מעקב עכבר מח עצם המונוציטים Published: February 27, 2015 doi: 10.3791/52476

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Pauline Hamon¹, Mathieu Paul Rodero¹, Christophe Combadière¹, Alexandre Boissonnas¹

¹Centre d'Immunologie et des Maladies Infectieuses (CIMI), INSERM, U1135, CNRS, ERL 8255, Sorbonne Universités, UPMC Univ Paris 06, CR7

Protocol

הערה: כל פרוטוקולי הניסוי אושרו על ידי הוועדה לניסויים בבע"ח והאתיקה הצרפתית ומאומתים על ידי "הגנת שירות et סנטה Animales, Environnement" עם מספר-75-2065. גודל מדגם נבחרים כדי להבטיח שחזור של הניסויים, ובהתאם ל3R של רגולציה אתיקה של בעלי החיים.

1. הכנת העכבר

1. אלחוש
   1. לתקופה קצרה של הדמיה (שעות פחות מ 1), לטשטש את העכבר עם זריקת intraperitoneal של 200 μl של תמיסת מלח המכילה קטמין (100 מ"ג / קילוגרם) וXylazine (10 מ"ג / קילוגרם).
   2. לחלופין, לתקופה ארוכה יותר של הדמיה (עד 4 שעות), לטשטש את העכבר עם שאיפה של 2.5% isoflurane מתאדה בתערובת 70/30 של O ₂ / N ₂ O, דרך מסכה מותאמת.
   3. הערה: בדרך זו מספקת לחוסר הכרה יציבה יותר ותמנע זריקת intraperitoneal סדרתי של תרופות. לאחר העכבר הוא הרדים, לבדוק חוסר הכרה באמצעות גירוי של כרית כף הרגל עם מצבטים.
2. צביעת כלי דם / כתמים נוספים
   1. עבור מכתים כלי דם: להזריק לוריד בוריד הזנב, 200 μl של Rhodamin-Dextran (2 מד"א, 10 מ"ג / מיליליטר במאגר מלוח).
   2. עבור מכתים נויטרופילים: להזריק 2 מיקרוגרם של Ly6G-PE (שיבוט 1A8) בתמיסת מלח לוריד בוריד הזנב 100 μl.
3. קיבוע
   1. לקיבוע, השתמש בעל stereotactic מותאמת אישית המותאם למיקרוסקופ ולמכשיר אינהלציה גז ההרדמה.
      הערה: בעל sterotactic היא תמיכת מתכת עם שני סוגריים לוחית מתכת, אחד להיות קבוע ונשלפים וישימה אחרים, להדק את ראשו של בעל החיים.
   2. התקן את הראש של העכבר בין לוחות התמך כדי להבטיח בידוד מתנועות נשימה. הדק את האוזניים בין צלחות וראש למתוח את sk שמירהב. בדקו יציבות ורווחה נשימה של בעלי החיים.
4. הסר את הקרקפת
   1. להשתמש בזהירות אתנול 70% להרטיב את השיער של הקרקפת עם המוליך סטרילי, הימנעות ממגע עם העיניים.
   2. חותך את העור עם מספריים ומלקחיים סטריליים כדי להסיר באופן מלא את הקרקפת מאחורה של העצם הקודקודית לעצם הקדמי. הרחק עד 3 מ"מ מעיניים ואוזניים למניעת דימום נרחב. הסר את רקמת חיבור הרופפת המכסה את הגולגולת (קרום עצם). לשטוף את השיער שנשאר עם מגבת נייר ספוג-PBS חם.
5. מערכת טבילה להגדיר
   1. הדבק טבעת גומי בקוטר 18 מ"מ עם דבק כירורגים ישירות על הגולגולת באמצעות מחט מד קטנה לשלוט הפצה. מדביק את כל הפריפריה של טבעת הגומי כדי למנוע דליפה (30 μl צריך להיות מספיק).
   2. נקה את הגולגולת מתחת לזירה בפעם האחרונה עם מגבת נייר ספוג-PBS ולאחר מכן להוסיף 37 ° C PBS לטבילה של שלמהגולגולת. הוסף ירידה של 0.9% NaCl פתרון או משחת עיניים ספציפי בכל עין של העכבר, כדי למנוע יובש בעיניים. גרור את בעל stereotactic תחת המטרה.
   3. כ למקם את השדה באמצעות עינית המיקרוסקופ באמצעות העברת ישירה.

