التقليدية.
المبيض خطوط الخلايا السرطانية الشكل 1. تطوير كروي في ظروف ثقافة مختلفة. (A) تأسست (ACI-23، OVCAR-5 وCAOV3) والخلايا الأولية المستمدة من المريض استسقاء (TGS-3) تزرع في قوارير مرفق منخفضة مع المصل خالية وقف سائل الإعلام خلية تشكل بسهولة الأجسام الشبه الكروية المتعددة الخلايا. تظهر الصور الظروف ثقافة ملتصقة التقليدية المحافظة الظهارية التشكل المرصوفة بالحصى في ACI-23، OVCAR-5، CAOV3 وTGS-3 خلايا، في حين أن الخلايا نفسها شكلت الأجسام الشبه الكروية خلال 96 ساعة في ظروف TIC. مقياس شريط 100 ميكرون. (ب) عند التعرض 24 ساعةلظروف ثقافة ملتصقة التقليدية، وتعرض الأشكال التضاريسية الثقافة TIC النمط الظاهري متباينة تشبه التشكل ملتصقة الأصلي. مقياس شريط 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. منخفضة مرفق، وظروف خالية من المصل إثراء للخلايا مع علامات TIC. (A) التدفق الخلوي تحليل ACI-23 الخلايا باستخدام APC مترافق CD133 الأجسام المضادة يوضح زيادة النسبة المئوية من CD133 + الخلايا في قوارير مرفق منخفضة مع الجذعية المصل خالية وسائل الاعلام الخلية. التدفق الخلوي التحليل باستخدام يظهر فحص Aldefluor زيادة النشاط ALDH في الخلايا المستزرعة في قوارير مرفق منخفضة مع وسائل الاعلام الخلايا الجذعية خالية من المصل. تحتوي CD133 السيطرة السلبية لا الأجسام المضادة وALDH يخدع سلبي المحول المتعدد العادي هو الركيزة تفعيلها في وجود المانع ALDH (DEAB). (ب) تحليل باستخدام FITC مترافق TRA-1-60 الضد يدل على أعلى نسبة من + خلايا TRA-1-60 في الظروف TIC العوام في ACI-23 الخلايا. تحتوي سيطرة سلبية لا الأجسام المضادة. (C) CD133 + ALDH خلايا + هم أعلى في TIC التقليدية والعوام الظروف TIC في خط الخلية ACI-23. أشرطة الخطأ: SEM، N = 6 *، ف <0.05. (D) تحليل لطخة غربية تظهر زيادة في مستويات البروتين من علامات النسخي الخلايا الجذعية في ACI-23 الخلايا المستزرعة في ظروف TIC لمدة 5 أيام. وقد تم تحليل لست] خلية كاملة (50 ميكروغرام) مع GAPDH كعنصر تحكم التحميل. (E) نقطة المؤامرات التمثيلية للTGS-3 خلايا استسقاء الأولية تحليلها كما في A. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
EP-together.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 3. منخفضة مرفق، وظروف خالية من المصل إثراء للخلايا مع زيادة tumorigenicity. (A) 5 × 10 5 قابلة للحياة ACI-23 خلايا تم حقن تحت الجلد في الفئران عارية athymic في ثلاث نسخ. وتم وزن الفئران والأورام تقاس الفرجار مرتين أسبوعيا. A = الثقافة التقليدية ملتصقة والثقافة F = العوام TIC، والثقافة، S = TIC التقليدية. * P <0.05. (B) صور الممثل من الأورام التي تشكلت من ACI-23 بعد 25 يوما باستخدام الخلايا المزروعة في ظل ظروف ثقافة مختلفة. (C) 5 × 10 5 قابلة للحياة OVCAR-5 خلايا تم حقن تحت الجلد في الفئران عارية athymic في ثلاث نسخ ومراقبتها كما هو الحال في A. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
بروتوكول الموصوفة هنا يقدم وسيلة فعالة ومتسقة لإثراء الثقافات للخلايا مع ميزات الخلايا الجذعية من خطوط الخلايا السرطانية في المبيض ثابتة وقابلة للتطبيق على عينات المريض الأولية. هذه الطريقة يثري بنجاح لالحيازات المشتركة عبر مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا. انها تسمح لتحديد الوقت المناسب لظروف التي تثري لTIC و / أو النمط الظاهري مكون للأورام، من دون أخذ الوقت لفرز جسديا التشنجات اللاإرادية من غير الحيازات ضمن السكان. في هذه الطريقة، المستويات النسبية للمسارات إشارات مختلفة يمكن تقييم لمساهمتهم في النمط الظاهري TIC بمقارنة الثقافات تمسكا التقليدية إلى TIC الثقافات باستخدام مجموعة متنوعة من المقايسات الفنية. إذا كان المطلوب من السكان TIC النقي، والعزلة يمكن أن يتحقق بسهولة من خلال دمج خطوة بمساعدة مضان أو مغناطيسية الفرز في التدفق الخلوي البروتوكول.
