Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati condotti secondo il National Institutes of Health (NIH) Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dalla Institutional Animal Care and Use Committee Yale University (IACUC).
Preparazione 1) Pre-chirurgiche
- Preparazione della soluzione orale
- Creare soluzioni di 10% di saccarosio e 0,005% L-mentolo in acqua deionizzata (pH 7,4). Conservare queste soluzioni in contenitori chiusi, a temperatura ambiente, e rifare ogni 2 settimane, per evitare il degrado.
- Soluzioni di riferimento di elettrodi
- Rendere tampone Tris (pH 7,4) in qualsiasi momento prima della calibrazione. La soluzione consiste di 12,0 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 3,25 mM KCl, 1,20 mM di CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 1.20 mM MgCl 2, e 2,00 mM Na 2 SO 4.
- Create una soluzione di dopamina 10 mm (DA, dopamina cloridrato) in 0,1 M di acido perclorico. L'acido perclorico aiuta a prevenire l'ossidazione della dopaminae. Conservare questa soluzione, a -20 ° C e utilizzare per un massimo di 6 mesi. Fate diverse aliquote della soluzione di riserva DA per l'archiviazione di usare ogni aliquota solo una volta.
- Dal magazzino DA 10 mm, soluzioni diluite in tampone Tris a concentrazioni di 1 micron, 500 nM, 250 Nm, 125 nM, 62,5 nm e 31.25 nM.
- Per la calibrazione del pH, preparare soluzioni tampone Tris con il pH di 7.2, 7.3, 7.5, e 7.6. Ciò fornirà soluzioni che imitano pH cambiamenti che possono verificarsi durante l'esperimento in vivo.
- Fabbricazione di elettrodi
- Con aspirazione a vuoto, aspirare una fibra di carbonio T-650 (7 micron di diametro) in un capillare di vetro borosilicato (lunghezza 10 mm, diametro esterno 0,6 mm 0,4 millimetri di diametro interno).
- Posizionare capillare di vetro riempita con fibra di carbonio in un elettrodo estrattore verticale. Per i parametri iniziali, impostare il riscaldatore a 55,0 e spegnere il magnete. Tuttavia, un'ulteriore ottimizzazione può essere necessario sia come riscaldamento e impostazioni magnetici variano frlaboratorio om al laboratorio.
Nota: L'elettrodo dovrebbe essere lunga almeno 5,5 centimetri (comprese cono) in modo che possa facilmente adattarsi micromanipolatore ed essere inserito almeno 6,9 millimetri al di sotto dura nel cervello di ratto. Se l'elettrodo è troppo breve, registrazioni da parte ventrale del nucleus accumbens non sarà realizzabile. D'altra parte, la lunghezza totale dell'elettrodo non deve superare 6,5 centimetri altrimenti sarà troppo lunga per micromanipolatore. - Utilizzando un microscopio ottico, tagliare la fibra di carbonio esposto in modo tale che si estenda 75-100 micron oltre l'estremità del vetro. Verificare che l'elettrodo ha una molto stretto, appena percettibile, tenuta tra l'elettrodo di vetro e fibra di carbonio, che produrrà minimo rumore durante la registrazione successiva. Eliminare l'elettrodo se ci sono delle crepe evidenti nel vetro o se il sigillo è sciolto, che è indicativo di una scarsa tenuta. Per informazioni più dettagliate, consultare [12] e [13].
- Montaggio del elettrodo nel microfonoromanipulator
- Ottenere un 3, 30G filo che è isolato lungo metà della lunghezza del filo e utilizzare un piccolo pennello per applicare uno strato sottile di argento vernice direttamente al filo. Immediatamente dopo l'applicazione della vernice argento, inserire il filo nel foro sulla parte superiore dell'elettrodo per fornire una connessione fisica ed elettrica alla fibra di carbonio. Al microscopio, assicurarsi che il filo di argento viene a contatto con la fibra di carbonio.
- Fissare il filo d'argento e elettrodo al micromanipolatore utilizzando termorestringente.
