Protocol
NOTA: Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dalla sperimentazione animale ed etica Comitato francese e validati dal "Protection Service et Santé Animales, Environnement" con il numero A-75-2065. Le dimensioni dei campioni sono scelti in modo riproducibilità degli esperimenti, e secondo la 3R della regolamentazione etica animale.
1. Preparazione del mouse
- Anestesia
- Per breve periodo di immagini (meno di 1 ora), anestetizzare il mouse con una iniezione intraperitoneale di 200 ml di una soluzione salina contenente ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg).
- In alternativa, per un periodo di più immagini (fino a 4 ore), anestetizzare il mouse con inalazione di isoflurano 2,5% vaporizzato in una miscela di 70/30 O 2 / N 2 O, attraverso una maschera adattato.
- NOTA: In questo modo fornisce per incoscienza più stabile ed evita l'iniezione di serie intraperitoneale di droghe. Una volta che il mouse è anestetizzato, verificare la presenza di incoscienza attraverso la stimolazione del pad piede con pinze.
- Colorazione vascolare / colorazione supplementare
- Per la colorazione vascolare: Iniettare per via endovenosa nella vena della coda, 200 ml di Rhodamin-Destrano (2 MdA, 10 mg / ml in tampone salino).
- Per neutrofili colorazione: iniettare 2 ug di Ly6G-PE (clone 1A8) in 100 ml di soluzione salina per via endovenosa nella vena della coda.
- Immobilizzazione
- Per l'immobilizzazione, utilizzare un supporto stereotassica misura adattato al microscopio e l'inalatore gas anestetico.
NOTA: Il supporto Sterotactic è un supporto in metallo con due staffe in lamiera metallica, uno essendo fissato e l'altra estraibili e adattabili, per stringere la testa dell'animale. - Installare la testa del mouse tra le piastre di fissaggio per assicurare l'isolamento dai movimenti respiratori. Serrare le orecchie tra le piastre di fissaggio e la testa per allungare la skin. Controllare la stabilità e la respirazione benessere degli animali.
- Per l'immobilizzazione, utilizzare un supporto stereotassica misura adattato al microscopio e l'inalatore gas anestetico.
- Rimuovere il cuoio capelluto
- Usare cautela etanolo al 70% per bagnare i capelli del cuoio capelluto con un applicatore sterile, evitando il contatto con gli occhi.
- Tagliare la pelle con forbici sterili e tronchesi per rimuovere completamente il cuoio capelluto dal all'indietro dell'osso parietale all'osso frontale. Tenere lontano fino a 3 mm da occhi e orecchie per prevenire vasta emorragia. Rimuovere il tessuto connettivo lasso che copre il cranio (periostio). Lavare i capelli rimanenti con caldo tovagliolo di carta PBS-impregnati.
- Sistema Immersion istituito
- Incollare un anello di gomma di 18 mm di diametro con colla chirurgica direttamente sul cranio con un piccolo ago calibro di controllare la distribuzione. Colla l'intera periferia dell'anello di gomma per evitare perdite (30 microlitri dovrebbero essere sufficienti).
- Pulire il cranio sotto l'anello per l'ultima volta con un tovagliolo di carta imbevuta di PBS e poi aggiungere 37 ° C PBS per una completa immersione delcranio. Aggiungere una goccia di soluzione di NaCl allo 0,9% o specifica pomata oftalmica su ciascun occhio del mouse per evitare secchezza oculare. Trascinare il titolare stereotassica nell'ambito dell'obiettivo.
- Circa posizionare il campo con l'oculare del microscopio attraverso la trasmissione diretta.
2. due fotoni Imaging Acquisition
- Utilizzare un microscopio multifotone accoppiato con un laser Ti: zaffiro, che fornisce 140fs impulsi di luce NIR, selettivamente sintonizzabile da 680 a 1.080 nm, e un modulatore acustico-ottico per il controllo della potenza del laser. Utilizzare una configurazione di cui 3 rilevatori esterni non descanned (NDD) (che consentono la registrazione simultanea di 3 canali fluorescenti) con una combinazione di due specchi dicroici (565 nm e 690 nm), 565/610 e 500/550 filtri passa-banda, e una 485 breve filtro passa, con un piano di apochromat × 20 (NA = 1) Obiettivo immersione in acqua.