من المهم أن نأخذ في الاعتبار، مع ذلك، أن التعبير عن علامة TICالصورة، مثل CD133، CD44، أو ALDH، قد تختلف بين خطوط الخلايا أو عينات من المرضى حتى من نفس النوع الورم. على سبيل المثال وجدنا أن OVCAR-5 الخلايا لديها أعلى من التعبير CD44 نسبة إلى CD133، في حين أن العكس هو الصحيح لACI-23. ولذا فمن المناسب أن الاعتماد على بدء الورم في الفئران والتدفق الخلوي التحليل كما نهائيا من الوجود TIC. بعد هذا البروتوكول، لوحظ نشاط ALDH عالية باستمرار عندما كانت تزرع خلايا سرطان المبيض في ظروف الخلايا الجذعية. ومن المثير للاهتمام، CD133 التعبير هو أعلى باستمرار في ACI-23 الخلايا المزروعة في ظروف ثقافة TIC التقليدية، في حين ALDH هو أعلى في ظروف TIC العوام. في المقابل تعرض TGS-3 خلايا استسقاء الأولية زيادة صغيرة في CD133 إيجابية في ظل ظروف TIC العوام، ولكن زيادة ملحوظة في النشاط ALDH في ظل ظروف TIC التقليدية. هذه النتائج تسلط الضوء على عدم تجانس خلايا سرطان المبيض واللدونة المرتبطة عادة مع الحيازات. لزيادة دعم CLAايم أن هذه الأساليب تعزز الحيازات، وقد لوحظ أيضا في إثراء TRA-1-60 خلايا إيجابية. TRA-1-60 هو علامة تعدد القدرات واستخدمت لتحديد سرطان الجنينية من المبيض والخصيتين وكذلك سرطان البروستاتا TICS 30-32. على الرغم من أن طرقنا كانت ناجحة مع العديد من خطوط الخلايا، فمن الممكن أن الشروط TIC القياسية قد تكون أنسب لبعض خلايا سرطان المبيض، في حين أن الظروف العوام تعديل إثراء أفضل لالحيازات في غيرهم من السكان خلية سرطان المبيض. وهذا يؤكد مرة أخرى عدم التجانس المتوقع سواء داخل المبيض خطوط الخلايا السرطانية للمرضى المشتقة وراسخة.
بالإضافة إلى علامات سطح الخلية هناك عدة عوامل النسخ التي ثبت أنها تميز الحيازات سرطان المبيض بما في ذلك NANOG، Sox2، أكتوبر 4 11، على الرغم من أن هذه العلامات ليست محددة لالحيازات سرطان المبيض وتمثل بدلا من العوامل الهامة لتعدد القدرات الخلايا الجذعية الجنينية وDIFferentiation 33،34. درسنا التغيرات في مستويات البروتين من هذه العوامل، ووجدت أن مستويات NANOG زيادة في ظروف ثقافة TIC، بالاتفاق مع الآخرين 13،35 وكذلك CD133، TRA-1-60، وCD117. وأظهر علامة الخلية الجذعية [كدنا مجموعة الإنسان مزيد من زيادة في الجينات CD133، NANOG، ميلك، وPODXL في الظروف TIC مقارنة مع الظروف ملتصقة التقليدية. الأهم من ذلك، وتجدر الإشارة إلى أنه، كما هو الحال مع علامات سطح الخلية، والعوامل النسخي المرتبطة الحيازات المبيض قد تختلف بين خطوط الخلايا وعينات المرضى.