2. רכישת הדמיה שני פוטונים

1. השתמש במיקרוסקופ multiphoton יחד עם Ti: לייזר גביש ספיר, המספק פולסים 140fs של אור NIR, באופן סלקטיבי מתכונן מ -680, ל- 1,080 ננומטר, ומאפנן acousto אופטי לבקרת כוח הלייזר. השתמש בתצורה כולל 3 גלאים חיצוניים-descanned שאינו (NDD) (המאפשרים הקלטה בו זמנית של 3 ערוצי ניאון) עם שילוב של 2 מראות dichroic (565 ננומטר ו690 ננומטר), 565/610 500/550 ומסנני bandpass, ו 485 מסנן קצר לעבור, עם Apochromat תכנית × 20 (NA = 1) מטרת טבילה במים.
2. הגדר את תא החימום כדי לאפשר homeothermy הטוב של anaesעכבר thetized.,
   הערה: טמפרטורה עשויה להיות מוגדרת 1 שעה לפני פגישת ההדמיה ליציבות טובה יותר. במקרה שלנו, 32 ° C נבחר כדי לקבל את טמפרטורת גוף אופטימלית של העכבר המורדם (36-37 ° C) ומתוחזק עד 4 שעות. טמפרטורה זו עשויה להיות מותאמת למערכת בשימוש (בדיקה דיגיטלית יכולה לשמש כדי לבדוק נקודה זו). בנוסף, תא החימום משמש הוא כהה / שחור ומכסה חלק מהמערכת (היעדים וצלחת ממונעת), כדי למנוע זיהום אור חיצוני.
3. הפעל את המערכת
   1. הפעל את טי: ספיר הלייזר, ולאחר מכן מערכת מיקרוסקופ כולה. הפעל את תוכנת הרכישה. הגדר את טווח אורך גל לייזר 870 ננומטר. בחר NDD המתאים להקלטה.
      הערה: במקרה שלנו, דור שני הרמוני (SHG) ¹⁹ וחלבון ציאן ניאון (ECFP) מזוהים על ידי NDD לאחר לעבור סינון קצר 485. ECFP גם זוהה על ידי NDD לאחר מסנן 500/550 bandpass וrhodamin-dextran הוא זוהה על ידי tהוא NDD לאחר מסנן 565/610 bandpass.
4. התאם את הגדרות רכישה
   1. השתמש בפקודת ההדמיה "רכישה חי" של התוכנה והשימוש בשליטה כיוונית מיקרוסקופ, לשנות את הפוקוס על אזור עם אות ECFP וRhodamine. הגדר את כוח הלייזר עד למינימום כדי להשיג יחס אות לרעש הטוב ביותר עם תמונה-נזק מינימאלי.
      הערה: הגדרת ההספק משמשת משתנה בהתאם לעומק של האזור של עניין. בדרך כלל הגדרות AOM מוגדרות כ -20%, המייצג את כוח לייזר מעבר למטרה כ -15 מילי-ואט. עדיף להגדיל את הכח הרווח על PMTs לכל NDD להפחית צילום הלבנה וצילום נזק. הגדרות רכישה אופייניות הן סריקה יחידה עם פיקסל להתעכב זמן של 1.58 מייקרו-שני, ורזולוציה של 512 x 512 פיקסלים עם הגדלה של 1.5.