- Impostare la camera di riscaldamento per consentire una buona omeotermia delle ANAESMouse thetized.,
NOTA: temperatura potrebbe essere impostato a 1 ora prima di imaging sessione per una migliore stabilità. Nel nostro caso, 32 ° C è stata scelta per ottenere la temperatura corporea ottimale del mouse anestetizzato (36-37 ° C) ed è mantenuta fino a 4 ore. Questa temperatura può essere adattato al sistema utilizzato (sonda digitale può essere utilizzato per controllare questo punto). Inoltre, la camera di riscaldamento utilizzato è scuro / nero e copre una parte del sistema (obiettivi e piattello motorizzato) per evitare la contaminazione luce esterna. - Accendere il sistema
- Accendere il laser Ti: zaffiro, l'intero sistema di microscopio. Avviare il software di acquisizione. Impostare l'intervallo di lunghezze d'onda laser a 870 nm. Selezionare appropriata NDD per la registrazione.
NOTA: Nel nostro caso, generazione di seconda armonica (SHG) 19 e proteina fluorescente ciano (ECFP) vengono rilevati dal NDD dopo il filtro passaggio corto 485. ECFP viene anche rilevato dal NDD dopo il filtro passa-banda 500/550 e Rhodamin destrano viene rilevato da tegli NDD dopo il filtro passa-banda 565/610.
- Accendere il laser Ti: zaffiro, l'intero sistema di microscopio. Avviare il software di acquisizione. Impostare l'intervallo di lunghezze d'onda laser a 870 nm. Selezionare appropriata NDD per la registrazione.
- Regolare le impostazioni di acquisizione
- Utilizzare la "acquisizione dal vivo" il comando di imaging del software e con il controllo direzionale del microscopio, regolare la messa a fuoco su una regione con il segnale ECFP e Rhodamine. Impostare la potenza del laser al minimo per ottenere il miglior rapporto segnale-rumore con minima foto-danni.
NOTA: L'impostazione di potenza utilizzato varia a seconda della profondità della regione di interesse. In genere le impostazioni AOM sono disposte intorno al 20%, che rappresenta una potenza laser oltre l'obiettivo di circa 15 mW. E 'meglio aumentare la potenza plusvalenza PMT per ogni NDD per ridurre fotometabolismo e foto-danni. Impostazioni di acquisizione tipiche sono la scansione singola con un tempo di permanenza di pixel di 1,58 ms e una risoluzione di 512 x 512 pixel con un ingrandimento di 1,5.
- Utilizzare la "acquisizione dal vivo" il comando di imaging del software e con il controllo direzionale del microscopio, regolare la messa a fuoco su una regione con il segnale ECFP e Rhodamine. Impostare la potenza del laser al minimo per ottenere il miglior rapporto segnale-rumore con minima foto-danni.
- Selezionare le regioni di interesse
- Una volta che i parametri di registrazione sono impostati, usare di nuovo il comando di acquisizione "in diretta",e rilevare il tessuto di scegliere un (x, y, z) campo desiderato da monitorare in tempo reale.
NOTA: in genere, abbiamo scelto un campo che include sia vascolare e aree parenchimali. - Registrare il campo con il comando software "posizione".
NOTA: Questo comando memorizza x, y, z coordinate di diversi campi lontani. - Selezionare e registrare ulteriori campi di interesse (fino a 3) utilizzando la stessa procedura.
- Impostare un z-stack 3D con il comando software "z-stack" sulla prima posizione memorizzata secondo il volume richiesto con ingrandimento scelto. Memorizza posizione più profonda, e poi la posizione più alta. Normalizza potenza del laser con la profondità.