وقد لاحظنا أن الخلايا قد تكون أكثر مكون للأورام والتعبير عن مستويات أعلى من علامات الخلايا الجذعية إذا كانت هي بطبيعتها غير ملتصقة في المختبر (أي الخلايا التي لا نعلق بسهولة إلى لوحة ملتصقة العائمة). في الثقافة، وخطوط الخلايا مثل ACI-23 وعادة ما يكون العديد من خلايا قابلة للحياة العائمة و / أو الخلايا التي تنمو عموديا بطريقة التراص تحت كونديت الثقافة التقليديةأيونات. وعلى الرغم من تخصيب ناجح التشنجات اللاإرادية من خلايا العائمة والمجاميع قد تكون خطوط الخلايا التي تنطبق على عدد قليل نسبيا بما في ذلك تلك الموجودة في هذه الدراسة وOVCAR-3 12، وتشير النتائج التي توصلنا إليها هذا قد يمثل السكان أكثر مكون للأورام. ولذلك، حصاد "عائم" سكان الخلايا المزروعة في لوحات زراعة الأنسجة القياسية وسائل الإعلام قد تكون بمثابة أسلوب بديل لتخصيب TIC، للخلايا التي تتكيف بشكل سيئ على وسائل الاعلام الخلايا الجذعية التجاري.
واستخدام الأساليب ثقافة مختلفة المعروضة في هذه المخطوطة تمكين تخصيب سريع للسكان التشنج وفهم أفضل لما العوامل دعم هذا النمط الظاهري في خلايا مختلفة. وتشمل التطبيقات الحالية لهذه الطريقة التي تميز مسارات إشارات حيوية لدعم انتشار هذه الفئة من السكان فريد من الخلايا. ونتائج هذه الدراسات تساعد على توضيح آليات تطور الورم والانتكاس.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Ultra - Low Attachment Flask | Corning | 3814 | |
| 75 cm2 Tissue Culture Flask | Sarstedt | 83.1813.002 | |
| Aldefluor Kit | Stemcell Technologies | 1700 | |
| CD133-APC | Miltenyi Biotec Inc. | 130-090-826 | |
| Fibroblast Growth Factor - Basic human recombinant | Sigma-Aldrich | F0291 | Prepared according to manufacturer's instructions |
| Epidermal Growth Factor - human recombinant | Sigma-Aldrich | E9644 | Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS |
| DMEM:F12 (+L-glutamine, +5 mM HEPES) | Gibco | 11330-032 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (without calcium and magnesium) | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-056 | |
| Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution | Corning Cellgro | 25-056-CI | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-10G | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 51500-056 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum (heat inactivated) | Gemini | 100-106 | |
| Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 μm) | Nalgene | 450-0045 | |
| 15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube | Corning | 430052 | |
| 50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
| Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl | Lonza | 17-942E |
References
- Coleman, R. L., Monk, B. J., Sood, A. K., Herzog, T. J. Latest research and treatment of advanced-stage epithelial ovarian cancer. Nat Rev Clin Oncol. 10, 211-224 (2013).
- Ushijima, K. Treatment for recurrent ovarian cancer-at first relapse. J Oncol. 2010, 497429 (2010).
- Erickson, B. K., Conner, M. G., Landen, C. N. The role of the fallopian tube in the origin of ovarian cancer. Am J Obstet Gynecol. 209, 409-414 (2013).
- King, S. M., et al. The impact of ovulation on fallopian tube epithelial cells: evaluating three hypotheses connecting ovulation and serous ovarian cancer. Endocr Relat Cancer. 18, 627-642 (2011).
- Flesken-Nikitin, A., et al. Ovarian surface epithelium at the junction area contains a cancer-prone stem cell niche. Nature. 495, 241-245 (2013).
- Paik, D. Y., et al. Stem-like epithelial cells are concentrated in the distal end of the fallopian tube: a site for injury and serous cancer initiation. Stem Cells. 30, 2487-2497 (2012).
- Connor, M. L., et al. Cancer stem cells: A contentious hypothesis now moving forward. Cancer Lett. 344, 180-187 (2014).
- Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nat Rev Cancer. 5, 275-284 (2005).
- Bapat, S. A., Mali, A. M., Koppikar, C. B., Kurrey, N. K. Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer. Cancer Res. 65, 3025-3029 (2005).
- Szotek, P. P., et al. Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 11154-11159 (2006).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68, 4311-4320 (2008).
- Wang, L., Mezencev, R., Bowen, N. J., Matyunina, L. V., McDonald, J. F. Isolation and characterization of stem-like cells from a human ovarian cancer cell line. Mol Cell Biochem. 363, 257-268 (2012).