5. אזורים נבחרים של ריבית
   1. ברגע פרמטרים הקלטה נקבעים, להשתמש בו שוב את פקודת הרכישה "חי",ותסקור את הרקמה לבחור (x, y, z) שדה רצוי להיות במעקב בזמן אמת.
      הערה: בדרך כלל, בחרנו שדה כולל שני כלי דם ובאזורי parenchymal.
   2. הרשם השדה עם פקודת התוכנה "עמדה".
      הערה: פקודה זו משננת x, y, z קואורדינטות של שדות רחוקים שונים.
   3. בחר ולהירשם תחומים נוספים של ריבית (עד 3) באותו האופן.
   4. להגדיר Z- מחסנית 3D עם פקודת התוכנה "Z- המחסנית" על העמדה שיננה הראשונה בהתאם להיקף הנדרש עם הגדלה בחרה. לשנן עמדה עמוקה ראשונה, ולאחר מכן המיקום הגבוה ביותר. לנרמל כוח לייזר עם העומק.
      הערה: להדמית שדה הנלווה מרובה, אנו רוכשים 5 פרוסות מופרדות על ידי z-שלבי 3 מיקרומטר עבור כל שדה לרכישה בהיקף של 12 מיקרומטר עובי. הגדרות אלה עשויות להיות מותאמות לסוג של תא למד.
6. רכישת השקה
   1. בחר220; זמן סדרה "פקודת התוכנה ולבחור את משך הזמן של מרווח זמן ומספר המחזורים. בגין הזמן לשגות הדמיה לפי הזמן לשגות ומשך הזמן הנדרש על ידי בחירת "להתחיל ניסוי" פקודת התוכנה.
      הערה: במקרה שלנו, אנו רוכשים כרך אחד כל שנייה 30 במהלך 60 מחזורים מייצגים בזמן אמת 30 דקות. זמן לשגות קטן יותר ניתן לבצע כדי לעקוב אחר גלגול תא מהיר בכלי הדם. במקרה זה-ערימת z דקה יותר ולא יותר מ -2 תחומים שונים ניתן להקליט באותו הזמן.
   2. מעקב שוטף אחר להגדיר.
      1. תמיד לפקח על בעלי החיים כדי לוודא שהוא מחוסר הכרה.
         הערה: טלטול של שפם או רגליו של בעל החיים הן אינדיקטורים של תחייה. במקרה הנשימה של בעלי החיים היא קופצנית, כמות isoflurane יכולה להיות מופחתת במקצת. להיסחף רקמה חזקה במהלך הרכישה הוא אינדיקטור של תחיית עכבר.
      2. ודא המטרה הוא שקוע כראוי. לחדש 37 ° C betwee PBSn שתי רכישות (30 דקות).
         הערה: היעלמות מתקדמת של אות במהלך הרכישה היא אינדיקטור של דליפת PBS.
7. סיומו של הליך
   1. ברגע שקטעי הווידאו הנדרש נרשמים, להרדימו על ידי נקע בצוואר הרחם במהירות לפני ההחייאה.
      הערה: ריפוי פצעים מוביל להיווצרות של גלד ב -24 עד 48 שעות המגבילה את האפשרות לבצע הדמיה אורך.