NOTA: Per più immagini campo concomitante, acquisiamo 5 fette separate da 3 micron z-punti per ogni campo di acquisire un volume di 12 micron di spessore. Queste impostazioni possono essere adattati al tipo di cellula studiati.
- Una volta che i parametri di registrazione sono impostati, usare di nuovo il comando di acquisizione "in diretta",e rilevare il tessuto di scegliere un (x, y, z) campo desiderato da monitorare in tempo reale.
- Acquisizione di lancio
- Selezionare il220; serie comando "software e scegliere la durata dell'intervallo di tempo e del numero di cicli di tempo. Inizia time-lapse imaging in base al lasso di tempo e la durata richiesta selezionando il comando software "avviare esperimento".
NOTA: Nel nostro caso, acquisiamo un volume ogni 30 secondi per 60 cicli che rappresentano 30 minuti in tempo reale. Più piccolo lasso di tempo può essere effettuata per tenere traccia di laminazione delle cellule veloce nel vaso sanguigno. In questo caso diluente z-stack e non più di 2 campi differenti possono essere registrati contemporaneamente. - Monitoraggio regolare del set up.
- Controllare sempre l'animale per assicurarsi che è inconscio.
NOTA: Agitazione di baffi o gambe dell'animale sono indicatori di ripresa. In caso di respirazione dell'animale è a scatti, la quantità di isoflurano può essere leggermente ridotta. Forte deriva tessuti durante l'acquisizione è un indicatore del mouse del risveglio. - Assicurarsi che l'obiettivo sia correttamente immersa. Rinnova 37 ° C PBS between due acquisizioni (30 min).
NOTA: la scomparsa progressiva di segnale durante l'acquisizione è l'indice di perdita PBS.
- Controllare sempre l'animale per assicurarsi che è inconscio.
- Selezionare il220; serie comando "software e scegliere la durata dell'intervallo di tempo e del numero di cicli di tempo. Inizia time-lapse imaging in base al lasso di tempo e la durata richiesta selezionando il comando software "avviare esperimento".
- Fine della procedura
- Una volta che i video richiesti vengono registrati, eutanasia animale da dislocazione cervicale rapidamente prima rianimazione.
NOTA: guarigione delle ferite porta alla formazione di una crosta in 24 a 48 ore, che limita la possibilità di effettuare l'imaging longitudinale.
- Una volta che i video richiesti vengono registrati, eutanasia animale da dislocazione cervicale rapidamente prima rianimazione.
Analisi 3. Dati
- Correzione Drift
- Utilizzare software Imaris Bitplane per il 3D tracking automatico.
- Aprire la sequenza di immagini 3D su Imaris. Selezionare "spot" di comando, e generare tracciamento manuale (mouse + shift) per tutti i punti di tempo per un minimo di 4 diversi punti di ancoraggio, se possibile, omogeneamente distribuito in campo.
- Applicare la correzione della deriva mediante il comando "corretto deriva" nella scheda "Modifica brano".
- Verificare la presenza di tha qualità della correzione in x, ye z in particolare per evitare esitazioni artefatti.
NOTA: Se la correzione non è soddisfacente, provare altri punti di ancoraggio o escludere il video dall'analisi.
- Monitoraggio cellulare
- Utilizzare "aggiungere nuovi spot" di comando e selezionare "macchie traccia nel tempo" Impostazione algoritmo. Andare al passo successivo.
- Applicare procedura automatica di monitoraggio cellulare o su tutto il canale di interesse utilizzando "canale di origine" comando. Set oggetti (cioè, le cellule) diametro 10 micron. Andare al passo successivo.