- Inserire l'elettrodo di carbonio preparati in alcool isopropilico purificato (IPA) per almeno 10 minuti per pulire la superficie dell'elettrodo e aumentare successiva sensibilità alla dopamina. Dopo l'immersione in IPA, sciacquare la fibra di carbonio con acqua di rubinetto per rimuovere l'IPA.
- Riferimento fabbricazione di elettrodi
- Prendete un filo 13 millimetri argento contenente uno di circa 6 millimetri maglie Ag / Ag Cl (7 millimetri filo d'argento da solo 6 mm di maglia, di diametro 0,4 millimetri),tagliare la parte d'argento fino a circa metà della sua lunghezza originale e saldare la parte d'argento del filo ad un perno oro.
- Applicare resina epossidica sulla saldatura sul perno.
- Immergere l'Ag / Ag Cl maglia fine in un copolimero di 5% politetrafluoroetilene e perfluoro-3,6-dioxa-4-metil-7octene-solfonico acido 5 volte, con 30 min periodi di essiccazione dell'aria tra ogni dip.
- Lasciare che il rivestito Ag / Ag Cl maglia asciugare O / N.
- Cure in forno caldo a 120 ° C per 1 ora.
2) Chirurgia combinata intraorale e intracranica Incannulazione Chirurgia (circa 75 min)
- Catetere orale fabbricazione
- Rendere il catetere per via orale, e sterilizzare in ossido di etilene, almeno 10 giorni prima dell'intervento.
- Tagliare PE 100 tubi in 6 cm di lunghezza segmenti.
- Utilizzando un saldatore, fondere un'estremità del tubo PE e premere immediatamente contro una superficie solida per raffreddare il tubo PE. Il risultato dovrebbe creareun piccolo disco piatto ad una estremità del tubo PE e non deve essere flangiato. Utilizzare un ago (18 G) o perno di spinta per creare un foro al centro di questo disco.
- D'altra estremità del tubo in PE, comodamente inserire l'estremità smussata di un ago G nel tubo 18.
- Utilizzando uno standard foro di carta perforatore, pugno diversi pezzi circolari di un foglio di politetrafluoroetilene (spessore 3,18 millimetri, 6 millimetri di diametro) per creare rondelle politetrafluoroetilene.
- Creazione di un foro al centro della rondella. Prendere l'ago attaccato al tubo PE e spingerlo completamente attraverso la rondella. Una volta che l'ago è attraverso, far scorrere la rondella sul fondo del tubo PE in modo che sia a filo contro la rondella.
- Chirurgia orale
- Dopo la sterilizzazione di strumenti chirurgici, cannula (tagliato a 2,5 mm sotto il piedistallo prima della sterilizzazione), ed elettrodo di riferimento, anestetizzare il ratto con una iniezione intraperitoneale di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg).
- After 5 min, applicare un test di stimolo nocivo (a piedi o un pizzico di coda) per valutare il livello di anestesia. Se il soggetto mostra alcuna reazione fisica al test stimolo nocivo (indietreggiare risposta, aumento della frequenza respiratoria e cardiaca), somministrare una spinta ketamina del 10% al 15% della dose iniziale e ripetere il protocollo stimolo nocivo sopra.
- Dopo il ratto è completamente anestetizzato e non mostra alcuna reazione al test stimolo nocivo, utilizzare tosatrici animali per radere il pelo del topo dagli occhi a circa 2 mm dietro le orecchie. Poi mettere il topo su un ricircolo d'acqua piastra elettrica sottile per mantenere la temperatura corporea durante l'intervento chirurgico. Applicare lubrificante occhio. Somministrare il farmaco non steroideo anti-infiammatori (FANS), carprofen (5 mg / kg), mediante iniezione intraperitoneale prima di eseguire eventuali incisioni e prima dell'inserimento cannule intraorali. Utilizzare una tecnica asettica in ogni momento.
- Applicare betadine seguito dal 70% di etanolo per pulire la pelle. Ripetere 3 volte.
- PlaCe il ratto sulla sua schiena, e aprire la bocca con un tampone di cotone sterile. Trova il primo molare superiore.
- Inserire l'ago nel tessuto tra la guancia e il primo molare superiore fino a quando l'ago esce appena dietro e mediale per le orecchie.