ניתוח 3. נתונים

1. תיקון דריפט
   1. השתמש בתוכנת Imaris Bitplane למעקב אוטומטי 3D.
   2. פתח את התמונה ברצף 3D על Imaris. בחר "נקודה" הפקודה, וליצור מעקב ידני (לחיצת עכבר + shift) לכל נקודות הזמן למינימום של 4 נקודות עיגון שונות, במידת האפשר מופץ בצורה הומוגנית בתחום.
   3. החל התיקון להיסחף באמצעות הפקודה "להיסחף נכון" בכרטיסייה "מסלול עריכה".
   4. בדוק עבור tהוא האיכות של התיקון בx, y ובמיוחד בz כדי למנוע התלבטויות artefactual.
      הערה: אם התיקון אינו משביע רצון, לנסות נקודות עיגון אחרות או להוציא וידאו מהניתוח.
2. מעקב סלולארי
   1. השתמש "להוסיף כתמים חדשים" הפקודה ובחר "כתמי מסלול לאורך הזמן" הגדרת אלגוריתם. עבור לצעד הבא.
   2. החל הליך מעקב תא אוטומטי או על כל הערוץ של עניין באמצעות פקודת "ערוץ המקור". קוטר אובייקטי סט (כלומר, תאים) עד 10 מיקרומטר. עבור לצעד הבא.
      הערה: הבחירה תהיה תלויה בהבחנה בין אובייקטים וספציפיות של האות הנמדדת. בקיצור, מעקב אוטומטי על כל הערוץ אפשרי רק אם האות זוהתה היא ספציפית לאובייקט של עניין. מכיוון שגם SHG וECFP מזוהים על ידי NDD לאחר מסנן 485 לעבור קצר, מעקב יהיה יותר ספציפי ויעיל באמצעות אות ECFP נרשמה על ידי NDD לאחר 500/550 מסנני bandpass. אשכול או אובייקטים צפופים, ידרשו בחירה ידנית של אובייקטים בודדים דומים לצעד 3.1.2.
   3. בחר את סוג מסנן "איכות", לקבוע את הסף להוציא מעקב של אובייקטים נוקבים. עבור לצעד הבא.
   4. בחר "בראונית האלגוריתם Motion" עם פרמטרים מדויקים של "מרחק מקס" ו- "גודל פער" בין שתי נקודות. לאמת דור מסלול.
   5. ברגע שמסלולים מחושבים באופן אוטומטי, בחר סוג המסנן "משך מסלול", לקבוע את הסף לחסל מסלולים קצרים יותר מ -120 שניות (המייצגות את 4 נקודות זמן).
   6. חובה: אחרי מעקב אוטומטי, לבדוק את האיכות של השירים.
      1. לפרוש על סרגל הזמן כדי לבדוק שחפצי מעקב נתיבי המסלול. אם לא, השתמש באפשרויות של תיקון נקודת מסלול הזמינות בכרטיסייה "ערוך": מחיקת שירים כוזבים או לא תקינים עם "למחוק" הפקודה (למחוק את כל p מסלולoint בנפרד באמצעות פקודת "ניתוק"). אם נתיב מסלול הוא רציף, להוסיף נקודות חסרות זמן (לחיצת עכבר + shift), לבחור את כל הנקודות במסלול מסוים, ולהשתמש "להתחבר" הפקודה בכרטיסייה "מסלול עריכה".
3. פרמטרים כימות
   1. בחר בכרטיסייה "הסטטיסטיקה" בפקודה "העדפות", לבחור את הפרמטרים הדינמיים של עניין ברשימה. בחר "לייצא את כל הנתונים הסטטיסטיים לקובץ" הפקודה ולשמור את קובץ Excel שנוצר.
      הערה: פרמטרים דינמיים כמה ישירות מתקבלים מהתוכנה כגון אורכי מסלול, מהירות רגעית, מהירות ממוצעת, ולעקוב אחר יושר. מקדם תנועתיות ^{6, 20} ניתן לקבוע אך אינו מסופקים ישירות על ידי התוכנה.
   2. עבור כל תא, לחשב את הממוצע של ההתקות לכל תקופת זמן (אורך יממה) (לסרט הזמן לשגות 30 שניות, אורך היממה תהיה 30, 60, 90 שניות, וכו ').עלילה המרושעת של העקירה רבועה כפונקציה של מרווח הזמן. להשיג מקדם תנועתיות ידי חישוב השיפוע של חלק הליניארי של העקומה.