NOTA: La scelta dipenderà dalla distinzione tra oggetti e specificità del segnale misurato. In breve, inseguimento automatico l'intero canale è possibile solo se il segnale rilevato è specifico per l'oggetto di interesse. Poiché sia SHG e ECFP vengono rilevati dal NDD dopo il filtro 485 passaggio corto, il monitoraggio sarà più specifico ed efficace utilizzando il segnale ECFP registrato dal NDD dopo la 500/550 filtri passa-banda. Raggruppati o oggetti confezionati densi richiederanno selezione manuale dei singoli oggetti simili al punto 3.1.2. - Selezionare "qualità" tipo di filtro, impostare la soglia di escludere il monitoraggio di oggetti non specifici. Andare al passo successivo.
- Scegliere "browniano Algoritmo Motion" con i parametri esatti di "distanza Max" e "size Gap" tra due punti. Convalidare generazione track.
- Una volta che le tracce vengono calcolate automaticamente, selezionare "Durata del brano" tipo di filtro, impostare la soglia di eliminare le tracce più breve di 120 secondi (in rappresentanza di 4 punti di tempo).
- Obbligatorio: Dopo inseguimento automatico, controllare la qualità delle tracce.
- Srotolare la barra del tempo per verificare che gli oggetti seguono i percorsi della pista. In caso contrario, utilizzare le opzioni di correzione del punto di traccia disponibili nella scheda "edit": Cancellare le tracce false o improprie con comando "Elimina" (eliminare qualsiasi traccia pmista individualmente utilizzando il comando "disconnect"). Se il percorso tracciato è discontinua, aggiungere momento del dato mancante (click del mouse + SHIFT), selezionare tutti i punti di una determinata traccia, e usare "collegare" il comando nella scheda "Modifica brano".
- Parametri di quantificazione
- Selezionare la scheda "Statistiche" in "Preferenze" il comando, scegliere i parametri dinamici di interesse nella lista. Selezionare "Esporta tutte le statistiche su file" di comando e salvare il file excel generato.
NOTA: Diversi parametri dinamici sono ottenuti direttamente dal software, come lunghezza della pista, velocità istantanea, velocità media, e tenere traccia rettilineità. Coefficiente Motilità 6, 20 può essere determinata, ma non è fornita direttamente dal software. - Per ogni cella, calcolare la media degli spostamenti per ciascun periodo di tempo (T) (per un film lasso di tempo di 30 sec, Dt saranno 30, 60, 90 sec, ecc).Tracciare la media dello spostamento quadrata in funzione dell'intervallo di tempo. Ottenere coefficiente motilità calcolando la pendenza della parte lineare della curva.
- Selezionare la scheda "Statistiche" in "Preferenze" il comando, scegliere i parametri dinamici di interesse nella lista. Selezionare "Esporta tutte le statistiche su file" di comando e salvare il file excel generato.
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Representative Results
Struttura del cranio del mouse offre una buona opportunità di studiare la fisiologia del midollo osseo da imaging intravitale. L'osso essendo sottile intorno alla zona anteriore-parietale, è possibile ottenere l'accesso a nicchie midollari, senza abrasione dell'osso. La figura 1 rappresenta un campo 2D ampio del cranio di un MacBlue topo transgenico. La matrice ossea si compone principalmente di collagene I facilmente rilevabile con SHG 19. Iniezione di Rhodamin-destrano macchia la rete vascolare del midollo osseo e permette l'identificazione di nicchie midollo osseo parenchimale tra la matrice ossea ed i vasi 14. Cellule ECFP sono distribuiti in due compartimenti del midollo osseo, ma sono assenti dalla matrice ossea. I monociti sono classificati manualmente in base alla loro posizione all'interno del tessuto. Monocyte vascolare viene definita quando l'intera cella è all'interno del sistema vascolare, trascurando la dimensione del vaso. Grandi venule raccolta sono esclusi dalla nostra un soloANALISI. Parenchimale monociti è definita quando la cella si trova tra la vascolarizzazione e la matrice ossea.