- Pierce l'ago attraverso la pelle fino a quando il tubo PE esce dalla pelle ed è accessibile.
- Sollevare la cannula (presa dalla cannula stessa e non l'ago) e fissare la rondella politetrafluoroetilene nei molari in modo che il catetere rimane al suo posto.
Nota: Tagliare la rondella in una forma trapezoidale e fissandolo contro i molari, con il lato piatto rivolto verso la guancia rende questo passaggio più semplice. - Prendete un'altra rondella politetrafluoroetilene e farlo scorrere sopra l'ago esposto, lungo il tubo di plastica, e andare in battuta contro l'incisione.
- Per fissare la rondella politetrafluoroetilene, utilizzare il nastro sterilizzato per creare un "flag" triangolare in modo che la rondella non scivola su. Fissare il lavaggioer contro la pelle del topo e il nastro sterilizzato.
- Tagliare il catetere esposto per consentire 2-4 cm di tubo da esporre sopra la testa del topo.
- Ripetere i passaggi 2.2.1 attraverso 2.2.10 per l'altro lato della bocca.
- Dopo la sterilizzazione di strumenti chirurgici, cannula (tagliato a 2,5 mm sotto il piedistallo prima della sterilizzazione), ed elettrodo di riferimento, anestetizzare il ratto con una iniezione intraperitoneale di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg).
- Chirurgia intracranica per voltammetria
- Mettere il topo nel frame stereotassico e pulire il cuoio capelluto del animale con un due scrub stadio (uno scrub betadine seguito da una macchia di etanolo al 70%, eseguire con una ripetizione di 3 cicli).
- Utilizzare sterilizzati aghi pinze naso e forbici chirurgiche per tagliare via una sezione 15 x 15 mm di tessuto del cuoio capelluto.
- Pulire delicatamente la superficie del cranio con sterilizzati applicatori di punta di cotone. Ulteriori pulire il cranio applicando 2 o 3 gocce di 3% di perossido di idrogeno.
- Utilizzare un trapano stereotassico per fare 3 piccole (diametro 1 mm) fori nel cranio per il successivo inserimento di viti, 1 foro per la cannula guida, 1 foro per l'elettrodo stimolante, e 1 foro per gli eletti di riferimentoha guidato.
- Per le registrazioni nel nucleo NAc, posizionare la cannula guida a 1.2 mm anteriormente e 1,4 millimetri lateralmente alla Bregma. Abbassare l'apparato della cannula fino a quando la base di plastica è a filo con il cranio.
- Posizionare l'elettrodo di riferimento sterilizzato nel controlaterale emisfero alla guida cannula. Abbassare il riferimento circa 2 mm sotto la dura.
- Posizionare l'elettrodo stimolante al 5,2 mm posteriormente e 1,0 mm lateralmente a Bregma e abbassato 8,0 millimetri sotto dura per colpire l'area tegmentale ventrale (VTA).
- Usare un piccolo cacciavite chirurgica sterilizzato per fissare le viti al cranio. Poi, inserire l'elettrodo di riferimento, stimolando l'elettrodo, e guidare cannula. Infine, fissare tutti i componenti con cemento cranioplastic.
- Per le prime 48 ore di cure post-operatorie, amministrare il non-steroidei farmaci anti-infiammatori (FANS) Carprofen mediante iniezione sottocutanea (5 mg / kg). Lasciare almeno 1 settimana per il recupero completo chirurgica prima di eseguire voltamRegistrazione metria.
- Durante l'assistenza post-operatoria, cateteri per via orale a filo al giorno con acqua. Fornire cibo saturo in acqua per 2 giorni per aiutare l'animale in masticare e mangiare. Fornire monitoraggio quotidiano per i potenziali segnali di stress del dolore (a causa di infezione lieve o disidratazione) e fornire interventi adeguati, se necessario, (compresa l'amministrazione di liquidi, somministrazione topica di antisettici e amministrazione o FANS Carprofen a 5 mg / kg).
3) voltammetrica Registrazioni in Awake, Ratto liberamente Muoversi
- Abbassando l'elettrodo e l'acquisizione di un insieme di addestramento DA.