Representative Results

מבנה גולגולת עכבר מציע הזדמנות טובה ללמוד את הפיסיולוגיה מח עצם על ידי ההדמיה intravital. להיות רזה באזור הקדמי הקודקודית העצם, ניתן לקבל גישה לנישות medullar ללא שחיקה של העצם. איור 1 מייצג שדה 2D רחב של הגולגולת של עכבר מהונדס MacBlue. מטריצת העצם מורכבת בעיקר של קולגן אני בקלות לזיהוי על ידי SHG ^19. הזרקה של rhodamin-dextran מכתימה את רשת כלי הדם של מח העצם ומאפשרת לזיהוי נישות מח עצם parenchymal בין מטריצת העצם וכלי ^14. תאי ECFP מופצים בשני התאים של מח העצם, אך נעדרים ממטריצת העצם. מונוציטים מסווגים באופן ידני בהתאם למיקומם בתוך הרקמה. מונוציטים כלי דם מוגדר כאשר כל התא הוא בתוך כלי הדם, תוך התעלמות מהגודל של כלי השיט. רק venules איסוף הגדולה אינן נכללתnalysis. מונוציטים parenchymal מוגדר כאשר התא נמצא בין כלי הדם ומטריצת העצם.

זמן לשגות הדמיה של אזור מסוים של עניין (וידאו משלים 1 ו -2) מאפשרת לחישוב מסלול תא הבודד לאורך זמן לאו כלי דם (איור 2 א) או parenchymal מונוציטים (איור 2). אורך המסלול מראה כי תצוגת מונוציטים parenchymal מופחתת עקירה לעומת מונוציטים כלי דם. ניתוח של העקירה לאורך הזמן משווה את המהירות הממוצעת של מונוציטים בשני התאים (איור 2 ג). העקירה מרובעת הממוצעת כפונקציה של הזמן היא מדד של המידה המרחבי של תנועה אקראית. מקדם תנועתיות נקבע על ידי השיפוע של חלק הליניארי של העקומה ומספק מושג טוב יותר של עקירת התא (ראה סעיף דיון). מקדם תנועתיות של מונוציטים כלי דם (MC = 71μm² / s) הוא גבוה יותר מאשר coefficie תנועתיותNT של מונוציטים parenchymal (MC = 4.4μm² / s).

הרזולוציה של רכישת הזמן צריכה להיות מותאמת למהירות הממוצעת של התאים. מונוציטים כלי דם רולינג יכולים לעשות עקירה חשובה בתוך עיכוב זמן קצר. למעקב תא מדויק יותר, הפחתת המרווח של רכישת הזמן עדיף. איור 3 מציג איור של מעקב מונוציטים עם שני בזמן רזולוציות שונות. זמן מרווח של 30 שניות מפחית את הדיוק, כמו גם את אורכו של המסלולים (בקו מקווקו ירוק) בהשוואה לזמן מרווח 10 שניות.

לבסוף, תרשים 4 מתאר את האפשרות לנתח משנה תא אחר במקביל למונוציטים. Ly6G הוא סמן ספציפי של נויטרופילים עכבר הבוגרים. ההזרקה של אנטי-Ly6G בשילוב עם fluorochrome (במקרה Phyco-erythrin זה) 5 דקות לפני נויטרופילים כתם רצף הדמיה ישירות in vivo. גישה זו מספקת עמומה נוספת ension של ניתוח ואת האפשרות להשוות את ההתנהגות של תת תא השונים. גישה כזו יכולה לשמש להגדרה תת בתאי מונוציטים.