Time-lapse imaging di regione di interesse (video complementare 1 e 2) consente il calcolo della traiettoria singola cella nel tempo sia per vascolari (Figura 2A) o parenchimali (Figura 2B) monociti. La lunghezza della traccia mostra che mostra monociti parenchimali ridotta cilindrata rispetto ai monociti vascolari. Analisi dello spostamento nel tempo confronta la velocità media dei monociti in entrambi i compartimenti (Figura 2C). Lo spostamento quadratico medio in funzione del tempo è una misura della estensione spaziale del movimento casuale. Coefficiente motilità è determinato dalla pendenza della parte lineare della curva e fornisce una migliore idea dello spostamento cella (vedere la sezione di discussione). Il coefficiente motilità dei monociti vascolari (MC = 71μm² / s) è superiore al coefficie motilitànt dei monociti parenchimali (MC = 4.4μm² / s).
La risoluzione temporale di acquisizione deve essere adattata alla velocità media di cellule. Monociti vascolari volventi possono fare importanti spostamenti all'interno di un breve ritardo di tempo. Per una cella di rilevamento più accurato, riducendo l'intervallo di tempo di acquisizione è preferibile. La Figura 3 mostra un esempio di inseguimento monociti con due diversi tempi risoluzioni. Un intervallo di tempo di 30 sec riduce la precisione e la lunghezza dei percorsi (in linea tratteggiata verde) rispetto al 10 sec intervallo di tempo.
Infine, la Figura 4 illustra la possibilità di analizzare un altro sottoinsieme cella contemporaneamente ai monociti. Ly6G è uno specifico marcatore di neutrofili maturi mouse. L'iniezione di anti-Ly6G combinato con un fluorocromo (in questo caso Phyco-erythrin) 5 min prima che la sequenza di imaging neutrofili macchia direttamente in vivo. Questo approccio fornisce un ulteriore dimensione di analisi e la possibilità di confrontare il comportamento dei differenti sottopopolazioni di cellule. Tale approccio potrebbe essere utilizzato per definire sottoinsiemi nei compartimenti monociti.
Figura 1. Ampio campo dell'organizzazione del midollo osseo del cranio. In vivo a due fotoni microscopia a scansione laser immagine del cranio stato stazionario di midollo osseo da MacBlue mouse. Vasculature (in rosso) è macchiata dalla coda iniezione vana 2MDa Rhodamin-Dextran 5 minuti prima sessione di imaging. L'osso viene visualizzato mediante generazione di seconda armonica (blu). ECFP + monociti (Ciano) si trovano all'interno di nicchie parenchimali (aree scure tra vasi e ossa) e all'interno dei vasi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura di monitoraggio in tempo reale delle cellule 2.. Percorsi pista Rappresentante lungo tempo di monociti all'interno (A) il sistema vascolare e (B) il parenchima. Tracks (linea verde) per ogni cella vengono generati automaticamente dal software. Macchie rosse rappresentano il centro di massa di cellule cingolati. (C) Media comparatore di velocità tra vascolari e parenchimali monociti. È stata eseguita l'analisi statistica Mann-Whitney, rappresenta *** p <0,001. (D) Media spostamento quadrata (MSD) in funzione del tempo viene rappresentato per vascolari e parenchimali monociti. Curva asintotica indica lo spostamento vincolata delle cellule nel tempo, mentre la curva lineare indica passeggiata casuale in un ambiente non vincolato. Coefficiente motilità indica l'entità dello spostamento cellulare ed è determinato dalla pendenza della c Urve calcolato regressione lineare. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. risoluzione Intervallo di tempo nello studio dei monociti rotolamento. Sequenze di immagini rappresentative mostrano che una maggiore risoluzione temporale migliora la precisione della traiettoria cellule rotolamento. (Up) sequenza di immagini con intervalli di tempo di 10 sec. (Down) sequenza di immagini con intervalli di tempo di 30 sec. La qualità del percorso pista è migliorata e il rischio di considerare due cellule diverse per lo stesso o il contrario si riduce. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. In vivo co-localizzazione di neutrofili e monociti midollari. Questa figura illustra la possibilità di rilevare un altro sottoinsieme di cellule in vivo in concomitanza con monociti, iniettando anticorpo monoclonale specifico combinato con un fluorocromo. 2 mg di anticorpi Ly6G-PE è stato iniettato per via endovenosa 5 minuti prima del cranio del midollo osseo di imaging del mouse MacBlue. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Il video supplementare 1. comportamento migratorio dei monociti parenchimali. In vivo 3D imaging dello stato stazionario l'attività migratoria dei monociti nel midollo parenchima cranio osso di un mouse MacBlue. Il segnale ECFP + è in ciano. Percorsi migratori di ogni cella (punto rosso) visualizzati in verde.