- Kryczek, I., et al. Expression of aldehyde dehydrogenase and CD133 defines ovarian cancer stem cells. Int J Cancer. 130, 29-39 (2012).
- Meng, E., et al. CD44+/CD24- ovarian cancer cells demonstrate cancer stem cell properties and correlate to survival. Clin Exp Metastasis. 29, 939-948 (2012).
- Alvero, A. B., et al. Molecular phenotyping of human ovarian cancer stem cells unravels the mechanisms for repair and chemoresistance. Cell Cycle. 8, 158-166 (2009).
- Chen, J., et al. Evaluation of characteristics of CD44+CD117+ ovarian cancer stem cells in three dimensional basement membrane extract scaffold versus two dimensional monocultures. BMC Cell Biol. 14, 7 (2013).
- Guo, R., Wu, Q., Liu, F., Wang, Y. Description of the CD133+ subpopulation of the human ovarian cancer cell line OVCAR3. Oncol Rep. 25, 141-146 (2011).
- Curley, M. D., et al. CD133 expression defines a tumor initiating cell population in primary human ovarian cancer. Stem Cells. 27, 2875-2883 (2009).
- Baba, T., et al. Epigenetic regulation of CD133 and tumorigenicity of CD133+ ovarian cancer cells. Oncogene. 28, 209-218 (2009).
- Liao, J., et al. Ovarian cancer spheroid cells with stem cell-like properties contribute to tumor generation, metastasis and chemotherapy resistance through hypoxia-resistant metabolism. PLoS One. 9, e84941 (2014).
- Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Cancer Res. 71, 3991-4001 (2011).
- Jaggupilli, A., Elkord, E. Significance of CD44 and CD24 as cancer stem cell markers: an enduring ambiguity. Clin Dev Immunol. 2012, 708036 (2012).
- Irollo, E., Pirozzi, G. CD133: to be or not to be, is this the real question. Am J Transl Res. 5, 563-581 (2013).
- Ma, I., Allan, A. L. The role of human aldehyde dehydrogenase in normal and cancer stem cells. Stem Cell Rev. 7, 292-306 (2011).
- McLean, K., et al. Human ovarian carcinoma–associated mesenchymal stem cells regulate cancer stem cells and tumorigenesis via altered BMP production. J Clin Invest. 121, 3206-3219 (2011).
- Amara, I., Touati, W., Beaune, P., de Waziers, I. Mesenchymal stem cells as cellular vehicles for prodrug gene therapy against tumors. Biochimie. , (2014).
- Brabletz, T. EMT and MET in metastasis: where are the cancer stem cells. Cancer Cell. 22, 699-701 (2012).
- Latifi, A., et al. Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors. PLoS One. 7, e46858 (2012).
- Liu, S., et al. Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts. Stem Cell Reports. 2, 78-91 (2014).
- Malecki, M., et al. TRA-1-60(+), SSEA-4(+), Oct4A(+), Nanog(+) Clones of Pluripotent Stem Cells in the Embryonal Carcinomas of the Ovaries. J Stem Cell Res Ther. 2, (2012).
- Malecki, M., Tombokan, X., Anderson, M., Malecki, R., Beauchaine, M. TRA-1-60(+), SSEA-4(+), POU5F1(+), SOX2(+), NANOG(+) Clones of Pluripotent Stem Cells in the Embryonal Carcinomas of the Testes. J Stem Cell Res Ther. 3, 10-4172 (2013).
- Rajasekhar, V. K., Studer, L., Gerald, W., Socci, N. D., Scher, H. I. Tumour-initiating stem-like cells in human prostate cancer exhibit increased NF-κB signalling. Nat Commun. 2, 162 (2011).
- Loh, Y. H., et al. The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells. Nat Genet. 38, 431-440 (2006).
- Tay, Y., Zhang, J., Thomson, A. M., Lim, B., Rigoutsos, I. MicroRNAs to Nanog, Oct4 and Sox2 coding regions modulate embryonic stem cell differentiation. Nature. 455, 1124-1128 (2008).
- Lee, M., et al. Prognostic impact of the cancer stem cell-related marker NANOG in ovarian serous carcinoma. Int J Gynecol Cancer. 22, 1489-1496 (2012).