איור 1. שדה רחב של ארגון מח עצם גולגולת. בתמונת vivo שני פוטונים סריקת לייזר מיקרוסקופי של מוח עצם מצב יציב גולגולת מעכבר MacBlue. כלי דם (באדום) מוכתמים על ידי הזרקה לשווא זנב של דקות 2MDa Rhodamin-Dextran 5 לפני פגישת הדמיה. העצם דמיין ידי דור השני הרמוני (כחולה). ECFP + מונוציטים (ציאן) ממוקמים בתוך נישות parenchymal (אזורים כהים בין כלי דם ועצם) ובתוך כלי הדם. לוחצים כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

together.within-page = "תמיד">
מעקב בזמן אמת איור 2. תא. שבילי מסלול נציג לאורך הזמן של מונוציטים בתוך () בכלי הדם ו( B) parenchyma. מסלולים (קו ירוק) עבור כל תא נוצרים באופן אוטומטי על ידי התוכנה. כתמים אדומים מייצגים את מרכז מסה של תאי מעקב. (C) Mean השוואת מהירות בין מונוציטים כלי דם וparenchymal. ניתוח סטטיסטי מאן-ויטני בוצע, *** מייצג p <0001. (ד) Mean עקירה בריבוע (MSD) כפונקציה של הזמן מיוצג על מונוציטים כלי דם וparenchymal. עקומת Asymptotic מציינת את העקירה המאולצת של התאים לאורך זמן, ואילו עקומה ליניארית מצביעה על הליכה אקראית בסביבה שאינה מוגבלת. מקדם תנועתיות מצביעה על מידת תזוזת תא והוא נקבע על ידי השיפוע של ג urve מחושב על ידי רגרסיה ליניארית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. ברזולוציה זמן מרווח במחקר של מונוציטים מתגלגלים. רצפי תמונת נציג מראה כי רזולוציה זמן מוגברת משפרת את הדיוק של מסלול התא מתגלגל. (עד) רצף תמונות במרווחי זמן של 10 שניות. (Down) רצף תמונות במרווחי זמן של 30 שניות. האיכות של נתיב המסלול משופר ואת הסיכון לשוקל שני תאים שונים לאותו או ההפך מצטמצם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

s ">
איור 4. בשיתוף לוקליזציה vivo של נויטרופילים ומונוציטים medullar. נתון זה ממחיש את האפשרות לזיהוי תת תא אחר בגוף חי במקביל עם מונוציטים, על ידי הזרקת נוגדנים חד שבטיים מסוימים בשילוב עם fluorochrome. 2 מיקרוגרם של נוגדן Ly6G-PE כבר הזריק לוריד 5 דקות לפני ההדמיה מח עצם הגולגולת של עכבר MacBlue. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

וידאו משלים 1. התנהגות נדידה של מונוציטים parenchymal. בvivo 3D הדמיה של פעילות נדידת המצב היציב של מונוציטים בparenchyma מח עצם גולגולת של עכבר MacBlue. אות ECFP ⁺ היא בצבע תכלת. נתיבי נדידה עבור כל תא (נקודה אדומה) מופיעים בירוק.

= "Jove_content"> התנהגות נדידת וידאו 2. משלימה של מונוציטים כלי דם. בvivo 3D הדמיה של פעילות נדידת המצב היציב של מונוציטים בכלי הדם במח עצם גולגולת של עכבר MacBlue. אות ECFP ⁺ היא בצבע תכלת. (2M   Da) rhodamine-dextran הוזרק לפני פגישת ההדמיה להבחין בכלי הדם במח העצם (אדום). נתיבי נדידה עבור כל תא (נקודה אדומה) מופיעים בירוק.

Discussion

נקודות הקריטיות של in vivo מתודולוגיה ההדמיה הן להבטיח את היציבות של המיקוד במטרה למקסם את משך הזמן של הדמיה וכדי למזער את סיכון לזיהום חיידקים ודלקות, אשר עשוי להשפיע על הדינמיקה של תאי הדלקת. הדמיה של מוח עצם גולגולת כדלקמן מטרות אלה כניתוח שבוצע כדי לקבל גישה למח העצם הוא מינימאלי. השימוש בחומר החיטוי וסטרילי הוא חיוני כדי להגביל את הסיכון לזיהום שעלול לגרום להפרעות בהומאוסטזיס תא.