- Il giorno dell'esperimento, controllare la pervietà della cannula orale infondendo 200 ml di acqua e osservando le risposte orofacciale (per verificare che il ratto è la degustazione l'acqua).
- Fissare il headstage FSCV al ratto inserendo l'elettrodo stimolante (sul headstage) nella stimolante bipolare dell'elettrodo Cannula (sul ratto). Così, headstage (miniaturizzato convertitore corrente-tensione) collega direttamente l'elettrodo bipolare stimolante.
- Rimuovere la cannula fittizia dall'apparato cannula ed applicare due gocce di soluzione di eparina 50% nella cannula. Poi inserire delicatamente una cannula fittizia (leggermente più lungo che la cannula fittizia precedentemente rimosso) per annullare eventuali coaguli di sangue o cicatrici glial che possono essersi verificati, che si rompono elettrodi in fibra di carbonio che saranno successivamente inseriti durante l'esperimento. Estendere la cannula utilizzata per la compensazione coaguli 3-4 mm sotto il cranio (di almeno 2 mm al di sopra del sito di registrazione).
- Inserire il micromanipolatore, con l'elettrodo, nella cannula guida e posizionare l'anello omega in una posizione "bloccata".
- Collegare il cavo elettrodo di riferimento dal headstage per il perno adatto. Quindi, collegare il cavo elettrodo di lavoro dal micromanipolatore al filo appropriato sul headstage.
- Abbassare le elecelettrodo a circa 4-4,5 mm al di sotto del cranio.
- Utilizzare un potenziostato per applicare una forma d'onda triangolare (400 V / s, -0.4 a +1.3 V). Applicare la forma d'onda per l'elettrodo a 60 Hz per almeno 10 minuti, quindi cambiare la frequenza di applicazione della forma d'onda di 10 Hz per le successive registrazioni sperimentali.
Nota: La fase di applicazione della forma d'onda di 60 Hz produce una superficie stabile in fibra di carbonio e contribuirà a evitare la dispersione elettrica - Applicare stimolazione elettrica al VTA utilizzando diverse frequenze (da 10 a 60 Hz) impulsi (10 a 30 impulsi) e correnti (50 a 150 μA) il tutto con una larghezza di impulso di 2 ms / fase, per evocare diverse concentrazioni di rilascio di DA e pH turni. Acquisire almeno 5 diverse concentrazioni di rilascio di DA e 5 turni diversi pH. Attendere (2-3 min minimo) tra stimolazioni per consentire la ricarica vescicolare [14].
Nota: È importante ottenere stimolazioni che producono concentrazioni DA sull'intera gamma che verranno raccolti durante il successivoesperimento in quanto saranno utilizzati come set di formazione per Analisi delle Componenti Principali (vedere paragrafo 5.1). - Abbassare l'elettrodo nel nucleo NAc (6,3 millimetri ventrale a dura). Successivamente abbassare l'elettrodo in 100 micron incrementi all'interno del nucleo NAc fino eventi transitori rilascio di DA sono osservate a frequenze di almeno 1 per min.
- Collegare il tubo (diametro interno 1/32 ", diametro esterno 3/32") per una siringa da 20 ml, collegato a una pompa a siringa. Sull'altra estremità del tubo, utilizzare un ago 23 G smussato per collegare il tubo della cannula del ratto. Assicurarsi che il tubo è riempito completamente con il sapida desiderato e verificare che non esistono bolle nel tubo.
Nota: Tipicamente, somministrare una piccola quantità di sapida nella bocca del ratto prima di registrare per garantire che la prima infusione per la registrazione fornisce la quantità di infusione pieno e non l'acqua residua o aria nel tubo. Inoltre, questo permette all'animale di avere un po 'di spirito prima esperienzah la sapida dal romanzo tastants, anche quelli appetitive, può essere avversivi inizialmente a causa della sua novità. - Per la raccolta dei dati, in infusione 200 ml di sapida (6.5 sec con una pompa e tubi precedentemente descritto). Infondere la sapida ogni 1-3 min. Infondere un totale di 25 volte al sapida. Ogni infusione eroga 200 ml di soluzione.