integrativa Video 2. comportamento migratorio dei monociti vascolari. In vivo 3D imaging dello stato stazionario l'attività migratoria dei monociti nel midollo osseo vascolarizzazione cranio di un mouse MacBlue. Il segnale ECFP + è in ciano. (2M Da) rodamina-destrano è stato iniettato prima della sessione di imaging per distinguere la vascolarizzazione del midollo osseo (rosso). Percorsi migratori di ogni cella (punto rosso) visualizzati in verde.
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Discussion
I punti critici della metodologia di imaging in vivo devono garantire la stabilità della messa a fuoco per massimizzare la durata di imaging e di minimizzare il rischio di contaminazione batterica e infiammazione, che potrebbe influenzare le dinamiche delle cellule infiammatorie. Imaging del cranio midollo osseo segue questi obiettivi, come l'intervento chirurgico effettuato per ottenere l'accesso al midollo osseo è minimo. L'uso di materiale sterile e antisettici è essenziale per limitare il rischio di infezione che possono indurre perturbazione omeostasi cellulare.
Lo sviluppo del titolare stereotassica potrebbe essere difficile e richiede personalizzazione specifica per ogni sistema (distanza tra fase oggettiva e motorizzato del microscopio, uso di inhalator gas per anestesia). È importante ottenere testa del mouse più orizzontale possibile per un accesso più ampio superficie di formazione dell'immagine. Una volta che l'animale è posizionato, è probabile che alcuni minuti possono essere required ottenere una buona stabilità del piano focale. Pertanto, si raccomanda di verificare la deriva dei tessuti prima di lanciare la registrazione di acquisizione. Poiché questo processo insieme con la selezione delle regioni di interesse può durare un po ', si raccomanda anche di verificare periodicamente che l'animale è incosciente se sono stati utilizzati Ketamin / Xylazin, e per verificare il corretto immersione della obiettiva di perdita ed evaporazione può verificarsi.
Il buon posizionamento dell'anello di gomma sul cranio rappresenta un altro passo critico nel processo. Colla cianoacrilato fornisce buoni risultati in termini di stabilità e di tenuta, ma si deve evitare un eccessivo surriscaldamento della colla, che potrebbe coprire il cranio e bloccare l'accesso alla regione di interesse del tessuto. Il vantaggio di immersione diretta del cranio senza vetrino di vetro è quello di ottenere l'accesso alle regioni profonde dell'osso. Inoltre, poiché il cranio non è una superficie piana, ciò non limita l'area di esposizione al consuperficie di contatto tra il cranio e coprioggetti, consentendo un ampio campo di ripresa, come indicato in figura 1.
Per tutte le tecnologie di imaging, la scelta tra velocità di acquisizione e qualità risoluzione è un compromesso. Così, il numero e la qualità delle immagini per unità di tempo sono limitate, e la scelta dipende dalla questione scientifica indirizzata. Tipicamente, monociti vascolari stanno rapidamente rotolando cellule, mentre i monociti parenchimali sono mobili lento o sessili. Un monitoraggio accurato delle cellule rotolamento richiede risoluzione temporale maggiore di acquisizione, come mostrato nella Figura 2. Alto tasso di imaging per cellule sessili è inutili e alte x, y, z risoluzione può essere preferito per analizzare l'attività sporgente di dendriti per esempio. Cellule veloci richiederebbero il volume più spesso per ottenere un monitoraggio più lungo di loro spostamento in z.