פיתוחו של בעל stereotactic עשוי להיות מאתגר ודורש התאמה אישית ספציפית לכל מערכת (מרחק בין במה אובייקטיבית וממונעת של המיקרוסקופ, שימוש במכשיר אינהלציה גז להרדמה). חשוב לקבל את הראש של העכבר כאופקי ככל האפשר לגישת משטח הדמיה רחבה יותר. ברגע שבעלי החיים נמצאים בעמדה, סביר להניח שכמה דקות יכולות להיות required להשיג יציבות טובה של מטוס המוקד. לכן, מומלץ לבדוק להיסחף רקמה לפני השקת הקלטת הרכישה. בגלל תהליך זה ביחד עם מבחר של אזורים של עניין יכול להימשך זמן מה, זה מומלץ גם לבדוק באופן קבוע כי בעלי החיים הוא לא מודע אם Ketamin / Xylazin היה בשימוש, וכדי לבדוק אם טבילה נכונה של המטרה כדליפה ואידוי יכול להתרחש.

מיקום הטוב של טבעת הגומי בגולגולת מייצג עוד צעד קריטי בתהליך. דבק cyanoacrylate מספק תוצאות טובות במונחים של יציבות ואיטום, אבל צריך למנוע העמסת יתר של דבק, שיכול לכסות את גישת הגולגולת ובלוק לאזור של עניין של הרקמה. היתרון של טבילה ישירה של הגולגולת ללא coverslip זכוכית הוא להשיג גישה לאזורים עמוקים יותר של העצם. בנוסף, מאז הגולגולת היא לא משטח רגיל, זה לא יגביל את אזור ההדמיה לconמשטח טקט בין הגולגולת וcoverslip, המאפשר תחום הדמיה רחב, כפי שמוצג באיור 1.

לכל טכנולוגיות ההדמיה, הבחירה בין מהירות רכישה ואיכות רזולוציה היא פשרה. לכן, המספר והאיכות של תמונות ליחידת זמן מוגבל, והבחירה תלויה בשאלה המדעית התייחסה. בדרך כלל, מונוציטים כלי דמם מהר מתגלגלים תאים, ואילו מונוציטים parenchymal הם ניע או נייחים איטיים. מעקב מדויק של תאים מתגלגלים דורש רזולוציה גבוהה יותר עת רכישה, כפי שמוצג באיור 2. שיעור הדמיה גבוהה לתאים נייחים הוא x חסר תועלת וגבוה, y, z רזולוציה יכולה להיות מועדפת לניתוח פעילות מִזדַקֵר של דנדריטים למשל. תאים מהיר ידרשו נפח עבה כדי לקבל מעקב ארוך יותר של עקירתם בz.

העקירה מרובעת הממוצעת כפונקציה של הזמן אינה מסופקת על ידי Imaris התוכנה. פרינציפle של ייצוג זה מבוסס על העובדה ש, לאובייקט שנסע בליסטי ללא כל מפגש או התכווצות מבנית, המרחק זה נסע יהיה פרופורציונאלי למרווח הזמן (איור 2 ד). כך הליניאריות של המדרון מציינת הליכה אקראית בסביבה שאינה מוגבלת. בניגוד לכך, צורה אסימפטוטית של העקומה תשקף עקירה מוגבלת לאורך הזמן של אוכלוסיית התא. היתרון השני של חישוב זה הוא שמהירות לעתים בהערכת על ידי עקירת artefactual של מרכז המסה. הדבר חשוב במיוחד לתא ניעתי איטי עם פעילות מִזדַקֵר. לפיכך, חישוב של מקדם תנועתיות על ידי שיפוע העקום מחושב על ידי רגרסיה ליניארית מצביע על תזוזה אמיתית של זמן cellover ^21.