- Se più tastants vengono consegnati in un singolo esperimento, irrigare il catetere per via orale con acqua dopo aver raccolto i dati per una sapida e attendere almeno 20 minuti prima di infondere nuova sapida.
- Dopo la sessione di registrazione DA, prepararsi per la verifica istologica creando una piccola lesione nel sito di registrazione. Per conservare l'elettrodo fibra di carbonio per la successiva calibrazione, retrarre l'elettrodo e rimuovere il micromanipolatore. Quindi utilizzare un nuovo micromanipolatore con un microelettrodo di vetro e un filo di tungsteno (100 micron estende oltre la punta di vetro) alla stessa profondità (sotto dura) come il carbonio originale fmicroelettrodo Iber.
- Per la verifica istologica, creare una piccola lesione applicando 3 V al filo di tungsteno e aumentando la tensione incrementi di 1 V, ogni 10 secondi, fino a raggiungere l'impostazione 10 V.
- Se una curva concentrazione standard è già stato creato utilizzando elettrodi multipli in fibra di carbonio, eseguire il punto sopra lesione (3.1.14) applicando direttamente il potenziale dell'elettrodo di fibra di carbonio.
Nota: Questo metodo lesione danneggia la fibra di carbonio e prevenire la successiva calibrazione con quella dell'elettrodo specifico. - Euthanize l'animale con un pentobarbital iniezione letale (150 mg / kg, ip).
- Rimuovere la headcap con le cannule con una pinza tirando direttamente verso l'alto la headcap. Non torcere il headcap poiché questo causerà inutili danni al cervello e rendere difficile per identificare la posizione degli elettrodi durante istologico.
- Togliere il cervello e mettere in formalina 4% per 3 giorni, seguiti da 30% suCrose per 1 settimana. Creare 30 micron porzioni utilizzando un criostato, montare su vetrini ed esaminare fette al microscopio ottico per identificare la posizione della fibra di carbonio o tungsteno lesione.
Nota: Perfusione è opzionale per 3.1.17.
- Togliere il cervello e mettere in formalina 4% per 3 giorni, seguiti da 30% suCrose per 1 settimana. Creare 30 micron porzioni utilizzando un criostato, montare su vetrini ed esaminare fette al microscopio ottico per identificare la posizione della fibra di carbonio o tungsteno lesione.
4) elettrodo Taratura
- Utilizzando la cella di flusso per creare un fattore di conversione corrente-concentrazione.
- Al fine di determinare la sensibilità dell'elettrodo, calibrare elettrodi dopo ogni esperimento utilizzando un flusso apparecchiatura "t-cell". Abbassare l'elettrodo nel "cellule T" mentre tampone Tris, pH soluzioni o soluzioni DA vengono lavati sulla superficie dell'elettrodo (ad una velocità di 2 ml / min). Utilizzare un sei posizioni elettrovalvola aria attuatore per passare avanti e indietro tra tampone e pH o soluzione DA.
- Per ogni calibrazione, raccogliere i dati voltammetrici durante 5 applicazione sec di tampone Tris (baseline) seguito da 5 applicazione secondi di pH o soluzione DA, seguiti da 20 secondi unpplicazione di tampone Tris (file totale 30 sec). Ripetere ogni corsa per 3 volte per ogni taratura concentrazione standard, controbilanciando tra le diverse concentrazioni di ogni standard.
- Per ogni raccolta del campione, misurare il picco di DA o corrente pH evocato. Nella media la corrente di picco attraverso ogni prova per ottenere una concentrazione di picco rispetto al rapporto attuale. Per informazioni più dettagliate, consultare [12] e [13].
5) Analisi dei dati
- Utilizzando una formazione ambientato in analisi delle componenti principali (PCA)
Nota: Durante un esperimento voltammetria, uscita viene prodotta come corrente, che è il risultato di ossidazione e di riduzione dopamina, cambiamenti di pH, e il rumore elettrochimico. PCA permette la separazione di questi fattori in modo che si può isolare i componenti desiderati (DA e pH) e rimuovere i componenti aggiuntivi che potrebbero falsare i segnali desiderati (per una descrizione più dettagliata, vedi 15, 16).- Assegnare un fattore di calibrazione per thCorrente e di uscita (circa il 5-10 nA / micron) dopo PCA per consentire valori di concentrazione degli analiti da determinare.