Lo spostamento quadratico medio in funzione del tempo non è fornito dalla Imaris software. La PrincipLe di questa rappresentazione basata sul fatto che, per un oggetto viaggia balisticamente senza incontro o costrizione strutturale, la distanza ha viaggiato sarebbe proporzionale all'intervallo di tempo (Figura 2D). Così linearità della pendenza indica una passeggiata casuale in un ambiente non vincolato. In contrasto, la forma della curva asintotica rifletterebbe uno spostamento vincolata nel tempo della popolazione cellulare. Il secondo vantaggio di questo calcolo è che la velocità è talvolta sovrastimato mediante spostamento artefatti del centro di massa. Ciò è particolarmente importante per lenta cellule mobili con attività protrusione. Pertanto, il calcolo del coefficiente motilità dalla pendenza della curva calcolata mediante regressione lineare indica un vero spostamento del tempo cellover 21.
Ly6G colorazione in vivo illustra la possibilità di aggiungere un nuovo parametro di analisi durante il processo di imaging (Figura 3 et al in corso di stampa). Sebbene più del 98% dei neutrofili vascolari siano etichettati, la colorazione dei neutrofili midollo osseo è meno efficiente, e l'intensità di fluorescenza media è fortemente ridotta, suggerendo ridotto accesso dell'anticorpo verso il parenchima midollo osseo (dati non mostrati). Rhodamin destrano, punti quantici, o altri coloranti specifici di cellule apoptotiche o necrotiche come Dapi, propidio ioduro, Sytox 22, o reporter fluorescente per le funzioni cellulari come la produzione di specie reattive dell'ossigeno 23, possono essere aggiunti per via endovenosa attraverso la vena della coda durante l'imaging processo e offrono una buona occasione per quantificare le proprietà funzionali come la morte cellulare, fagocitosi e neutrofili trappola extracellulare. Mazo et al 12 ben utilizzato due diversi coloranti vascolaricon peso molecolare basso e alto per meglio parenchima contrasto e vascolare. La scelta del colorante fluorescente è fondamentale per consentire l'acquisizione contemporanea di diversi reporter fluorescenti. Infatti, la lunghezza d'onda di eccitazione sarà scelto di conseguenza per ottenere il miglior compromesso tra tutti i coloranti fluorescenti utilizzati.
Il protocollo qui utilizzato consente di analizzare in vivo l'attività biologica di un compartimento cellulare, cui studio era difficile finora. Analisi istologica del tessuto midollare di solito richiede una lunga preparazione di decalcificazione ossea per consentire sezione sottile, e fornisce solo una vista statica del tessuto. La visione dinamica evidenzia il tasso di cambio tra il cellulare e il parenchima sinusoidi midollo osseo. Questo processo rapido è un passo cruciale per decifrare in modo da avere una migliore comprensione del meccanismo di mobilizzazione cellulare dopo segnale infiammatorie 5 o precondizionamento chemioterapia myeloaplasiveRegimen 6. Abbiamo riportato caso di intravasation cella 6 ma questo processo è appena rilevabile dovuto alla bassa frequenza allo stato stazionario. Tuttavia, è probabile che sia migliorata su segnalazione infiammatoria. Recettori per chemochine come CCR2, CX3CR1 o CXCR4 sono altamente implicati nel processo di intravasation, quindi l'uso di invalidazione genetica di questi recettori dovrebbe fornire nuove intuizioni fondamentali nei percorsi di migrazione cellulare
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Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Anne Daron e Pierre Louis Loyher per l'assistenza editoriale, il Plateforme Imagerie Pitié-Salpêtrière (PICPS) per l'assistenza con il microscopio a due fotoni e Facility animale "NAC" e Camille Baudesson per topi allevamento assistenza. La ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dal Settimo programma quadro della Comunità europea (FP7 / 2007-2013), contratto di sovvenzione n ° 304810 - RAID, e n ° 241440-Endostem, da Inserm, da Université Pierre et Marie Curie "Emergence ", da la" Ligue contre le cancer ", da" Association pour la Recherche sur le Cancer "e da" Agence Nationale de la Recherche "Programma Emersione 2012 (ANR-EMMA-050). PH è stata sostenuta da la "Ligue contre le cancer".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamin | Merial | 100 mg/ml, anesthetic | |