צביעת Ly6G in vivo ממחישה את האפשרות להוסיף פרמטר חדש של ניתוח במהלך תהליך ההדמיה (איור 3 (אל Rodero et in press). למרות שיותר מ 98% של נויטרופילים כלי דם מסומנים כראוי, ההכתמה של נויטרופילים מח עצם היא פחות יעילה, ואת עוצמת הקרינה הממוצעת בחום מופחתת, המצביעה על גישה מופחתת של הנוגדנים כלפי parenchyma מח עצם (מידע לא מוצג). dextran Rhodamin, נקודות קוונטיות, או צבעים ספציפיים אחרים של תאים אפופטוטיים או נימקי כגון DAPI, יודיד Propidium, Sytox ^22, או כתב ניאון עבור פונקציות תא כגון ייצור של מיני חמצן מגיבים ^23, ניתן להוסיף לוריד דרך וריד הזנב במהלך הדמיה תהליך ומציע הזדמנות טובה לכמת תכונות פונקציונליות כגון מוות של תאים, phagocytosis ומלכודת תאית נויטרופילים. Mazo et al ¹² יפה השתמש בשני צבעים שונים של כלי דםעם משקל מולקולרי נמוך וגבוה לparenchyma ניגוד טוב יותר וכלי דם. הבחירה של צבע הניאון היא קריטית כדי לאפשר רכישה קשורה של כתבי ניאון השונים. ואכן, גל העירור ייבחר בהתאם כדי לקבל את הפשרה הטובה ביותר בין כל צבעי הניאון משמשים.

הפרוטוקול המשמש במסמך זה מאפשר לנתח in vivo הפעילות הביולוגית של תא תא, מחקר שבם היה כל כך קשה בהרבה. ניתוח היסטולוגית של רקמת מוח עצם בדרך כלל דורש הכנת decalcification העצם ארוכה כדי לאפשר דק סעיף, וזה רק מספק תצוגה סטטית של הרקמה. התצוגה דינאמית מדגישה את שער חליפין בין תא parenchyma וsinusoids מח עצם. תהליך מהיר זה הוא צעד חיוני כדי לפענח כדי לקבל הבנה טובה יותר של מנגנון גיוס תא על אות דלקתית ⁵ או נפשית מראש כימותרפיה myeloaplasiveמשטר ^6. יש לנו דיווח אירוע של תא intravasation ⁶ אך תהליך זה הוא בקושי לזיהוי בשל התדירות הנמוכה במצב יציב. עם זאת, סביר להניח שיהיה משופר על איתות דלקתית. קולטנים chemokine כגון CCR2, CX3CR1 או CXCR4 הם מעורבים מאוד בתהליך של intravasation, ומכאן השימוש בפסילה גנטית של קולטנים אלה אמורים לספק תובנות יסוד רומן במסלולים של נדידת תאים

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamin	Merial		100 mg/ml, anesthetic
Xylazin	Bayer HealthCare		10 mg/ml, anesthetic
Isofluran	Baxter		2.5%, anesthetic
O2/NO2			70/30 mixture, anesthetic
Rhodamin-Dextran	Invitrogen		2 MDa, 10 mg/ml, Vascular staining
Ly6G-PE	Becton-Dickinson		clone 1A8, neutrophils staining
Stereotactic holder	Home made		surgery
Ethanol 70%			surgery
Sterile scissors and nippers			surgery
Rubber ring			18 mm diameter, surgery
Glubran 2	Queryo Medical		Surgical Glue, rubber ring fixation
Small gauge needles	Terumo		surgery
Zeiss LSM 710 NLO multiphoton microscope	Carl Zeiss		Microscope
Ti:Sapphire crystal laser	Coherent Chameleon Ultra		140 fsec pulses of NIR light
Zen 2010	Carl Zeiss		Acquistion Software
Imaris Bitplane	Bitplane		Analysis Software, 3D automatic tracking
PBS 1X	D. Dutscher		surgery
Thermostated chamber	Carl Zeiss		intravital imaging