- Usare il training set ottenuto durante un esperimento per "addestrare" il modello APC per separare DA, pH, e di altri fattori. PCA prende il training set voltammograms ciclici (raccolte nella sezione 3.1.8), e determina quali caratteristiche essenziali del voltammogramma possono essere utilizzati per identificare ciascun analita raccolte durante le registrazioni in vivo voltammetria.
- Per determinare il numero di componenti principali per mantenere, utilizzare un Malinowski F-test. In genere, mantenere solo 2 o 3 principali componenti che normalmente spiegano circa il 95-99% della varianza nei dati. Per ulteriori discussioni in atto del Malinowski F-test, vedere 17.
Nota: Una volta che il numero di componenti sono determinati, l'analisi PCA efficacemente proietterà i voltammograms misurati da DA e formazione pH imposta sui principali componenti che sono stati conservati.Il risultato è un insieme di dati che è stata filtrata in modo che solo DA (o pH) dati rimangono ei dati residua che non assomiglia DA o pH viene rimossa (Vedi Risultati rappresentativi per output atteso). Per una spiegazione dettagliata e un'ulteriore passo per passo le istruzioni per l'utilizzo di PCA per l'analisi voltammetrica vedi scheda Materiali e 16, 17.
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Representative Results
FSCV combinato con intraorale catetere impianto è stato utilizzato per esaminare come il saccarosio, una sapida appetitivo, modula fasica rilascio di DA nel nucleo NAc. Prima dell'infusione sapida, stimolazione elettrica (150 μA, 60 Hz, 24 impulsi, indicato dalla barra rossa) della VTA produce aumenti robusti fasica rilascio di DA nel NAc (Figura 1) Figura 1 mostra un grafico a colori con potenziale. l'asse y, tempo sul asse x, e la corrente (rappresentato come falsi colori) sul l'asse z. Sotto la trama del colore è la concentrazione DA contro traccia temporale. Concentrazione verso il tempo è stato determinato utilizzando la traccia corrente in funzione del tempo al potenziale di ossidazione della dopamina (indicata dalla linea tratteggiata bianca) che è stata convertita in concentrazione, dopo post-calibrazione dell'elettrodo. Questa concentrazione DA contro traccia temporale è stato utilizzato come parte della formazione fissato per PCA.
Dopo il training set è stato acquisito, 25 infusioni di saccarosio(10%, 200 pl per infusione) sono stati somministrati a 1-3 min. Esempi di modulazione saccarosio fasica rilascio di DA sono illustrati nelle figure 2 e 3. Nella figura 2, l'infusione 6.5 sec (indicato dalla barra rossa) ha prodotto un aumento della corrente (indicata dalla bianca, freccia rivolta verso il basso) al potenziale di ossidazione di DA (indicata dalla linea tratteggiata bianca). Trasformare i dati in una concentrazione in funzione del tempo dopo plot PCA verificato che l'aumento di corrente in risposta alla sapida è il risultato di un aumento della concentrazione DA. Un'altra sapida, mentolo (0,005%, 200 pl per infusione) è stato anche infusa durante la registrazione FSCV nel nucleo NAc. La figura 3 mostra concentrazione DA rispetto esempio tempo traccia per intra orale saccarosio e mentolo, rivelando una maggiore concentrazione di AD dopo l'infusione di una sapida . Bisogna aspettare di vedere qualche prova alla variabilità processo in fasica rilascio di DA a tastants (Figura 2 e 3A). Tuttavia, noi non vediamo in genere tutte le tendenze non specifici verso un aumento o una diminuzione del rilascio di DA fasica su più prove. Varia 10-100 nM DA si può aspettare in un tipico esperimento in un singolo animale.