| Xylazin | Bayer HealthCare | 10 mg/ml, anesthetic | |
| Isofluran | Baxter | 2.5%, anesthetic | |
| O2/NO2 | 70/30 mixture, anesthetic | ||
| Rhodamin-Dextran | Invitrogen | 2 MDa, 10 mg/ml, Vascular staining | |
| Ly6G-PE | Becton-Dickinson | clone 1A8, neutrophils staining | |
| Stereotactic holder | Home made | surgery | |
| Ethanol 70% | surgery | ||
| Sterile scissors and nippers | surgery | ||
| Rubber ring | 18 mm diameter, surgery | ||
| Glubran 2 | Queryo Medical | Surgical Glue, rubber ring fixation | |
| Small gauge needles | Terumo | surgery | |
| Zeiss LSM 710 NLO multiphoton microscope | Carl Zeiss | Microscope | |
| Ti:Sapphire crystal laser | Coherent Chameleon Ultra | 140 fsec pulses of NIR light | |
| Zen 2010 | Carl Zeiss | Acquistion Software | |
| Imaris Bitplane | Bitplane | Analysis Software, 3D automatic tracking | |
| PBS 1X | D. Dutscher | surgery | |
| Thermostated chamber | Carl Zeiss | intravital imaging |
References
- Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83, 430-433 (2008).
- Parihar, A., Eubank, T. D., Doseff, A. I. Monocytes and macrophages regulate immunity through dynamic networks of survival and cell death. J Innate Immun. 2, 204-215 (2010).
- Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity. 19, 71-82 (2003).
- Robbins, C. S., Swirski, F. K. The multiple roles of monocyte subsets in steady state and inflammation. Cell Mol Life Sci. 67, 2685-2693 (2010).
- Shi, C., et al. Bone marrow mesenchymal stem and progenitor cells induce monocyte emigration in response to circulating toll-like receptor ligands. Immunity. 34, 590-601 (2011).
- Jacquelin, S., et al. CX3CR1 reduces Ly6Chigh-monocyte motility within and release from the bone marrow after chemotherapy in mice. Blood. 122, 674-683 (2013).
- Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise. Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).
- Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. N Engl J Med. 354, 610-621 (2006).
- Milo, I., et al. Dynamic imaging reveals promiscuous crosspresentation of blood-borne antigens to naive CD8+ T cells in the bone marrow. 122, 193-208 (2013).
- Cavanagh, L. L., et al. Activation of bone marrow-resident memory T cells by circulating, antigen-bearing dendritic cells. Nat Immunol. 6, 1029-1037 (2005).
- Mazo, I. B., et al. Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells. Immunity. 22, 259-270 (2005).
- Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicol Pathol. 34, 548-565 (2006).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1. J Exp Med. 188, 465-474 (1998).
- Rashidi, N. M., et al. In vivo time-lapse imaging of mouse bone marrow reveals differential niche engagement by quiescent and naturally activated hematopoietic stem cells. Blood. , (2014).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435, 969-973 (2005).
- Cariappa, A., et al. Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes. Immunity. 23, 397-407 (2005).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317, 1767-1770 (2007).
- Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 11014-11019 (2002).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu Rev Immunol. 26, 585-626 (2008).
- Yost, C. C., et al. Impaired neutrophil extracellular trap (NET) formation: a novel innate immune deficiency of human neonates. Blood. 113, 6419-6427 (2009).
- Devi, S., et al. Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus. Nat Med. 19, 107-112 (2013).