Figura 1. plot Rappresentante colore (in alto) e la concentrazione contro plot tempo (in basso) di evocato elettricamente rilascio di DA nel nucleo accumbens. Barra rossa indica il tempo di stimolazione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. plot Rappresentante colore (in alto) e la concentrazione DA contro traccia temporale (in basso), nel corso di una singola infusione di saccarosio. Red bar indica 6.5 sec infusione. Bianco verso il basso freccia rivolta indica in elevazione in corrente (rappresentato in falsi colori) al potenziale di ossidazione di DA. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. concentrazione rappresentante DA rispetto al tempo tracce durante (A) 10% di saccarosio e (B) mentolo 0,005% con la somministrazione intraorale. Bar rosso indica 6,5 sec infusione intraorale. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Consegna sapida intraorale combinato con FSCV permette l'analisi di "real-time" DA risposte a aromatizzanti orali. Ci sono tre fasi critiche nel protocollo che sono necessari per il successo delle misurazioni DA. In primo luogo, il corretto fissaggio del catetere orale è critico per l'attuazione di aromatizzanti. Assicurare che il catetere viene inserito dietro il primo molare e incuneato in posizione impedisce il catetere di perdere pervietà e impedisce la rimozione accidentale da parte dell'animale. Lavaggio del catetere durante i primi giorni dopo il recupero è anche importante, dal momento che il cibo morbido data all'animale durante i primi 2 o 3 giorni post-operatorio potrebbe intasare il catetere. In secondo luogo, la qualità dell'elettrodo è fondamentale per aumentare il rapporto segnale-rumore in un topo muoversi liberamente. In alcuni casi, gli elettrodi che sembrano visivamente per essere di alta qualità e di buone condizioni può ancora dare segnali rumorosi. Un modo per risolvere questo problema è quello di prendere le registrazioni di base nel dOrsal striato (4 mm al di sotto dura). Se l'elettrodo produce troppo rumore, l'elettrodo può essere rimosso e sostituito con un nuovo elettrodo prima di eseguire l'esperimento nel sito di registrazione nucleo NAc (6-7 mm al di sotto dura). Un terzo punto critico è trovare una posizione di registrazione idoneo nella regione del cervello mirata, in cui si osservino eventi rilascio spontaneo DA ("transienti") ad una frequenza sufficiente (almeno 1 per min) con aumenti sufficienti concentrazione DA (almeno 20 nM a 40 nM). Questa ottimizzazione farà sì che gli eventi di rilascio fasica DA spontanee possono essere rilevati in posizione specifica, prima della somministrazione aromatico. Abbassando l'elettrodo in incrementi equivalenti alle dimensioni della fibra di carbonio esposta (50-100 micron) massimizza le possibilità di trovare un sito di registrazione con transienti rilevabili.
Un importante avvertimento del FSCV è l'incapacità di determinare la concentrazione di analita assoluta in un punto nel tempo, poiché FSCV è un diftecnica ferenziale che misura le variazioni di concentrazione relativi (rispetto ad una linea di base stabile) nel corso di ogni file di registrazione voltammetria. Tuttavia, la tecnica del differenziale permette anche per la quantificazione delle fluttuazioni inferiori al secondo in concentrazione di dopamina in risposta ai tastants gratificanti e aversive 5. Nel contesto della dipendenza da nicotina, additivi prodotti del tabacco, come il mentolo e orali dolcificanti, hanno dimostrato di influenzare il comportamento di fumare 18 e sono state recentemente vietato nelle sigarette (tranne che per il mentolo) dalla famiglia la prevenzione del tabagismo e Act controllo del tabacco. Così, consegna intraorale in combinazione con FSCV fornisce un importante strumento metodologico che può essere usato per esaminare come aromatizzanti prodotto del tabacco può alterare segnalazione DA, e potenzialmente le proprietà rinforzanti della nicotina.
Qui, abbiamo descritto il metodo di combinare intraorale sapida infusione con FSCV allo scopo di misurare fasica DArilasciare in risposta a stimoli sapida primari. È importante notare che, mentre la nostra tecnica consente l'esame di rilascio fasica DA per tastants indipendenti di azione o scelta, è anche possibile che la natura inattesa della consegna sapida potrebbe influenzare fasica DA rilascio 19. Così, una soluzione di controllo adeguato, come acqua o saliva artificiale, può essere utilizzato in esperimenti di controllo per confrontare ed esaminare gli effetti di un premio imprevisto o stimolo sulla fasica DA rilascio indipendente dalla sapida di interesse. Tuttavia, la tecnica non è limitata a sia misure di rilascio DA conto terzi. Ad esempio, il lavoro precedente ha esaminato il rilascio di noradrenalina sia durante ricompensa e l'avversione 20. Dal momento che gli animali non fanno facilmente consumano tastants avversi intraorale sapida infusione con FSCV è l'unica tecnica a disposizione per misurare fasica rilascio di DA a tastants spiacevoli. Tuttavia, questa tecnica non determina se un sapida è repulsivo oppetitive, piuttosto, misura semplicemente rilascio di DA durante il consumo del sapida. Per determinare il valore edonistico di una sapida, test comportamentali possono essere incorporati per osservare risposte oro-facciali durante gusto reattività (come descritto altrove 5, 21).
Va inoltre notato che FSCV è anche adatto per la misurazione di altri sostanze neurochimiche importanti, come la serotonina 22 e ossigeno 23, ma i metodi per la registrazione di questi analiti negli animali svegli, liberi di muoversi, non sono ancora disponibili. Inoltre, con il combinato voltammetria e il metodo di infusione intra-orale, risposte dopamina tempo bloccato alla consegna sapida possono essere analizzati in assenza di altri comportamenti, come il comportamento di avvicinamento o di recupero di cibo, che potrebbe anche influenzare il rilascio di DA. Come applicazione aggiuntiva, la consegna sapida intraorale combinato e FSCV può essere l'ideale per la misurazione di segnalazione DA a eventi gratificanti o avversi durante condizi operante o pavlovianong. Infatti, una recente pubblicazione JoVE da Levy e colleghi combina consegna sapida intraorale con il comportamento operante per determinare se tastants intraorali supportano l'acquisizione e il mantenimento di un comportamento operante autosomministrazione 24. Pertanto, tali metodi possono essere combinati con FSCV per identificare fasica risposta DA a tastants orali durante il comportamento.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
| Cannula for electrode | BioAnalytical Systems | MD-2251 | |
| Glass capillary | A-M systems | 624503 | |
| Carbon fiber | Thornel | T650 | |
| Electrode puller | Narishige International | PE-22 | |
| Neurolog stimulus isolator |  Digitimer Ltd. |
DS4 | |
| Heat shrink | 3M | FP-301 | |
| Insulated wires for electrodes | Squires electronics | Custom | L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU |
| Micromanipulator | Univ. of Illinois at Chicago, Engineering Machine Shop | ||
| Epoxy | ITW Devcon | 14250 | "5 minute epoxy" |
| Copolymer of perfluoro-3,6-dioxa-4-methyl-7octene-sulfonic acid and tetrafluoroethylene | Ion Power | LQ-1105 | i.e., Nafion |
| Silver paint | GC Electronics | 22-023 | |
| Power supply | BK Precision | 9110 | |
| Tubing for intra-oral catheters | Intramedic | 427426 | PE 100, I.D. = 0.86 mm; O.D. = 1.52 mm |
| Tubing for intra-oral infusion | Fischer Scientific | 02-587-1A | I.D. 1/32"; O.D. 3/32" |
| Syringe pump for flow cell | Pump Systems Inc. | NE 1000 | |
| Surgical cement | Dentsply Caulk | 675571 and 675572 | |
| Air actuator | VICI | A60 | 6 position digital valve interface |
| Digital valve interface | VICI | DVI | 230 VAC |
| Quad headstage | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Power supply for tastant syringe pump | Med Associates | SG-504 | |
| Tastant syringe pump | Med Associates | PHM-107 | |
| Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Sucrose | Sigma | 80497 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Sodium chlroide | Sigma | S7653 | |
| Perchloric acid | Sigma | 244252 | |
| Hydrochloric acid (4 M) | Sigma | 54435 | |
| Soidum hydroxide | Sigma | 306576 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | H1009 | |
| Dopamine hydrochloride | Sigma | H8502 | |
| TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | Must request software: click here for link to software request page |
References
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